Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

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Summary

Este trabajo describe un nuevo método para la orientación selectiva de orgánulos subcelulares en las plantas, ensayada mediante la pistola de genes BioRad.

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Mattozzi, M. D., Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C. Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun. J. Vis. Exp. (86), e51234, doi:10.3791/51234 (2014).

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Abstract

Con el fin de dirigirse a una sola proteína a múltiples orgánulos subcelulares, las plantas normalmente duplican los genes pertinentes, y expresan cada gen por separado utilizando estrategias regulatorias complejas incluyendo promotores diferenciales y / o secuencias de señal. Ingenieros metabólicos y biólogos sintéticos interesadas en la orientación de las enzimas a un orgánulo particular, se enfrentan a un desafío: Para una proteína que es para ser localizada a más de un orgánulo, el ingeniero debe clonar el mismo gen múltiples veces. Este trabajo presenta una solución a esta estrategia: aprovechar splicing alternativo del mRNA. Esta tecnología se aprovecha de cloroplasto establecido y secuencias de peroxisomas focalización y los combina en un único ARNm que se empalmados alternativamente. Algunas variantes de empalme se envían al cloroplasto, algunos hasta el peroxisoma, y ​​algunos al citosol. Aquí, el sistema está diseñado para múltiples orgánulo que apunta con el corte y empalme alternativo. En este trabajo, se espera que las buenas prácticas agrarias para ser exprEssed en el cloroplasto, citosol, y peroxisomas por una serie de diseñados racionalmente 5 'etiquetas de ARNm. Estas etiquetas tienen el potencial de reducir la cantidad de clonación requerido cuando los genes heterólogos necesitan ser expresado en múltiples orgánulos subcelulares. Las construcciones fueron diseñadas en el trabajo anterior 11, y se clonaron utilizando el montaje de Gibson, un método de clonación independiente de ligación que no requiere enzimas de restricción. Los plásmidos resultantes se introdujeron en las células epidérmicas de la hoja de Nicotiana benthamiana con un protocolo modificado pistola de genes. Finalmente, las hojas transformadas se observaron con microscopía confocal.

Introduction

Este trabajo es un proyecto de ingeniería / biología sintética metabólica en la que las células vegetales están diseñados para expresar una proteína reportera en varios orgánulos, pero con una única construcción de ADN.

Un enfoque para dirigir proteínas a más de un lugar de clonación implica múltiples copias genéticas, cada uno que contiene un péptido de localización diferente. Cada copia debe ser introducida por los sucesivos retransformación, o alternativamente, por retrocruzamiento transformaciones individuales 1. Esto implica la clonación por adición, y está limitado por una etiqueta de localización por terminal.

Otra forma de localizar una proteína para múltiples ubicaciones es a través de splicing alternativo 2-5. ARN se transcribe a partir de un único gen, pero diferentes copias de la transcripción se procesa de manera diferente, a menudo en más de una forma por célula. Esto puede resultar en más de un ARN mensajero en la célula transcrito a partir de un único gen. Estos diferentes messengeARN R puede codificar para diferentes isoformas de la misma proteína, o en el caso de un desplazamiento del marco, una proteína totalmente diferente. Aunque splicing alternativo ha sido descrita en la literatura para muchos años, los mecanismos de acción y de donantes conservadas y sitios de empalme del receptor sólo están siendo elucidados más recientemente 6. A medida que se describen mejor estos sitios, se abren oportunidades para la ingeniería.

