ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

עבודה זו מתארת ​​את שיטה חדשה למיקוד סלקטיבי אברונים subcellular בצמחים, assayed באמצעות BioRad ג'ין האקדח.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mattozzi, M. D., Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C. Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun. J. Vis. Exp. (86), e51234, doi:10.3791/51234 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

על מנת למקד את החלבון יחיד לאברונים subcellular מרובים, צמחים בדרך כלל לשכפל את הגנים הרלוונטיים, ולהביע את כל גן בנפרד באמצעות אסטרטגיות רגולציה מורכבות כולל יזמים ההפרש ו / או רצפי אות. מהנדסי חילוף חומרים וביולוגים סינטטיים מעוניינים במיקוד אנזימים לאברון בפרט מתמודדים עם אתגר: לחלבון שהוא להיות מקומי כדי אברון יותר מפעם אחת, המהנדס חייב לשכפל אותו הגן מספר פעמים. עבודה זו מציגה פתרון לאסטרטגיה זו: רתימת שחבור חלופי של mRNA. טכנולוגיה זו מנצלת הכלורופלסט הוקם ורצפי peroxisome מיקוד ומשלבת אותם לתוך mRNA יחיד שאיחה לחלופין. גרסאות אחוי חלקם נשלחו להכלורופלסט, כמה לperoxisome, וחלק לcytosol. הנה המערכת מיועדת למרובה אברון מיקוד עם שחבור חלופי. בעבודה זו, היה צפוי GFP להיות expressed בהכלורופלסט, cytosol, וperoxisome על ידי סדרה של 5 תגי mRNA 'נועדו באופן רציונלי. יש תגים אלה את הפוטנציאל להפחית את כמות הדרושה בעת שיבוט גנים Heterologous צריכים לבוא לידי ביטוי באברונים subcellular מרובים. המבנים עוצבו בעבודה קודמת 11, והיו משובטים באמצעות ההרכבה גיבסון, שיטת שיבוט עצמאית קשירה שאינו דורשת אנזימי הגבלה. פלסמידים התוצאה הוכנסו לתוך תאי עלה אפידרמיס ניקוטיאנה benthamiana עם פרוטוקול ג'ין אקדח שונה. לבסוף, עלים הפכו נצפו עם מיקרוסקופיה confocal.

Introduction

עבודה זו היא פרויקט הנדסי / ביולוגיה סינתטית מטבולים שבי תאי צמח שהונדסו חלבון כתב באברונים מרובים אבל עם רק לבנות DNA בודד.

גישה אחת כדי למקד את החלבונים למיקום אחד או יותר כרוכה בעותקים מרובים שיבוט גנטיים, המכיל פפטיד לוקליזציה שונה. כל עותק חייב להיות מוצג על ידי retransformation רצוף, או לחלופין, על ידי backcrossing התמרות אחת 1. זה כרוך בשיבוט נוסף, והוא מוגבל על ידי תג לוקליזציה אחד לתחנה סופית.

דרך נוספת בתרגום חלבון למקומות רבים היא באמצעות שחבור חלופי 2-5. RNA הוא עיבד מגן יחיד, אך עותקים שונים של התמליל מעובדים בצורה שונה, לעתים קרובות בצורה יותר מפעם אחת לכל תא. זה יכול לגרום לRNA שליח יותר מפעם אחת בתא עיבד מגן יחיד. Messenge שונה אלהRNAs r יכול לקודד לisoforms שונה של אותו החלבון, או במקרה של frameshift, חלבון אחר לגמרי. למרות ששחבור חלופי כבר תואר בספרות במשך שנים רבות, את מנגנוני פעולה ותורמים שימור אתרים ואחוי קולט הם רק שהובהרו לאחרונה 6. האתרים אלה נמצאים בתארו טובים יותר, הם נפתחים הזדמנויות להנדסה.

מהנדסים מטבולי צמח מתמודדים עם אתגר כשלבטא חלבון באברונים מרובים. לחלבון שהוא להיות מקומי כדי אברון יותר מפעם אחת, המהנדס חייב לשכפל אותו הגן מספר רב של פעמים, כל אחד עם רצף אות נפרד לכוון אותו לאברון של עניין. לגן יחיד בשלושה אברונים, זה פשוט שלושה גנים. אבל למסלול מטבולים של שישה גנים, זה מתרחב ל18 גנים, מאמץ שיבוט משמעותי. שילוב של רצפי לוקליזציה מרובים לתוך סימן יחיד, לחלופין-איחה גןificantly מפחית את המאמץ הזה. לדוגמא, photorespiration הנדסה מחדש 7,8 וסינתזת isoprenoid 9,10 כרוך הן כלורופלסטים וperoxisomes. במקרה שלנו לקחנו את היתרון של אתרי אחוי כפי שנצפה במערכת thaliana ארבידופסיס טבעית שתואר לעיל 6. אנחנו באופן רציונלי מחדש את רצף ה-mRNA עוזב את אתרי אחו הטבעיים בלבד, אלא להציב רצפים שמקודדים הכלורופלסט או תגי מיקוד peroxisome בתוך אינטרונים לחלופין-איחו (איור 1). החלבון לידי ביטוי עשוי או לא עשוי להיות תג, תלוי אם מראש mRNA שמקודד אותו היה נכרת כאינטרון (1G דמויות ו1H). לקבלת מידע נוסף על העיצוב של המבנים שהוצגו בעבודה זו, עיין במאמר הנלווה 11.

