Transient espressione genica in tabacco con all'Assemblea Gibson e Gene Gun

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Summary

Questo lavoro descrive un nuovo metodo per selettivamente organelli subcellulari nelle piante, saggiata usando l'BioRad Gene Gun.

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Mattozzi, M. D., Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C. Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun. J. Vis. Exp. (86), e51234, doi:10.3791/51234 (2014).

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Abstract

Al fine di indirizzare una singola proteina a più organelli subcellulari, piante tipicamente duplicare i geni rilevanti, ed esprimono ogni gene separatamente utilizzando complesse strategie di regolamentazione, tra cui promotori differenziali e / o sequenze di segnali. Ingegneri metaboliche e biologi sintetici interessato a colpire enzimi per un particolare organello trovano ad affrontare una sfida: per una proteina che è da localizzare a più di un organello, il tecnico deve clonare il gene stesso più volte. Si presenta una soluzione a questa strategia: sfruttando splicing alternativo dell'mRNA. Questa tecnologia sfrutta cloroplasto stabilito e dei perossisomi mira sequenze e li combina in un unico mRNA che viene alternativamente impiombata. Alcune varianti di splicing vengono inviati al cloroplasto, alcuni al perossisoma, e alcuni al citosol. Qui il sistema è progettato per multipli organello targeting con splicing alternativo. In questo lavoro, GFP si aspettava di essere espressed nei cloroplasti, citosol, e perossisomi da una serie di razionalmente progettati 5 'tag mRNA. Questi tag hanno il potenziale per ridurre la quantità di clonazione necessaria quando i geni eterologhi devono essere espressi in più organelli subcellulari. I costrutti sono stati progettati in opera precedente 11, e sono stati clonati usando Gibson assembly, un metodo di clonazione indipendente legatura che non richiede enzimi di restrizione. I plasmidi risultanti sono stati introdotti in Nicotiana benthamiana celle foglia epidermica con un protocollo Gene Gun modificato. Infine, foglie trasformate sono state osservate con microscopia confocale.

Introduction

Questo lavoro è un progetto di ingegneria / biologia sintetica metabolica in cui le cellule vegetali sono progettati per esprimere una proteina reporter in diversi organelli ma solo con un singolo costrutto di DNA.

Un approccio per proteine ​​bersaglio a più di una posizione comporta clonazione più copie genetiche, ciascuna contenente un diverso peptide localizzazione. Ogni copia deve essere introdotto da successive ritrasformazione, o, in alternativa, da backcrossing singole trasformazioni 1. Ciò comporta la clonazione supplementare, ed è limitata da un tag di localizzazione per ogni terminale.

Un altro modo per localizzare una proteina a più riprese è attraverso splicing alternativo 2-5. RNA è trascritto da un singolo gene, ma diverse copie della trascrizione sono trattati in modo diverso, spesso in più di un modo per cella. Ciò può comportare più di un RNA messaggero nella cella trascritto da un singolo gene. Questi diversi messengeRNA R possono codificare per diverse isoforme della stessa proteina, o nel caso di un frameshift, una proteina diversa. Sebbene splicing alternativo è stato descritto in letteratura per molti anni, i meccanismi di azione e donatore conservati e splice siti recettoriali sono solo stati chiariti più recente 6. Poiché questi siti vengono meglio descritti, si aprono opportunità per l'ingegneria.

Gli ingegneri metaboliche delle piante si trovano ad affrontare una sfida quando esprime una proteina in più organelli. Per una proteina che è da localizzare a più organello, il tecnico deve clonare il gene stesso più volte, ciascuno con una sequenza segnale separato dirigendolo al organello di interesse. Per un singolo gene in tre organelli, questo è semplicemente tre geni. Ma per una via metabolica sei gene, questo si espande a 18 geni, un notevole sforzo di clonazione. La combinazione di più sequenze di localizzazione in un unico segno gene alternativa-impiombatoriduce ificantly questo sforzo. Ad esempio, re-engineering fotorespirazione 7,8 e sintesi isoprenoide 9,10 coinvolge sia i cloroplasti e perossisomi. Nel nostro caso abbiamo approfittato dei siti di splicing come osservato in un sistema di Arabidopsis thaliana naturale descritto in precedenza 6. Abbiamo razionalmente riprogettato la sequenza di mRNA di lasciare i siti di splicing naturali solo, ma messo sequenze che codificano tag-perossisomi rivolti-cloroplasto o all'interno introni alternativamente-splicing (Figura 1). La proteina espressa può o non può avere un tag, a seconda che il pre-mRNA che codifica è stato escisso come un introne (Figure 1g e 1h). Per ulteriori informazioni sulla progettazione dei costrutti presentati in questo lavoro, vedere l'articolo compagna 11.

