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रिसोर्स लिमिटेड सेटिंग्स के लिए एक किफायती एचआईवी -1 औषध प्रतिरोध निगरानी पद्धति

Medicine
 

Summary

एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (एआरटी) में नाकाम रहने एचआईवी -1 से संक्रमित व्यक्तियों के लिए दवा प्रतिरोध परीक्षण के भविष्य के उपचार के लिए गाइड और उपचार के परिणामों में सुधार कर सकते हैं. उच्च एचआईवी व्याप्ति लेकिन सीमित संसाधनों वाली स्थितियों में अनुकूलन व्यक्तिगत और जनसंख्या स्वास्थ्य परिणाम अंततः सस्ती और सुलभ दवा प्रतिरोध जीनोटाइपिंग और व्याख्या के तरीकों की आवश्यकता होगी.

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Manasa, J., Danaviah, S., Pillay, S., Padayachee, P., Mthiyane, H., Mkhize, C., Lessells, R. J., Seebregts, C., de Wit, T. F., Viljoen, J., Katzenstein, D., De Oliveira, T. An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings. J. Vis. Exp. (85), e51242, doi:10.3791/51242 (2014).

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Abstract

एचआईवी -1 दवा प्रतिरोध को गंभीरता से एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (एआरटी) के प्रभाव और प्रभाव समझौता करने की क्षमता है. उप सहारा अफ्रीका में एआरटी कार्यक्रम का विस्तार जारी है, एआरटी पर व्यक्तियों बारीकी से दवा प्रतिरोध के उद्भव के लिए निगरानी की जानी चाहिए. एआरटी के लिए पहले से ही प्रतिरोधी वायरल उपभेदों के प्रसारण पर नज़र रखने के लिए प्रेषित दवा प्रतिरोध की निगरानी भी महत्वपूर्ण है. जीनोटाइपिंग महंगा है और परिष्कृत प्रयोगशाला और डेटा प्रबंधन के बुनियादी ढांचे की आवश्यकता है, क्योंकि दुर्भाग्य से, दवा प्रतिरोध परीक्षण, अभी भी संसाधन सीमित सेटिंग में आसानी से सुलभ नहीं है. व्यक्तियों का प्रबंधन और संचरित दवा प्रतिरोध का आकलन करने के लिए एक खुला उपयोग genotypic दवा प्रतिरोध निगरानी विधि वर्णित है. विधि दवा प्रतिरोध पैटर्न की व्याख्या और व्यक्तिगत रोगी रिपोर्ट की पीढ़ी के लिए नि: शुल्क खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है. जीनोटाइपिंग प्रोटोकॉल ए वी के साथ प्लाज्मा नमूनों के लिए 95% से अधिक की एक प्रवर्धन दर हैiral लोड> 1,000 एचआईवी -1 शाही सेना प्रतियां / एमएल. संवेदनशीलता वायरल लोड <1,000 एचआईवी -1 शाही सेना प्रतियां / एमएल के लिए काफी कम हो जाती है. यहाँ वर्णित विधि संयुक्त राज्य अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए), Viroseq जीनोटाइपिंग विधि द्वारा अनुमोदित परीक्षण एचआईवी -1 दवा प्रतिरोध की एक विधि के खिलाफ मान्य किया गया था. यहाँ वर्णित विधि की सीमाओं यह स्वचालित है और यह एक ही पैनल से उपप्रकार ए और बी परिलक्षित हालांकि यह भी नमूने की एक मान्यता पैनल से परिसंचारी पुनः संयोजक फार्म CRF02_AG बढ़ाना करने में विफल रहा है कि नहीं है कि तथ्य शामिल हैं.

Introduction

दक्षिणी अफ्रीका में एचआईवी की महामारी विशेष रूप से दक्षिण अफ्रीका 2, 3 में, एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (एआरटी) पर व्यक्तियों में एक सहवर्ती घातीय वृद्धि के साथ तेजी से 1 विकसित किया गया है. घटना 4 को कम करने और सीमित संसाधनों वाली स्थितियों में जीवन प्रत्याशा (आरएलएस) 5 बढ़ाने में बड़े पैमाने पर इलाज के कार्यक्रमों के महामारी विज्ञान के प्रभाव पर साक्ष्य के रूप में जमा करने के लिए जारी है, एआरटी कवरेज बढ़ाने के लिए प्रयास तेज कर दिया जाएगा. परीक्षण और इलाज के कार्यक्रमों के तहत एक निवारण उपकरण 6, 7 के रूप में उपचार के उपयोग की दिशा में दिशा निर्देशों का विकास उपचार पर व्यक्तियों की पूर्ण संख्या के आगे बढ़ाने जाएगा. लोगों की बड़ी संख्या एआरटी पर व्यक्तियों की औसत जीवन प्रत्याशा एचआईवी असंक्रमित जनसंख्या 8 की कि nears के रूप में समय की लंबी अवधि के लिए एआरटी पर होगा. एचआईवी दवा प्रतिरोध के विकास और प्रसारण alwa हैवाईएस एआरटी 9-12 की उपलब्धियों के लिए खतरा माना गया. इस प्रकार, अधिक व्यक्तियों एआरटी पर शुरू कर रहे हैं के रूप में अधिक कठोर निगरानी और दवा प्रतिरोध की निगरानी के लिए एक की जरूरत है.

Genotypic दवा प्रतिरोध (जीआरटी) के परीक्षण की निगरानी के लिए और साथ ही कला प्राप्त व्यक्तियों में एचआईवी -1 दवा प्रतिरोध की निगरानी दोनों, विकसित देशों में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. इन सेटिंग्स में, जीआरटी एचआईवी -1 से संक्रमित व्यक्तियों के लिए देखभाल के सातत्य में एकीकृत किया गया है. ज्यादातर अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों वयस्क या एआरटी (पहली पंक्ति और दूसरी लाइन) 13-15 में नाकाम रहने के बाल चिकित्सा रोगियों के लिए जीआरटी की सलाह देते हैं, बाल चिकित्सा मां से बच्चे को संचरण (PMTCT) regimens की रोकथाम के संपर्क में रोगियों लेकिन बाद में 16 संक्रमित है, और साथ सेटिंग में तीव्रता से संक्रमित व्यक्तियों 13-15 के बीच संचरित दवा प्रतिरोध के उच्च स्तरों. हालांकि, लागत, प्रौद्योगिकी, और बुनियादी सुविधाओं की आवश्यकताओं implemen सीमित हैआरएलएस में दवा प्रतिरोध निगरानी के लिए इसी तरह के दृष्टिकोण के tation.

दक्षिण अफ्रीकी एचआईवी उपचार और निगरानी के दिशा निर्देशों वर्तमान में पहली पंक्ति 17 regimens में नाकाम रहने के व्यक्तियों के लिए कला का मार्गदर्शक चुनाव में जीआरटी के इस्तेमाल की सिफारिश नहीं है. व्यक्तियों मुख्यतः विषाणुजनित (एचआईवी -1 शाही सेना वायरल लोड) मापदंडों के आधार पर बदल रहे हैं. हालांकि 2012 में, दक्षिणी अफ्रीकी एचआईवी चिकित्सकों सोसायटी पहले दक्षिणी अफ्रीकी एआरवी दवा प्रतिरोध परीक्षण के दिशा निर्देश 18 को प्रकाशित किया. ये दिशानिर्देश पहली पंक्ति और दूसरी लाइन कला में नाकाम रहने के सभी वयस्कों के लिए और PMTCT 18 से अवगत कराया संक्रमित शिशुओं और बच्चों के लिए जीआरटी जांच की सिफारिश. दक्षिणी अफ्रीका 19-29 में संचरित दवा प्रतिरोध के उच्च स्तर के लिए कोई मौजूदा सबूत नहीं है क्योंकि हालांकि, जीआरटी तीव्रता से संक्रमित व्यक्तियों के लिए 18 की सिफारिश नहीं है. यह इन सिफारिशों में से कुछ राष्ट्रीय Tre में समय के साथ एकीकृत किया जाएगा कि उम्मीद हैक्षेत्र में विभिन्न देशों की atment और निगरानी दिशा निर्देशों. पहले से ही 2013 में दक्षिण अफ्रीका के उपचार दिशानिर्देशों में वयस्कों के लिए दूसरी पंक्ति की विफलता के समय में और बच्चों को 30 के लिए पहली या दूसरी लाइन गड़बड़ी आधारित आहार विफलता के समय जीआरटी की सिफारिश क्यों मौजूद है.

