Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler'den Kök Hücre

Neuroscience
JoVE Journal
Neuroscience
AccessviaTrial
 

ERRATUM NOTICE

Summary

Burada subventricular bölgesi ve bireysel yetişkin farelerin kıvrımlarının gelen yapışkan tek katman veya neurospheres ya gibi, sinir öncü hücre kültürlerinin eş zamanlı üretimi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. J. Vis. Exp. (84), e51225, doi:10.3791/51225 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neurosphere deneyi ve yapışkan tek tabakalı kültürü sistemi potansiyeli, in vitro olarak yetişkin nöral kök hücreler (proliferasyon veya farklılaşma) belirlenmesi için değerli araçlardır. Bu deneyler sinir öncü hücre proliferasyonu ve farklılaşması üzerinde dışsal faktörlerinin etkilerini belirlemek için ve sürekli geçişleri üzerinde analiz edilebilir sinir öncü hücre hatları oluşturmak için genetik olarak farklı ya da farklı olarak tedavi edilen hayvanlardan izole edilen hücrelerin ön-madde potansiyelini karşılaştırmak için kullanılabilir. Neurosphere deney geleneksel öncelikle bunlar birincil dokusundan izole edilmiş olup, beyin dokusunda öncü hücre sayıları hızlı bir tahmini veren en önemli avantajı vardır edilebildiği kesin markerlerinin eksikliği nedeniyle, kök hücrelerin post-hoc tanımlanması için kullanılır ayrı ayrı hayvanlardan elde. Yapışık tek tabaka kültürleri, aksine, geleneksel tek tek hayvanlar arasında proliferasyonunu karşılaştırmak için kullanılmaz, Her kültür, genellikle 5-8 arasında hayvanların birleşik doku olarak başlatılır. Ancak, neurospheres aksine, ön-madde hücreleri, bir çok homojen bir popülasyonundan oluşur ve tek hücre farklılaşma işlem için de yararlıdır büyük bir avantaja sahiptir. Burada, ilk kez için, ayrı ayrı hayvanlardan yapışkan kültürler, ayrıntılı olarak, neurosphere kültürlerin üretimi tarif ve. Bu subventricular bölgesi (SVZ) ve işlenmiş ya da genetik olarak farklı fare hatları kıvrımlarının (DG) hem de çoğalma ve / veya farklılaşma potansiyeli eşleştirilmiş analizi, hem de hayvan kullanımında önemli bir azalma da dahil olmak üzere bir çok önemli etkileri vardır.

Introduction

Neurosphere tahlil 1,2 ve yapışık tek tabaka kültürü 3,4, hem de 1990'ların başında geliştirilen, halen vitro nöral kök hücre deneylerinde altın standart kalır. Bu deneylerde, ana doku belli bir beyin bölgesinden mikro kesilmiş olduğu, serbest bir ya faktörü-2 (FGF2) oluşturmak için tek bir hücre süspansiyonu ile mitojenlerdir epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme mevcudiyetinde kültürlenmiş ayrışması kümeler (neurospheres) ya da yapışık mono tabakalar. Her iki sistem de avantajları ve dezavantajları ve dikkatli dikkate bir numara ya da başka bir sistem seçilir önce ele alınması için olan söz verilmelidir sahiptir.

Neurospheres öncü hücre sayısı ve potansiyel farklılıkları doğrudan bir okunmasını sağlar. Buna ek olarak, aynı zamanda, normal neurospheres dış ortamdan uzaklaştırıldı, hücrelerin iç özelliklerini incelemek için yararlı bir araçtır. Extrinsic ipuçları sadece büyüme ortamına ilgi faktörü eklenerek ve üretilen neurospheres sayısını ve boyutunu miktarının ele alınabilir. Neurospheres en büyük dezavantajı, ancak, üst yüzeyi 5 üzerine daha fazla farklı olan neurospheres (özellikle bir neurospheres) merkezinde hücrelerle, kendi niş formu olmasıdır. Neurospheres kök hücreler, kararlı soylarının ve farklı hücre ve neurospheres içindeki hücre-hücre etkileşimleri ve kök hücrelerin bakım karşı bir karışımını içerir. Neurospheres gerçek kök hücrelerin 6-8 sadece küçük bir numarası içeren nedeni budur.

Yapışık tek tabaka kültürleri de vivo çoğalmasında Modele iyi bir in vitro sistem sağlar. Hücreler daha izole ve homojen kaldığı yapışık kültürler, neurosphere heterojen doğasını ortadan kaldırabilir. Bu büyüme koşulları altında, ön-madde hücreleri çoğalır RAPIdly ve hemen hemen tüm hücreler bölünerek ve karakteristik nöral prekürsör belirteçleri Nestin, Sox2 ve BLBP ifade edilmektedir. Neurosphere deneyi ile karşılaştırıldığında tek tabakalı kültürü sisteminin en önemli dezavantajı ayrı ön-madde türetilen klonlar izlenmesi ve anlaşılabilir olması için mümkün olmasıdır.