Perché questo è ancora uno sforzo significativo clonazione, il montaggio Gibson, un nuovo metodo di clonazione costrutti di DNA, è used in costruzione. Il metodo Gibson può essere utilizzato per qualsiasi sequenza, indipendentemente siti di restrizione (Figura 2) 12-14. Il mix specifico di enzimi permette un solo passaggio, assemblaggio isotermica. In questo metodo, più parti a doppio filamento lineare di DNA sono progettati in modo tale che essi hanno sequenze sovrapposte di ~ 50 bp. L'assemblaggio miscela enzimatica Gibson digerisce parzialmente le parti di DNA lineari, esponendo singoli filamenti di sequenze omologhe. Questi parziali sequenze a singolo filamento sono ri-ricotti nella miscela di reazione, con un conseguente rapido, one-step, sequenza-indipendente, reazione subcloning privo di legatura.

Questo lavoro descrive 1) progettazione razionale costrutti splicing alternativo per l'espressione di cloroplasti delle piante, perossisomi, e citosol, 2) la loro clonazione utilizzando il nuovo metodo privo di legatura di riunione Gibson, 3) la loro consegna nelle cellule delle foglie di tabacco con Gene Gun, e 4) I risultati mostrano il targeting organelli, come osservato con GFPe microscopia confocale.

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Protocol

1. Progettazione di sequenze alternativa-splicing per multipla Organelle Targeting

  1. Determinare i siti per l'espressione finale di proteine. Per questo lavoro, l'interesse è in mira la cloroplasti, perossisomi, e citosol.
  2. Utilizzare la letteratura per identificare proteine ​​e DNA sequenze note di indirizzare le proteine ​​per organelli di interesse. In questo caso un cloroplasto di targeting sequenza di Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferasi 6,15, e un perossisomi mira sequenza di Arabidopsis thaliana transthyretin come S-allantoina sintasi 16,17 sono stati determinati.
  3. Identificare un regime-splicing alternativo che dovrebbe indirizzare le proteine ​​di interesse per gli organelli corretti. Per questo lavoro, splice siti come osservato in un sistema di Arabidopsis naturale 6. La sequenza di mRNA è stata ridisegnata lasciando i siti di splicing naturali, ma le sequenze sono stati collocati codifica peroxis-cloroplasto oome-targeting tag all'interno introni alternativamente-splicing (Figura 1).

2. Assemblea Gibson di parti di DNA

Vedi anche figura 2.

Il metodo di assemblaggio Gibson dipende dall'azione di numerosi enzimi in un mix pre-made a 1) parzialmente digerire le estremità del DNA a doppio filamento di rendere filamenti singoli e 2) ricottura paia di basi gratuiti della vicina pezzi di DNA. Questo permette la clonazione di frammenti di DNA senza le limitazioni dei siti di restrizione.