यह दक्षिण अफ्रीका में उपचार दिशानिर्देशों में जीआरटी शामिल संभावित लागत तटस्थ होगा कि दिखाया गया है. सही मायने में दूसरी पंक्ति उपचार के लिए बंद किए जाने की जरूरत वाले मरीजों की पहचान के लिए जीआरटी का उपयोग, अपेक्षाकृत अधिक महंगा पहली पंक्ति दवाओं की तुलना में कर रहे हैं जो दूसरी पंक्ति आहार दवाओं की लागत को ध्यान में रखते कार्यक्रम के लिए कोई अतिरिक्त लागत नहीं होगी. इसके अलावा, जीआरटी भी, विफलता के लिए अन्य कारणों की पहचान के उपचार के विकल्प के संरक्षण और उभरते प्रतिरोध पैटर्न 31 के बारे में जानकारी उत्पन्न कर सकते हैं. इसलिए, यह आगे भी उपयोग, देखभाल एक की गुणवत्ता में सुधार के क्रम में दवा प्रतिरोध निगरानी तरीकों की लागत को कम करने के लिए आवश्यक हैडी परिणामों.

यहाँ, हम रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और अनुक्रमण (1 टेबल), साथ ही दवा प्रतिरोध व्याख्या के लिए ज्यादातर खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के लिए जेनेरिक (ओपन सोर्स) प्राइमरों का उपयोग करने के लिए बनाया गया एक जीआरटी विधि प्रस्तुत करते हैं. नैदानिक ​​प्रबंधन के लिए, प्रोटोकॉल राष्ट्रीय उपचार दिशानिर्देशों के करीब पालन के साथ प्रयोगशाला दवा प्रतिरोध की रिपोर्ट के विशेषज्ञ व्याख्या के साथ एक व्यापक समीक्षा की और रिपोर्टिंग विधि द्वारा बधाई दी है. प्रोटोकॉल चार विभिन्न घटकों में विभाजित है, 1) एचआईवी Ribonucleic एसिड (आरएनए) निकालना, 2) रिवर्स प्रतिलेखन और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) वायरल लक्ष्य के प्रवर्धन, 3) अनुक्रमण और chromatograms, संरेखण के विश्लेषण के लिए 4) जैव सूचना विज्ञान के तरीकों, curation और अनुक्रम डेटा की व्याख्या.

Protocol

1. Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) पूरे रक्त प्रसंस्करण

नोट: रक्त तुरंत का संग्रह कोई अधिक से अधिक 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है के बाद कार्रवाई की जा सकती.

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करते हुए, EDTA पूरे रक्त के नमूने कमरे के तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं.
  2. प्रत्येक नमूने के लिए, नमूना पहचान (आईडी), भंडारण सामग्री (प्लाज्मा), और तारीख के साथ काफी cryovials लेबल.
  3. 1000 x जी पर 10 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र. अपकेंद्रित्र को रोकने के लिए ब्रेक का उपयोग न करें. प्लेटलेट्स सहित और एरिथ्रोसाइट्स, - एक बहुत पतली परत - प्लाज्मा, ल्यूकोसाइट (Buffy कोट): यह तीन परतों (ऊपर से नीचे तक) निकलेगा.
  4. ध्यान से प्रत्येक cryovial में सतह पर तैरनेवाला (प्लाज्मा) और विभाज्य 500 मिलीलीटर महाप्राण. सेल परत (Buffy कोट) को बाधित करने या किसी भी कोशिकाओं को हस्तांतरण नहीं ख्याल रखना.
  5. शाही सेना निकासी के लिए जब तक जरूरत -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या तुरंत शाही सेना निकासी के लिए आगे बढ़ें.
ve_title "> 2. शाही सेना निष्कर्षण

  1. सकारात्मक और नकारात्मक प्लाज्मा नियंत्रण सहित निकाले नमूनों की आईडी के साथ एक निष्कर्षण वर्कशीट तैयार करें.
  2. प्रत्येक नमूने निकाले जाने के लिए, नमूना आईडी, निकासी की तारीख और "शाही सेना" के साथ एक 1.5 एमएल बाँझ microcentrifuge ट्यूब लेबल. इसके अलावा एक इकट्ठे स्तंभ और संग्रह ट्यूब के साथ ही निकासी वर्कशीट से इसी संख्या के साथ काम lysis समाधान युक्त 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब लेबल.
  3. जैव सुरक्षा कैबिनेट में कार्य करना, काम कर lysis समाधान की इसी 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब 200 μl नमूना जोड़ें.
  4. भंवर अच्छी तरह से और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. 10 मिनट के बाद, संक्षेप में ट्यूब अपकेंद्रित्र.
  6. ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए पूर्ण इथेनॉल की 800 मिलीलीटर जोड़ें.
  7. पल्स vortexing और संक्षिप्त अपकेंद्रित्र से मिलाएं.
  8. इसी कॉलम / संग्रह ट्यूब विधानसभा के लिए इस समाधान के 600 μl स्थानांतरण. 6000 X पर अपकेंद्रित्र1 मिनट के लिए जी.
  9. एक नया संग्रह ट्यूब स्तंभ स्थानांतरण और छानना युक्त पुराने संग्रह ट्यूब त्यागें. दो बार अधिक ऊपर 2.8 कदम (ऊपर) दोहराएँ.
  10. 1 मिनट के लिए 6000 XG पर प्रत्येक स्तंभ अपकेंद्रित्र 500 μl धो बफर AW1 जोड़ें.
  11. छानना और संग्रह ट्यूब त्यागें और एक नया संग्रह ट्यूब स्तंभ हस्तांतरण.
  12. जोड़ें 500 μl 3 मिनट के लिए 20,000 XG पर बफर AW2 और अपकेंद्रित्र था. कदम 2.11 दोहराएँ.
  13. एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए 20,000 XG पर एक नया संग्रह ट्यूब में अपकेंद्रित्र.
  14. 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में छानना और जगह स्तंभ त्यागें.
  15. आप स्तंभ के किनारे पर तरल बांटना नहीं है यह सुनिश्चित करना कि स्तंभ के बीच करने के लिए 60 μl बफर AVE (RNase मुफ्त पानी) जोड़ें.
  16. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  17. 2 मिनट के लिए 6000 XG पर अपकेंद्रित्र.
  18. स्तंभ त्यागें और 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब टोपी.
  19. नमूने अब लौ के लिए तैयार हैंएसई प्रतिलेखन.
  20. परीक्षण के 6 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत दुकान का प्रदर्शन किया जा रहा है. परीक्षण में देरी हो रहा है हालांकि, अगर फिर तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस जगह है. नायब: फ्रीज नहीं है / 3x से अधिक नमूने पिघलना.

3. रिवर्स प्रतिलेखन के लिए अभिकर्मक तैयार

  1. शुरू करने से पहले, सकारात्मक और नकारात्मक प्लाज्मा नियंत्रण, सहित कार्रवाई की जा रही नमूनों की संख्या के लिए आवश्यक अभिकर्मकों में से प्रत्येक की मात्रा की गणना. इसके अलावा एक अभिकर्मक नियंत्रण जोड़ें.
  2. 3.1 कदम से गणना संस्करणों का प्रयोग (ऊपर), संक्षेप में पल्स vortexing द्वारा पीछा किया एक स्वच्छ, बाँझ 200 μl पीसीआर ट्यूब में deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) प्राइमर मिश्रण तैयार करें. प्रत्येक नमूना, रिवर्स प्राइमर RT21 के 0.5 μl और dNTP के 0.5 μl है 2 टेबल देखना चाहिए.
  3. 200 μl पीसीआर ट्यूब को dNTP-प्राइमर मिश्रण से विभाज्य 1.0 μl.
  4. 1 μ जोड़कर रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस तैयार (आरटी) एंजाइम मिश्रण; 10x रिवर्स प्रतिलेखन बफर के एल, 0.1M डीटीटी का 1 μl और vortexing और संक्षेप में centrifuging द्वारा पीछा एक बाँझ ट्यूब 25mm 2 MgCl के 2 μl, 3 टेबल देखें.
  5. 0.5 μl RNAseOUT और सुपरस्क्रिप्ट III एंजाइम मिश्रण ट्यूब को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एंजाइमों से प्रत्येक में जोड़ें तो मिश्रण करने के लिए धीरे ट्यूब नल.
  6. एक ठंड ब्लॉक पर dNTP-प्राइमर घोला जा सकता है और एंजाइम मिश्रण के साथ ट्यूबों रखें और शाही सेना स्टेशन के लिए कदम.