Izolasyon stratejilerin verimi genellikle kötü olmuştur, çünkü kültürlerin her iki tip için en protokollerin bir dezavantajı, göreceli olarak büyük bir hayvan numaralarını kullanmak zorunlu hale gelmiştir. Aynı zamanda, bu yetişkin nöron hem de tek tek ex vivo modelleri için ihtiyaç sonuçlanan, beyin 9'un bireyselleştirilmesine katkı olduğu açık hale gelmiştir. Bu raporda açıklanan şekilde bu ihtiyaçlarını "tek-fare-tek-kültür" protokolleri ile karşılanabilir.

Aşağıda görsel protokol SVZ'unda ve DG bireysel hayvanların ya gibi yapışkan m hem de sinir öncü kültürlerinin eşzamanlı üretimini tarifonolayers veya neurospheres gibi. Ayrı hayvanlardan olan kültürlerin üretimi tek tek muamele edilmiş hayvanlar ya da transgenik çeşitli bireysel veya vahşi tip fareler arasında karşılaştırmalar gerekli olduğunda özellikle yararlıdır. Bu protokol ayrıntılı yetişkin farelerden SVZ ve DG bölgelerin aynı anda mikro-kesim için talimatlar, tek bir hücre süspansiyonu içine ayrışma, yapışkan ya da tek tabakalı kültürler neurospheres ve multipotentiality ve uzun süreli potansiyel analizi ya da in vitro olarak kültür, iki kardinal içerir Bir kemik niyetli kök hücre özellikleri.

Protocol

1.. Temel Kurulum ve Kültür Orta hazırlanması

  1. En az iki gün önce deney başlamadan, Poly-D-lisin (PDL) / Laminin yapışkan tek tabakalı kültürler için levha kaplı hazırlar. Kuyu / şişeler yüzeyin kaplanması için, yeterli PDL (dH 2 O 10 mg / ml) ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe hazırlamak. Çanak çözüm çıkarın ve dH 2 O. ile çanak üç defa yıkamak Kurumaya bırakın. Laminin (soğuk DMEM'de 5 mg / ml: F12) ilave edin ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Laminin çıkarın ve ya derhal ya da plakaların kullanılması gerekene kadar -20 ° C 'de, laminin ile saklayın.
  2. Kenarları yuvarlatılmış haline gelene kadar bir alevle cam Pasteur pipetler çevirerek "orta" ve "küçük" delikleri ile yangın cilalı pipetler hazırlayın. Sterilize etmek otoklavlayın.
  3. Diseksiyon gününde,% 2 B27, 1x Glutamax, 2 mg / ml heparin ile Nöral Bazal Ortamda karıştırılarak kültür ortamının uygun miktarda hazırlanması 50 birim / ml Penisilin / Streptomisin, 20 ng / ml saflaştırılmış fare reseptörü dereceli epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 20 ng / ml yeniden birleştirici sığır fibroblast büyüme faktörü (FGF-2). Bir su banyosu içerisinde 37 ° C'ye kadar kültür ortamı ısıtın.
  4. SVZ ayrışma için,% 0.05 tripsin-EDTA hazırlamak ve 0.125 mg / ml tripsin 0.01 mg / ml DNase içeren inhibitör. 37 ° C'ye bu çözümleri Denge
  5. Bir diseksiyon mikroskobu kurmak ve beyin (makas ve küçük spatula) çıkarın ve SVZ'unda ve DG diseksiyonlarla (bisturi, 1 ml şırınga bağlı 27 G iğne, 1 x # 7 forseps, 1 x # 5/45 için gerekli araçları hazırlamak % 70 etanol içinde ıslatılmasıyla forseps).