  1. Scegliere un ordine per gli elementi del costrutto di DNA plasmidico. Come esempio TriTag-1 ha elementi di: a) un vettore plasmidico (pori, contenente un costrutto GFP noto a lavorare in piante, un marcatore di resistenza alla kanamicina, e origini di replicazione di E. coli e Agrobacterium tumefaciens host), b) una sequenza promotore, (P ENTCUP2, mostrato come costitutivo in piante), C) un cloroplasto rivolti sequenza (CTS), c) una sequenza di targeting perossisomi (PTS), e d) una serie di siti di splicing come descritto in precedenza 6.
  2. Progettare la base-per-base costrutto con il software di progettazione in silico. Scimmia è un pacchetto freeware open source utile per questo lavoro.
    Nota: TriTag-1, ha l'ordine: plasmide vettore, promoter, ATG, sito di splice donatore, cloroplasti sequenza bersaglio, sito donatore di splicing, luogo neutro, accettore sito di splice, perossisomi sequenza bersaglio, accettore sito di splice, GFP contenute nel vettore plasmidico .
    1. Progettare il silico costrutto di DNA in modo tale che vi sia una sovrapposizione di 50 bp tra ogni pezzo al momento dell'ordine primer per PCR. È possibile utilizzare la sovrapposizione 50 bp come primer: 25 bp ciascuna direzione.
      1. Essere sicuri di tenere traccia della provenienza di ciascuno dei pezzi di sequenza. E 'come: un plasmide di essere coltivate e miniprepped; una sequenza lineare che può essere utilizzato come modello PCR; o una sequenza che dovrà esseresintetizzato in commercio? Diverse aziende offrono servizi di sintesi del DNA a basso costo per frammenti <500 bp. In questo caso, il TriTag sé è 437 bp quindi era vantaggioso per ordinare commercialmente.
      2. I migliori risultati arriveranno se tutti i frammenti siano PCR-amplificati e purificati dalla loro DNA template. Il marcatore di resistenza è un buon posto per dividere questo grande DNA in due modelli più piccoli che sono più facilmente PCR-amplificato.
      3. Di restrizione restrizione enzima DpnI taglia il DNA metilato. Se il modello di PCR era una miniprep da E. coli, trattamento DpnI rimuoverà il contaminante DNA stampo.
  3. Purificare tutte le sequenze di DNA separatamente ed eluire in acqua, TE o tampone EB.
    1. parte PORE vettore 1, ~ 3000 bp (frecce verdi). PCR amplificato e DpnI trattata.
    2. PORE vettore parte 2, ~ 3000 bp (frecce nere). PCR amplificato e DpnI trattata.
    3. TriTag inserto, 437 bp (frecce blu). Ordinato in commercio. Resuspend in DDH 2 O.
    4. P ENTCUP promotore, ~ 750 bp (frecce arancioni). PCR-amplificato e DpnI trattata.
  4. Misurare le concentrazioni di ciascuno dei pezzi di DNA. Obiettivo per 150 ng / ml dei pezzi di vettore.
  5. Prelevare un 'aliquota del mix di montaggio Gibson fuori dal freezer e scongelare sul ghiaccio. Questa è disponibile in commercio, ma anche di semplice realizzazione in laboratorio 12-14.
    1. Ci sono due passi per questa ricetta: a 5x master mix viscoso e 15 reazione dimensioni aliquote di 1.33x microlitri. Il master mix 5x contiene: 3 ml di 1 M Tris-HCl pH 7.5, 300 ml 1 M MgCl 2, 600 microlitri 10 mM di ciascun dNTP, 300 ml 1 M DTT, 1,5 g di PEG-8000, 20 mg di NAD, e DDH 2 O a 6 ml. Preparare 320 microlitri aliquote (18) e congelare tutti tranne uno a -20 ° C. La soluzione sarà molto viscoso. Etichettare questi "tampone isoterma 5X"
    2. Per quello rimanente (320 ml), aggiungere 1,2 microlitri T5 Exonuclease, 20 microlitri Phusion Alto-Fidelity DNA polimerasi, 160 microlitri Taq DNA Ligase e 700 ml DDH 2 O. Preparare 15 aliquote microlitri (~ 80) sul ghiaccio in provette per PCR e conservare a -20 ° C.
  6. Determinare il volume di quantità equimolari di ciascuno dei frammenti. Ci sono alcuni calcolatori online, tra cui Gibthon.org. Ci dovrebbe essere un totale di 5 ml di tutti i pezzi di DNA. Aggiungerli al 15 microlitri Gibson mix aliquota. Se questo richiede volumi troppo piccolo per pipetta, diluire i frammenti di DNA e / o utilizzare più di una aliquota.
    1. Non dimenticate di preparare un controllo del DNA vettore da solo (ad esempio, la parte di DNA che contiene il marcatore di resistenza agli antibiotici) e portare a volume con acqua.
  7. Incubare le provette in un termociclatore a 50-55 ° C per 30-60 minuti. Sostituire su ghiaccio e trasformare in E. coli attraverso le cellule chimicamente competenti shock termico. Non utilizzare cellule elettrocompetenti. La concentrazione di sale e la concentrazione di DNA relativamente bassapuò causare le cellule a arco.
    1. Applicare tutte le 20 microlitri di una preparazione commerciale di 200 microlitri di calcio cloruro competente E. coli.
      Incubare 30 min in ghiaccio e shock termico 60 sec a 42 ° C
    2. Ritorno al ghiaccio 2 min, applicare 750 microlitri SOC o terreno LB e recuperare agitazione in una provetta 30 minuti a 37 ° C. Piatto il composto e diluizioni adeguate LB + Kan (o altro antibiotico appropriato). Questo può tradursi in background maggiore (e un numero maggiore di eventi di ricombinazione non-target) rispetto ai tradizionali clonazione a base di legatura, ma vale la pena di schermo di circa 10 colonie.
  8. Conferma clone tramite sequenza e memorizzare una aliquota a -80 ° C