4. रिवर्स प्रतिलेखन

  1. संक्षेप में मिश्रण करने के लिए vortexing द्वारा पीछा dNTP-प्राइमर मिश्रण ट्यूब को शाही सेना के नमूने की 6 μl जोड़ें.
  2. शाही सेना के अलावा के बाद, dNTP / प्राइमर / आरएनए मिश्रण और आरटी एंजाइम एक ठंड ब्लॉक या बर्फ पर ट्यूबों मिश्रण दोनों के साथ पीसीआर कमरे में कदम.
  3. संक्षिप्त (4.2 कदम से) dNTP / प्राइमर / आरएनए मिश्रण ट्यूबों अपकेंद्रित्र और एक thermocycler में उन्हें जगह है.
  4. शाही सेना denature के लिए 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर हीट.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए तेजी से शांत, 2 के लिए पकड़मि.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस, जबकि अभी भी thermocycler रोकें, ट्यूब बाहर ले.
  7. एक ठंड ब्लॉक पर ट्यूब रखते हुए जल्दी एंजाइम मिश्रण के 5 μl जोड़ें.
  8. ट्यूब दोहन द्वारा धीरे मिलाएं तो संक्षेप ट्यूबों अपकेंद्रित्र और thermocycler पर लौटें.
  9. रिवर्स प्रतिलेखन रोकने के लिए 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम विकृतीकरण द्वारा पीछा आरएनए नक़ल रिवर्स करने के लिए 60 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब पकड़ो.
  10. 37 डिग्री सेल्सियस के कूल जैसे ही तापमान 37 डिग्री सेल्सियस तक हो जाता है, ठहराव और thermocycler के बाहर ट्यूब ले.
  11. जल्दी ट्यूबों को RNase एच के 0.5 μl जोड़ने और thermocycler पर लौटें.
  12. 20 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस तक तो शांत के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पकड़
  13. पूरक डीएनए (सीडीएनए) तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या जब तक जरूरत -20 डिग्री सेल्सियस या ठंडा पर संग्रहित किया जा सकता है. हालांकि, सीडीएनए की लंबी अवधि के भंडारण -80 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए

5. पीसीआर के लिए अभिकर्मक तैयार

  1. Befoशुरू कर रहे हैं, कार्रवाई की जा रही नमूने और नियंत्रण की संख्या के लिए आवश्यक अभिकर्मकों में से प्रत्येक की मात्रा की गणना. तीन नियंत्रण (सकारात्मक, नकारात्मक, और अभिकर्मक) के अलावा, आप भी एक पीसीआर नियंत्रण (एचआईवी डीएनए) जोड़ सकते हैं. पहले और दूसरे दौर पीसीआर घोला जा सकता है एक साथ तैयार किया जा सकता है और जब तक जरूरत दूसरा मास्टर मिश्रण -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. घोला जा सकता है लगभग 8 घंटे के लिए भंडारित किया जा सकता है.
  2. तालिका 4 और भंवर पर दिखाया के रूप में 18.4 μl पानी, 2.5 μl 10x बफर, 1.0 μl 2 MgCl, 0.5 μl dNTPs, और प्राइमरों में से प्रत्येक के 0.25 μl जोड़ें.
  3. प्लेटिनम Taq पोलीमरेज़ (5U/μl) के 0.1 μl जोड़ें और धीरे यह दोहन से ट्यूब मिश्रण.
  4. 200 μl पीसीआर ट्यूब के लिए मास्टर मिश्रण की विभाज्य 23 μl.
  5. एक ठंड ब्लॉक या पीसीआर कमरे में बर्फ कदम पर मास्टर मिश्रण ट्यूबों के साथ.

6. नेस्टेड पीसीआर

  1. 1 दौर पीसीआर Maste की 23 μl के लिए सीडीएनए के 2 μl जोड़ेंआर मिश्रण.
  2. , ट्यूब बंद करें thermocycler में नमूने डाल दिया है और निम्नलिखित पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति का उपयोग: 2 मिनट के लिए 2 मिनट, 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 20 सेकंड के लिए 58 डिग्री सेल्सियस, और 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, चित्रा 1 पर दिखाया के रूप में 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम extention द्वारा पीछा किया.

चित्रा 1
चित्रा 1. नेस्टेड पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

  1. 2 दौर पीसीआर चरण के लिए जारी रखें या एक बाद में मंच पर जब तक आवश्यक -20 डिग्री सेल्सियस या ठंडा में 1 दौर पीसीआर उत्पादों की दुकान.
  2. 2 दौर पीसीआर के लिए, 2 दौर पीसीआर मास्टर मिश्रण एक के 23 μl के लिए 1 दौर पीसीआर उत्पाद के 2 μl जोड़नेचित्रा 1 पर एक ही पीसीआर प्रोग्राम का उपयोग घ.

7. जेल वैद्युतकणसंचलन

  1. जेल तैयारी
    1. एक 250 मिलीलीटर कांच फ्लास्क agarose गोली की 0.5 ग्राम जोड़ें और कुप्पी 1x TBE बफर के 50 एमएल जोड़ें.
    2. उबलते के लिए माइक्रोवेव में गर्मी; पूरी तरह से solubilized तक अक्सर (लगभग हर 30 सेकंड) ज़ुल्फ़. एक सिलिकॉन पकड़ या सिलिकॉन का उपयोग ओवन गर्म कुप्पी काबू करने के लिए दस्ताने. agarose समाधान इस प्रक्रिया की निगरानी इतनी बारीकी से बहुत आसानी से कुप्पी से बाहर उबाल कर सकते हैं.
    3. लगभग 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शांत.
    4. उचित आकार कंघी युक्त एक जेल कास्टिंग ट्रे में agarose डालो, जेल में लगभग 20-30 मिनट का उपयोग करने के लिए तैयार है.
    5. वैद्युतकणसंचलन चैम्बर में जेल प्लेस और निर्माता से सिफारिश के रूप में चला रहे हैं.
  2. जेल वैद्युतकणसंचलन और दृश्य.
    1. 10 सेकंड के लिए भंवर उपन्यास के रस का प्रयोग करने से पहले.
    2. डी के 5 μl के साथ उपन्यास के रस 1 μl पतलाएनए नमूना और मिश्रण.
    3. आणविक वजन मार्कर के 3 μl के साथ उपन्यास के रस का 3 μl पतला और मिश्रण.
    4. वर्गों (ऊपर) 7.2.2 और 7.2.3 से मिक्स लोड और पीसीआर प्रवर्धन का मूल्यांकन करने के लिए 40 मिनट के लिए 100 वी और 400 मा जेल चला रहे हैं.
    5. सकारात्मक प्रवर्धन 1,315 बीपी टुकड़ा, चित्रा 2 के रूप में पराबैंगनी प्रकाश के तहत देखे जा सकते हैं.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. 1% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन और एक 200 बीपी सीढ़ी का उपयोग करते हुए पीसीआर प्रवर्धन की जेल पुष्टि. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    1. इस प्रकार संदूषण के अभाव का संकेत नकारात्मक और अभिकर्मक नियंत्रण में कोई प्रवर्धन होना चाहिए.