2. Yetişkin Fare Brain ve SVZ'una / DG Microdissections Hasat

  1. Uygun kurumsal kurallarına göre tek yetişkin (8 haftalık) fareler anestezisi. Servikal dislokasyon gerçekleştirin.
  2. Alan sterilize etmek ve kürk miktarını en aza indirmek için% 70 etanol ile baş Sprey birmakas ve beyin dheres. Kullanarak keskin makas beyin sapının dibinde hayvan başını kesmek.
  3. Her bir göz boşluğu içine makas küçük bir çiftin bir bıçak yerleştirme ve koronal keserek iki koku ampuller arasında kafatası kesilmiş, kafatası tabanında baş tutarak. . Makas açısı yatan beyin zarar görmesini önlemek için mümkün olduğunca sığ sağlamak: Sonraki, Dikkat sagital sütür boyunca kafatası yoluyla uzunlamasına bir kesim tarafından takip kafatasının dibinde iki yan keser, yapmak.
  4. Makas, bıçak ya da kavisli bir forseps ya bir çift ile kafatası soyulması ile beyin Açığa. Soğuk PBS içine küçük bir spatula ve yer kullanarak kafatası beyni özgür.
  5. Kan ve kürk çıkarmak için PBS ile beyinleri durulayın.
  6. PBS içeren bir 10 cm plastik Petri beynini transfer
  7. Düşük büyütmede bir diseksiyon mikroskop altında beyin içeren Petri yerleştirin ve Brai konumlandırmakventral yüzeyi üzerinde n. Beyincik tarafından pozisyonunda beyin tutarken ince kavisli bir forseps kullanarak koku ampuller çıkarın.
  8. Dorsal üzerine beyin döndürün ve bir neşter kullanılarak kiazmada düzeyinde beyin aracılığıyla koronal kesim yapmak
  9. Svz microdissect için (Daha ayrıntılı talimatlar için, Azari ve ark. 10. ayrıca bkz), kesilmiş koronal yüzey yukarı bakacak şekilde beynin rostral kısmını yerleştirin ve daha yüksek bir büyütme üzerine mikroskop odak. Çıkarın ve ince kavisli bir forseps kullanarak septum atın.
  10. Hemen hemen dokuya KK ve diğer yaklaşık 1 mm altında, yan ventrikül yan köşesinde iyi eğri forseps bir çiftin bir bıçak ucu yerleştirerek svz (ventrikül çevreleyen doku ince tabaka) teşrih ventriküle komşu. Yemeğin tabanına doğru ve ventr ventral doğru forseps aşağı bastırınicle doku küçük bir üçgen parça kaldırmak için. Buz üzerinde bir Petri kabı içine disseke svz yerleştirin.
  11. DG microdissect için (Daha ayrıntılı talimatlar için, Hagihara vd. 11. ayrıca bkz), Petri kabı ve bir neşter kullanılarak uzunlamasına fissür birlikte kesti beynin kaudal kısmını yerleştirin.
  12. Diseksiyon mikroskobu altında, forseps kullanarak beyincik ve diensefalonu çıkarın.
  13. DG etrafında sınırların artık görünür böylece mikroskop yönlendirmesi. Dentat girus kaldırmak için, DG ve Ammon boynuzu arasındaki sınır boyunca bir 27 G iğne ve slayt ucu takın. Ince forseps kullanarak, çevreleyen dokudan DG ücretsiz.

3. SVZ'una Doku Ayrılma

  1. Hiçbir büyük parça kalmayıncaya kadar yaklaşık 1 dakika boyunca bir neşter bıçak kullanarak doku kıyma.
  2. Önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin-EDTA kullanılarak 1 ml bir 15 ml tüp kıyılmış doku aktarın ve 7 dakika boyunca inkübeBir su banyosu 37 ° C olarak ayarlanmış
  3. , Enzimatik reaksiyonu durdurmak DNaseI içeren tripsin inhibitörü 1 ml ekleyin ve tüp hafifçe vurarak içerikleri karıştırmak için.
  4. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile süspansiyon Pelet ve supernatant atmak
  5. Büyüme ortamı içinde 1 ml pelletini ve yavaşça bir P1000 Dikkat pipet kullanarak aşağı, yaklaşık 7-10x yukarı pipetleme ile ayrışır:. Öğütülerek fazla artmış hücre ölümüne yol açabilir ve daha sonra negatif hücre büyümesi üzerinde etkisi olacaktır.
  6. 5 ml'lik bir toplam hacme büyüme ortamı ilave edin ve enkaz ve ayrışmamış doku kümeleri kaldırmak için bir 40 mm bir elekten hücre süspansiyonu geçmektedir.
  7. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj, süpernatant atmak ve 200 ml büyüme ortamı içinde elde edilen pelet tekrar süspansiyon.

4. DG Doku Ayrılma

  1. Hiçbir büyük parça kalması ve transfer kadar yaklaşık 1 dakika boyunca bir neşter bıçak kullanarak doku Kıymaönceden ısıtılmış PDD enzim karışımı (Papain 2.5 U / ml, Dispase 1 U / ml, DNaseI 250 U / mi). Tüpü, her 3-5 dakikada bir çevirerek karıştırma, 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Mekanik orta delik kullanılarak doku ayırmak, hafifçe aşağı 10x yukarı pipetleme, Pasteur pipet cilalı yangın.
  3. Tüpü, her 3-5 dakikada bir çevirerek karıştırma, 37 ° C'de ilave bir 10 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Dahası, mekanik bir küçük delik kullanılarak doku ayırmak, yangın yavaşça aşağı 10x yukarı pipetleme ve Pasteur pipet cilalı.
  5. 5 dakika boyunca 130 x g'de santrifüj.
  6. Süpernatantı ve 1 ml tampon çözeltisi (1x HBSS, 30 mM glikoz, 2 mM HEPES (pH 7.4), 26 mM NaHCO 3) 'de pelletini. Tampon çözeltisi ile 10 ml'ye tamamlanır.
  7. 5 dakika boyunca 130 x g'de santrifüj.
  8. Süpernatantı ve% 20 Percoll 5 ml pelletini. (10x 0.5 ml PBS,% 100 Percoll 4.5 ml eklemek,% 90 Percoll hazırlanması için daha sonra% 20 bu seyreltik3,9 ml 1 x PBS) 1.1 ml% 90 Percoll ekleyerek.
  9. 15 dakika boyunca 450 xg santrifüjleyin.
  10. Süpernatantı ve 10 ml tampon maddesi içinde pelletini.
  11. 5 dakika boyunca 130 x g'de santrifüj.
  12. 200 ul büyüme ortamında pelletini.