3. Biolistic trasfezione di tabacco con il Gene Gun

Questa è una tecnica che si instaura in JoVE 18,19. Passaggi chiave e le differenze sono descritte di seguito.

  1. Crescere 50-100 ml E. coli o 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep cultura. Una concentrazione di circa 1.500 ng / ml è necessaria per continuare.
  2. Preparare gene proiettili di pistola come descritto in precedenza. Caricarli nella Gene Gun.
  3. Per la trasfezione di Nicotiana benthamiana tabacco foglia tessuto epidermico, scegliere un grande foglia vicino alla base di un impianto di 3 mesi. Tagliare con cautela e metterlo lato inferiore su tovaglioli di carta bagnati in un piatto di 15 centimetri Petri.
  4. Impostare la pressione Lui per il Gene Gun a 200-250 psi.
  5. Orientare con attenzione la pistola genica tra nervature sul lato inferiore di una foglia, circa 3-5 cm sopra di esso. Rilasciare la sicurezza e fornire le particelle all'anta. Ogni proiettile può essere utilizzato per due volte nella stessa posizione sulla foglia. Se esplode foglia, scartano e avviare una nuova foglia-c'è qualche variazione in foglia tenacità a causa di condizioni di crescita, come l'età, l'umidità, ecc Per una foglia di 12 cm, si aspettano per adattarsi circa 6 colpi.
  6. Conservare la foglia, coperto con la parte superiore di unCapsula di Petri per 2-3 giorni in condizioni di scarsa luminosità in panchina.
  7. Esaminare la foglia in un microscopio dissezione dotato di fluorescenza UV, e la ricerca di singole cellule che esprimono GFP. Sezionare 5-10 mm sezioni di foglia.
  8. Immergere la foglia in un vetrino da microscopio ben profondità sotto ~ 200 microlitri 0,1% Triton X-100. Il detersivo aiuta a prevenire la formazione di bolle d'aria sulla superficie, e la profonda microscopio ben vetrino consente una grande area di esposizione del tessuto.

4. Microscopia confocale di Tissue trasfezionati

Queste istruzioni variano per ogni strumento, quindi è essenziale per ottenere adeguatamente formati.

  1. Per gli esperimenti di rivelazione di fluorescenza, impostare il laser di eccitazione a 489 nm, e impostare i rivelatori fotomoltiplicatori a 500-569 nm per GFP fluorescenza e 630-700 nm per la clorofilla auto-fluorescenza. Celle di immagine utilizzando un obiettivo 40x immersione in acqua.