    8. पीसीआर उत्पाद सफाई

    1. अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए तैयार करने में, सकारात्मक दूसरे दौर पीसीआर उत्पादों PureLink पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर साफ कर रहे हैं.
    2. पीसीआर उत्पाद और पिपेट मिश्रण की 20 μl के लिए बाध्य बफर उच्च कटौती (बी 3) काम करने का 80 μl जोड़ें.
    3. एक संग्रह ट्यूब में एक स्पिन स्तंभ के लिए बाध्य बफर के साथ मिश्रित नमूना जोड़ें.
    4. 1 मिनट के लिए 10,000 XG पर स्तंभ अपकेंद्रित्र. एक नया संग्रह ट्यूब में स्तंभ स्थानांतरण.
    5. इथेनॉल के साथ धोने बफर के 650 μl के साथ स्तंभ धो लें.
    6. 1 मिनट के लिए 10,000 XG पर स्तंभ अपकेंद्रित्र. एक नया संग्रह ट्यूब में स्तंभ स्थानांतरण.
    7. किसी भी अवशिष्ट धो बफर दूर करने के लिए 2-3 मिनट के लिए अधिकतम गति पर स्तंभ अपकेंद्रित्र.
    8. किट के साथ आपूर्ति की एक साफ 1.7 मिलीलीटर क्षालन ट्यूब में स्पिन स्तंभ रखें.
    9. स्तंभ के केंद्र के लिए क्षालन बफर के 40 μl जोड़ें और कमरे temperatur में स्तंभ सेते1 मिनट के लिए ई.
    10. 2 मिनट (> 10,000 XG) के लिए अधिकतम गति पर स्तंभ अपकेंद्रित्र.
    11. क्षालन ट्यूब अनुक्रमण के लिए अपने शुद्ध पीसीआर उत्पाद तैयार होता है. स्तंभ त्यागें.
    12. एक Nanodrop का उपयोग डीएनए की एकाग्रता और गुणवत्ता का निर्धारण.
    13. कोई घर में अनुक्रमण सुविधा उपलब्ध है, तो शुद्ध पीसीआर उत्पादों इस स्तर पर एक वाणिज्यिक अनुक्रमण प्रयोगशाला में भेजा जा सकता है.

    9. अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं

    1. पीसीआर उत्पादों बड़ा डाई टर्मिनेटर किट संस्करण 3.1 और प्रत्येक नमूने के लिए 4 प्राइमरों (आगे दो और दो रिवर्स) का उपयोग कर अनुक्रम रहे हैं. प्राइमर दृश्यों तालिका 2 में दिखाया गया. इसलिए, अनुक्रमण चलाने के बाद, प्रत्येक नमूना एक contig में इकट्ठा किया जा करने के लिए चार दृश्यों होगा.
    2. चार प्राइमरों से प्रत्येक के लिए 5 तालिका में संकेत के रूप में अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं सेट करें.
    3. उपयोग से पहले vortexing द्वारा अनुक्रमण बफर और प्राइमरों मिलाएं.
    4. मिश्रणबड़ा डाई अनुक्रमण के अलावा पहले पानी, बफर और प्राइमर. Vortexing द्वारा मिलाएं.
    5. धीरे ट्यूब inverting या धीरे यह दोहन से बड़ा डाई अनुक्रमण मिश्रण जोड़ने के बाद मास्टर मिश्रण मिश्रण.
    6. एक 96 अच्छी तरह से ऑप्टिकल थाली में मास्टर मिश्रण की अशेष 9 μl.
    7. चित्रा 3 नीचे संकेत के रूप में थाली की स्थापना की 24 नमूने / प्लेट, चलाने के लिए.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. 12 रोगी के नमूने 4 प्राइमरों प्रत्येक (RTC1F, RTC2R, RTC3F, और RTC4R) के साथ अनुक्रम होने के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली की योजना प्रतिनिधित्व. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    1. डीएनए नमूने (~ 20-40 एनजी) के 1.0 μl जोड़ें, एक साथ प्लेट कवरn एल्यूमीनियम कवर चिपकने वाला और फिर धीरे यह मिश्रण.
    2. 1 मिनट के लिए 3000 XG पर अपकेंद्रित्र. एल्यूमीनियम कवर निकालें और एक रबर सील चटाई जोड़ें.
    3. Thermocycler पर थाली प्लेस और 4 चित्र में दिखाया निम्नलिखित साइकिल कार्यक्रम चलाते हैं.

    चित्रा 4
    चित्रा 4. अनुक्रमण के लिए पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    1. पीसीआर समाप्त करता है, तुरंत अनुक्रमण उत्पाद को साफ.

    10. अनुक्रमण सफाई

    1. प्रत्येक अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए, 50 μl पूर्ण इथेनॉल और 5 μl 3 एम सोडियम एसीटेट मिश्रण.
    2. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, 55 जोड़ और# 956; प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सोडियम एसीटेट / EtOH के समाधान के एल.
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से ठीक से बंद कर रहा है यह सुनिश्चित करना कि चिपकने वाला एल्यूमीनियम कवर के साथ कुओं सील.
    4. 20 मिनट के लिए 3000 XG पर अपकेंद्रित्र.
    5. 20 मिनट के बाद, कवर हटाने और (इस गोली हटाना होगा के रूप में सतह पर तैरनेवाला से छुटकारा पाने के धमाके नहीं है!) एक जोड़ प्रयोगशाला ऊतक पर, एक निर्बाध गति में, थाली पलटना.
    6. 2 मिनट के लिए 150 XG पर एक ही ऊतक पर उल्टे थाली अपकेंद्रित्र.
    7. तुरंत EtOH के 150 μl ठंड 70% जोड़ें. इस चरण में इथेनॉल के अलावा देरी न करें.
    8. एक ही चिपकने वाला एल्यूमीनियम कवर और भंवर के साथ सील.
    9. 5 मिनट के लिए 3000 XG पर अपकेंद्रित्र.
    10. 1 मिनट के लिए 150 XG पर उल्टे एक नया मुड़ा हुआ ऊतक और अपकेंद्रित्र पर थाली उलटें.
    11. Centrifugation के बाद, thermocycler में खुला डाल दिया और 2 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर यह सूखी.
    12. प्लेटें सूखी है एक बार,, चिपकने वाला पन्नी कवर के साथ इसे सील तैयार वाई आगे बढ़ने के लिए जब तक -20 ˚ सी पन्नी और दुकान में लपेटअनुक्रमण वैद्युतकणसंचलन वें.
    13. अनुक्रम करने के लिए तैयार, 10 मिलीलीटर हाय-डि formamide में साफ अनुक्रमण उत्पादों को भंग करते हैं, denature और वैद्युतकणसंचलन के लिए भार.

    11. जैव सूचना विज्ञान

    1. अनुक्रम विधानसभा
      1. कार्यक्रम Geneious लॉन्च.
      2. दृश्यों स्टोर करने के लिए काम कर रहे एक फ़ोल्डर बनाएँ.
      3. आयात उपकरण का उपयोग कर काम करने के लिए फ़ोल्डर अनुक्रमण मशीन द्वारा उत्पन्न अबी फ़ाइलें आयात. Geneious आयातित प्रत्येक दृश्य के लिए प्रतिशत गुणवत्ता स्कोर का आवंटन होगा.
      4. उन पर डबल क्लिक करके गुणवत्ता स्कोर> 70% के साथ खुला दृश्यों.
      5. प्रत्येक फाइल जो नई विंडो में खोलने चाहिए. सॉफ्टवेयर हल्के नीले रंग की पट्टियों का उपयोग अनुक्रम गुणवत्ता की वर्णलेख की प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड स्थिति में गुणवत्ता का संकेत होगा. बार उच्च, बेस कॉल की गुणवत्ता बेहतर है.
      6. कर्सर का प्रयोग, खराब गुणवत्ता का आम तौर पर कर रहे हैं जो बाहर समाप्त छोड़ने अनुक्रम के मध्य वर्ग का चयन करें. अच्छी गुणवत्ता के दृश्य के साथ क्षेत्र को निकालने के लिए निकालने बटन पर क्लिक करें.
      7. प्रत्येक नमूने के लिए सभी चार निकाला दृश्यों का चयन करें और एक संदर्भ अनुक्रम के खिलाफ उन्हें इकट्ठा.
      8. आप सही पढ़ने फ्रेम में हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए इकट्ठे अनुक्रम का निरीक्षण किया. PQITLW: आप सही पढ़ने फ्रेम में हैं, protease की शुरुआत निम्न एमिनो एसिड के साथ शुरू करना चाहिए. आरटी की शुरुआत PISPIE के साथ शुरू होगा.
      9. 300 आरटी कोडोन पीआर की शुरुआत कवर contig क्षेत्र निकालें. इस प्रक्रिया के दौरान, भी सम्मिलन या विलोपन के लिए जाँच करें.
      10. निकाले contig की आम सहमति अनुक्रम के माध्यम से जाओ किसी भी अस्पष्टता की पहचान करने और बेस कॉल की गुणवत्ता (समरूपता, ऊंचाई, पृष्ठभूमि और flanking क्षेत्रों के कंधों) द्वारा निरीक्षण मिश्रित अड्डों के साथ पदों को सत्यापित.
      11. आम सहमति अनुक्रम चुने और चार प्राइमरों से आम सहमति अनुक्रम का एक अलग फाइल बना सकते हैं और labe को निकालने बटन पर क्लिक करेंएल यह उचित.
      12. कंप्यूटर या एक नेटवर्क फ़ोल्डर पर एक बैकअप भंडारण फ़ोल्डर में अनुक्रम निर्यात.
    2. अनुक्रम गुणवत्ता मूल्यांकन (HIVDB)
      1. पर HIVDB प्रोग्राम का उपयोग अनुक्रम का विश्लेषण http://hivdb.stanford.edu .
      2. सारांश डेटा में विलोपन और सम्मिलन के लिए जाँच करें और अनुक्रम सभी 99 प्रोटीज (पीआर) codons और 1 300 आरटी codons को शामिल किया गया है यह सुनिश्चित.
      3. किसी भी ऐसे रोक codons, फ्रेम पाली, अस्पष्ट स्थिति और असामान्य अवशेष के रूप में दोनों पीआर और आरटी क्षेत्रों में गुणवत्ता आश्वासन (क्यूए) के मुद्दों पर प्रकाश डाला के लिए जाँच करें.
    3. अनुक्रमण गुणवत्ता नियंत्रण
      1. पिछले रन से एक स्थानीय अनुक्रम डेटाबेस के खिलाफ नया दृश्य ब्लास्ट.
      2. नई अनुक्रम डेटाबेस में किसी भी क्रम के समान> 97% है, तो प्रोटोकॉल के सभी चरणों के अनुक्रम विश्लेषण के साथ शुरू और वापस ensur करने के लिए शाही सेना निकासी के लिए जा रहा, समीक्षा की जानी चाहिएई कोई मिश्रण अप (नमूना स्विचिंग, mislabeling) या संक्रमण है कि वहाँ थे.
      3. कोई समस्या नहीं पहचान रहे हैं, शाही सेना निकासी मंच से पुराने और नए दोनों नमूनों के विश्लेषण से दोहराएँ.
      4. दृश्यों अभी भी> 97% समान हैं, व्यक्तियों के बीच किसी भी महामारी विज्ञान लिंकेज के लिए मूल्यांकन करने के लिए रोगी के इतिहास की समीक्षा करें.
    4. वंशावली विश्लेषण
      1. Geneious में ClustalW प्रोग्राम का उपयोग कर डेटाबेस से सभी दृश्यों संरेखित करें.
      2. मैन्युअल misaligned दृश्यों, विलोपन और सम्मिलन के लिए संरेखण की जाँच करें और तदनुसार संपादित करें.
      3. एक वंशावली PHYML का उपयोग पेड़, Geneious पेड़ बिल्डर या Geneious में अन्य पेड़ बिल्डरों का निर्माण.
      4. छोटी शाखा लंबाई के साथ नमूने के लिए पेड़ की जांच करना.
      5. संभव संदूषण लघु शाखा लंबाई के साथ नमूनों की समीक्षा करें.

    12. REGA डीबी सूचना विज्ञान

    1. अनुक्रम अपलोड करें
      1. RegaD में प्रवेश करेंएक अद्वितीय उपयोगकर्ता नाम और पासवर्ड का उपयोग करते हुए बी.
      2. ड्रॉप डाउन मेनू पर, रोगी आईडी के तहत, "के साथ शुरू होता है" का चयन करें.
      3. रोगी आईडी जोड़ने और जिसका जीनोटाइप अपलोड किया जा रहा है व्यक्ति का चयन करें.
      4. बाईं ओर मेनू पर, "वायरल अलग" का चयन करें.
      5. वायरल अलग तहत विकल्पों से "जोड़ें" का चयन करें.
      6. नमूना तारीख, नमूना आईडी, अनुक्रम आईडी और अनुक्रम दिनांक दर्ज करें.
      7. "फ़ाइल चुनें" और फिर अपलोड किया जा अनुक्रम के fasta फ़ाइल पर नेविगेट करें चुनें.
      8. अपलोड किये जाने वाले fasta फ़ाइल का चयन करने के बाद, अपलोड करें पर क्लिक करें.
      9. अपलोड अनुक्रम अनुक्रम को दिखाता है और तारीखों के अंतर्गत न्यूक्लियोटाइड बॉक्स में प्रकट होने के बाद, खिड़की के नीचे सही पर ठीक बटन पर क्लिक करें.
      10. बटन प्रोटीन क्लिक करने और पीआर या आरटी या तो चयन करके पीआर और आरटी प्रोटीन संरेखण के लिए जाँच करें.
      11. प्रतिरोध बटन पर क्लिक करके दवा प्रतिरोध उत्परिवर्तन के लिए जाँच करें. यह देता हैआप तीन एल्गोरिदम से प्रतिरोध प्रोफाइल: ANRS, स्टैनफोर्ड HIVDB और RegaDB.
    2. REGA का उपयोग कर रिपोर्ट पीढ़ी
      1. अपने अद्वितीय यूज़रनेम और पासवर्ड का उपयोग कर RegaDB में प्रवेश करें.
      2. ड्रॉप डाउन मेनू पर, रोगी आईडी के तहत, "के साथ शुरू होता है" का चयन करें.
      3. रोगी आईडी जोड़ने और जिसकी रिपोर्ट उत्पन्न किया जा रहा है व्यक्ति का चयन करें.
      4. सही करने के लिए मेनू पर, वायरल अलग चयन करें.
      5. वायरल अलग तहत विकल्पों से "देखें" पर क्लिक करें.
      6. आप एक रिपोर्ट बनाने के लिए चाहते हैं, जिसके लिए वायरल अलग पर डबल क्लिक करें.
      7. वायरल अलग विंडो पर, वायरल अलग रिपोर्ट टैब पर क्लिक करें.
      8. ड्रॉप डाउन मेनू से जीनोटाइप की व्याख्या और उसके बाद का उपयोग करने के लिए चयन की रिपोर्ट टेम्पलेट के लिए एल्गोरिदम का चयन करें.
      9. एल्गोरिथ्म और टेम्पलेट चुने जाने के बाद, "उत्पन्न" बटन पर क्लिक करें.
      10. उत्पन्न आरटीएफ दस्तावेज़ डाउनलोड करें.
      11. आरटीएफ कर खोलेंएक शब्द दस्तावेज़ के रूप में cument.
      12. उपचार इतिहास चार्ट का आकार बदलें.
      13. चार्ट के बाद, अनुभाग "नैदानिक ​​चार्ट और प्रतिरोध व्याख्या" जोड़ें.
      14. प्रतिरोध तालिका और नैदानिक ​​चार्ट पर डेटा का उपयोग, रोगी के इलाज के इतिहास की शुरुआत के साथ रोगी के प्रतिरोध प्रोफाइल का एक विवरण जोड़ सकते हैं, और दवाओं जो वायरल अलग प्रतिरोधी है. इसके अलावा एक रोगी के वायरल लोड का विवरण और चार्ट से सीडी 4 + सेल गिनती प्रोफाइल को जोड़ने.
      15. संक्रामक रोगों की समीक्षा के लिए (आईडी) विशेषज्ञ और भविष्य रोगी प्रबंधन पर सिफारिशों को रिपोर्ट भेजें. इस प्रक्रिया को भी एक बहुत महत्वपूर्ण गुणवत्ता आश्वासन मंच है. एक अंतिम रिपोर्ट रोगी प्रबंध चिकित्सक को सभी सिफारिशों के साथ, भेजे जाने से पहले उपचार के इतिहास में जीनोटाइप या inconsistences में किसी भी त्रुटि, विषाणुजनित और प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रोफाइल्स की पहचान की और समीक्षा की जा सकती.

Representative Results

मान्य विधि एक पहले की रिपोर्ट विधि 20 के एक संशोधन किया गया था. एफडीए द्वारा अनुमोदित किया गया है जो Viroseq जीनोटाइपिंग विधि, सत्यापन में संदर्भ पद्धति के रूप में इस्तेमाल किया गया था. एड्स पर रिसर्च और वायरल हेपेटाइटिस (ANRS) के लिए फ्रांसीसी राष्ट्रीय एजेंसियों से प्राप्त प्रवीणता परीक्षण नमूनों के एक पैनल दो तरीकों के बीच प्राथमिक तुलना में इस्तेमाल किया गया था. दो जीनोटाइपिंग तरीकों सफलतापूर्वक दोनों तरीकों से परिलक्षित किया गया है कि नमूने के लिए HIVDB कार्यक्रम द्वारा व्याख्या के रूप में सभी चिकित्सकीय महत्वपूर्ण दवा प्रतिरोध जुड़े म्यूटेशन की पहचान करने में 100% सहमत थे. 6 तालिका में दिखाया गया है, तीन जोड़े की nucleotide दृश्यों 99.5% समान थे. भविष्यवाणी एमिनो एसिड दृश्यों 100% समान थे. पांच में से एक नमूना सफलतापूर्वक Viroseq से परिलक्षित नहीं किया जा सका. Viroseq से परिलक्षित नहीं नमूना के अलावा, घर में विधि दिखाया गया था जो एक दूसरा नमूना बढ़ाना करने में विफलViroseq द्वारा एक परिसंचारी पुनः संयोजक वायरस (CRF02_AG) किया जाना है. दोनों तरीके से परिलक्षित कि तीन नमूने उप प्रकार बी (दो नमूने) और उप प्रकार एक (एक नमूना) थे.

चित्रा 5
चित्रा 5. अनुक्रम गुणवत्ता आश्वासन के हिस्से के रूप में किया एक HKY पड़ोसी शामिल होने से पेड़ का उपयोग करें. बहुत ही कम आनुवंशिक दूरी के साथ अनुक्रम के चार जोड़े / समूहों के होते हैं. RES655 और RES655_1 के बीच आनुवंशिक दूरी (एक ही नमूने अलग अलग दिनों पर अनुक्रम) 0.003 है. उनके आनुवंशिक दूरी अलग epidemiologically लिंक रद्द व्यक्तियों से नमूने लिए (0.075) बहुत छोटा है के रूप में RES637_1/RES638 जोड़ी के साथ एक संभावित त्रुटि है. RES638_1 जब की तुलना में 0.075 की दूरी के साथ पेड़ पर एक और RES637 है. CQ01/CQ02 क्लस्टर से पता चलता है कि दो नमूनेपैनल से ही नमूने के डुप्लिकेट हैं. वे REGA subtyping उपकरण द्वारा सौंपा उप प्रकार की पुष्टि उप प्रकार बी संदर्भ अनुक्रम के साथ एक साथ क्लस्टर. REGA subtyping उपकरण क्रमश: एक और CRF02_AG के रूप में उन्हें वर्गीकृत जबकि CQ05 और CQ04, क्रमशः उपप्रकार एक और जी के साथ क्लस्टर. एचआईवी subtyping और पुनर्संयोजन के लिए एक और उपयोगी उपकरण http://www.datamonkey.org पर उपलब्ध है जो SCUEL है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पांच नमूनों के एक पैनल घर में विधि का सटीक आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. दस दोहराने जीनोटाइप पांच नमूनों में से प्रत्येक के लिए उत्पन्न किया गया. 16 केशिका 3130xl आनुवंशिक विश्लेषक का उपयोग, 50 जीनोटाइप के 48, 24 रन से उत्पन्न एक ही दिन में तैयार की गई. सभी पांच नमूने लिए, भविष्यवाणी एमिनो एसिड दृश्यों प्रतिकृति के बीच 100% सहमत थे. न्यूक्लिक एसिड दृश्यों, वें के लिएअरे> 99% जोड़ो में समानता थी.

इस विधि के प्रयोग के पहले दो वर्षों के दौरान साठ नमूने अनुक्रमण करने के लिए शाही सेना निकासी से बेतरतीब ढंग से दोहराया गया. अनुक्रम गुणवत्ता स्कोर और प्रतिकृति के बीच मिश्रित अड्डों की संख्या के बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद थे. साठ जोड़े के लिए न्यूक्लियोटाइड और एमिनो एसिड दोनों जोड़ो में तुलना के 99% से अधिक समान थे. इस प्रकार सभी जोड़ों के लिए दवा प्रतिरोध म्यूटेशनों 100% सहमत थे.

लागत में कमी

आरटी पीसीआर और अनुक्रमण के लिए प्रतिक्रिया मात्रा में उत्पन्न दृश्यों की गुणवत्ता पर कोई समझौता किए बिना, कम से कम आधा, मूल विधि 20, 32 के सापेक्ष से कम हो गई थी. इस आरटी पीसीआर और चरणों के लिए 50% की लागत में कमी सक्षम होना चाहिए.

नई विधि मूल अनुक्रम को छह अनुक्रमण प्राइमर के साथ काम करने के लिए डिजाइन किया गया था प्रोटीज जीन और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस जीन 20, 32 के पहले 300 codons के सभी 99 codons. इसी तरह के तरीकों में भी छह से आठ प्राइमरों 33, 34 का उपयोग करें. कभी कभी seprately 35, 36 प्रोटीज और आरटी जीन अनुक्रमण हालांकि कुछ हाल ही में प्रकाशित तरीकों, कम से कम छह प्राइमरों का इस्तेमाल किया है. हम 6-4 अनुक्रमण प्राइमरों की संख्या को कम करने की मांग की, चित्रा (6)

चित्रा 6
चित्रा 6. सभी 99 एचआईवी -1 प्रोटीज codons और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस जीन की पहली 300 codons कवर 1197 बी.पी. पीओएल अनुक्रम की पीढ़ी के लिए छह चार बनाम अनुक्रमण प्राइमरों से सटे दृश्यों की तुलना.242/51242fig6highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

छह प्राइमरों से उत्पन्न 17 नमूनों का एक सेट दृश्यों से दो प्राइमरों (MAW46 और rty) के बहिष्कार के बाद उत्पन्न दृश्यों की तुलना में थे. उपप्रकार अनुक्रम गुणवत्ता स्कोर में कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे 14 उप प्रकार सी, दो उप प्रकार बी, और एक उप प्रकार ए थे. फिर, न्यूक्लिक एसिड के 17 जोड़े के बीच औसत जोड़ो पहचान अमीनो एसिड स्तर पर 99% और 100% थी. इस प्रकार, 6-4 अनुक्रमण प्राइमरों को कम करने के लगभग एक तिहाई से अनुक्रमण लागत में कमी हुई.

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल केवल मालिकाना सॉफ्टवेयर उपकरण अनुक्रम विधानसभा के लिए Geneious था. दवा प्रतिरोध व्याख्या उपकरण, साथ ही रिपोर्ट औजार पैदा सभी मुक्त, खुले उपयोग उपकरण हैं. यह मालिकाना सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ जुड़े लागत को नष्ट करने से आगे की लागत कम कर देता है. इसके अलावा, collectivई बातचीत इस प्रोटोकॉल के लिए अभिकर्मकों जीवन टेक्नोलॉजीज से आसान पहुंच के लिए एक किट में पैक और शनि / जीवन टेक्नोलॉजीज विधि 37 जीनोटाइपिंग के रूप में उपलब्ध है की अनुमति दी. इसके अलावा, शनि के सदस्यों को एक रियायती मूल्य पर अभिकर्मकों उपयोग कर सकते हैं.

नैदानिक ​​सेटिंग

वर्णित प्रोटोकॉल क्वाजुलु नटाल में एक ग्रामीण समुदाय में निगरानी और दवा प्रतिरोध की निगरानी में लागू किया गया है. 604 जीनोटाइप की कुल> 1,000 आरएनए प्रतियां / एमएल वायरल लोड के साथ नमूने के लिए 95% की एक प्रवर्धन दर दिसंबर 2010 और मई 2013 के बीच चिकित्सीय नमूनों से उत्पन्न किया गया. इस नैदानिक ​​एचआईवी दवा प्रतिरोध अध्ययन क्वाजुलू नटाल विश्वविद्यालय (संदर्भ BF052/10) के जैव चिकित्सा अनुसंधान आचार समिति और स्वास्थ्य के क्वाजुलू नटाल विभाग (संदर्भ HRKM 176/10) के स्वास्थ्य अनुसंधान समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था. व्यक्तिगत रोगी रिपोर्ट बनाई और क्लीनिकों के लिए वापस भेज दिया गयारोगी प्रबंधन के लिए.

सत्तर दो (72) जीनोटाइप भी प्रेषित, दवा प्रतिरोध अध्ययन की एक निगरानी के हिस्से के रूप में उत्पन्न एक बड़े भावी जनसंख्या के आधार पर एचआईवी निगरानी अध्ययन के भीतर नेस्ट किया गया. प्राथमिक नमूने EDTA microtubes में एकत्र सुई चुभन पूरे रक्त थे. जीनोटाइपिंग 79% 19 के एक प्रवर्धन दर थी. निगरानी अध्ययन से नमूनों की जीनोटाइपिंग के लिए आचार अनुमोदन क्वाजुलू नटाल बायोमेडिकल रिसर्च आचार समिति के विश्वविद्यालय (संदर्भ BE066107) से प्राप्त हुई थी.

प्राइमर नाम अनुक्रम लंबाई दिशा HXB2 स्थिति
मुख-26 TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC 23 आगे 2028-2050 1 दौर पीसीआर
आर टी -21 CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG 31 रिवर्स 3539-3509 1 दौर पीसीआर
समर्थक 1 TAGAGCCAACAGCCC CACCA 20 आगे 2147-2166 2 दौर पीसीआर
आर टी -20 CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC 22 रिवर्स 3462-3441 2 दौर पीसीआर
RTC1F ACCTACACCTGTCAA CATAATTG 23 आगे 2486-2508 अनुक्रमण
RTC2R TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG 27 रिवर्स 2630-2604 अनुक्रमण
RTC3F CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC 30 आगे 2956-2994 अनुक्रमण
RTC4R CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC 29 रिवर्स 3129-3101 अनुक्रमण
RT-Y GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG 22 रिवर्स 2967-2946 अनुक्रमण
मुख-46 TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC 27 आगे 2251-2277 अनुक्रमण

तालिका 1. प्रतिलेखन, पीसीआर, और सभी 99 एचआईवी -1 Protease codons और रिवर्स trascriptase जीन की पहली 300 codons कवर 1197 बी.पी. पीओएल टुकड़ा की पीढ़ी में इस्तेमाल अनुक्रमण कस्टम प्राइमरों उल्टा.

RT21 (5pmol/ml) 0.5 0.2
dNTP (10 मिमी) 0.5 0.4
संपूर्ण 1

तालिका 2. dNTP / प्राइमर रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए मिश्रण.

अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) / प्रतिक्रिया एकाग्रता / प्रतिक्रिया
पहली कतरा बफर (10x) 1 1
2 MgCl (25 मिमी) 2 4
डीटीटी (0.1 एम) 1 0.008
RNaseOUT (40 यू / एमएल) 0.5 16
सुपरस्क्रिप्ट III रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (200U/ml) 0.5 8
संपूर्ण 5

तालिका 3. एनजाइम रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए मिश्रण.

अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) / प्रतिक्रिया अंतिम एकाग्रता / प्रतिक्रिया
DEPC इलाज पानी 18.4 - </ P>
पीसीआर बफर (10x) 2.5 1
MgCI 2 (50 मिमी) 1 2
dNTP मिश्रण (10 मिमी) 0.5 0.2
Froward प्राइमर (5 pmol / एमएल) 0.25 0.05
रिवर्स प्राइमर (5 pmol / एमएल) 0.25 0.05
प्लेटिनम Taq पोलीमरेज़ (5 यू / एमएल) 0.1 0.02
आधा 23 -

तालिका 4. नेस्टेड पीसीआर के लिए मास्टर मिश्रण.

अभिकर्मक वॉल्यूम (एमएल) / प्रतिक्रिया एकाग्रता / प्रतिक्रिया
DEPC इलाज पानी 6.1
अनुक्रमण बफर (5x) 2 1
प्राइमर (3.2 pmol / एमएल) 0.5 0.16
बिग डाई टर्मिनेटर अनुक्रमण मिश्रण 0.4 -
संपूर्ण 9

सारणी 5. अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के लिए मास्टर मिश्रण.

Viroseq हाउस % ना समानता
नमूना आईडी उपप्रकार गुणवत्ता स्कोर पीआर उत्परिवर्तनों आरटी म्यूटेशनों उपप्रकार गुणवत्ता स्कोर पीआर म्यूटेशनों आरटी उत्परिवर्तनों
CQ01 बी 99.9 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q बी 99.2 M46L, I54L, V82ए, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q 100
CQ02 बी 99.5 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q बी 99.5 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q 100
CQ03 एनए एनए एनए एनए एनए एनए
CQ04 CRF02_AG 98.4 I54V, V82F, I84V M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C एनए एनए एनए एनए एनए
CQ05 एक 99.7 K103N एक 93 K103N 100

तालिका 6. तुलनात्मक resulViroseq जीनोटाइपिंग विधि और ANRS द्वारा प्रदान के नमूने के एक पैनल का उपयोग कर घर में विधि के बीच एक समानांतर विश्लेषण से टीएस.

Discussion

कई कम लागत में घर तरीकों 33, 34, 36 एचआईवी दवा प्रतिरोध जीनोटाइपिंग और अधिक किफायती बनाने के लिए प्रयास करने के प्रयासों में वर्णित किया गया है. सीमित संसाधनों वाली स्थितियों में एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी पर व्यक्तियों के लिए देखभाल के सातत्य में दवा प्रतिरोध परीक्षण एकीकृत करने की आवश्यकता का कोई संदेह नहीं है. हालांकि, रिपोर्ट की विधियों में से अधिकांश आबादी के स्तर पर दवा प्रतिरोध की निगरानी में दवा प्रतिरोध जीनोटाइपिंग के आवेदन पर ध्यान केंद्रित. सैटर्न / जीवन टेक्नोलॉजीज जीनोटाइपिंग विधि निगरानी और दवा प्रतिरोध की निगरानी के लिए एक पूरी तरह से एकीकृत प्रोटोकॉल है. इस विधि नैदानिक ​​प्रबंधन के लिए रिपोर्ट की दवा प्रतिरोध और पीढ़ी की व्याख्या के लिए ज्यादातर खुला स्रोत और खुले उपयोग जैव सूचना विज्ञान संसाधनों को लागू करने के लिए एक किफायती प्रोटोकॉल होने के लिए डिजाइन किया गया था.

यह होने के लिए एफडीए को मंजूरी दी Viroseq जीनोटाइपिंग विधि के साथ तुलना के माध्यम से दिखाया गया थासफलतापूर्वक परिलक्षित गया कि प्रयोगशाला पैनल नमूनों की 100% में ANRS प्रवीणता परीक्षण नमूनों के एक पैनल से दवा प्रतिरोध परिवर्तन की पहचान करने में सही. शुद्धता भी उप प्रकार सी वायरस, दक्षिणी अफ्रीका में सबसे प्रमुख उप प्रकार के चिकित्सीय नमूनों पर मूल्यांकन किया गया था. विधि CRF02_AG प्रचलित है, जहां दुनिया के अन्य भागों में इस्तेमाल किया जाएगा अगर विधि यह हालांकि उप प्रकार ए और बी पर था के रूप में उप प्रकार सी नमूनों पर के रूप में सही था,, विधि के बाद प्राइमरों के संशोधन के लिए एक की जरूरत है CRF02_AG है दिखाया गया था कि पैनल के नमूनों में से एक बढ़ाना करने में विफल रहा. उप प्रकार वितरण 38 अधिक विषम है जहां वैकल्पिक रूप से, एम 33 वायरस सभी समूह के प्रति संवेदनशील प्राइमरों की एक पतित सेट, 36 क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है.

रिवर्स प्रतिलेखन और पीसीआर की संवेदनशीलता इस तरह के 500 मिलीलीटर के रूप में प्लाज्मा की अधिक मात्रा से शाही सेना निकालने के द्वारा बढ़ाया जा सकता है. प्लाज्मा centrif किया जा सकता हैQIAamp वायरल शाही सेना निकासी मिनी किट द्वारा वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले वायरल कणों ध्यान केंद्रित करने के लिए 90 मिनट के लिए 21,000 XG पर uged.

दिखाया गया है, नई विधि यह व्यक्तिगत रोगी प्रबंधन के लिए व्यापक रिपोर्टों का उत्पादन है कि एक अतिरिक्त लाभ है. इन रिपोर्टों RegaDB से जीनोटाइप के एक समेकन, प्रतिरक्षा और virologic निगरानी डेटा के रूप में भी नैदानिक ​​और उपचार इतिहास हैं. यह एक समान रूप से विस्तृत रोगी के नैदानिक ​​इतिहास की समीक्षा के साथ ही उपचार की सिफारिशों के द्वारा पीछा प्रतिरोध प्रोफाइल की एक विस्तृत प्रयोगशाला व्याख्या के साथ है. रिपोर्ट की समीक्षा और रोगियों के लिए इलाज की सिफारिशों प्रदान करने के लिए एक विशेषज्ञ चिकित्सकों का उपयोग नर्स चिकित्सकों के रूप में भी तेजी से काम स्थानांतरण के लिए डब्ल्यूएचओ की सिफारिशों के हिस्से के रूप में दक्षिण अफ्रीका में एआरटी प्रदान कर रहे हैं, जो अनुभवहीन चिकित्सकों के लिए बहुत जरूरी सदस्यता प्रदान करता है. इन क्लिनिकलरिपोर्टों दवा प्रतिरोध प्रबंधन में कम या कोई अनुभव के साथ चिकित्सकों के लिए प्रभावी शिक्षण सहायक होना दिखाया गया है. एक मरीज के नजरिए से, हमारे विधि विशेषज्ञ एचआईवी सेवाओं का उपयोग करने के लिए केंद्रीकृत साइटों की यात्रा की जरूरत कम कर देता है.

इस प्रकार, एक पूरे के रूप में लिया वर्णित प्रोटोकॉल एचआईवी दवा प्रतिरोध प्रबंधन एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों में नाकाम रहने के एआरटी के लिए देखभाल के सातत्य में, एक सस्ती कीमत पर, एकीकृत किया जा सकता है जिसके माध्यम से एक अच्छा मंच प्रदान करता है. उत्पन्न डेटा समुदाय में दवा प्रतिरोध के विकास और संचरण का आकलन करने के महामारी विज्ञान के उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उत्पन्न पीओएल टुकड़ा के आकार आबादी के स्तर पर महामारी की बेहतर समझ का उत्पादन होगा जो अधिक जटिल वंशावली विश्लेषण के लिए काफी अच्छा है.

Disclosures

स्वास्थ्य प्रणाली को मजबूत बनाने और एचआईवी उपचार विफलता (एचआईवी: यह काम वेलकम ट्रस्ट (082384/Z/07/Z), यूरोपीय संघ (SANTE 2007 147-790), रोगों के लिए अमेरिका केंद्र द्वारा समर्थित किया गया CAPRISA (परियोजना शीर्षक के माध्यम से नियंत्रण टीएफसी)), और स्विस दक्षिण अफ़्रीकी संयुक्त अनुसंधान कार्यक्रम (SSJRP) हकदार अनुसंधान अनुदान "स्विस Prot / दक्षिण अफ्रीका: प्रोटीन जैव सूचना विज्ञान संसाधन विकास महत्वपूर्ण स्वास्थ्य से संबंधित रोगजनकों के लिए". आरएल वेलकम ट्रस्ट द्वारा समर्थित है (अनुदान संख्या 090999 / Z / 09 / जेड). funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी. लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों के लिए इस काम को संभव बनाया है जो सभी सहयोगियों, खासकर माया Balamane, एलिजाबेथ जॉनसन सफेद, शेरोन Sjoblom, ग्रेग ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, जेम्स गर्वे, गेविन कॉब, Senzo Maphanga, Terusha चेट्टी स्वीकार करना चाहते हैं , Kevi नायडू, एंड्रयू Skingsley, कैथरीन Stott, और Lungani Ndwandwe. लेखकों को भी स्वास्थ्य विभाग और Hlabisa एचआईवी उपचार और देखभाल कार्यक्रम काम करने वाले अफ्रीका सेंटर कर्मियों के सभी कर्मियों को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superscript III 1st strand Synthesis kit Life Technologies 18080051 Reverse Transcription
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers Life Technologies 4473517 PCR
Platinum Taq Life Technologies 10966026 PCR
PureLink QUICK PCR Purification Kit Life Technologies K310002 PCR
Viroseq ABBOTT 4J94-20 Reverse Transcription and PCR
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) BIOLINE BIO-41027 PCR
TBE Buffer MERCK 1.06177.2500 PCR
O'Range Ruler 200 bp DNA Ladder Fermentas FE SM0633 PCR
Novel Juice GeneDireX LD001-1000 PCR
MiniBis Bioimaging System DNR Bioimaging Systems Ltd Gel Documentation
Power Pac 300  BIORAD Gel Electrophoresis
Big Dye Terminator Kit version 3.1 Life Technologies 4337456 Sequencing
Arrays Life Technolgies 4319899 Sequencing
PoP Life Technologies 4363785 Sequencing
10x EDTA Buffer Life Technologies 402824 Sequencing
Formamide Life Technologies 4311320 Sequencing
5x Sequencing Buffer Life Tecgnologies 4336697 Sequencing
3130 xl Genetic Analyzer Life Technologies Sequencing
GeneAmp PCR System 9700 Life Technologies RT/PCR/Sequencing
Centrifuge 5804 EPPENDORF Sample Processing
Centrifuge 5415R EPPENDORF RNA Extraction
Centrifuge 5415R EPPENDORF RT and PCR
Centrifuge 5415D EPPENDORF PCR Product Clean up
Centrifuge 5810 EPPENDORF Sequencing Clean up
Picofuge BIORAD C1301-230V RT and PCR
Vortex Genius 3 IKA RNA extraction and reagent preparation
Vortex mixer IKA Sequencing Cleanup
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer ThermoScientific DNA quantification 
3 M Sodium Acetate MERCK 567422 Sequencing Clean up
Absolute Ethanol MERCK SAAR2233540LP Sequencing Cleanup
1.5 ml SARSTEDT Tubes BIODEX 72.692.005 RNA Extraction
2 ml SARSTEDT  Tubes BIODEX 72.693.005 RNA Extraction
2 ml Collection tubes SCIENTIFIC GROUP MCT-200-NC/S RNA Extraction
Optical MicroAmp 96-well reaction plates Life Technologies N8010560 Sequencing
200 µl 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps STAR Lab - supplied by CELTIC A1402-3700 RT and PCR
200 µl PCR individual tubes Scientific Group CR/3745 RT and PCR
Geneious  Biomatters Sequence analysis
Internet Access Preferrably high speed
Web resources
hivdb.stanford.edu Stanford University Drug reistance analysis
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB SATuRN database
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html SATuRN Sequence quality tool

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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