Ingenieros metabólicos Plant se enfrentan a un desafío cuando la expresión de una proteína en múltiples orgánulos. Para una proteína que es para ser localizada a más de un orgánulo, el ingeniero debe clonar el mismo gen varias veces, cada una con una secuencia señal separada dirigir a los orgánulos de interés. Para un solo gen en tres orgánulos, esto es simplemente tres genes. Sin embargo, para una vía metabólica de seis genes, esto se expande a 18 genes, un importante esfuerzo de clonación. Combinación de varias secuencias de localización en un único signo de genes empalmados alternativamente-reduce ificantly este esfuerzo. Por ejemplo, la reingeniería de la fotorrespiración 7,8 y la síntesis de isoprenoides 9,10 involucra tanto a los cloroplastos y peroxisomas. En nuestro caso nos aprovechamos de los sitios de empalme como se observa en un sistema de Arabidopsis thaliana naturales descrito previamente 6. Nos racionalmente rediseñado la secuencia de ARNm de salir de los sitios de empalme naturales solo, pero colocamos secuencias que codifican cloroplasto-o etiquetas al peroxisoma dentro de los intrones empalmados alternativamente-(Figura 1). La proteína expresada puede o no puede tener una etiqueta, dependiendo de si la pre-ARNm que lo codifica se escindió como un intrón (Figuras 1g y 1h). Para obtener más información sobre el diseño de las construcciones que se presentan en este trabajo, por favor vea el artículo del compañero 11.

Debido a que este es todavía un esfuerzo significativo clonación, montaje Gibson, un nuevo método para la clonación de las construcciones de ADN, es used en la construcción. El método de Gibson puede ser utilizado para cualquier secuencia, con independencia de los sitios de restricción (Figura 2) 12-14. La mezcla específica de enzimas permite un solo paso, el montaje isotérmica. En este método, varias partes de ADN lineal de doble cadena están diseñados de tal manera que tienen secuencias solapantes de ~ 50 pb. El conjunto de mezcla de enzimas Gibson digiere parcialmente las partes lineales de ADN, la exposición de cadenas simples de secuencias homólogas. Estas secuencias de una sola hebra parciales se vuelven a recocidas en la mezcla de reacción, lo que resulta en una, de un solo paso, independiente de la secuencia, la reacción subclonación-ligadura libre rápida.

Este trabajo describe 1) Diseño de construcciones racionales empalmados alternativamente para la expresión en los cloroplastos de las plantas, los peroxisomas, y citosoles, 2) su clonación utilizando el nuevo método de ligadura libre de reunión Gibson, 3) de su entrega a las células de las hojas de tabaco con la pistola de genes, y 4) resultados que muestran la orientación de orgánulos, como se observa con las buenas prácticas agrariasy microscopía confocal.

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Protocol

1. Diseño de secuencias Alternativamente empalmados-en caso de pluralidad Orgánulos Focalización

  1. Determinar los sitios para la expresión de la proteína final. Para este trabajo, el interés se centra en la orientación del cloroplasto, peroxisomas y citoplasma.
  2. Usar la literatura para identificar las secuencias de proteínas y de ADN conocidos que atacan las proteínas de los orgánulos de interés. En este caso, una orientación del cloroplasto secuencia de Arabidopsis thaliana-L isoaspartate metiltransferasa 6,15, y una secuencia dirigida a los peroxisomas de Arabidopsis thaliana-transtiretina como S-alantoína sintasa 16,17 fueron determinado.
  3. Identificar un régimen alternativo de empalme que deben orientar las proteínas de interés a los orgánulos correctas. Para este trabajo, los sitios de empalme como se observa en un sistema de Arabidopsis naturales 6. La secuencia de ARNm fue rediseñado dejando los sitios de empalme naturales, pero las secuencias de codificación se colocaron peroxis cloroplastos oome de metas de etiquetas dentro de los intrones empalmados alternativamente-(Figura 1).

2. Asamblea Gibson de piezas de ADN

Ver también la Figura 2.

El método de montaje Gibson depende de la acción de varias enzimas en una mezcla pre-hechos a 1) digerir parcialmente los extremos de la doble hebra de ADN para hacer de hebras sencillas y 2) de recocido pares de bases complementarias de la vecina partes de ADN. Esto permite la clonación de fragmentos de ADN sin las limitaciones de los sitios de restricción.