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Representative Results

Lo sforzo progettuale è stato il risultato di una pianificazione significativa. Novel di questo progetto è l'uso di splicing alternativo per creare un pre-mRNA che viene tradotto in proteine ​​differenzialmente espressi. Queste proteine ​​sono espresse in diversi organelli, in questo caso il cloroplasti, perossisomi e / o citosol. Abbiamo adattato gene Arabidopsis naturale che viene alternativamente impiombato 6, e collocato conosciuti cloroplasto 6 e perossisomi 17 mira sequenze in esoni alternativi (TriTag-1 e TriTag-2). TriTag-3 è costituito da un segnale perossisomi incorporato all'interno di una regione a bassa complessità della sequenza cloroplasto. Questi sono stati collocati in frame con GFP (Figura 1).

I plasmidi utilizzati in questo studio, quindi, contenevano diversi elementi: il regime di splicing alternativo nativo dal gene PIMT2 6, cloroplasti e perossisomi rivolti sequenze, GFP, e una spina dorsale plasmide. Dal momento che ciascuno ha molto specific necessaria sequenza, un metodo sequenza-indipendente è necessario. Il protocollo assemblaggio Gibson 12,13 può essere usato su tutte le sequenze purché le parti costituenti sono progettati con similarità di sequenza tra loro, e non contengono sequenze ripetute. In breve, i frammenti di DNA lineari sono costruiti (tramite amplificazione PCR, sintesi commerciale, o digestione di un plasmide pre-made) tale che essi hanno ~ 50 bp di cumulo sequenza omologa (Figura 2). Quantità equimolare di ciascuno dei frammenti di DNA sono combinati in una singola provetta contenente la miscela assemblaggio Gibson, incubate a 50 ° C per un'ora, e trasformati in E. coli. I plasmidi derivanti dal protocollo di assemblaggio Gibson sono state confermate dal sequenziamento Sanger.

In questo studio i tre diversi costrutti GFP-organelli rivolti stati confrontati con GFP non etichettato e un GFP Rubisco-tag. Microscopia confocale è stato utilizzato per rilevare la fluorescenza GFP nel SIcellule NGLE transitoriamente trasformate. In esperimenti di controllo, l'espressione transiente osservata è stata correlata ai cloroplasti (facilmente identificabili dal autofluorescenza rosso di clorofilla), i nuclei (grande organelli che non è un cloroplasto e ha solo uno per cella), e / o piccoli organelli ritenuto perossisomi. Verde (GFP) e (clorofilla autofluorescenza) canali rosso sono stati sovrapposti per studiare la localizzazione intracellulare (Figura 3). Per una discussione più completa di questi risultati, si prega di consultare il nostro articolo compagno di 11.

Come previsto, in tutti e tre i costrutti di targeting duali, GFP è stata osservata nei cloroplasti (figura 4) in micrografie confocale overlay. TriTag-1 e TriTag-2 porta la GFP anche al citosol e il piccolo organello ritenuto perossisoma (figure 4a e 4b, rispettivamente). TriTag-3 obiettivi la GFP per solo cloroplasti e perossisomi, ma noncitosol (Figura 4c). Una sintesi dei risultati è diagrammed (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. Progettazione di costrutti di splicing alternativo per l'espressione organello differenziale in Nicotiana benthamiana. Splice schemi di (a) TriTag-1, (b) TriTag-2, e (c) TriTag-3 che mostra sequenze non di targeting (grigio), cloroplasto sequenze di targeting (verde chiaro), sequenze di targeting dei perossisomi (arancione), e la sequenza codificante GFP utilizzata in esperimenti di espressione transiente. TriTag-1 e TriTag-2 sono costituiti da costrutti di splicing alternativo; TriTag-3 è costituito da un segnale perossisomi incorporato all'interno di una regione a bassa complessità della sequenza cloroplasto. Sequenze di (e) TriTag-2, e (f) TriTag-3. Il codone ATG al termine di queste sequenze corrisponde alla GFP codone di inizio. Regioni di targeting alternativa giuntate sono sottolineate. Donatore e accettore dimeri sono sottolineate. Le sequenze di DNA luce verde derivano dalla PIMT2 5 'regione codificante e 6 comprendono sequenze codificanti la sequenza di targeting cloroplasto (verde). La luce sequenze di DNA arancione derivano dal TTL regione 5 '17 la codifica e comprendono sequenze codificanti la sequenza dei perossisomi di targeting (arancione). TriTag-3 è costituito da un segnale perossisomi incorporato all'interno di una regione a bassa complessità della sequenza cloroplasto. Schemi di mRNA finali che si ritiene essere espresso per (g) TriTag-1 e (h) TriTag-2. Ristampato con il permesso 11. Clicca qui per ingrandire image.

Figura 2
Figura 2 Schema di montaggio Gibson:.. Un nuovo metodo per l'assemblaggio di sovrapposizione di frammenti di DNA Il metodo di assemblaggio Gibson per plasmide costruzione 12,13 sta rapidamente sostituendo tradizionale clonazione restrizione-ligazione in molti laboratori. Essenzialmente, si può progettare un costrutto in silico che contiene il DNA di interesse esattamente, composto da prodotti PCR amplificati da varie fonti. Disegnare primer che sono complementari l'uno all'altro, e PCR-amplificare ogni frammento con i primer colorati. Aggiungere tutti i pezzi in un singolo tubo con la miscela enzimatica, e trasformare E. cellule competenti coli. Clicca qui per vedere limmagine arger.

Figura 3
Figura 3. Trattamenti di controllo bombardati in N. benthamiana cellule epidermiche foglia. (ac) GFP Senza tag. (a) canale verde. GFP senza tag viene espresso nel nucleo e intorno alla periferia cellulare, corrispondente al citosol, ma non il vacuolo. (B) cloroplasti rossi indicano autofluorescenza della clorofilla. (C) overlay. In questo costrutto fluorescenza si osserva nel nucleo e solo citosol, ma non i cloroplasti. (Df) controllo GFP-tagged cloroplasto. (D) del canale verde. GFP è espresso nelle grandi organelli, con una cella come descritto. (E) cloroplasti rossi indicano autofluorescenza di cloroophyll. (f) Overlay. In questo caso si osservano cloroplasti giallo, che indica che la GFP (green) è mirato al cloroplasto. Ristampato con il permesso 11. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 4
Figura 4. Tri-Tag-1, 2, 3 GFP targhetta fusa immagini. (A) Tri-Variabile1. In questo caso si osservano periferie cloroplasti giallo, che indica che la GFP è rivolto a cloroplasto. GFP si osserva anche nel citosol così come piccoli organelli puntiformi che possono essere perossisomi. (B) Tri-Tag2. In questo caso si osservano periferie cloroplasti giallo, che indica che la GFP è mirato per il c hloroplast. GFP si osserva anche nel citosol così come piccoli organelli puntiformi che possono essere perossisomi. (C) Tri-Tag3. In questo caso si osservano cloroplasti giallo, così come piccoli organelli puntiformi che possono essere perossisomi. Ma GFP non è osservata nel citoplasma. Ristampato con il permesso 11. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 5
Figura 5. Compartimenti di una cellula epidermica tipica foglia di tabacco. Ecco le loro dimensioni e posizioni all'interno della cellula relativi sono mostrati, ed i livelli di espressione relativi osservati tramite microscopia confocale. Ristampato con il permesso 11./ 51234/51234fig5highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Discussion

In questo studio, strategie semplici sono descritti per la localizzazione di una singola proteina transgenica a più compartimenti cellulari nelle piante. L'obiettivo era di progettare costrutto che esprimesse un singolo gene in più di un organello in Nicotiana benthamiana. Le strategie includono progettazione razionale di base di GFP-costrutti di DNA, il montaggio Gibson, la consegna dei plasmidi a celle foglia con il Gene Gun, e l'osservazione dei risultati con microscopia confocale.

Tre diversi, tag N-terminale brevi sono stati progettati per cloroplasto simultanea, perossisomi e citosol di targeting 11. Questi "TriTags" sono state progettate combinando naturalmente DNA che codificano mRNA splicing alternativo che dirigono le proteine ​​codificate sia al cloroplasto più citoplasma 6 o perossisomi più citoplasma 17. TriTag-3 non si basa su splicing alternativo e consiste in una sequenza cloroplasto rivolti in cui una naporzione strutturalmente non strutturati è stato sostituito con una sequenza di targeting perossisomica 15,17. La funzione TriTags in vivo di GFP in benthamiana cellule epidermiche foglia Nicotiana (Figura 5) bersaglio.

Micrografie confocale hanno mostrato che TriTag-1 e TriTag-2 porta GFP al cloroplasto, perossisomi, e citosol efficacemente, ma con preferenza per il cloroplasti e perossisomi, rispettivamente (figure 4a e 4b). TriTag-3 obiettivi GFP solo al cloroplasti e perossisomi, ma non citosol (Figura 4c). In tutto, questi tag possono ridurre il tempo e le risorse spesi per la clonazione di piante ingegneria metabolica, in particolare per coloro che necessitano di particolare espressione nei cloroplasti e perossisomi.

Modifiche e risoluzione dei problemi

I TriTags come attualmente costruiti sono abbastanza statici. Tuttavia, il underlying tecnologia, splicing alternativo per permettere la traduzione di diverse etichette specifiche della posizione, è flessibile. I cloroplasti e / o dei perossisomi tag specifici esistenti potrebbero essere modificati per qualsiasi altro organello, sia esso il percorso di secrezione, mitocondrio, un tag residenza ER, il vacuolo. Questi potrebbero anche essere combinati con i promotori tessuto-specifici, ad esempio per i semi, i fiori, le radici, le foglie, steli, ecc

Per un progetto come questo, il metodo di assemblaggio Gibson 12-14 di clonazione di costrutti è l'ideale. Si tratta di un semplice, potente strumento per subclonare qualsiasi sequenza senza le limitazioni dei siti di restrizione. Nelle reazioni one-step, il montaggio Gibson rapidamente creato i costrutti e controlli con il minimo sforzo nella clonazione. La tecnica di assemblaggio Gibson è quasi infinitamente modificabile per ogni sequenza desiderata finché le sequenze template possono essere PCR-amplificate. Sebbene in questo esempio l'assemblaggio Gibson è stato mostrato con un plasmide digerito, PCR, amplificando il vettore tende a funzionare meglio che utilizzare un miniprep digerito.

Il Gene Gun è un rapido, efficace metodo per trasfezione transiente di cellule, come è stato stabilito da questa rivista 18,19. Nicotiana benthamiana ha grandi foglie lobate, le cellule epidermiche, che sono entrambi ideali per trasfezione con il gene pistola, ma anche per osservando con microscopia confocale. Il protocollo per fare proiettili è ben stabilita. L'oro è stato usato come un microveicolo nella maggior parte degli esperimenti in letteratura finora, ma microcarriers tungsteno sono recentemente disponibili a basso costo.

Limitazioni di Tecniche

Una importante limitazione del metodo Gibson è la presenza di sequenze ripetute: più lungo della regione di sovrapposizione è il risultato meno prodotti collaterali. Digestione dei prodotti di PCR con DpnI dovrebbe rimuovere contaminanti templates plasmide; che di solito sono la fonte di latoprodotti. Gli enzimi digeriscono i frammenti di DNA da DNA a doppia elica in singolo filamento. La presenza di sequenze ripetute in prossimità delle estremità (~ 1 kb) dei frammenti di DNA aumenta notevolmente la possibilità di ricombinazione improprio. Come pure, ripete all'interno delle sequenze pongono anche un limite: non è noto, e difficile da controllare in che misura i mastica T5 exonuclease indietro DNA a singolo filamento. La rapida attività del esonucleasi è mitigato dalla temperatura di reazione elevata (50-55 ° C) eventualmente denaturazione dell'enzima, e la viscosità diminuendo il movimento complessivo nella soluzione. Per ulteriori fine-tuning della fasi di reazione, la sequenza e la legatura clonazione indipendente (SLIC) 20 è preferito.

Una limitazione importante della tecnica pistola gene è che produce solo nell'ordine da uno a dieci celle transitoriamente trasformate per evento di scatto.

Significative in relazione a metodi esistenti

La tecnica di assemblaggio Gibson sta vivendo una rapida adozione per la sua semplicità, la flessibilità e l'adattabilità. Si tratta di un protocollo più veloce rispetto ai tradizionali clonazione restrizione / legatura, e non richiede sequenze specifiche come quelle richieste per la digestione di restrizione. Esso non è limitato a due o tre frammenti di essere ricombinati; i ricercatori hanno dimostrato originali con successo fino a 10 parti, anche se con efficienza limitata. Per molti ricercatori montaggio Gibson fa per un maggior numero di cloni positivi.

Per ulteriori trasformanti con tecniche Biolistic, o per la creazione di tessuto callo trasformato, deve essere utilizzato l'uso di un dispositivo biolistic diffusore tipo (ad esempio il BioRad PDS-1000). Un metodo alternativo è Agrobacterium infiltrazione.

Applicazioni future

Montaggio Gibson permette cluster più grandi di DNA da assemblare, peril punto in cui non è stato osservato un limite massimo. Gli autori originali hanno utilizzato per assemblare diverse centinaia di kilobasi DNA 13.

La capacità di indirizzare selettivamente organelli multipli con un singolo costrutto genetico ha il potenziale di diminuire il numero di geni che devono essere trasformate. La consegna di frammenti più grandi di DNA (e quindi grandi vie metaboliche) è un obiettivo a breve termine. Percorsi isoprenoidi sono stati consegnati al cloroplasto con metodi Biolistic; altri gruppi di geni come percorsi alternativi fissazione del carbonio sono all'orizzonte.

Fasi critiche all'interno del protocollo.

Nel montaggio Gibson, assicurarsi sequenze template non hanno omologia tra loro eccetto nei siti di ricombinazione bersaglio.

In biolistic trasformazione delle piante di Nicotiana, fare attenzione a tenere l'arma gene circa 10-15 cm sopra le foglie di unnd mantenere la pressione elio a 200-250 psi. Più vicino di così, la foglia fragile esploderà, e più lontano che non saranno ben trasformate. Due giorni dopo la transfezione un livido dovrebbe apparire sulla foglia se è adeguatamente trasformata.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Jen Sheen del Massachusetts General Hospital per la generosa donazione di piantine di Nicotiana benthamiana. Jen Bush ci ha aiutato molto nella consulenza in coltivazione di piante e la creazione di una zona di camera di crescita. Tom Ferrante dell'Istituto Wyss offerto aiuto cruciale con microscopia confocale. Gli autori desiderano soprattutto ringraziare Don Ingber del Children Hospital di Boston e l'Istituto Wyss per la generosa donazione di una pistola Gene e relative forniture. Il finanziamento per questo progetto è stato fornito attraverso un accordo di cooperazione con il Dipartimento dell'Energia Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) per la PAS, JCW, e MdM, e attraverso Chimerion Biotechnology, Inc. per MJV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligonucleotide primers IDT (custom) Design specifically for construct
GeneBlocks IDT (custom) 500 bp oligonucleotides
ApE software U Utah (download) http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit Qiagen 28004 Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kit Qiagen 27104 Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC Buffer NEB M0532S Used to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mix NEB E2611L Master mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5 Teknova T1075 Gibson assembly mix
1 M MgCl2 G Biosiences 82023-086 Gibson assembly mix
dNTP mix Fermentas R0192 Gibson assembly mix
1 M DTT Fermentas R0861 Gibson assembly mix
PEG-8000 Affymetrix 19966 Gibson assembly mix
NAD Applichem A1124,0005 Gibson assembly mix
T5 exonuclease Epicentre T5E4111K Gibson assembly mix
Phusion polymerase NEB F530S Gibson assembly mix
Taq DNA ligase NEB M0208L Gibson assembly mix
Gibthon.org Website to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kit Qiagen 12963 Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun system BioRad 165-2451 Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana (n/a) (n/a) Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscope Leica SP5 X MP Imaging of resultant cells
Deep well slides Electron Microscopy Sciences 71561-01 Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE) University of Utah http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/

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References

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