5. Yapışık tabakalı Kültürlerin Üretimi

  1. 96 oyuklu bir plakanın de kaplanmış tek bir PDL / laminin içine ayrışmış svz veya DG doku Plate ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
  2. Hücreler kaplanmış yüzeye yapışık bir kez yaklaşık olarak 24 saat sonra kaplama, daha fazla kalıntıları çıkarmak için büyüme ortamı değişimi.
  3. Her sonraki 3-4 gün sonra, büyüme faktörleri doldurmak için taze ortam ile büyüme ortamının kuru yarısı.
  4. . Hücreler yaklaşık% 80 confluency ulaşmak ve pasajlanır hazır Not olana kadar tekrarlayın: kaplama ve ilk geçişi arasındaki süre 2-3 hafta kadar sürebilir.
  1. Kültürler, yaklaşık% 80 ortak akışkanlığa ulaştıklarında kuyudan orta kaldırmak ve PBS ile yıkayın.
    Not: Hücre ölümü artmış seviyeleri, bu hücrelerin ayrılması ve neurosphere oluşumu ve ek olarak yol açabilir olarak hücreler% 90 konfluent aşmasına izin vermeyin.
  2. 50 ml Accutase ekleyin ve 2-3 dk (hücreleri yuvarlak ve müstakil olup olmadığını görmek için kontrol) için 37 ° C'de inkübe.
  3. Bir 15 ml tüp hücreleri çıkarın ve iyi bir kez PBS ile yıkayın ve aynı tüpe aktarın.
  4. PBS ile 5 ml ve 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj hücreleri seyreltin.
  5. İlk geçit için, 1 ml hücre seyreltin ve 24 yuvalı plakanın kaplanmış bir PDL / laminin içine plaka.
  6. Daha sonra geçişleri için, 200 ml büyüme ortamı ve sayımı bir hemasitometre kullanarak içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Plaka 1 x 10 4 hücre uygun büyüklükte kaplanmış kuyuda veya şişede / cm 2. i>

7. Yapışık Tek tabakalı Kültürlerin Farklılaşma

  1. 20 ng / ml EGF ve 10 ng / ml bFGF ihtiva eden büyüme ortamı içinde 1 x 10 4 hücre / cm 2 yoğunluğunda PDL / laminin kaplanmış, kapak slipleri üzerine yapışık tek tabaka kültürleri, levha çoğalan hücreleri ayırt etmek için.
  2. Hücreler, yaklaşık% 80 ortak akışkanlığa (genellikle 2 gün) ulaştığında, ortam 5 ng / ml bFGF ve 0 ng / ml EGF içeren büyüme ortamı değiştirin.
  3. 5 ng / ml bFGF 2 gün sonra, ilave bir 3 gün boyunca her iki mitojen yokluğunda büyüme ortamı ile orta yerine Not:. Bu süre esnasında hücre ölümü, önemli miktarda ortaya çıkar.
  4. 5 günlük bir toplam sonra, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) ile düzeltme daha sonra herhangi bir ölü hücreleri çıkarmak için PBS ile farklılaşmış hücreleri yıkayın.
  5. 4 ° C'de 1 ml PBS içinde kuyu herhangi bir PFA ve saklamak lamelleri çıkarmak için PBS ile tekrar yıkanır
jove_title "> 8. Neurosphere Kültür ve Ölçümü

  1. Kültür ortamı, 20 ml bir hayvandan ya da ayrışmış svz DG doku seyreltin ve 10 ml multidoser pipet kullanarak, 96 oyuklu bir plaka üzerinde 200 ml / oyuk plaka.
  2. DG türetilmiş neurospheres için SVZ türetilen neurospheres ve 10-12 gün boyunca 6-7 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.
    Not: Bu önerilen inkübasyon sürelerinde daha uzun bir süre için büyüme aşırı neden olur ve neurospheres ve / veya kendiliğinden bağlantı ve farklılaşma merkezinde hücre ölümüne yol açar.
  3. Saymak ve dik bir ışık mikroskobu yerleştirilmiş bir mercek ağı kullanarak neurospheres çapını ölçmek

9. Neurospheres Pasajlanması

Birincil neurospheres sayılır edilmiş ve boyutları kaydedilmiş sonra tek bir neurosphere ya da bir yığın ya da kültürü ile başlayarak birkaç geçişleri fazla genişletilebilir.

  1. Bulk kültür neurosphere genleşme
    1. Bir kütle kültürü olarak pasaj Birleştirilen neurospheres için, 5 dakika boyunca 300 x g'de, 15 ml tüp ve santrifüje aktarım, plakadan neurospheres içeren orta çıkarın.
    2. Süpernatant atılır ve önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin-EDTA 1 ml neurospheres tekrar süspansiyon ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    3. DNasel tripsin inhibitörü içeren eşit hacimde ekleyin ve iyice karıştırın.
    4. 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj, süpernatant kaldırmak ve büyüme ortamı içinde 1 ml.
    5. Neurospheres ayırmak için bir P1000 pipet ile yukarı ve aşağı yaklaşık 10x çiğnemek.
    6. Hücre süspansiyonu 10 ml çıkarın ve tripan mavisi eşit hacmi ile karıştırmak ve bir hemasitometre kullanarak canlı hücre sayımı gerçekleştirin.
    7. Uygun büyüklükte bir hücre kültüründe ya da iyi bir şişede / cm 2 1 x 10 4 hücre yoğunluğunda hücreler reseed.
    8. 37 ° C'de inkübe% 5 CO 2 ile ikincil neurospheres formu kadar.
  2. Tek neurosphere genişleme
    1. Geçişi için tek tek neurospheres neurosphere içeren kuyu ve dikkatli bir şekilde seçmek neurosphere bozmadan, her kuyudan büyüme ortamı içinde yaklaşık olarak 160 ul çıkarın ve atın.
    2. Her bir geçişli edilmesi için% 0.05 tripsin-EDTA, 100 ml ilave edin ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    3. Reaksiyonu durdurmak için DNaseI içeren tripsin önleyicisi 100 ul ekle.
    4. Öğütün yaklaşık 10 kat yukarı ve Neurosphere parçalayın bir P200 pipet ile aşağı.
    5. Büyüme ortamı 1,5 ml ihtiva eden bir 24-yuvalı plakanın yeni bir oyuğuna ayrışmış neurosphere ihtiva eden 200 ml aktarın. İkincil neurospheres oluşana kadar% 5 CO 2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
      Not: uzun vadeli potansiyelini, gerçek bir sinir s kardinal özelliklerinden birini belirlemek içintem hücresi, neurospheres en az 5-10 pasajlar için geçişli olmalıdır. Ayrıca bu tür sonuçların 12-14 part tartışmalı yorumuna literatüre bakınız.

10. Neurosphere Kültürlerin Farklılaşma

Birincil veya pasajlanır neurospheres multipotentiality belirlemek için ayırt edilebilir.

  1. Kendi kültür plakası ya da şişeden süspansiyon içinde neurospheres çıkarın ve bir 10 cm Plastik Petri tabağına aktarın.
  2. , Bir teşhir mikroskopu altında P20 pipet kullanarak ortamından yaklaşık olarak 15-20 neurospheres kaldırmak ve büyüme faktörlerine ve bir PDL / laminin kaplı lamel olmaksızın kültür ortamını ihtiva eden bir 24-iyi levhaya transfer.
  3. % 5 CO2 ile 37 ° C'de yaklaşık 7 gün boyunca ayırt edebilecektir.
  4. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 PFA ile çözmek daha sonra herhangi bir ölü hücreleri çıkarmak için PBS ile ayrılır neurospheres yıkayın.
  5. R PBS ile tekrar yıkanır4 ° C'de 1 ml PBS içinde kuyu herhangi bir PFA ve mağaza lamelleri birikimleri temizlenmelidir

11. Neurosphere ve Yapışık Kültürlerin immün

Not: O4 antikoru ile boyama için Triton engelleme ve boyama adımları atlarsanız ve uygun bir IgM ikincil antikor kullanmayı unutmayın.

  1. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca çözeltisi (PBS içinde% 10 normal eşek serumu,% 0.2 Triton X-100 ihtiva eden) engelleme farklılaştırılmış neurospheres veya yapışkan ihtiva eden tek tabaka kültürleri lamelleri inkübe edin.
  2. Primer, BIII-tubulin, Map2a + b, glial fibriller asidik protein (GFAP) ya da oda sıcaklığında 60 dakika için O4 antikorları ihtiva eden taze bloke çözeltisi içinde inkübe edin.
  3. 3 kez PBS ile yıkayın.
  4. Uygun floresan konjuge sekonder antikor ve 4,6-diamidino-2-fenilindol ihtiva eden taze bloke çözeltisi içinde inkübe (DAPI; 1:5,000) karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı.
  5. Karanlık gecede floresan montaj orta ve kuru hava kullanılarak mikroskop lamı üzerine monte lamelleri
  6. Bir floresan mikroskop kullanılarak görünümü ve görüntü.

Representative Results

Erişkin fare beyninden hem iki nörojenik bölge nöral öncü hücreleri içermesine rağmen zaman in vitro kültüre, bu hücrelerin çok farklı davranabilir. Her iki bölgede elde edilen yapışkan tek tabaka kültürleri Ancak SVZ türevi yapışık kültürlerin hızlı çoğaldığı ve 1-2 gün önce GM türetilenler dışında, ortalama geçişli olması gerekir (Şekil 1A) morfolojik olarak ayırt edilemez görünür. Neurospheres olarak, SVZ türetilen öncü hücreler de hızlı çoğaldığı ve DG-türevi öncü hücreleri (Şekil 1 C) daha büyük neurospheres (Şekil 1 B) oluşturur. SVZ'una türetilmiş neurospheres tipik kültür 6-7 gün sonra sayılır iken, DG-türetilmiş neurospheres genellikle 10-12 gün sonra ölçülür. Cins olabilir neurospheres hemen hemen 10 misli daha büyük bir sayı ile kanıtlandığı Buna ek olarak, sinir öncü hücrelerin çok daha büyük bir sayı, DG göre SVZ'unda ikametbu bölgeden ted (SVZ: DG genel 1173 ± 74.9: 145.3 ± 26.4, p = <0.0001, n = grup başına 10 hayvan, Şekil 2A).

Çalışmalar SVZ'unda ve DG içindeki ön-madde hücreleri, farklı uyarıcılara yanıt göstermiştir. SVZ ön-madde hücreleri, koku, öğrenme ve koku zenginleşmesi ile aktive oysa dg içinde öncü hücreler, mekansal öğrenme belirli türleri tarafından ve çevresel zenginleştirme ve fiziksel aktivite gibi stimuli ile aktif hale. Bununla uyumlu olarak, bizim (TLW) bir önceden DG sinir uyarma 15-18 ile aktive edilebilir latent kök ve projenitör hücrelerin bir popülasyonu içerdiğini de gösterdik. Bunun aksine olarak, ön-madde hücreleri, SVZ KCI 17 seviyelerini depolarize edici yanıt olarak neurosphere sayısında bir azalma ile, oldukça farklı bu uyarana yanıt bulundu. Burada, biz ind SVZ'unda ve DG türetilen izole edilmiş hücrelerin yarısını kaplama, bu deneyi tekrar ettilerKCl seviyeleri ve kontrol KCl seviyelerinde, diğer yarısı depolarize hayvanlar ividual. Biz, (DG öncü hücreler depolarizasyon (101.2 ± 17.4 genel 184.8 ± 12.5, p = 0.005, n = 5 hayvan) tarafından aktive edilirken, SVZ türetilen hücrelerin çoğalması aslında önemli ölçüde azalmış olduğu, daha önce, göstermek 368.0 ± 62.9 vs 266.6 ± 41.6, p = 0.02, n = 5 hayvan, Şekil 2B).

Uzun süreli potansiyel, gerçek bir kök hücre, bir neurospheres tek tabaka ya da yapışık kültürlerin önemli özelliklerinden birini doğrulamak için, en az 10 geçirme zarfında, yani uzun bir genişleme yeteneğine sahip olmalıdır. Her bir geçiş de, tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması sonra, hücrelerin sayısı sayılır ve kat genişleme hesaplanır. Teorik hücre toplam sonra önceki geçidinden teorik toplam göre bu geçişi esnasında kat genişlemesi çarpılarak hesaplanır. Bu disp olduğunu geçiş sayısı ile bir çizgi grafiği olarak koydu (örneğin bakınız Şekil 3) teorik toplam hücre sayısının log10 karşı çizilmiştir. Multipotentiality teyit etmek için, hem de tek tabakalı kültürler ve neurospheres mitojen vazgeçilmesinden farklı olabilir ve her ikisi de nöronlar doğuran gösterilmeyecek ve glia (Şekil 4).

Şekil 1
.. Şekil 1. Yetişkin fare öncü hücreler yapışık tek tabaka kültürleri (A) veya neurospheres (: SVZ'una, C: B DG) olarak yetiştirilebilir. Ölçek çubuğu 50 mm daha büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

load/51225/51225fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg "/>
Şekil 2,. Önemli ölçüde daha neurospheres tek farelerin DG kıyasla SVZ'unda oluşturulur (A). SVZ ve DG ön-madde hücreleri, in vitro depolarizasyon (B) farklı yanıt vermektedir.

Şekil 3,
Şekil 3,. Uzun süreli potansiyelini teyit etmek için, üzerinde 10 neurospheres geçişleri için genişletilir.

Şekil 4,
Şekil 4. Neurospheres BIII-Tomar yay içine ayırt edilebilirlin + nöronlar (A: kırmızı), GFAP + astrocytes (A: yeşil), O4 + oligodendrositler (B: kırmızı) ve Map2ab + nöronlar (C: kırmızı). resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Discussion

Bu çalışma, yetişkin fare beyin iki ana nörojenik bölgelerden sinir ön kültürler olarak tek katmanlar ve yapışkan neurospheres hem başlatılması için ayrıntılı bir protokol sunar. Bu in vitro kültür sistemleri ya da çalışırken akılda tutulmalıdır önemli noktaları vardır. İlk olarak, ayrışma yönteminin seçimi çok önemlidir ve doku bağlıdır. Elimizde olanlar,% 0.05 tripsin-EDTA SVZ doku ayrılması için çok etkili olduğunu ve bir papain tabanlı bir ayırma tekniği kullanılarak zaman daha neurospheres daha yüksek bir sayı ile sonuçlanmaktadır. DG doku ayrılması için ancak, biz güçlü bir papain-temelli ayrışma yaklaşımı öneriyoruz. Doğrudan DG doku üzerinde iki ayırma yöntemleri karşılaştırırken, hayatta kalabilen hücreler önemli ölçüde daha düşük verim gözlendi ve tripsin kullanılırken yaklaşık olarak daha az neurospheres 10-kat. Ayrışma bu fark doku compositio farkı nedeniyle olabiliriki bölge arasında n. DG kompakt doku geniş neuropil çevrilidir ve hücresel süreçleri kapsamlı hasar ayrışma sırasında oluşabilir.

Unutulmaması gereken ikinci önemli nokta neurosphere tahlil verilen bir doku numunede mevcut öncü hücrelerin sayısı hakkında nicel ifadeler yapmak için yararlı olabilir iken, bazı dikkatli, ancak bu mutlak sayıların yorumlanması istihdam edilmelidir olmasıdır. Neurospheres Fusion önemli bir karıştırıcı faktör olabilir. Çeşitli çalışmalar nöronlar son derece hareketli ve hatta sözde 'klonal' koşullar 7,19 ne altında, sigorta olduğunu göstermiştir. Elde edilen neurosphere frekans ortam bileşenleri, diseksiyon prosedürü ve ayrışma işlemi de dahil olmak üzere çok faktöre bağlı olabilir. Hatta tecrübeli işleyicileri arasındaki sözde özdeş örneklerinden üretilmiştir neurospheres sayısındaki bir değişim (Şekil 1a belirgindir.) Daha kullanışlı, verilen iki örnekte (örn. kontrol vs işlenmiş veya yabani tip vs knock-out) değil, toplam bir nicel ifadesi yerine, tek bir deney içinde aynı kişi tarafından ele arasındaki öncü frekans doğrudan bir karşılaştırma öncül hücre sayısı.

Bu iki kültür sistemleri üretilen hücre tiplerinin homojen olarak farklı olduğunu belirtmek önemlidir, belirli bir deney için en uygun olan, iki kültür yöntemleri hangi karar verirken. Oldukça homojen öncü hücre havuzu (~ hücrelerin% 98 Sox2 + olan) göstermektedir yapışık hücre kültürleri, çoğalan karşılaştırıldığında 20, neurospheres daha heterojendir ve içeren, hem de ön-madde hücreleri, proliferasyon, farklı nöron ve astrositler 21,22. Bu neurospheres büyük olarak geçitler arasında uzun bir süre boyunca kültüre değildir önemlidir onların çekirdekte farklılaşmış hücre türleri bulmak daha olası hale neurosphere.

Bu, geleneksel olarak, 5-8 arasındaki farelerin DG dokusundan yapışkan tek tabakalı ön-madde sinir kültürlerini başlatmak. Tek bir fare Müdürlüğü veya SVZ'unda gelen yapışık tek tabaka kültürleri kurmaya çalışırken nedenle, son derece dikkatli doku öğütülerek üzerinde yol açtığı aşırı hücre ölümünü önlemek için doku ayrışma işlemi sırasında alınması gereken veya genişletilmiş tutma, diseksiyon ve son kültürleme adımlar arasında zaman dönemleri. Bu protokol, ilk kez tarif bireysel hayvanların SVZ'da ve DG hem yapışkan olmayan tek tabakalı ön-madde kültürlerin üretimi. Öncü çoğalması ve farklılaşması karşılaştırma tek bir hayvan olarak yapılması gerekiyor birçok örnekleri vardır. Bunlar doğrudan doğruya DG ve eşleştirilmiş istatistikleri kullanarak bireysel hayvanların svz karşılaştırmak ve bireysel davranışsal veya fizyolojik verilerle 9 ile kültür verileri eşleştirmek için yeteneği vardır. Tek hayvan kültürleri de alGenetik dernek çalışmaları için yaş-eşleştirme kültür başına 5-8 donör havuzu mümkün değildir nadir transgenik hayvanlar, hem de benzersiz hayvanların (F2 haçlar veya dışında yetiştirilmiş hayvanlar) düşük kullanımı.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

TLW Marie Curie Uluslararası Gelen Bursu ile desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda temel kurumsal finansman ile finanse edildi, Bundesministerium Bildung ve Forschung (Bmbf) finansman ve kısmen GK için Öncelikli Araştırma Programı (SFB) 655 desteği ile für. Yazarlar bakım ve bu çalışmada kullanılan hayvanların ve Odette Leiter'e, Susann Ruhwald, Fanny Boehme ve hücre kültürü ve mikroskopi yardım için Richard Wetzel bakımı için Anne Karasinsky teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-lysine Sigma P7280-5MG
Laminin Roche 11243217001
Glass Pastuer pipettes Volac BS5732
DMEM:F12 (1:1) 1x Life Technologies 21331-020
Neural Basal Medium (1x) Life Technologies 21103-049
B27 supplements (50x) Life Technologies 17504-044
GlutaMAX Life Technologies 35050-038
Heparin Sigma H3393
Penacillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
EGF PeproTech AF-100-15
bFGF PeproTech 100-18B
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Trypsin inhibitor Sigma T6522
DNaseI Roche 10104159001
Accutase PAA L11-007
Papain Worthington LS003120
Dispase Life Technologies 17105-041
Percoll GE Healthcare 17-0891-02
HBSS (with Calcium and Magnesium) Life Technologies 14025-050
Glucose Roth X997.2
HEPES Sigma H3375-500G
NaHCO3 Merck K39347429847
1 ml Syringes  Braun 2016-10
27 G Needles Braun 4657705
Scalpels (#22 disposable) Braun BA222
Dumont #7 forceps FST 11271-30
Dumont 5/45 forceps FST 11251-35
Scissors FST 14060-10
Iris spatula FST 10093-13
70% Ethanol
PBS Life Technologies 14040-091
flasks/well plates TPP 92696
PFA (4%) Sigma P6148
Hemocytometer Marienfeld 650010
Trypan blue (0.4%) Sigma T8154
NDS Millipore 530
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal bIII-tubulin antibody Promega G712A
Rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody Dako 20334
O4  R&D Systems MAB1326
Map2a+b Sigma M1406
Donkey anti-mouse Cy3 antibody  Jackson ImmunoResearch 715-505-151
Donkey anti-rabbit Alexa488  Dianova 711-545-152
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)  Invitrogen 861405
Aqua Polymount Polysciences Inc 18606
10 ml Combi tips Eppendorf 30089677
Plastic 10 ml and 25 ml serological pipettes Corning 4488/4489
EQUIPMENT
Pipetboy Integra Biosciences 521942
Multidoser pipette Eppendorf
37 °C waterbath
Dissecting microscope
37 °C:5% CO2 incubator
Centrifuge Eppendorf 5810R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
  3. Palmer, T. D., Ray, J., Gage, F. H. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol. Cell. Neurosci. 6, 474-486 (1995).
  4. Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
  5. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993, 18-29 (2003).
  6. Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PLoS One. 2, (2007).
  7. Jessberger, S., Clemenson, G. D., Gage, F. H. Spontaneous fusion and nonclonal growth of adult neural stem cells. Stem Cells. 25, 871-874 (2007).
  8. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565-4574 (1992).
  9. Freund, J., et al. Emergence of individuality in genetically identical mice. Science. 340, 756-759 (2013).
  10. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (2010).
  11. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J. Vis. Exp. (2009).
  12. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).
  13. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell. Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
  14. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres- re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
  15. Walker, T. L., Turnbull, G. W., Mackay, E. W., Hannan, A. J., Bartlett, P. F. The latent stem cell population is retained in the hippocampus of transgenic Huntington's disease mice but not wild-type mice. PLoS One. 6, (2011).
  16. Walker, T. L., et al. Prolactin stimulates precursor cells in the adult mouse hippocampus. PLoS One. 7, (2012).
  17. Walker, T. L., et al. Latent stem and progenitor cells in the hippocampus are activated by neural excitation. J. Neurosci. 28, 5240-5247 (2008).
  18. Walker, T. L., et al. Prominin-1 allows prospective isolation of neural stem cells from the adult murine hippocampus. J. Neurosci. 33, (2013).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
  20. Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Front. Neurosci. 5, 89 (2011).
  21. Parmar, M., Sjoberg, A., Bjorklund, A., Kokaia, Z. Phenotypic and molecular identity of cells in the adult subventricular zone in vivo and after expansion in vitro. Mol. Cell Neurosci. 24, 741-752 (2003).
  22. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14506-14511 (2002).

Erratum

Formal Correction: Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.

A correction was made to One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.

Protocol section 1.1 was changed from:

At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.

to:

At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 µg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 µg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.

Protocol section 1.3 was changed from:

On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 µg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.

to:

On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.

Protocol section 3.6 was changed from:

Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.

to:

Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 µm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.

Protocol section 3.7 was changed from:

Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.

to:

Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 µl growth medium.

Protocol section 6.2 was changed from:

Add 50 ml Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).

to:

Add 50 µl Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).

Protocol section 6.6 was changed from:

For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.

to:

For subsequent passages, resuspend cells in 200 µl growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.

Protocol section 8.1 was changed from:

Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.

to:

Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 µl/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.

Protocol section 9.1.6 was changed from:

Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.

to:

Remove 10 µl of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.

Protocol section 9.2.2 was changed from:

Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.

to:

Add 100 µl of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.

Protocol section 9.2.5 was changed from:

Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.

to:

Transfer the 200 µl containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.

Figure 1 description was updated from:

Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.

to:

Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 µm.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics