Ischemia / reperfusion में के लिए एक अनॉक्सिता भुखमरी मॉडल

Biology
 

Summary

एक प्रोटोकॉल सी. में अनॉक्सिता / भुखमरी का उपयोग करता है वर्णन किया गया है ischemia / reperfusion मॉडल पर एलिगेंस. कार्यात्मक परिणामों वृद्धि की मृत्यु, GFP लेबल neuronal प्रक्रियाओं में दिखाई असामान्यताएं, और neuronal समारोह की आवश्यकता है कि भ्रष्ट व्यवहार प्रतिक्रियाओं शामिल हैं.

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Queliconi, B. B., Kowaltowski, A. J., Nehrke, K. An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans. J. Vis. Exp. (85), e51231, doi:10.3791/51231 (2014).

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Abstract

आनुवंशिक मॉडल जीव सी एलिगेंस में अनॉक्सिता / भुखमरी के लिए प्रोटोकॉल ischemia / reperfusion अनुकरण. कीड़े जीवाणु भोजन से अलग और अनॉक्सिता के अंतर्गत रखा 20 घंटा (नकली ischemia) के लिए, और बाद में भोजन (नकली reperfusion) के साथ एक सामान्य वातावरण में स्थानांतरित कर रहे हैं. वृद्धि हुई मौत और neuronal नुकसान, और तकनीकों में इस प्रयोगात्मक प्रतिमान परिणाम जीव व्यवहार्यता, स्पर्श न्यूरॉन प्रक्रियाओं की आकृति विज्ञान के लिए परिवर्तन, साथ ही neuronal समारोह के व्यवहार उत्पादन का प्रतिनिधित्व करता है जो स्पर्श संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. अंत में, आम रसोई भंडारण कंटेनरों का उपयोग कर hypoxic इन्क्यूबेटरों के निर्माण के लिए एक विधि का वर्णन किया है. परिवर्तन कस्टम इन्क्यूबेटरों में गैस का मिश्रण करने के लिए किए जाने की, और एक परिसंचारी पानी स्नान दोनों तापमान नियंत्रण के लिए अनुमति देता है और यह आसान लीक की पहचान करने के लिए बनाता है के लिए एक जन प्रवाह नियंत्रण इकाई के अलावा की अनुमति देता है. इस विधि व्यावसायिक रूप से करने के लिए एक कम लागत विकल्प प्रदान करता हैउपलब्ध इकाइयों.

Introduction

एलिगेंस व्यापक रूप ब्रेनर 1 से इसकी शुरूआत के बाद से एक बहुकोशिकीय यूकेरियोटिक मॉडल जीव के रूप में अपनाया गया है कि एक निमेटोड है. यह आनुवंशिक परिवर्तन और प्ररूपी के बीच आसान लिंक 2 परिवर्तन की अनुमति देता है जो एक सस्ता, सरल, और बहुमुखी मॉडल, है.

Ischemia प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में से एक फट 3 उत्पादन किया है और क्षति के अधिकांश होता है जब reperfusion द्वारा पीछा पोषक तत्वों और एक ऊतक को ऑक्सीजन की आपूर्ति की कमी, के द्वारा होती है. 2002 में, सी. में ischemia / reperfusion (आईआर) की एक मॉडल एलिगेंस सामान्य परिस्थितियों में 24 घंटे के द्वारा पीछा लगभग 20 घंटे के लिए अनॉक्सिता, पोषक अभाव और गर्मी तनाव को पूरे कीड़ा प्रस्तुत करने से जुड़े 4 विकसित किया गया था. इस मॉडल को तकनीकी रूप से एक अनॉक्सिता भुखमरी (एएस) है हालांकि हालत, कोशिका मृत्यु reperfusion के दौरान oxidants द्वारा प्रेरित क्षति सहित स्तनधारियों में संरक्षित कर रहे हैं कि तंत्र के माध्यम से होता <समर्थन> 5. के रूप में सी में से प्रेरित इसके अलावा, स्तनधारी आईआर के लिए इसी तरह, नुकसान एलिगेंस इस्कीमिक शर्त 6,7 या संवेदनाहारी शर्त 8,9 से रोका जा सकता है.

नीचे प्रोटोकॉल सी. में आईआर की नकल करने के लिए प्रदर्शन एलिगेंस रूप से होने वाली रूपात्मक और व्यवहार असामान्यताएं स्कोर करने के लिए कैसे, के रूप में मॉडल का उपयोग कर, और कैसे प्रयोग एक कस्टम बनाया, आसानी से निर्माण चैम्बर विकल्प का उपयोग कर एक कम प्रारंभिक निवेश के साथ आयोजित करने की अनुमति देता है कि एक तरह से प्रोटोकॉल अनुकूलन करने के लिए .

Protocol

1. सी. एलिगेंस विकास

  1. मानक खेती विधियों 1 के अनुसार OP50 बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त 35 मिमी निमेटोड विकास मीडिया (एन जी एम) अगर प्लेटों, तैयार करें.
  2. एक वरीयता प्राप्त एन जी एम थाली पर 6 गर्भवती वयस्कों रखकर एलिगेंस सिंक्रनाइज़. ~ 100 अंडे (~ 3 घंटा) निर्धारित किया गया है के बाद वयस्कों निकालें.
  3. कीड़े युवा वयस्क चरण के लिए विकसित किया है और इस प्रयोग के लिए उपयोगी हैं जो होगा बिंदु पर 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए प्लेटें सेते हैं. सी. सिंक्रनाइज़ करने के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल एलिगेंस कहीं 10 से वर्णित हैं.

2. के रूप में के लिए सामग्री

  1. M9 बफर (22 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 42 मिमी ना 2 4 HPO, 86 मिमी NaCl, 1 मिमी MgSO 4) एन 2 के साथ equilibrating द्वारा ऑक्सीजन की purged किया जाना चाहिए प्रयोग करने से पहले 30 मिनट के दौरान (आर्गन भी इस्तेमाल किया जा सकता है) और बर्फ से घिरे रखा.
  2. एक छोटा सा छेद (3 मिमी बनाओ) विस्तृत 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के ढक्कन में जिसमें कीड़े के रूप में रखा जाएगा. इस अत्यधिक मीडिया वाष्पीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में छेद, खुले ढक्कन रखने के बिना गैस आदान प्रदान के लिए अनुमति देता है.

3. अनॉक्सिता / भुखमरी

  1. कम से कम तीन प्रतियों में सभी प्रयोगों का संचालन.
  2. ऊपर वर्णित के रूप में विकसित युवा वयस्क कीड़े युक्त प्रत्येक 35 मिमी प्लेट को आर टी के 1 मिलीलीटर, ऑक्सीजन M9 बफर जोड़ें. (बैक्टीरिया वरीयता प्राप्त नहीं कर रहे थे, जहां किनारों को M9 जोड़) थाली से बैक्टीरिया को दूर करने से बचने के लिए सावधान रहें. ~ 1 मिनट के बाद कीड़े M9 में तैराकी की जानी चाहिए.
  3. Pipetting और एक बाँझ 1% BSA समाधान खदेड़ने से कोट बीएसए के साथ एक 1 एमएल पिपेट टिप.
  4. ध्यान से M9 बफर में कीड़े युक्त थाली झुकाना, यह जोड़ा गया है, जहां एक ही जगह से M9 हटाने, और तैयार microcentrifuge ट्यूबों में निलंबन जगह है. कीड़े ट्यूबों के नीचे गिरा दिया है जब तक बर्फ में आराम करते हैं (~ 1-2 मिनट).
  5. (करीब 100 μl छोड़ने) ट्यूब से कीड़े परेशान बिना संभव M9 की अधिकतम राशि निकालें, ऑक्सीजन पर्ज और ठंडी M9 के 1 मिलीलीटर जोड़ें और कीड़े फिर से नीचे के लिए व्यवस्थित जब तक बर्फ पर ट्यूब जगह. अंतिम चरण 3x दोहराएँ. ~ 100 μl ट्यूब में रहता है जब तक अंतिम धोने में, M9 हटा दें.
  6. (धारा 3.6.2, नीचे निर्देश देखें) एक कस्टम मोहरबंद कंटेनर में, वैकल्पिक रूप से, (नीचे निर्देश, धारा 3.6.1 देखें) या एक anoxic / hypoxic कक्ष के अंदर ऑक्सीजन रहित M9 में कीड़े के साथ ट्यूबों रखें.
    1. एक वाणिज्यिक anoxic / hypoxic कक्ष में इस्तेमाल किया जा रहा है, 3.5 चरण शुरू करने से पहले सदन के अंदर कुछ पर्ज M9 छोड़ और कीड़े कक्ष के अंदर हैं एक बार 3.5 कदम दोहराएँ.
    2. एक कस्टम चैम्बर में इस्तेमाल किया जा रहा है, एक कम लागत के उपकरण बनाने के लिए की एक विस्तृत विवरण इस प्रोटोकॉल के अंत में प्रस्तुत किया है और पहले 11 अन्य समूह द्वारा वर्णित किया गया है. संक्षेप में: एक 250 मिलीलीटर Tupperware प्रकार कंटेनर ढक्कन में दो छेद बनाओ और उन्हें ट्यूब कनेक्टर्स जोड़ने. एक अन्य एक पानी के स्नान में गैस बाहर निकलने के लिए किया जाएगा, जबकि गैस मिश्रण इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    3. चेंबर में कीड़े प्लेस और ढक्कन का उपयोग चैम्बर सील.
    4. एक निरंतर एन 2 प्रवाह (100 मिलीग्राम / मिनट) के साथ गैस.
    5. 26 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान के अंदर कंटेनर रखें कोई लीक (चैम्बर से ही उत्पन्न होने वाली बुलबुले से स्पष्ट) प्रणाली में कर रहे हैं कि और कोई हवा रिटर्न तो बाहर निकलने के नलकूप पानी में डूब जाता है कि सुनिश्चित करें.
  • 20 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े सेते हैं.
  • 4. नकली Reperfusion

    1. के रूप में शर्तों के तहत 20 घंटे के बाद कमरे में हवा में ऊष्मायन कक्ष से ट्यूबों निकालें.
    2. पिपेट सी. एक OP50 पर (3.3 कदम के रूप में) एक बीएसए लिपटे टिप के साथ एलिगेंस 35 मिमी एन जी एम प्लेट वरीयता प्राप्त. 24 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं.इस के बाद, कीड़े रन बनने के लिए तैयार हो जाएगा.

    5. लाइव कीड़े बनाम मृत पहचान

    1. एक प्लेटिनम लेने का उपयोग करना, हल्के से कृमि के सिर के ऊपर से स्पर्श. लाइव कीड़े छुआ जा रहा है के बाद पीछे की ओर कदम होगा. कीड़े nonresponsive हैं, मृत के रूप में स्कोर. कभी कभी, एक कीड़ा पीछे की ओर कदम नहीं होगा, लेकिन एक मामूली पक्ष की ओर सिर आंदोलन प्रदर्शन कर सकते हैं. तकनीकी रूप से मृत नहीं है, इन कीड़े घंटे के भीतर समाप्त करने के लिए लगभग कुछ कर रहे हैं, और मृत के रूप में रन बनाए जाना चाहिए. एक कीड़े स्कोर करने के लिए भी लंबे समय से इंतजार कर रहा है, तो संतान के आंतरिक अंडे सेने हो सकता है और इन "बैग के कीड़े" बहुत मुश्किल शवों का पता लगाने, जिससे टूटना कर सकते हैं.
    2. वे डुप्लिकेट मायने रखता बचने के लिए गिने जाते हैं के रूप में थाली से दोनों रहते हैं और मृत कीड़े निकालें. लाइव कीड़े व्यवहार assays प्रदर्शन करने के लिए एक अलग प्लेट में ले जाया जा सकता है. कुल के सापेक्ष रहने वाले कीड़े की राशि जीवित कीड़े का% का प्रतिनिधित्व किया है (चित्रा 1 ए

    6. रिस्पांस परख टच

    1. इस प्रोटोकॉल का एक विस्तृत वर्णन हार्ट, ऐनी सी., एड में प्रस्तुत किया गया है. व्यवहार (3 जुलाई 2006), WormBook, एड. सी. एलिगेंस अनुसंधान समुदाय, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
      1. स्पर्श प्रतिक्रिया के लिए स्कोर करने के लिए, चलती है और हल्के से एक बरौनी पिकअप (चित्रा 3) के साथ (ग्रसनी के मध्य भाग के पास) कृमि के सिर के पक्ष स्पर्श कर रहे हैं कि कीड़े की पहचान.
      2. कीड़ा पिछड़े चलता है, के रूप में उत्तरदायी स्कोर, अगर नहीं, (चित्रा 1 बी) के रूप में nonresponsive स्कोर. 10 सेकंड के अंतराल के साथ प्रत्येक कीड़ा के लिए यह कदम 10-15x दोहराएँ. सटीक डाटा के लिए प्रत्येक समूह में कम से कम 10 कीड़े जांच. एक ही परख पीछे शरीर दीवार के लिए हल्के स्पर्श निम्नलिखित आगे locomotory परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह एक अलग व्यवहार को बढ़ावा देने के बाद से, कृमि के सिर या पूंछ को छूने के लिए नहीं भूलें.
      3. अंत में, मेंकॉर्पोरेट आनुवंशिक नियंत्रण उपभेदों [नकारात्मक के लिए सकारात्मक, MEC (mechanosensory) उत्परिवर्ती के लिए N2 ब्रिस्टल जंगली प्रकार - जैसे CB1338 MEC-3 (e1338) चतुर्थ] कीड़े को छूने के लिए बल के साथ जो जांच करने के लिए. एक उत्तेजना की बहुत कठोर बहुत कम wildtype एन 2 नियंत्रण में एक प्रभाव प्रकाश में लाना नहीं होगा, MEC म्यूटेंट में एक व्यवहार प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना होगा.

    7. Neuronal संशोधन

    1. , Neuronal संशोधनों के रूप में पद कल्पना स्पर्श जवाब MEC न्यूरॉन्स 4,5 में GFP व्यक्त जो एक तनाव का उपयोग करें. इन न्यूरॉन्स शरीर दीवार के साथ चलाने के लिए और आसानी से रूपात्मक असामान्यताओं के लिए अंक दिए जाते हैं लंबी प्रक्रिया है. इसके अलावा, शब्द के भागों जानकारी ऊपर वर्णित है, neuronal समारोह के व्यवहार उपायों के साथ एकीकृत किया जा सकता है. इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक तनाव सी. से उपलब्ध है जो TU2583 है एलिगेंस जेनेटिक्स सेंटर और fro GFP व्यक्त uIs25 एकीकृत transgene शामिलएक एकीकृत MEC-3 :: GFP संलयन होता है जो MEC-18 प्रमोटर, या वैकल्पिक रूप से TU2562, एम.
    2. एक agarose पैड तैयार करें.
      1. पानी में, एक 10x स्टॉक के साथ M9 1x को लाने, और 70 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को बनाए रखने agarose 2% पिघला
      2. उनके नीचे की ओर पर टेप का एक टुकड़ा है, जिनमें से प्रत्येक दो अन्य स्लाइड्स के बीच रखा गया है कि एक गिलास स्लाइड (x 75 मिमी 25 मिमी) पर इस समाधान की एक बूंद (~ 20 μl) रखें.
      3. 2% agarose समाधान के शीर्ष पर पहला सीधा करने के लिए एक अंतिम गिलास स्लाइड प्लेस, और यह आरटी पर शांत करते हैं. इस टेप की मोटाई है कि एक पैड फार्म चाहिए.
      4. शीर्ष स्लाइड निकालें और कीड़े स्थिर करना होगा जो 0.1% tetramisole युक्त M9 के 10 μl, जोड़ें.
    3. 2% agarose स्लाइड पर कीड़े रहते कुछ (~ 10) चाल. उन पर एक coverslip जगह और उचित रोशनी के साथ एक 100X उद्देश्य के तहत एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग GFP कल्पना.
    4. क्षतिग्रस्तन्यूरॉन्स प्रक्रियाओं (चित्रा 2 बी) को तोड़ा जा दिखाई देते हैं जहां एक साइटोसोलिक झिल्ली कई बुंदकी (2A चित्रा) के शामिल प्रक्रियाओं में मोती पैटर्न की स्ट्रिंग,, और / या असामान्यताएं दिखाएगा. कम से कम 10 कीड़े की कुल का उपयोग कर, प्रत्येक कीड़ा के लिए दोनों न्यूरॉन्स में बिंदी और असामान्यताएं गणना.

    8. लैब बनाया Hypoxic चैंबर

    1. एक Tupperware शैली, sealable, कंटेनर एक anoxic कक्ष पुराना वापस किया जा सकता है. संभव के रूप में छोटे रूप में है कि एक कंटेनर का चयन करने के लिए ध्यान रखना. एक छोटे कंटेनर तेजी से एक hypoxic वातावरण बनाता है और (चित्रा 4) नहाने के पानी में फिट करने के लिए आसान है.
    2. ढक्कन पर दो छेद (एक शराबी के साथ या संदंश हीटिंग और ढक्कन में मजबूर किया जा सकता है) और ट्यूबिंग (चित्रा 5A) हो गया है कि एक प्लास्टिक या धातु कनेक्टर डालें. पानी के नीचे रखा जा सकता है कि गोंद का उपयोग, और भी आंदोलन का परहेज, सुखाने के बाद मुश्किल हो जाता हैकनेक्टर और इसलिए रिसाव की संभावना (चित्रा 5 ब) को कम करने.
    3. यह (चित्रा 4) पूरी तरह से जलमग्न है कि इतनी कंटेनर पानी के स्नान में रखा जाना चाहिए. कंटेनर को विसर्जित करने के लिए, एक बोतल वजन या एक डाइविंग वजन का उपयोग करें.
    4. ट्यूब कनेक्शनों में से एक एक गैस का मिश्रण पेश करने और अन्य ट्यूब कंटेनर बाहरी वातावरण (चित्रा 4) से सील बंद किया जाता है तो यह है कि इसलिए यह पानी के नीचे छोड़ दिया जाना चाहिए, एक दबाव राहत के रूप में कार्य करेगा इस्तेमाल किया जाएगा.
    5. हवा रचना कस्टम मेड गैस, जन प्रवाह नियंत्रकों या वांछित गैसों घोला जा सकता है कि किसी भी उपकरण का उपयोग कर संग्राहक किया जा सकता है. उच्च प्रवाह अत्यधिक वाष्पीकरण बना सकते हैं के रूप में गैस का प्रवाह नियंत्रित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, एक 250 मिलीलीटर कंटेनर में, गैस की 100 मिलीग्राम / मिनट कीड़े के लिए अच्छा स्थान है और एक उपयुक्त प्रवाह प्रदान करेगा.
    6. वे गैस, एक के लिए प्रवेश के योग्य हो सकता है के रूप में टयूबिंग की लंबाई, कम से कम रखा जाना चाहिएllowing के ओ 2 का प्रवेश द्वार. इन सामग्रियों गैस विनिमय पारगम्य हैं के रूप में यह सिलिकॉन का उपयोग कर से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, Tygon ट्यूबों. हम polypropylene या नायलॉन ट्यूब पसंद करते हैं. ग्लास या धातु ट्यूबिंग अच्छी तरह गैसों को बनाए रखने, लेकिन यह भी साथ काम करने के लिए कठिन हैं.

    Representative Results

    सी. Subjecting एक कस्टम प्रयोगशाला बनाया ऊष्मायन कक्ष में के रूप में 26 डिग्री सेल्सियस के 20 घंटे के लिए एलिगेंस वर्णित (धारा 3.6.2) महत्वपूर्ण मृत्यु दर (चित्रा 1 ए) के परिणामस्वरूप के रूप में 5. बचे के GFP लेबल neuronal प्रक्रियाओं में बिंदी और टूट के बाद फ्लोरोसेंट इमेजिंग रूपात्मक असामान्यताएं की उपस्थिति (चित्रा 2) की पुष्टि की. बचे भी प्रकाश शरीर दीवार स्पर्श (चित्रा 1 बी) को खराब प्रतिक्रिया व्यक्त की. इस मॉडल आनुवंशिक गड़बड़ी, दवा हस्तक्षेप, और चयापचय plasticity के रूप में निर्भर परिणामों 4-6,8,9,12,13 कैसे प्रभावित करता है अध्ययन करने के लिए कई समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया है.

    चित्रा 1
    चित्रा 1. सी. एलिगेंस अस्तित्व और स्पर्श प्रतिक्रिया के बाद24 घंटा बाद के रूप में अस्तित्व है कि प्रदर्शन के कीड़े के रूप में. ए) प्रतिशत. एन 2 तनाव जंगली प्रकार आनुवंशिक पृष्ठभूमि है, और KWN85 सी. रहने की उत्तेजनाओं को छूने के लिए GFP. बी के साथ MEC न्यूरॉन्स लेबल है कि एक एकीकृत transgene) प्रतिक्रिया शामिल के रूप में के बाद एलिगेंस (एन 2 तनाव). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. ऐसे कपटपूर्ण प्रक्रियाओं और विराम (ए) या ​​प्रक्रियाओं (बी) में GFP समुच्चय के संचय के रूप में के बाद न्यूरॉन संशोधनों को स्पर्श करें. टच न्यूरॉन (PLML और PLMR) असामान्यताएं जीवित में निगरानी की गई सी. anesthetized eleg उत्तर: के रूप में करने के बाद.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. बरौनी लेने. एक इकट्ठे बरौनी लेने. इनसेट में, बरौनी के एक विस्तार दन्तखुदनी लकड़ी से चिपके.

    चित्रा 4
    चित्रा 4. लैब बनाया नहाने के पानी के अंदर hypoxic चैंबर. प्रयोग शुरू करने के लिए तैयार एक बंद कंटेनर. तीर गैस प्रवेश और निकास और फ्लोटिंग से रखने के लिए इस्तेमाल किया बोतल वजन से संकेत मिलता है.

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    चित्रा 5. कंटेनर ढक्कन का आंतरिक और बाहरी पक्ष का विवरण. पहले किए गए छेद से जुड़ी ट्यूब कनेक्टर का संकेत पहले किए गए छेद. बी) कंटेनर ढक्कन के बाहरी तरफ से जुड़ी ट्यूब और उसके कनेक्टर का संकेत कंटेनर ढक्कन का एक) बाहरी ओर,.

    Discussion

    व्यापक रूप से सी. में इस्तेमाल किया गया है आईआर चोट मॉडल को एलिगेंस. कुछ प्रमुख बिंदु इस प्रोटोकॉल के लिए प्रकाश डाला जाना चाहिए: एलिगेंस इस प्रणाली का उपयोग कर मौत को प्राप्त करने के लिए 3 सहवर्ती अपमान (गर्मी, भुखमरी और अनॉक्सिता) के लिए की जरूरत को न्यायोचित ठहरा, चोटों की एक विस्तृत सरणी के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. अकेले अनॉक्सिता समय 14 की इस विंडो में कीड़े मार नहीं है. इसके अलावा, तापमान में वृद्धि एक अतिरिक्त तनाव है, तो यह बारीकी से नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है. सच पूछिये तो, भुखमरी से प्रति, 7 मनाया मृत्यु दर की डिग्री करने के लिए काफी योगदान नहीं है, लेकिन यह प्रयोगात्मक प्रतिकृति के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए प्रकट होता है. दिन के लिए दिन से महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता हो सकता है कि यह देखते हुए, यह नमूने समानांतर में सीधे चला तुलना करने के लिए, और कई दिनों से अधिक प्रयोगों को दोहराने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. सामान्य में, परिणामों 50-100 कीड़े के तीन अलग प्लेटों / प्रयोगात्मक हालत के लिए मापा और इन कर रहे हैंn औसत और एक भी प्रयोगात्मक दोहराने के रूप में माना जाता है. आम तौर पर, सात और नौ के बीच प्रतिकृति को प्राप्त करने या सांख्यिकीय महत्व से इनकार करने के लिए पर्याप्त होना दिखाई देते हैं.

    प्रयोग में इस्तेमाल कीड़े की विकास मंच भी क्षति काफी 15,16 भिन्न होता है के रूप में ध्यान करने के लिए विभिन्न चरणों की संवेदनशीलता के रूप में नजर रखी जा करने की जरूरत है. युवा वयस्कों के उपयोग के मानक है, और लार्वा चरण (L3 और L4) कीड़े के रूप में (अप्रकाशित डेटा) के हानिकारक प्रभावों के लिए प्रतिरोधी हो दिखाई देते हैं.

    इस प्रोटोकॉल प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए दो तरीके हैं, एक वाणिज्यिक hypoxic कक्ष 4,6 का उपयोग और अन्य (Tupperware प्रकार के कंटेनर और गैस इनपुट 11 का प्रयोग करके) एक प्रयोगशाला में किए गए उपकरण का उपयोग कर एक प्रस्तुत करता है. कहीं 13,17 वर्णित के रूप में अनॉक्सिता, ऑक्सीजन की खपत है कि अन्य तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है. एक hypoxic माहौल बनाने के लिए वैकल्पिक तकनीक का उपयोग आवश्यक के रूप में ऊष्मायन समय बदल सकते हैंमौत के वांछित राशि बनाने के लिए. 80% के रूप में के हानिकारक प्रभाव को बढ़ा कि हस्तक्षेप के लिए इसी प्रकार आदर्श है, जबकि ~ 20% अस्तित्व का लक्ष्य निर्धारण, सुरक्षात्मक उपायों के अध्ययन के लिए एक आदर्श आरंभ बिंदु है. एक अन्य महत्वपूर्ण चेतावनी जिस पर पर्यवेक्षक के स्कोर जीवित / मृत कीड़े समय है. विश्लेषण के लिए समय 24 घंटा आगे बढ़ाया जाता है तो मृत कीड़े की पहचान करने के लिए तेजी से मुश्किल हो, के बाद से डेटा को गुमराह किया जा सकता है. इस वजह से कीड़ा शवों समय के साथ अपेक्षाकृत पारदर्शी बनने के लिए हो सकता है, लेकिन यह भी निषेचित भ्रूण शवों के अंदर संतान पोस्टमार्टम में विकसित और वे उभरने के रूप में उन्हें बाधित कर सकते हैं तथ्य यह है कि हो सकता है.

    neuronal आकारिकी का विश्लेषण प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न 18, नाभिकीय विखंडन 4 और उचित आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग मार्कर व्यक्त करता है कि एक कीड़ा तनाव प्रतिस्थापन से अन्य मापदंडों 19 को देखने के लिए संशोधित किया जा सकता है. एक अंतिम चेतावनी है कि के दृश्यneuronal प्रक्रियाओं स्लाइड पर कीड़े रखने के बाद कम से कम 30 मिनट किया जाना चाहिए. अब समय के रूप में स्वतंत्र क्षति प्रदर्शन कर सकते हैं के लिए पशु स्लाइड पर संज्ञाहरण के तहत रखा. उन्हें ट्रैक और विश्लेषण की जरूरत समय के अनुसार स्लाइड प्रति जानवरों की राशि को समायोजित करें.

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

    Acknowledgments

    आंकड़े 1 और 2 में पहले फ्री रेडिकल बायोलॉजी एंड मेडिसिन (Queliconi एट अल. 5) में प्रकाशित और Elsevier द्वारा आयोजित कॉपीराइट रहे थे. इस काम के द्वारा समर्थित किया गया Fundação डे Amparo à Pesquisa एस्टाडो डी साओ पाउलो (FAPESP), Instituto Nacional डी Ciencia ई Tecnologia डे Processos रिडॉक्स उन्हें Biomedicina, Pesquisa डे Processos रिडॉक्स उन्हें Biomedicina, USPHS NS064945 (कर्नाटक) एक Nucleo डे Apoio, और USPHS GM087483 (के.एन. करना ). BBQ एक FAPESP फैलोशिप द्वारा समर्थित एक डॉक्टरेट की छात्रा है.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    N2  strain CGC Wild type strain.

    http://www.cbs.umn.edu/CGC/

    TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP) CGC TU2583 integrated fluorescent transgene used to label touch neurons.

    http://www.cbs.umn.edu/CGC/

    CB1338 mec-3 (e1338)IV CGC CB1338 canonical mec-3 mutant that is touch insensitive.

    http://www.cbs.umn.edu/CGC/

    Microcentrifuge Tube Eppendorf 0030 120.086
    Nikon Eclipse TE2000-U Microscope  Nikon USA TE2000-U
    Low Temperature Incubator Sheldon Manufacturing Inc. Model 2005
    Eyelash Pick An eyelash pick can be prepared by attaching  an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3).
    Hypoxic Chamber Coy 8307030 Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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