  1. Elige un órden para los elementos de la construcción del plásmido de ADN. Como un ejemplo TriTag-1 tiene elementos de: a) un vector plásmido (poros, que contiene una construcción de GFP se sabe que funciona en plantas, un marcador de resistencia a kanamicina, y orígenes de replicación para E. coli y Agrobacterium tumefaciens anfitriones), b) una secuencia de promotor, (P ENTCUP2, demostrado ser constitutiva en plantas), C) una secuencia de direccionamiento de cloroplastos (CTS), c) una secuencia de dirección de peroxisomas (PTS), y d) una serie de sitios de empalme como se ha descrito previamente 6.
  2. Diseñar la base para la construcción de la base con en el software de diseño de silico. ApE es un paquete de software gratuito de código abierto útil para este trabajo.
    Nota: TriTag-1, tiene la orden: vector de plásmido, promotor, ATG, sitio de empalme de donantes, secuencia diana del cloroplasto, el sitio donador de empalme, lugar neutral, el sitio aceptor de empalme, secuencia diana de peroxisomas, sitio aceptor de empalme, las buenas prácticas agrarias, que figura en el plásmido vector .
    1. Diseñar el silico construcción de ADN de tal que hay un solapamiento de 50 pb entre cada pieza en el pedido cebadores para la PCR. Es posible usar la superposición de 50 pb como los cebadores: 25 pb cada dirección.
      1. Asegúrese de no perder de vista el origen de cada uno de los pedazos de secuencia. Es como: un plásmido ser cultivadas y miniprepped; una secuencia lineal que se puede utilizar como una plantilla de PCR; o una secuencia que tiene que sersintetizado comercialmente? Varias compañías ofrecen servicios de síntesis de ADN de bajo costo para los fragmentos de <500 pb. En este caso, la propia TriTag es 437 pb por lo que era conveniente pedirlo en el mercado.
      2. Los mejores resultados vendrán si todos los fragmentos son amplificado por PCR y purificados a partir de su plantilla de ADN. El marcador de resistencia es un buen lugar para dividir esta gran ADN en dos plantillas más pequeñas que son más fácilmente amplificado por PCR.
      3. Enzima de restricción Restricción DpnI corta el ADN metilado. Si la plantilla de PCR era un miniprep a partir de E. coli, el tratamiento DpnI se retire la plantilla de ADN contaminante.
  3. Purificar todas las secuencias de ADN por separado y se produzca la elución en agua, o TE Buffer EB.
    1. Pore ​​vector parte 1, ~ 3000 pb (flechas verdes). Amplificó por PCR y DpnI tratada.
    2. Pore ​​vector parte 2, ~ 3000 pb (flechas negras). Amplificó por PCR y DpnI tratada.
    3. TriTag inserción, 437 pb (flechas azules). Pedido comercialmente. Resuspend en ddH 2 O.
    4. P promotor ENTCUP, ~ 750 pb (flechas de color naranja). Amplificado por PCR y DpnI tratada.
  4. Medir las concentraciones de cada una de las piezas de ADN. Apunta a 150 ng / l de las piezas de vectores.
  5. Tomar una alícuota de la mezcla de ensamblaje Gibson del congelador y descongelar en hielo. Este está disponible comercialmente, pero también fácil de hacer en el laboratorio 12-14.
    1. Hay dos pasos para esta receta: una mezcla maestra 5x viscosa y 15 alícuotas 1.33x reacción de tamaño mL. La mezcla maestra 5x contiene: 3 ml de 1 M de Tris-HCl pH 7,5, 300 l 1 M de MgCl 2, 600 l 10 mM de cada dNTP, 300 l de DTT 1 M, 1,5 g de PEG-8000, 20 mg de NAD, y ddH 2 O a 6 ml. Preparar 320 ml de alícuotas (18) y la congelación de todos menos uno a -20 ° C. La solución será bastante viscoso. Etiquetar estos "tampón 5X isoterma"
    2. Para el resto (320 l), añadir 1,2 l T5 Exonucleasa, 20 l Phusion alta FidElity ADN polimerasa, 160 l de Taq ADN ligasa y 700 l ddH 2 O. Preparar 15 ml de alícuotas (~ 80) en el hielo en tubos de PCR y se almacena a -20 ° C.
  6. Determinar los volúmenes de cantidades equimolares de cada uno de los fragmentos. Hay algunas calculadoras en línea, incluyendo Gibthon.org. Debe haber un total de 5 l de todas las piezas de ADN. Añadir a la l 15 Gibson mezclar alícuota. Si esto requiere volúmenes demasiado pequeño para pipeta, diluir los fragmentos de ADN y / o utilizar más de una parte alícuota.
    1. No te olvides de preparar un control del ADN vector solo (por ejemplo, la parte de ADN que contiene el marcador de resistencia a los antibióticos) y completar el volumen con agua.
  7. Incubar los tubos en un termociclador a 50-55 ° C durante 30-60 minutos. Vuelva a colocar en hielo y se transforman en E. coli mediante choque térmico células químicamente competentes. No utilice células electrocompetentes. La alta concentración de sal y la concentración de ADN relativamente bajapueden hacer que las células ARC.
    1. Aplicar todos los 20 l de una preparación comercial de 200 l de cloruro de calcio competente de E. coli.
      Incubar en hielo 30 min y el calor de choque 60 segundos a 42 ° C
    2. Volver a hielo 2 min, aplicar 750 l de SOC o medio LB y recuperar agitación en un tubo de microcentrífuga de 30 min a 37 ° C. Placa de la mezcla y las diluciones adecuadas en LB + Kan (u otro antibiótico adecuado). Esto puede resultar en un mayor fondo (y un mayor número de eventos de recombinación no objetivo) que la clonación basada en la ligadura tradicional, pero vale la pena analizar cerca de 10 colonias.
  8. Confirmar clon a través de la secuencia y almacenar una parte alícuota a -80 ° C

3. Biolístico transfección de Tabaco de la pistola de Gene

Esta es una técnica que se establece en JoVe 18,19. Los pasos clave y las diferencias se describen a continuación.

  1. Crecer 50-100 ml E. coLi o 200 ml de Agrobacterium. Maxi-prep de la cultura. Una concentración de aproximadamente 1500 ng / l se requiere para continuar.
  2. Preparar balas de pistola de genes tal como se describe anteriormente. Cargarlos en la pistola de genes.
  3. Para la transfección de Nicotiana benthamiana tabaco tejido foliar epidérmica, elija una hoja grande cerca de la base de una planta de 3 meses de edad. Corte con cuidado y colocarlo parte inferior hacia arriba en toallas de papel húmedas en un plato de 15 cm de Petri.
  4. Ajustar la presión de Él para la pistola de genes de 200 a 250 psi.
  5. Apuntar con cuidado la pistola de genes entre las costillas en la parte inferior de una hoja, unos 3-5 cm por encima de ella. Suelte la seguridad y entregar las partículas a la hoja. Cada bala puede ser utilizado dos veces en el mismo lugar en la hoja. Si estalla la hoja, descartan y empezar una nueva vida-hay una cierta variación en la hoja de la dureza debido a las condiciones de crecimiento, tales como la edad, la humedad, etc Para una hoja de 12 cm, le espera para encajar alrededor de 6 disparos.
  6. Guarde la hoja, cubierta con la parte superior de unPlaca de Petri durante 2-3 días con poca luz en el banquillo.
  7. Examine la hoja en un microscopio de disección equipado con fluorescencia UV, y la búsqueda de las células individuales que expresan GFP. Diseccionar 5-10 mm secciones de la hoja.
  8. Sumerja la hoja en un portaobjetos de microscopio de pozo profundo en ~ 200 l 0,1% de Triton X-100. El detergente ayuda a prevenir la formación de burbujas de aire en la superficie, y la profunda portaobjetos de microscopio y permite una zona de formación de imágenes de tejido más grande.

4. Microscopía Confocal del tejido Transfectadas

Estas instrucciones varían para cada instrumento, por lo que es esencial para conseguir una formación adecuada.

  1. Para los experimentos de detección por fluorescencia, ajuste el láser de excitación a 489 nm, y establecer los detectores fotomultiplicadores de 500-569 nm para GFP fluorescencia y 630-700 nm para la clorofila autofluorescencia. Celdas de imagen utilizando un objetivo de inmersión en agua 40x.

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Representative Results

El esfuerzo de diseño fue el resultado de una planificación significativa. Novela de este proyecto es la utilización del splicing alternativo para crear un pre-ARNm que se traduce en proteínas expresadas diferencialmente. Estas proteínas se expresan en diferentes orgánulos, en este caso el cloroplasto, peroxisomas y / o citosol. Adaptamos gen Arabidopsis natural que se empalmados alternativamente 6, y se coloca conocidos cloroplasto 6 y peroxisomas 17 secuencias dirigidas en los exones alternativos (TriTag-1 y TriTag-2). TriTag-3 consta de una señal de peroxisomas incrustado dentro de una región de baja complejidad de la secuencia del cloroplasto. Estos se colocaron en el marco con GFP (Figura 1).

Los plásmidos utilizados en este estudio contenían por lo tanto varios elementos: el régimen de corte y empalme alternativo del gen nativo PIMT2 6, cloroplasto y de peroxisomas direccionamiento de secuencias, GFP, y un esqueleto del plásmido. Puesto que cada uno tiene muy especificaciónific requiere secuencia, un método independiente de la secuencia es necesario. El protocolo de ensamblaje Gibson 12,13 se puede utilizar en cualquier secuencia siempre y cuando las partes constituyentes están diseñados con la similitud de secuencia entre sí, y no contienen secuencias de repetición. En resumen, fragmentos de ADN lineales se construyen (ya sea a través de la amplificación por PCR, la síntesis comercial, o la digestión de un plásmido pre-hechos) de tal manera que tienen ~ 50 pb de la secuencia homóloga de solapamiento (Figura 2). Cantidades equimolares de cada uno de los fragmentos de ADN se combinan en un solo tubo que contiene la mezcla de montaje Gibson, se incubaron a 50 ° C durante una hora, y se transformaron en E. coli. Los plásmidos resultantes del protocolo de conjunto de Gibson se confirmaron por secuenciación de Sanger.

En este estudio los tres diferentes GFP construcciones orgánulos de metas se compararon con las buenas prácticas agrarias sin etiqueta y un GFP-etiquetados Rubisco. La microscopía confocal se usó para detectar la fluorescencia de GFP en el SINGLE células transformadas transitoriamente. En experimentos de control, la expresión transitoria observada fue correlacionada con los cloroplastos (fácilmente identificables por la autofluorescencia roja de la clorofila), los núcleos (gran orgánulo que no es un cloroplasto y sólo tiene una por célula), y / o pequeños orgánulos cree que es peroxisomas. Verde (GFP) y (autofluorescencia clorofila) canales rojo se superpone a estudiar la localización intracelular (Figura 3). Para una discusión más completa de estos resultados, por favor vea nuestro artículo compañero 11.

Como se predijo, en todas las tres estructuras artificiales de direccionamiento dual, GFP se observó en los cloroplastos (Figura 4) en micrografías confocales de superposición. TriTag-1 y TriTag-2 objetivo de la GFP también para el citosol y el pequeño orgánulo cree que es el peroxisoma (figuras 4a y 4b, respectivamente). TriTag-3 objetivos de la GFP a sólo el cloroplasto y el peroxisoma, pero noel citosol (Figura 4c). Un resumen de los resultados se esquematiza (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. Diseño de construcciones de splicing alternativo para la expresión diferencial orgánulo en Nicotiana benthamiana. Empalme diagramas de (a) TriTag-1, (b) TriTag-2, y (c) TriTag-3, que muestra secuencias no dirigidos (gris), cloroplasto secuencias de dirección (verde claro), secuencias de direccionamiento de peroxisomas (naranja), y la secuencia codificante de GFP utilizado en experimentos de expresión transitoria. TriTag-1 y TriTag-2 consisten de construcciones de splicing alternativo; TriTag-3 consta de una señal de peroxisomas incrustado dentro de una región de baja complejidad de la secuencia del cloroplasto. Las secuencias de (e) TriTag-2, y (f) TriTag-3. El codón ATG en el extremo de estas secuencias corresponde al codón de inicio de GFP. Se subrayan las regiones dirigidas a otra parte longitudinalmente. Se subrayan los donantes y aceptor de dímeros. Las secuencias de ADN de color verde claro se derivan de la PIMT2 5 'región 6 de codificación e incluyen secuencias que codifican la secuencia de direccionamiento de cloroplastos (verde). Las secuencias de ADN de color naranja claro se derivan de la TTL 5 'región 17 de codificación e incluyen secuencias que codifican la secuencia de peroxisomas focalización (naranja). TriTag-3 consta de una señal de peroxisomas incrustado dentro de una región de baja complejidad de la secuencia del cloroplasto. Esquemas de mRNAs finales que se cree que se expresa por (g) TriTag-1 y (h) TriTag-2. Reproducido con permiso 11. Haga clic aquí para ver más grande image.

Figura 2
Figura 2 Esquema para el montaje Gibson:.. Un nuevo método para el montaje de la superposición de fragmentos de ADN El método de montaje de Gibson para el plásmido construcción 12,13 está reemplazando rápidamente tradicional clonación de restricción-ligación en muchos laboratorios. Esencialmente, uno puede diseñar una construcción in silico que contiene el ADN de interés exactamente, compuesto de productos de PCR amplificados a partir de varias fuentes. Diseño de cebadores que son complementarios entre sí, y PCR-amplificar cada fragmento con los cebadores de colores. Añadir todas las piezas en un solo tubo con la mezcla de enzimas, y transformar E. células competentes de E. coli. Haz click aquí para ver la limagen Arger.

Figura 3
Figura 3. Tratamientos de control bombardeados en N. células epidérmicas de la hoja benthamiana. (ac) GFP No etiquetado. (a) del canal verde. No etiquetado GFP se expresa en el núcleo y alrededor de la periferia de la célula, correspondiente a la citosol, pero no la vacuola. (B) cloroplastos rojas indican la autofluorescencia de la clorofila. (C) de superposición. En este constructo de fluorescencia se observa en el núcleo y sólo citosol, pero no los cloroplastos. (Df) de control GFP cloroplasto-etiquetados. (D) canal verde. GFP se expresó en las grandes orgánulos, con una célula como se indica. (E) los cloroplastos rojas indican la autofluorescencia de los clorurosophyll. (f) Superposición. En este caso se observan los cloroplastos de color amarillo, lo que indica que la GFP (verde) está dirigido al cloroplasto. Reproducido con permiso 11. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4
Figura 4. Tri-Tag-1, 2, 3 GFP etiquetados fusionó imágenes. (A) Tri-Entrada1. En este caso se observan periferias del cloroplasto de color amarillo, lo que indica que la GFP se dirige al cloroplasto. GFP se observa también en el citosol, así como pequeños orgánulos puntiformes que pueden ser los peroxisomas. (B) Tri-Tag2. En este caso se observan las periferias de cloroplastos de color amarillo, lo que indica que la GFP se dirige a la c hloroplast. GFP se observa también en el citosol, así como pequeños orgánulos puntiformes que pueden ser los peroxisomas. (C) Tri-TAG3. En este caso se observan los cloroplastos de color amarillo, así como pequeños orgánulos puntiformes que pueden ser los peroxisomas. Pero GFP no se observa en el citosol. Reproducido con permiso 11. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

La figura 5
Figura 5. Compartimentos de una célula típica epidérmico hoja de tabaco. Aquí se muestran sus tamaños y ubicaciones dentro de la célula relativos, y los niveles de expresión relativos observados a través de microscopía confocal. Reproducido con permiso 11./ 51234/51234fig5highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Discussion

En este estudio, se describen estrategias simples para la localización de una única proteína transgénica a múltiples compartimentos celulares en plantas. El objetivo era diseñar constructo que expresara un solo gen en más de un orgánulo en Nicotiana benthamiana. Las estrategias incluyen el diseño racional de construcciones de ADN basada en GFP, el montaje de Gibson, la entrega de los plásmidos de células de las hojas con la pistola de genes, y la observación de los resultados con microscopía confocal.

Tres, las etiquetas N-terminales cortos diferentes fueron diseñados para cloroplasto simultánea, peroxisomas y citosol focalización 11. Estos "TriTags" fueron diseñados por la combinación de ADN de origen natural que codifican mRNAs alternativamente que dirigen las proteínas codificadas a cualquiera de los cloroplastos plus citoplasma 6 o el peroxisoma plus citoplasma 17. TriTag-3 no se basa en corte y empalme alternativo y consta de una secuencia de orientación del cloroplasto en el que un NAporción estructuralmente no estructurado ha sido reemplazado con una secuencia de dirección peroxisomal 15,17. La función TriTags in vivo para dirigirse a GFP en benthamiana células epidérmicas de la hoja de Nicotiana (Figura 5).

Micrografías confocales mostraron que TriTag-1 y TriTag-2 objetivo de GFP al cloroplasto, peroxisomas, y el citosol de manera efectiva, pero con preferencia por el cloroplasto y de peroxisomas, respectivamente (Figuras 4a y 4b). TriTag-3 objetivos GFP sólo para el cloroplasto y el peroxisoma, pero no el citosol (Figura 4c). En total, estas etiquetas pueden reducir el tiempo y los recursos gastados en la clonación para la ingeniería metabólica de la planta, especialmente para aquellos que necesitan una expresión específica en los cloroplastos y peroxisomas.

Modificaciones y Solución de problemas

Los TriTags como actualmente construidos son bastante estática. Sin embargo, la underlying tecnología, splicing alternativo para permitir la traducción de diferentes etiquetas específicas de la ubicación, es flexible. Los cloroplastos y / o de peroxisomas etiquetas específicas existentes se podrían cambiar por cualquier otro orgánulo, ya sea la vía de secreción, la mitocondria, una etiqueta de residencia ER, la vacuola. Estos también podrían combinarse con promotores específicos de tejido, por ejemplo, para las semillas, las flores, las raíces, las hojas, tallos, etc

Para un proyecto como este, el método de montaje Gibson 12-14 para la clonación de las construcciones es ideal. Es una poderosa herramienta sencilla, para subclonar cualquier secuencia sin las limitaciones de los sitios de restricción. En las reacciones de un solo paso, el montaje Gibson creado rápidamente las construcciones y los controles con un mínimo esfuerzo en la clonación. La técnica de montaje Gibson es casi infinitamente modificable para cualquier secuencia deseada tanto tiempo como las secuencias de plantilla pueden ser amplificados por PCR. Aunque en este ejemplo el montaje de Gibson se muestra con un plásmido digerido, PCR-amplificación del vector tiende a funcionar mejor que usar un minipreparación digerido.

La pistola génica es un método rápido y eficaz para la transfección transitoria de células, como se ha establecido por esta revista 18,19. Nicotiana benthamiana tiene grandes hojas lobuladas, células epidérmicas, que son tanto ideal para la transfección con la pistola de genes, sino también para observación con microscopía confocal. El protocolo para la fabricación de balas está bien establecida. El oro ha sido utilizado como un microvehículo en la mayoría de los experimentos en la literatura hasta la fecha, pero microportadores de tungsteno son recientemente disponibles a bajo costo.

Limitaciones de las Técnicas

Una limitación importante del método de Gibson es la presencia de secuencias repetidas: la más larga es la región de superposición es la menos productos secundarios resultado. La digestión de los productos de PCR con DpnI debe eliminar la contaminación de plantillas de plásmidos; que son generalmente la fuente de ladoproductos. Las enzimas digieren los fragmentos de ADN de doble cadena de ADN-en una sola hebra. La presencia de secuencias repetidas cerca de los extremos (~ 1 kb) de los fragmentos de ADN aumenta significativamente la posibilidad de recombinación inadecuada. Además, se repite dentro de las secuencias también representan una limitación: no es bien conocido, y difícil de controlar en qué medida las mastica exonucleasa T5 atrás ADN de una sola hebra. La rápida actividad de la exonucleasa es templado por la alta temperatura de reacción (50-55 ° C) eventualmente la desnaturalización de la enzima, y ​​la viscosidad disminuye el movimiento global de la solución. Para obtener más ajuste fino de la clonación independiente etapas de reacción, la secuencia y la ligadura (SLIC) se prefiere 20.

Una limitación importante de la técnica de pistola de genes es que sólo se produce en el orden de uno a diez células transformadas transitoriamente por evento de disparo.

Significativas en relación con los métodos existentes

La técnica de montaje Gibson está disfrutando de una rápida adopción por su facilidad, flexibilidad y adaptabilidad. Es un protocolo más rápido que el tradicional de clonación de restricción / ligadura, y no requiere de secuencias específicas, tales como las requeridas para la digestión de restricción. No se limita a dos o tres fragmentos para ser recombinados; los investigadores originales han demostrado con éxito para un máximo de 10 partes, aunque con una eficiencia limitada. Para muchos investigadores conjunto de Gibson convierte para un mayor número de clones positivos.

Para más transformantes con técnicas de biolística, o para la creación de tejido de callo transformado, se debe utilizar el uso de un dispositivo biolístico en forma de gabinete (por ejemplo, la BioRad PDS-1000). Un método alternativo es la infiltración de Agrobacterium.

Aplicaciones futuras

Conjunto de Gibson permite racimos más grandes y más grandes de ADN que se ensamblan, ael punto en el que no se ha observado un límite máximo. Los autores originales han utilizado para reunir a varios cientos de kilobases de ADN 13.

La capacidad de atacar selectivamente a múltiples orgánulos con una única construcción genética tiene el potencial de disminuir el número de genes que necesitan ser transformado. La entrega de fragmentos más grandes y más grandes de ADN (y por tanto las vías metabólicas más grandes) es un objetivo a corto plazo. Vías isoprenoides se hayan entregado en el cloroplasto por métodos biolísticos; otros grupos de genes, tales como vías de fijación de carbono alternativos están en el horizonte.

Pasos críticos dentro del Protocolo.

En asamblea Gibson, asegúrese de que las secuencias de molde no tienen homología entre sí excepto en los sitios de recombinación de destino.

En la transformación biolística de las plantas de Nicotiana, tener cuidado de mantener la pistola de genes de unos 10-15 cm por encima de las hojas de unnd mantener la presión de helio a 200-250 psi. Más cerca de lo que, a la frágil hoja va a explotar, y más lejos que que no van a estar bien transformadas. Dos días después de la transfección un moretón debe aparecer en la hoja si se transforma correctamente.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Jen Sheen, del Hospital General de Massachusetts por la generosa donación de plantones Nicotiana benthamiana. Jen Bush nos ayudó mucho en el asesoramiento en el cultivo de plantas y la creación de un área de la cámara de crecimiento. Tom Ferrante del Instituto Wyss ofreció ayuda decisiva con microscopía confocal. Los autores desean agradecer especialmente a Don Ingber del Hospital de Niños de Boston y el Instituto Wyss por la generosa donación de una pistola de genes y materiales asociados. Los fondos para este proyecto fueron proporcionados a través de un acuerdo de cooperación con el Departamento de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Energía (ARPA-E Award # DE-000079) para PAS, JCW, y Médicos del Mundo, y por medio de Chimerion Biotechnology, Inc. para MJV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligonucleotide primers IDT (custom) Design specifically for construct
GeneBlocks IDT (custom) 500 bp oligonucleotides
ApE software U Utah (download) http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit Qiagen 28004 Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kit Qiagen 27104 Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC Buffer NEB M0532S Used to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mix NEB E2611L Master mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5 Teknova T1075 Gibson assembly mix
1 M MgCl2 G Biosiences 82023-086 Gibson assembly mix
dNTP mix Fermentas R0192 Gibson assembly mix
1 M DTT Fermentas R0861 Gibson assembly mix
PEG-8000 Affymetrix 19966 Gibson assembly mix
NAD Applichem A1124,0005 Gibson assembly mix
T5 exonuclease Epicentre T5E4111K Gibson assembly mix
Phusion polymerase NEB F530S Gibson assembly mix
Taq DNA ligase NEB M0208L Gibson assembly mix
Gibthon.org Website to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kit Qiagen 12963 Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun system BioRad 165-2451 Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana (n/a) (n/a) Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscope Leica SP5 X MP Imaging of resultant cells
Deep well slides Electron Microscopy Sciences 71561-01 Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE) University of Utah http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/

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References

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