בגלל זה הוא עדיין מאמץ משמעותי שיבוט, הרכבה גיבסון, שיטה חדשה לשיבוט בונה DNA, הוא used בבנייה. שיטת גיבסון יכולה לשמש לכל רצף, ללא קשר לאתרי הגבלה (איור 2) 12-14. התערובת הספציפית של אנזימים מאפשרת לצעד אחד, הרכבה בידוד תרמית. בשיטה זו, מספר חלקי DNA ליניארי פעמיים תקועים הם תוכננו כך שיש להם רצפים חופפים של ~ 50 נ"ב. תערובת אנזים ההרכבה גיבסון באופן חלקי מעכלת את חלקי DNA ליניארי, חושף גדילים בודדים של רצפים הומולוגיים. רצפים חד גדילים החלקיים אלה מחדש annealed בתערובת התגובה, וכתוצאה מצעד אחד,, תגובה מהירה, רצף עצמאי ללא קשירה subcloning.

עבודה זו מתארת ​​1) מבני שחבור לחלופין תכנון רציונלים לביטוי בכלורופלסטים צמח, peroxisomes, וcytosols, 2) השיבוט שלהם תוך שימוש בשיטה ללא קשירה החדשה של ההרכבה גיבסון, 3) המשלוח שלהם לתאים עלה טבק עם אקדח הגן, ו 4) תוצאות מראים מיקוד אברון, כפי שנצפה עם ה-GFPומיקרוסקופיה confocal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. עיצוב של רצפים לחלופין-איחו לאברון מרובה מיקוד

  1. לקבוע את האתרים לביטוי חלבון סופי. לעבודה זו, העניין הוא במיקוד הכלורופלסט, peroxisome, וcytosol.
  2. השתמש בספרות כדי לזהות רצפי חלבונים ו-DNA הידועים למקד חלבונים לאברונים של עניין. במקרה זה הכלורופלסט מיקוד רצף מmethyltransferase L-isoaspartate thaliana ארבידופסיס 6,15, וperoxisome מיקוד רצף מthaliana ארבידופסיס synthase S-אלנטואין כמו transthyretin-16,17 נקבע.
  3. זהה את משטר שחבור-חלופי שצריך למקד את החלבונים המעניינים את האברונים הנכונים. עבור עבודה זו, אחוי אתרים כפי שנצפה במערכת ארבידופסיס טבעית 6. רצף ה-mRNA מחדש עוזב את אתרי אחוי הטבעיים, אבל רצפים הונחו peroxis הכלורופלסט או קידודשת מיקוד תגים בתוך אינטרונים לחלופין-איחו (איור 1).

2. עצרת גיבסון של חלקי DNA

ראה גם איור 2.

שיטת ההרכבה גיבסון תלויה בפעולה של אנזימים שונים בתמהיל שהוכן מראש, ל1) בחלקו לעכל את הקצוות של גדילי הדנ"א של פעמיים כדי להפוך את הגדילים יחיד ו2) זוגות בסיסים חינם לחשל שכני חלקי DNA. זה מאפשר לשיבוט של שברי DNA ללא מגבלות של אתרי הגבלה.

  1. בחר על מנת שהאלמנטים במבנה פלסמיד דנ"א. כדוגמא יש TriTag-1 אלמנטים של: א) וקטור פלסמיד (נקבובית, המכיל מבנה GFP הידוע לעבודה במפעלים, סמן התנגדות kanamycin, ומקורותיה של שכפול ל, E. coli ו Agrobacterium tumefaciens מארחים) ב) רצף אמרגן, (P ENTCUP2, הוצג להיות מכוננים בצמחים), ג) הכלורופלסט מיקוד רצף (CTS), ג) peroxisome סדרה של אתרי אחוי כפי שתואר לעיל 6 מיקוד רצף (PTS), וד).
  2. לעצב את הבסיס לבסיס המבנה עם בתוכנות עיצוב סיליקו. הקוף הוא חבילת תוכנה חופשית בקוד פתוח שימושית עבור עבודה זו.
    הערה: TriTag-1, יש לו את הסדר: וקטור פלסמיד, אמרגן, ATG, אתר אחוי תורם, רצף יעד הכלורופלסט, אתר תורם אחוי, באתר ניטראלי, אתר acceptor אחוי, רצף יעד peroxisome, אתר acceptor אחוי, ה-GFP ככלול בוקטור פלסמיד .
    1. עיצוב בסיליקון ומבנה ה-DNA כזה שיש חפיפה 50 BP-בין כל חתיכה בעת הזמנת פריימרים עבור ה-PCR. אפשר להשתמש בחפיפת 50 נ"ב כפריימרים: 25 נקודות בסיס לכל כיוון.
      1. הקפד לעקוב אחר מקורו של כל אחד מהחלקים ברצף. האם זה כמו: פלסמיד להיות מבוגרים וminiprepped; רצף ליניארי שניתן להשתמש בו כתבנית PCR; או רצף שצריך להיותמסונתז באופן מסחרי? מספר חברות מציעות שירותי סינתזת דנ"א בעלות נמוכה עבור ברים <500 נ"ב. במקרה זה, TriTag עצמו הוא 437 נ"ב אז זה היה יתרון להזמין אותו באופן מסחרי.
      2. התוצאות הטובות ביותר תגיע אם כל המקטעים הנן PCR מוגברים ומטוהרים מתבנית ה-DNA שלהם. סמן ההתנגדות הוא מקום טוב כדי לחלק את ה-DNA הזה הגדול לשתי תבניות קטנות יותר, כי הם יותר בקלות מוגברת-PCR.
      3. אנזים הגבלת הגבלת DpnI חותך DNA מפוגל. אם תבנית PCR הייתה miniprep מE. coli, טיפול DpnI יסיר את תבנית ה-DNA המזהמת.
  3. לטהר את כל רצפי DNA בנפרד וelute במים, TE או הצפת EB.
    1. חלק וקטור נקבובית 1, ~ 3,000 BP (חיצים ירוקים). PCR מוגבר וDpnI טופל.
    2. וקטור נקבובית חלק 2, ~ 3,000 BP (חיצים שחורים). PCR מוגבר וDpnI טופל.
    3. TriTag להוסיף, 437 נ"ב (חיצים כחולים). הזמין באופן מסחרי. Resuspend בDDH 2 O.
    4. אמרגן ENTCUP P, ~ 750 נ"ב (חצים כתומים). PCR מוגבר וDpnI טופל.
  4. מדוד את הריכוזים של כל אחד מחלקי ה-DNA. לשאוף 150 ng / μl של חתיכות הווקטור.
  5. קח aliquot של תמהיל ההרכבה גיבסון מהמקפיא ולהפשיר על קרח. זה זמין מסחרי, אלא גם פשוט לעשות במעבדה של 12-14.
    1. ישנם שני שלבים למתכון הזה: תערובת צמיגה 5x אב ו15 aliquots 1.33x תגובה בגודל μl. מיקס מאסטר 5x מכיל: 3 מיליליטר 1 M טריס-HCl pH 7.5, 300 μl 1 M MgCl 2, 600 μl 10 מ"מ של כל dNTP, 300 μl 1 M DTT, 1.5 גרם PEG-8000, 20 NAD מ"ג, וDDH 2 O ל 6 מיליליטר. הכן 320 aliquots μl (18) ולהקפיא את כולם מלבד אחד ב -20 ° C. הפתרון יהיה די צמיג. תווית "חיץ איזותרמה 5X" אלה
    2. לאחד שנותר (320 μl), להוסיף 1.2 μl T5 exonuclease, 20 μl Phusion גבוהה FIDelity DNA פולימראז, 160 תקי DNA אנזים μl וDDH μl 700 2 O. הכן 15 aliquots μl (~ 80) על קרח בצינורות PCR ולאחסן ב -20 ° C.
  6. לקבוע כרכים בסכומים equimolar של כל אחד מהקטעים. יש כמה מחשבונים באינטרנט, ובכלל זה Gibthon.org. לא צריך להיות בסך הכל 5 μl של כל חתיכות ה-DNA. הוסף אותם לμl 15 גיבסון לערבב aliquot. אם זה דורש נפחים קטנים מדי לפיפטה, לדלל את שברי DNA ו / או להשתמש aliquot יותר מאחד.
    1. אל תשכח להכין את שליטה של ה-DNA הווקטור בלבד (למשל חלק DNA המכיל את סמן עמידות לאנטיביוטיקה) ומרכיב את עוצמת הקול עם מים.
  7. דגירה הצינורות בCycler תרמית בC ° 50-55 ל30-60 דקות. החלף על קרח ולהפוך לE. coli באמצעות תאים כימיים המוסמכים חום הלם. אין להשתמש בתאי electrocompetent. ריכוז מלח הגבוה וריכוז ה-DNA הנמוך יחסיתעלול לגרום לתאים לקשת.
    1. החלתי את כל 20 μl להכנה מסחרית של 200 סידן כלוריד μl E. המוסמך coli.
      לדגור על קרח 30 דקות ושניות 60 הלם חום על 42 מעלות צלזיוס
    2. חזור לקרח 2 דקות, להחיל SOC μl 750 או מדיום LB ולשחזר רועדים בדקות 30 צינור microcentrifuge ב 37 ° C. פלייט את התערובת ודילולים מתאימים בLB + קאן (או אנטיביוטיקה מתאימה אחרת). הדבר עלול לגרום ברקע גבוה יותר (ומספר גבוה יותר של אירועי רקומבינציה יעד הלא) מאשר שיבוט מבוסס קשירה מסורתי אבל כדאי להקרין על 10 מושבות.
  8. לאשר שיבוט באמצעות רצף ולאחסן aliquot ב -80 ° C

3. Biolistic Transfection של טבק עם אקדח הגן

זוהי טכניקה שהיא הוקמה בשנת יופיטר 18,19. שלבים עיקריים והבדלים מתוארים להלן.

  1. לגדול 50-100 מיליליטר E. שיתוףli או 200 מיליליטר Agrobacterium. תרבות prep-מקסי. ריכוז של כ -1,500 ng / μl נדרש כדי להמשיך.
  2. הכן כדורי אקדח גן כפי שתואר לעיל. לטעון אותם לתוך אקדח הגן.
  3. עבור transfection של רקמת אפידרמיס עלה ניקוטיאנה benthamiana טבק, לבחור עלה גדול קרוב לבסיס של מפעל ישן של 3 חודשים. בזהירות לחתוך אותו ולמקם אותו בצד תחתון על מגבות נייר רטובות בצלחת פטרי 15 סנטימטר.
  4. הגדר את הלחץ הוא לאקדח הגן ל200-250 psi.
  5. בזהירות לכוון אקדח הגן בין צלעות בצד התחתון של עלה, כ 3-5 סנטימטר מעליו. שחרר את הבטיחות ולספק את החלקיקים לעלה. כל כדור ניתן להשתמש פעמיים באותו המקום על העלה. אם מתפוצץ העלה, לבטל ולהתחיל חדש עלים יש קצת שונות בקשיחות עלים בשל תנאי גידול, כגון גיל, לחות, וכו 'לקבלת עלה 12-סנטימטר, מצפים שיתאימו לכ 6 יריות.
  6. אחסן את העלה, מכוסה בחלקו העליון שלצלחת פטרי ל2-3 ימים באור נמוך על הספסל.
  7. בחן את העלה במיקרוסקופ לנתח מצויד בקרינת UV, ולחפש את תאים בודדים להביע GFP. לנתח 5-10 חלקי מ"מ של עלה.
  8. להטביע את העלים בשקופית מיקרוסקופ גם עמוק מתחת ~ 200 μl 0.1% טריטון X-100. חומר הניקוי מסייע במניעת בועות אוויר מלהרכיב על פני השטח, ושקופיות מיקרוסקופ גם עמוקות מאפשרת לאזור הדמיה רקמות גדול יותר.

4. מיקרוסקופיה confocal של רקמות transfected

הנחיות אלו משתנות בהתאם לכל מכשיר, ולכן זה חיוני כדי לקבל הכשרה כמו שצריך.

  1. לניסויי גילוי הקרינה, הגדר את עירור הלייזר ל489 ננומטר, ולהגדיר את הגלאים מכפיל ל500-569 ננומטר לקרינת ה-GFP ו630-700 ננומטר auto-הקרינה כלורופיל. תאי תמונה באמצעות מטרת מים טבילת 40X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מאמץ העיצוב היה תוצאה של תכנון משמעותי. רומן לפרויקט זה הוא השימוש בשחבור חלופי כדי ליצור מראש mRNA שמתורגם לחלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. חלבונים אלה באים לידי ביטוי באברונים שונים, במקרה זה הכלורופלסט, peroxisome ו / או cytosol. מתאמנים גן ארבידופסיס טבעי שאיחה 6 לחלופין, והניח ידוע הכלורופלסט 6 וperoxisome 17 מיקוד רצפים באקסונים חלופיים (TriTag-1 וTriTag-2). TriTag-3 מורכב מאות peroxisome מוטבעת בתוך אזור נמוך מורכבות של רצף הכלורופלסט. אלו הונחו במסגרת עם GFP (איור 1).

פלסמידים השתמשו במחקר זה ובכך הכילו כמה אלמנטים: משטר הילידים חלופי שחבור מגן PIMT2 6, הכלורופלסט וperoxisome מיקוד רצפים, ה-GFP, ועמוד שדרת פלסמיד. מאז לכל אחד יש מפרט מאודific נדרש רצף, שיטת רצף עצמאי היא הכרחית. פרוטוקול אסיפת גיבסון 12,13 יכול לשמש על כל רצפים כל עוד החלקים המרכיבים את נועדו עם דמיון רצף זה לזה, ואינו מכיל רצפים חוזרים. בקיצור, שברי DNA ליניארי בנויים (או דרך ההגברה PCR, סינתזה מסחרית, או עיכול של פלסמיד שהוכן מראש), כך שיש להם ~ 50 נ"ב של רצף הומולוגי חפיפה (איור 2). כמויות equimolar של כל אחד מקטעי DNA משולבות בצינור יחיד המכיל את תמהיל ההרכבה גיבסון, טופח על 50 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, והפכו לE. coli. פלסמידים הנובעים מפרוטוקול אסיפת גיבסון אושרו על ידי סנגר רצף.

במחקר זה שלושה המבנים במיקוד אברון GFP השונים הושוו לGFP לא מתויג וה-GFP-tagged RuBisCO. מיקרוסקופיה confocal שימשה לאיתור הקרינה ה-GFP בסיתאי ngle הפכו transiently. בניסויי שליטה, הביטוי החולף שנצפה היה בקורלציה לכלורופלסטים (לזיהוי בקלות על ידי autofluorescence האדום של כלורופיל), הגרעינים (אברון הגדול כי הוא לא הכלורופלסט ויש לו רק אחד לכל תא), ו / או האמינו אברונים קטנים להיות peroxisomes. ירוק (GFP) וערוצים אדומים (autofluorescence כלורופיל) היו מעולף ללמוד לוקליזציה תאית (איור 3). לדיון בתוצאות אלה מלאים יותר, אנא ראו מאמר הנלווה 11.

כצפוי, בכל שלושת מבני המיקוד כפולים, GFP נצפה בכלורופלסטים (איור 4) בmicrographs confocal כיסוי. יעד TriTag-1 וTriTag-2-GFP גם לcytosol ואברון הקטן האמין להיות peroxisome (איורים 4 א ו -4, בהתאמה). TriTag-3 מטרות GFP בלבד הכלורופלסט וperoxisome, אבל לאcytosol (איור 4C). סיכום התוצאות הוא נתח (איור 5).

איור 1
איור 1. עיצוב של מבני שחבור חלופיים לביטוי אברון ההפרש בbenthamiana Nicotiana. Splice דיאגרמות של (א) TriTag-1, (ב) TriTag-2, ו (ג) TriTag-3 מראים רצפים ללא מיקוד (אפור), הכלורופלסט רצפי מיקוד (אור ירוק), רצפי peroxisome מיקוד (כתומה), ואת רצף קידוד ה-GFP השתמש בניסויי ביטוי חולפים. TriTag-1 וTriTag-2 מורכבים של מבני שחבור חלופיים; TriTag-3 מורכב מאות peroxisome מוטבעת בתוך אזור נמוך מורכבות של רצף הכלורופלסט. רצפים של (ה) TriTag-2, ו (ו) TriTag-3. קודון ATG בסוף הרצפים אלה תואם את ה-GFP להתחיל קודון. איחו לחלופין אזורי מיקוד הם קו תחתי. הדימרים תורם acceptor הם קו תחתי. רצפי DNA האור הירוקים נובעים מPIMT2 5 'קידוד אזור 6 וכוללים רצפי קידוד רצף הכלורופלסט מיקוד (הירוקה). רצפי DNA הכתומים הבהירים נובעים מTTL 5 'קידוד אזור 17 וכוללים רצפי קידוד רצף peroxisome מיקוד (הכתומה). TriTag-3 מורכב מאות peroxisome מוטבעת בתוך אזור נמוך מורכבות של רצף הכלורופלסט. שרטוטים של mRNAs הסופי האמין לבוא לידי ביטוי ל( ז) TriTag-1 ו (ג) TriTag-2. הודפס מחדש באישור 11. לחץ כאן לצפייה בהר"י הגדול יותרge.

איור 2
איור 2 סכמטי להרכבת גיבסון:.. שיטה חדשה להרכבה של חפיפת שברי DNA שיטת ההרכבה גיבסון לבניית פלסמיד 12,13 במהירות להחליף שיבוט הגבלת קשירה מסורתי במעבדות רבות. בעיקרו של דבר, אחד יכול לעצב מבנה בסיליקו המכיל את ה-DNA של עניין בדיוק, מורכב ממוצרי ה-PCR המוגבר ממקורות שונים. לתכנן פריימרים המשתלבים זה בזה, וה-PCR-להגביר כל קטע עם פריימרים בצבע. הוסף את כל החתיכות לתוך צינור יחיד עם תערובת האנזים, ולהפוך את ה תאים המוסמכים coli. לחצו כאן לצפייה lתמונת arger.

איור 3
איור 3. טיפולי בקרה הפציצו לנ תאי benthamiana אפידרמיס העלה. (AC) GFP לא מתויג. (א) ערוץ ירוק. GFP לא מתויג בא לידי ביטוי בגרעין וסביב הפריפריה התא, המקביל ל cytosol, אבל לא vacuole. (ב) כלורופלסטים אדומים מצביעים autofluorescence של כלורופיל. (ג) כיסוי. בקרינת מבנה זה הוא ציין בגרעין וcytosol בלבד, אך לא כלורופלסטים. השליטה (DF), מתויג הכלורופלסט ה-GFP. (ד) ערוץ ירוק. ה-GFP באה לידי ביטוי באברונים הגדולים, עם תא כפי שתואר. (ה) כלורופלסטים אדומים מצביעים autofluorescence של כלורophyll. (ו) כיסוי. במקרה זה כלורופלסטים צהובים הם נצפו, המציינים את ה-GFP (הירוק) היא במיקוד להכלורופלסט. הודפס מחדש באישור 11. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
איור 4. Tri-Tag-1, 2, 3 GFP מתויג התמזג תמונות. (א) Tri-Tag1. במקרה זה פריפריה הכלורופלסט הצהוב הם נצפו, המציינות את ה-GFP הוא ממוקד להכלורופלסט. GFP הוא ציין גם בcytosol כמו גם אברונים punctate קטנים שעשויה להיות peroxisomes. (ב) Tri-Tag2. במקרה זה פריפריה הכלורופלסט הצהוב הם נצפו, המציינות את ה-GFP הוא ממוקד לג hloroplast. GFP הוא ציין גם בcytosol כמו גם אברונים punctate קטנים שעשויה להיות peroxisomes. (ג) Tri-Tag3. במקרה זה כלורופלסטים צהובים הם נצפו, כמו גם אברונים punctate קטנים שעשויה להיות peroxisomes. אבל GFP לא נצפה בcytosol. הודפס מחדש באישור 11. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5
איור 5. תאים של תא אפידרמיס עלה טבק טיפוסי. הנה הגדלים היחסי שלהם ובמקומות בתוך התא מוצגים, ורמות הביטוי היחסית שנצפו באמצעות מיקרוסקופיה confocal. הודפס מחדש באישור 11./ "= היעד" _blank 51234/51234fig5highres.jpg "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, אסטרטגיות פשוטות מתוארות לאיתור חלבון מהונדס בודד לתאים סלולריים מרובים בצמחים. המטרה הייתה לתכנן מבנה שיבטא את הגן יחיד באברון יותר מפעם אחת בbenthamiana Nicotiana. אסטרטגיות כוללות תכנון רציונלים של בונה DNA מבוסס ה-GFP, הרכבה גיבסון, משלוח של פלסמידים לתאים עלה עם אקדח הגן, והתבוננות בתוצאות עם מיקרוסקופיה confocal.

שלושה תגים קצרים, N-מסוף שונים נועדו להכלורופלסט בו זמנית, peroxisome וcytosol מיקוד 11. "TriTags" אלה נועדו על ידי שילוב של DNAs טבעי קידוד mRNAs איחה לחלופין שמכוונים את החלבונים המקודדים לשני הכלורופלסט בתוספת ציטופלסמה 6 או peroxisome תוספת 17 ציטופלסמה. TriTag-3 אינם מסתמכים על שחבור חלופי ומורכבים מרצף הכלורופלסט מיקוד בי naחלק turally לא מובנה הוחלף ברצף מיקוד peroxisomal 15,17. פונקצית TriTags in vivo כדי למקד את ה-GFP בתאי האפידרמיס ניקוטיאנה benthamiana עלה (איור 5).

micrographs confocal הראה כי ה-GFP יעד TriTag-1 וTriTag-2 להכלורופלסט, peroxisome, וcytosol ביעילות, אבל עם העדפה להכלורופלסט וperoxisome, בהתאמה (4 א ומספרים 4 ב). TriTag-3 מטרות GFP רק להכלורופלסט וperoxisome, אבל לא cytosol (איור 4C). בסך הכל, תגים אלה עשויים להפחית את הזמן ומשאבים מושקעים בשיבוט להנדסה מטבולית מפעל, במיוחד עבור אלה הזקוקים ביטוי ספציפי בכלורופלסטים וperoxisomes.

שינויים ופתרון בעיות

TriTags נבנה ככרגע הם די סטטי. עם זאת, underlyinטכנולוגיה גרם, שחבור חלופי כדי לאפשר תרגום של תגים ספציפיים למיקום שונים, הוא גמישה. התגים הספציפיים הכלורופלסט ו / או peroxisome הקיים יכולים להיות שונה לכל אברון אחר, יהיה זה מסלול ההפרשה, mitochondrion, תג מגורי ER, vacuole. אלה גם יכולים להיות משולבים עם יזמים רקמות ספציפיות, למשל עבור הזרעים, הפרחים, השורשים, העלים, גבעולים, וכו '

לפרויקט כגון זה, שיטת ההרכבה גיבסון 12-14 לשיבוט בונה הוא אידיאלי. זה הוא כלי פשוט ורב עצמה לsubclone כל רצף ללא מגבלות של אתרי הגבלה. בתגובות צעד אחד, ההרכבה גיבסון במהירות יצרה את המבנים ובקרות במינימום מאמץ בשיבוט. טכניקת ההרכבה גיבסון היא כמעט עד אינסוף לשינוי עבור כל רצף רצוי כל עוד יכולים להיות מוגבר-PCR רצפי התבנית. למרות שבדוגמה זו ההרכבה גיבסון הראתה עם פלסמיד מתעכל, PCR-הגברת הווקטור נוטה לעבוד טוב יותר מאשר שימוש miniprep מתעכל.

ג'ין האקדח הוא שיטה מהירה, יעילה לtransfection החולף של תאים, כפי שכבר נקבע על ידי כתב העת הזה 18,19. Benthamiana Nicotiana יש, תאים גדולים אפידרמיס עלה lobate, אשר שניהם אידיאליים עבור transfection עם אקדח הגן, אלא גם עבור התבוננות עם מיקרוסקופיה confocal. הפרוטוקול להכנת כדורים הוא מבוסס היטב. זהב שמש כmicrocarrier ברוב הניסויים בספרות עד כה, אבל microcarriers טונגסטן זמין לאחרונה בעלות נמוכה.

מגבלות של הטכניקות

מגבלה אחת גדולה של שיטת גיבסון היא נוכחותם של רצפים חוזרים ונשנים: עוד האזור החופף הוא תוצאת מוצרים פחות תופעות. עיכול של מוצרי ה-PCR עם DpnI צריך להסיר את זיהום תבניות פלסמיד; שהם בדרך כלל המקור לצדמוצרים. אנזימי עיכול שברי DNA מ-DNA הכפול תקוע לאחד תקוע. נוכחותם של רצפים חוזרים ונשנים בקרבת הקצוות (~ קילו 1) של שברי DNA מגבירה באופן משמעותי את האפשרות של רקומבינציה לא תקינה. גם וגם, חוזר בתוך הרצפים להוות מגבלה: זה לא ידוע, וקשה לשלוט עד כמה רחוק לועס exonuclease T5 לגבות גדילי דנ"א יחיד. הפעילות המהירה של exonuclease מושפעת על ידי טמפרטורה גבוהה תגובה (50-55 ° C) סופו של דבר denaturing האנזים, ואת הצמיגות ומקטינה את התנועה הכוללת בפתרון. לכוונון עדין יותר של שיבוט צעדי תגובה, רצף וקשירה העצמאי (SLIC) 20 הוא מועדף.

מגבלה העיקרית של טכניקת אקדח הגן היא שזה רק מייצר על הסדר של אחד עד עשרה תאים הפכו transiently לאירוע ירי.

משמעות ביחס לשיטות קיימות

טכניקת ההרכבה גיבסון נהנה אימוץ המהיר שלה להקל, גמישות והסתגלות. זהו פרוטוקול מהיר יותר משיבוט הגבלה / קשירה מסורתית, ואינו דורשים רצפים ספציפיים, כגון אלה הנדרשים לעיכול הגבלה. זה אינו מוגבל לשניים או שלושה שברים שrecombined; החוקרים המקוריים הוכיחו אותו בהצלחה עד 10 חלקים, אם כי עם מוגבלת יעילות. עבור חוקרים רבים ההרכבה גיבסון הופכת למספר גדול יותר של שיבוטים חיוביים.

במשך יותר transformants עם טכניקות Biolistic, או ליצירה של רקמת יבלת הפכה, יש להשתמש בשימוש במכשיר בסגנון ארון biolistic (למשל BioRad PDS-1000). שיטה חלופית היא חדירת Agrobacterium.

יישומים עתידיים

ההרכבה גיבסון מאפשרת אשכולות גדולים יותר ויותר של ה-DNA שנאספו, כדיהנקודה שבה גבול מקסימאלי לא נצפה. המחברים המקוריים השתמשו בו כדי להרכיב כמה מאה kilobases 13 ה-DNA.

היכולת למקד באופן סלקטיבי האברונים מרובים עם מבנה גנטי יחיד יש את הפוטנציאל להפחית את מספר הגנים הצורך להשתנות. המשלוח של שברים גדולים יותר ויותר ה-DNA (ובכך מסלולים מטבוליים גדולים יותר) הוא מטרה לטווח קרוב. מסלולי Isoprenoid כבר נמסרו להכלורופלסט בשיטות biolistic; אשכולות גנים אחרים, כגון מסלולי קיבוע פחמן חלופיים הם באופק.

שלבים קריטיים במסגרת הפרוטוקול.

בהרכבת גיבסון, כדי להיות בטוח שאין לי רצפי תבנית הומולוגיה אחד לשני אלא באתרי רקומבינציה היעד.

בשינוי biolistic של צמחי Nicotiana, להיות זהיר כדי לשמור על אקדח הגן על 10-15 סנטימטר מעל העליםnd לשמור על לחץ הליום ב200-250 psi. קרוב יותר מזה, עלה השביר יתפוצץ, ויותר מזה הם לא שינו גם. יומיים לאחר transfection חבורה אמורה להופיע על העלה אם הוא הפך אותה כמו שצריך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לג'ן שין של בית החולים כלליים מסצ'וסטס לתרומה הנדיבה של שתילי Nicotiana benthamiana. ג'ן בוש עזר לנו מאוד בייעוץ בגידול צמחים והקמת אזור חדר צמיחה. טום פראנטה של ​​מכון Wyss הציעה את העזרה מכרעת עם מיקרוסקופיה confocal. המחברים מבקש להודות במיוחד לדון אינגבר של בית החולים לילדים בבוסטון ומכון Wyss לתרומתו הנדיבה של אקדח גן והציוד נלווה. מימון לפרויקט זה סופק באמצעות הסכם שיתוף פעולה עם משרד אנרגיה של סוכנות לפרויקטי מחקר מתקדם (ARPA-E פרס # DE-000,079) לPAS, JCW, וMDM, ובאמצעות Chimerion ביוטכנולוגיה, Inc לMJV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligonucleotide primers IDT (custom) Design specifically for construct
GeneBlocks IDT (custom) 500 bp oligonucleotides
ApE software U Utah (download) http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit Qiagen 28004 Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kit Qiagen 27104 Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC Buffer NEB M0532S Used to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mix NEB E2611L Master mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5 Teknova T1075 Gibson assembly mix
1 M MgCl2 G Biosiences 82023-086 Gibson assembly mix
dNTP mix Fermentas R0192 Gibson assembly mix
1 M DTT Fermentas R0861 Gibson assembly mix
PEG-8000 Affymetrix 19966 Gibson assembly mix
NAD Applichem A1124,0005 Gibson assembly mix
T5 exonuclease Epicentre T5E4111K Gibson assembly mix
Phusion polymerase NEB F530S Gibson assembly mix
Taq DNA ligase NEB M0208L Gibson assembly mix
Gibthon.org Website to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kit Qiagen 12963 Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun system BioRad 165-2451 Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana (n/a) (n/a) Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscope Leica SP5 X MP Imaging of resultant cells
Deep well slides Electron Microscopy Sciences 71561-01 Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE) University of Utah http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1, (4), 220-229 (2010).
  2. Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3, (18), (2012).
  3. Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40, (10), 4701-4710 (2012).
  4. Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17, (10), 616-623 (2012).
  5. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
  6. Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55, (1), 1-13 (2008).
  7. Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25, (5), 593-599 (2007).
  8. Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3, (38), 1-12 (2012).
  9. Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14, (1), (2012).
  10. Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148, (3), 1219-1228 (2008).
  11. Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7, (20), (2013).
  12. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  13. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, (5), 12-16 (2009).
  14. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7, (11), 901-903 (2010).
  15. Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267, (9), 5985-5995 (1992).
  16. Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102, (4), 245-263 (2010).
  17. Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19, (10), 3170-3193 (2007).
  18. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  19. Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
  20. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4, (3), 251-256 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics