Author Produced

En overkommelig HIV-1 Drug Resistance Monitoring Metode til Resource begrænsede indstillinger

Medicine
 

Summary

Lægemiddelresistens testning for HIV-1-inficerede individer svigtende antiretroviral behandling (ART) kan vejlede fremtidige behandlinger og forbedre behandlingsresultater. Optimering individuelle og befolkningens sundhedsresultater i høj hiv-forekomst, men med begrænsede ressourcer i sidste ende vil kræve økonomisk overkommelige og tilgængelige lægemiddelresistens genotypebestemmelse og tolkning metoder.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Manasa, J., Danaviah, S., Pillay, S., Padayachee, P., Mthiyane, H., Mkhize, C., Lessells, R. J., Seebregts, C., de Wit, T. F., Viljoen, J., Katzenstein, D., De Oliveira, T. An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings. J. Vis. Exp. (85), e51242, doi:10.3791/51242 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

HIV-1 resistens har potentiale til alvorligt at kompromittere effektiviteten og virkningen af ​​antiretroviral behandling (ART). Som kunst-programmer i Afrika syd for Sahara fortsætter med at udvide, skal personer på ART overvåges nøje for fremkomst af resistens. Overvågning af transmitteret resistens at spore transmission af virusstammer allerede er resistente over for ART er også kritisk. Desværre lægemiddelresistens test er stadig ikke let tilgængelig i ressource begrænsede indstillinger, fordi genotypebestemmelse er dyrt og kræver avanceret laboratorieudstyr og datastyring infrastruktur. En åben adgang genotype overvågning resistens metode til at styre individer og vurdere transmitteret resistens er beskrevet. Den metode bruger gratis open source-software til fortolkning af narkotika resistensmønstre og generering af den enkelte patients rapporter. Genotypebestemmelse protokol har en forstærkning på mere end 95% for plasmaprøver med AV-iral belastning> 1.000 HIV-1 RNA kopier / ml. Følsomheden falder signifikant for viral belastning <1.000 HIV-1 RNA kopier / ml. Den her beskrevne metode blev valideret mod en metode til HIV-1 lægemiddel resistenstestning godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA), den Viroseq genotypebestemmelse metode. Begrænsninger af den her beskrevne fremgangsmåde kan nævnes, at det ikke er automatiseret, og at det også har undladt at forstærke den cirkulerende rekombinant form CRF02_AG fra en validering panel af prøver, selv om det forstærkede undertyper A og B fra samme panel.

Introduction

Hiv-epidemien i det sydlige Afrika har været i hastig udvikling 1 med en samtidig eksponentiel stigning i personer på antiretroviral behandling (ART), især i Sydafrika 2, 3. Som bevis på den epidemiologiske konsekvenser af storstilede behandlingsprogrammer reducere forekomsten 4 og stigende levealder i områder med begrænsede ressourcer (RLS) 5 fortsætter med at akkumulere, vil indsatsen for at øge ART dækning intensiveres. Udviklingen af retningslinjer i retning af anvendelse af behandling som et forebyggende værktøj 6, 7 under testen og behandle programmer betyder, at det absolutte antal personer i behandling vil stige yderligere. Et stort antal personer, vil være på ART, for længere perioder som den gennemsnitlige forventede levetid for enkeltpersoner på ART nærmer det af HIV-inficerede population 8. Udvikling og overførsel af hiv resistens har always blevet betragtet som en trussel mod resultaterne af ART 9-12. Således er der behov for mere stringent overvågning og kontrol af resistens som flere personer indledes på ART.

Genotypisk resistens testning (BRT) er blevet anvendt med succes i de udviklede lande, både for overvågning samt overvågning af HIV-1 resistens hos personer, der modtager ART. I disse indstillinger, har BRT blevet integreret i kontinuum af omsorg for HIV-1-inficerede individer. De fleste internationale retningslinjer anbefaler BRT for voksne patienter eller børn svigtende ART (first-line og second-line) 13-15, pædiatriske patienter udsat for forebyggelse af mor-til-barn-smitte (PMTCT) regimer, men efterfølgende smittet 16, og i indstillinger med høje niveauer af transmitteret lægemiddelresistens blandt akut inficerede individer 13-15. Imidlertid har de omkostninger, teknologi og infrastruktur krav begrænset gennemføførelsen af ​​lignende tilgange til lægemiddelresistens overvågning i RLS.

Den sydafrikanske HIV-behandling og overvågning af retningslinjer i øjeblikket ikke anbefale brug af BRT vejlede valg af kunst for personer svigtende første linje regimer 17. Enkeltpersoner er tændt primært baseret på virologisk (HIV-1 RNA viral belastning) parametre. Men i 2012 offentliggjorde sydafrikanske HIV Klinikere Society den første sydlige lægemiddelresistens test afrikanske ARV retningslinjer 18. Disse retningslinjer anbefaler BRT test for alle voksne svigtende første-line og second-line kunst og for smittede spædbørn og børn udsættes for PMTCT 18. Dog er BRT ikke anbefales 18 for akut inficerede individer, fordi der ikke er nogen aktuel evidens for høje niveauer af transmitteret resistens i det sydlige Afrika 19-29. Det forventes, at nogle af disse henstillinger vil blive integreret med tiden i den nationale Treasureatment og overvågning retningslinjer i de forskellige lande i regionen. Allerede i 2013 sydafrikanske retningslinjerne for behandling er der nu anbefaling af BRT på tidspunktet for second-line fiasko for voksne og på tidspunktet for første-eller second-line PI-baserede regime fiasko for børn 30.

Det er blevet påvist, at indarbejde BRT i behandlingsvejledninger i Sydafrika ville være potentielt omkostningsneutral. I betragtning af omkostningerne i den anden linje regime lægemidler, der er relativt dyrere end den første linje lægemidler ved hjælp af BRT til at identificere patienter, der virkelig har brug for at være skiftet til anden linje terapi vil ikke medføre yderligere omkostninger til programmet. Derudover kan BRT også pege på andre årsager til fiasko, bevare behandlingsmuligheder og generere oplysninger om nye resistensmønstre 31. Derfor er det nødvendigt at reducere omkostningerne til lægemiddelresistens metoder overvågning endnu mere for at forbedre adgangen, kvaliteten af ​​pleje end resultater.

Her præsenterer vi en BRT metode designet til at bruge generiske (open source) primere til revers transkription, polymerase chain reaction (PCR) og sekventering (tabel 1), såvel som for det meste open source software til lægemiddelresistens fortolkning. Til klinisk ledelse, er den protokol komplimenteres af en omfattende gennemgang og rapportering metode med specialist fortolkning af laboratorie resistens rapport med tæt tilslutning til de nationale retningslinjer for behandling af. Protokollen er opdelt i fire forskellige komponenter: 1) HIV ribonukleinsyre (RNA) Udvinding, 2) Reverse Transcription og Polymerase Chain Reaction (PCR) af virale mål 3) Sequencing og 4) Bioinformatik metoder til analyse af kromatogrammer, tilpasning, datasikring og fortolkning af sequencer-data.

Protocol

1.. Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) Fuldblod Processing

Bemærk: blod kan behandles umiddelbart efter indsamlingen af ​​kan opbevares ved 4 ° C i højst 24 timer.

  1. Arbejde i et biosikkerhed kabinet, tillade EDTA hele blodprøve til at nå stuetemperatur.
  2. For hver prøve, mærke nok kryoglas med prøven identifikation (ID), opbevaring materiale (plasma), og dato.
  3. Centrifuger prøverne for 10 minutter ved 1000 x g.. Brug ikke bremserne til at stoppe centrifugen. Dette vil give tre lag (fra top til bund): plasma, leukocytter (buffy coat) - et meget tyndt lag - og erythrocytter, herunder blodplader.
  4. Aspirere forsigtigt supernatanten (plasma) og alikvot 500 ml i hver cryovial. Pas på ikke at forstyrre cellelag (buffy coat), eller overføre nogen celler.
  5. Opbevar ved -80 ° C indtil brug for RNA-ekstraktion eller videre til RNA-ekstraktion straks.
ve_title "> 2.. RNA-ekstraktion

  1. Forbered en ekstraktion regneark med id'er for de skal udvindes prøver, herunder positive og negative plasma kontroller.
  2. For hver prøve, der skal udvindes, mærke et 1,5 ml sterilt mikrocentrifugerør med prøve-ID, udvinding dato og "RNA". Også mærke en samlet kolonne og indsamling rør samt en 2 ml mikrocentrifugerør indeholdende arbejder lysisopløsning med tilsvarende tal fra udvinding regnearket.
  3. Arbejde i Bio-Safety Cabinet, tilsættes 200 ul prøve til den tilsvarende 2 ml mikrocentrifugerør arbejde lysisopløsning.
  4. Vortex brønd og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
  5. Efter 10 minutter centrifugeres røret kortvarigt.
  6. Tilføj 800 ml absolut ethanol til hver af rørene.
  7. Bland ved puls hvirvelblanding og kort centrifuge.
  8. Overfør 600 ul af denne løsning til den tilsvarende kolonne / samling slange forsamling. Centrifugeres ved 6.000 xg i 1 min.
  9. Overfør kolonne til en ny kollektion rør og kassér gamle samling røret med filtratet. Gentag ovenstående trin 2.8 (ovenfor) to gange mere.
  10. Tilsæt 500 pi vaskebuffer AW1 til hver søjle, og der centrifugeres ved 6000 xg i 1 min.
  11. Kassér Filtratet og opsamlingsrør og overføre kolonnen til en ny samling rør.
  12. Tilsæt 500 pi var buffer AW2 og centrifugeres ved 20.000 xg i 3 min. Gentag trin 2.11.
  13. Centrifuger i en ny samling rør ved 20.000 xg i yderligere 2 min.
  14. Kassér filtrat og sted kolonne i 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  15. Tilføj 60 pi Buffer AVE (RNase frit vand) til midten af ​​søjlen sikrer, at du ikke dispensere væsken på siden af ​​søjlen.
  16. Der inkuberes ved stuetemperatur i 1 min.
  17. Centrifuger ved 6000 xg i 2 min.
  18. Kassér søjlen og låg på 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  19. Prøverne er nu klar til reverSE transkription.
  20. Hvis test skal udføres straks, opbevares ved 4 ° C i op til 6 timer. Men hvis test er at blive forsinket derefter placere ved -80 ° C med det samme. NB: ikke fryse / tø prøverne mere end 3x.

3. Reagensforberedelse for Reverse Transcription

  1. Før du starter, beregne mængden af ​​hvert af de krævede for antallet af prøver, der behandles, herunder de positive og negative plasma kontroller reagenser. Også tilføje en reagens kontrol.
  2. Brug de beregnede mængder fra trin 3.1 (ovenfor), forberede deoxyribonucleotid trifosfat (dNTP)-primer mix i en ren, steril 200 pi PCR-rør efterfulgt af kort puls vortex. Hver prøve skal have 0,5 ul af reverse primer RT21 og 0,5 ul af dNTP, se tabel 2.
  3. Alikvot 1,0 pi af dNTP-primer mix til 200 ul PCR-rør.
  4. Forbered reverse transkriptase (RT) enzymblanding ved at tilsætte 1 μ; L 10x revers transkription puffer, 1 pi 0,1 M DTT og 2 pi 25 mM MgCl2 til et sterilt rør efterfulgt af hvirvelblanding og kort centrifugering, se tabel 3.
  5. Tilsæt 0,5 pi hver af enzymerne RNAseOUT og Hævet III revers transkriptase til enzymet blandingsglasset derefter trykke røret forsigtigt for at blande.
  6. Hold rørene med dNTP-primer mix og enzym-mix på en kold blok og flytte til RNA station.

4.. Reverse Transcription

  1. Tilsæt 6 ul af RNA prøven til dNTP-primer mix rør efterfulgt af kortvarigt vortex at blande.
  2. Efter tilsætning af det RNA, flytte til PCR-værelse med både dNTP / primer / RNA-blanding og RT Enzyme mix rør på en kold blok eller is.
  3. Kort centrifugere dNTP / primer / RNA-mix rør (fra trin 4.2) og placere dem i en thermocycler.
  4. Opvarm til 65 ° C i 5 minutter for at denaturere RNA'et.
  5. Hurtigt afkøles til 4 ° C, hold 2min.
  6. Pause termocyklusapparatet, mens du stadig ved 4 ° C, tage ud rørene.
  7. Hurtigt tilføje 5 ul af enzymet mix samtidig holde rørene på en kold blok.
  8. Bland forsigtigt ved at banke røret derefter kortvarigt centrifugeres rørene og vende tilbage til thermocycler.
  9. Hold rørene ved 50 ° C i 60 min for at vende transskribere RNA efterfulgt af enzym denaturering ved 85 ° C i 5 minutter for at stoppe revers transkription.
  10. Der afkøles til 37 ° C. Så snart temperaturen bliver til 37 ° C, pause og tage slangen ud af thermocycler.
  11. Hurtigt tilføje 0.5 pi RNAse H til rørene og vende tilbage til thermocycler.
  12. Hold ved 37 ° C i 20 min og afkøles til 4 ° C.
  13. Den komplementære DNA (cDNA) kan anvendes umiddelbart eller kan opbevares ved -20 ° C eller koldere indtil brug. Lang tids opbevaring af cDNA bør dog ved -80 ° C.

5.. Reagensforberedelse til PCR

  1. Before start, beregne mængden af ​​hvert af de krævede for antallet af prøver, der behandles, og kontrollen reagenser. Ud over de tre kontroller (positive, negative og reagens), kan du også tilføje en PCR-kontrol (HIV DNA). Den første og den anden runde PCR-blandinger kan fremstilles samtidig, og den anden master mix opbevaret ved -20 ° C indtil brug. Blandinger kan opbevares i cirka 8 timer.
  2. Læg 18,4 pi vand, 2,5 pi 10x buffer, 1,0 pi MgCl2, 0,5 pi dNTP, og 0,25 pi af hver af primerne, som vist i tabel 4 og vortex.
  3. Tilføj 0,1 pi Platinum Taq polymerase (5U/μl), og bland forsigtigt røret ved at trykke på det.
  4. Alikvote 23 ul af master mix til 200 ul PCR-rør.
  5. Med master mix rør på en kold blok eller is flytte til PCR-rum.

6.. Nested PCR

  1. Tilsæt 2 pi af cDNA'et til 23 pi af 1. runde PCR master blandes.
  2. Luk rørene sætte prøver thermocycler og brug følgende PCR cyklusbetingelser: 94 ° C i 2 minutter, 30 cyklusser af 95 ° C i 30 sek, 58 ° C i 20 sekunder og 72 ° C i 2 minutter, efterfulgt af en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 minutter, som vist på fig. 1.

Figur 1
Figur 1. Nested PCR cyklisternes forhold. Klik her for at se større billede.

  1. Fortsæt til 2. runde PCR scene eller opbevare 1. runde PCR-produkter ved -20 ° C eller koldere, indtil de skal på et senere tidspunkt.
  2. For 2. runde PCR, tilsættes 2 ul af 1. runde PCR-produkt til 23 ul af den 2. runde PCR Master Mix end bruge det samme PCR-program på figur 1.

7.. Gelelektroforese

  1. Gel forberedelse
    1. Tilføj en 0,5 g agarose tablet til en 250 ml glaskolbe og tilsættes 50 ml 1x TBE-buffer til kolben.
    2. Varme i mikrobølgeovn til kogning hvirvle ofte (ca. hver 30 sek) indtil den er helt opløst. Brug en silicone greb eller silikone grillhandske at forstå den varme kolbe. Agaroseopløsningen kan koge ud af kolben meget let, så nøje overvåge denne proces.
    3. Afkøling ved stuetemperatur i ca 10 minutter.
    4. Hæld agarose til en gel støbning bakke indeholdende passende størrelse kam, gel er klar til brug i ca 20-30 min.
    5. Placer gel i elektroforese kammer og køres som anbefalet af producenten.
  2. Gelelektroforese og visualisering.
    1. Vortex Novel Juice i 10 sek forud for anvendelse.
    2. Fortyndes 1 ml af Novel Juice med 5 pi DNA prøve og mix.
    3. Fortynd 3 ul Novel Juice med 3 ul molekylevægtmarkør og blandes.
    4. Load blandingerne fra § § 7.2.2 og 7.2.3 (ovenfor) og kør gelen ved 100 V og 400 mA i 40 min for at evaluere PCR-amplifikation.
    5. Positiv forstærkning kan visualiseres under UV-lys som 1.315 bp fragment, figur 2.

    Figur 2
    Figur 2. Gel bekræftelse af PCR-amplifikation ved 1% agarose gelelektroforese og et 200 bp stige. Klik her for at se større billede.

    1. Der bør ikke være nogen forstærkning i de negative og reagenser kontroller, hvilket indikerer fravær af forurening.

    8.. PCR-produkt Oprydning

    1. Som forberedelse til sekventeringsreaktionen de positive anden runde PCR-produkter renses op ved hjælp af PureLink PCR oprensning kit.
    2. Tilføj 80 pi arbejde bindingsbuffer High-Cutoff (B3) til 20 ul PCR-produkt og pipette mix.
    3. Tilsæt prøve blandet med den bindende buffer til et spin kolonne i et opsamlingsrør.
    4. Centrifuger kolonnen ved 10.000 xg i 1 min. Overfør kolonne i et nyt opsamlingsrør.
    5. Kolonnen udvaskes med 650 pi vaskebuffer med ethanol.
    6. Centrifuger kolonnen ved 10.000 xg i 1 min. Overfør kolonne i et nyt opsamlingsrør.
    7. Centrifuger kolonnen ved maksimal hastighed i 2-3 min for at fjerne eventuel resterende vaskebuffer.
    8. Placer centrifugesøjle i et rent 1,7 ml elueringsrør følger med sættet.
    9. Tilsæt 40 ​​ul elueringspuffer til midten af ​​søjlen og inkuberes søjlen ved rumtemperature i 1 min.
    10. Centrifuger kolonnen ved maksimal hastighed i 2 min (> 10.000 xg).
    11. Den elueringsrør indeholder dit oprensede PCR-produkt er klar til sekventering. Kassér kolonnen.
    12. Bestem koncentrationen og kvaliteten af ​​DNA under anvendelse af en NanoDrop.
    13. Hvis der ikke in-house sekventering faciliteter er til rådighed, kan de oprensede PCR-produkter blive sendt til en kommerciel sekventering laboratorium på dette stadium.

    9.. Sekventeringsreaktioner

    1. PCR-produkterne sekventeret ved hjælp af store farvestof-terminator kit version 3.1 og 4 primere for hver prøve (to frem og to tilbage). De primer-sekvenser er vist i tabel 2.. Derfor, efter sekventering sigt vil hver prøve har fire sekvenser, der skal samles til en contig.
    2. Opsætning sekventeringsreaktionerne som angivet i tabel 5 for hver af de fire primere.
    3. Bland sekventering buffer og primerne ved hvirvelbehandling før brug.
    4. Blandvand, puffer og primer før tilsætning af den store farvestof sekventering. Vortexes.
    5. Bland forsigtigt master mix efter tilsætning af store farvestof sekventering mix ved at vende røret eller trykke den forsigtigt.
    6. Alikvot 9 pi af master mix ind i en 96-brønds optisk plade.
    7. For at køre 24 prøver / plade, oprettet pladen som angivet nedenfor Figur 3.

    Figur 3
    Figur 3. Scheme repræsentation af en 96-brønds plade med 12 patientprøver bliver sekventeret med 4 primere hver (RTC1F, RTC2R, RTC3F og RTC4R). Klik her for at se større billede.

    1. Tilføj 1,0 pi af DNA-prøven (~ 20-40 ng), dække plade med enn klæbende aluminium låg og derefter forsigtigt blande det.
    2. Centrifuger ved 3.000 x g i 1 min. Fjern aluminiumsdæksel og tilføje en gummitætning mat.
    3. Pladen anbringes på thermocycler og kør følgende cykling i figur 4 viste.

    Figur 4
    Figur 4.. PCR cyklisternes forhold til sekventering. Klik her for at se større billede.

    1. Når PCR færdig, rydde op i sekventering produktet straks.

    10.. Sequencing Oprydning

    1. For hver sekventeringsreaktion, bland 50 ul absolut ethanol og 5 pi 3 M natriumacetat.
    2. Ved hjælp af en multikanal pipette tilsættes 55 &# 956; l natriumacetat / EtOH-opløsning til hver brønd.
    3. Seal brønde med lim aluminium låg, der sikrer, at hver brønd er forseglet ordentligt.
    4. Centrifuger ved 3.000 x g i 20 min.
    5. Efter 20 min, fjerne låget og vend pladen i én glidende bevægelse, på et foldet lab væv (IKKE bang for at slippe af supernatant, da dette vil løsne pillen!).
    6. Centrifuger omvendte plade på samme væv ved 150 x g i 2 min.
    7. Straks tilføje 150 pi kold 70% EtOH. Ikke forsinker tilsætning af ethanol på dette trin.
    8. Tætne med den samme lim alufoliepakning og vortex.
    9. Centrifuger ved 3.000 x g i 5 min.
    10. Vend pladen på en ny foldet væv og centrifuger inverteret ved 150 xg i 1 min.
    11. Efter centrifugering placere afsløret i thermocycler og tør det ved 50 ° C i 2 minutter.
    12. Når pladerne er tørre, forsegle det med selvklæbende folie covers, wrap i folie og opbevares ved -20 ˚ C, indtil klar til at gå with sekvensering elektroforese.
    13. Når du er klar til at rækkefølge, opløse rengjorte sekventering produkter i 10 ml Hi-Di formamid, denaturere og belastning til elektroforese.

    11.. Bioinformatik

    1. Sequence Assembly
      1. Start programmet Geneious.
      2. Opret en arbejdsgruppe mappe til at gemme sekvenser.
      3. Importer ABI filer genereret af sekventering maskinen til at arbejde mappe ved hjælp af import værktøj. Geneious vil afsætte procent kvalitet score for hver sekvens importeres.
      4. Åbne sekvenser med kvalitetsresultater> 70% ved at dobbeltklikke på dem.
      5. Hver fil skal åbne i et nyt vindue. Softwaren vil indikere kvaliteten ved hver nukleotid position kromatogrammet for ved hjælp af lys blå søjler sekvensen kvalitet. Jo højere søjlen er, jo bedre kvalitet af basen opkald.
      6. Ved hjælp af markøren, og vælg midtersektion af sekvensen udelade enderne, der normalt er af dårlig kvalitet. Klik på ekstrakt knappen for at udtrække region med god kvalitet sekvens.
      7. Vælg alle fire udtrukne sekvenser for hver prøve og samle dem imod en reference sekvens.
      8. Undersøg den samlede sekvens for at sikre, at du er i den korrekte læseramme. Hvis du er i den korrekte læseramme, bør begyndelsen af ​​Protease begynde med følgende aminosyrer: PQITLW. I begyndelsen af ​​RT starter med PISPIE.
      9. Uddrag contigen region dækker begyndelsen af ​​PR til 300-RT codon. Under denne proces også tjekke for insertioner eller deletioner.
      10. Gå gennem konsensus sekvens af det ekstraherede contigen, identificere eventuelle uklarheder og kontrollere positioner med blandede baser ved at inspicere kvalitet (symmetri, højde, baggrund og skuldre flankerende områder) basiskøretøjernes opkald.
      11. Vælg konsensus sekvens, og klik ekstraktet for at oprette en separat fil af konsensus sekvensen fra de fire primere og Label det korrekt.
      12. Eksporter sekvensen til en backup storage mappe på computeren eller en netværksmappe.
    2. Sequence Quality Assessment (HIVDB)
      1. Analyser sekvens ved hjælp af HIVDB programmet på http://hivdb.stanford.edu .
      2. Check for sletninger og indsættelser i resuméet af data og sikre, at sekvensen dækker alle de 99 protease (PR) codons og 1. 300 RT codons.
      3. Tjek for fremhævede kvalitetssikring (QA) spørgsmål i både PR og RT regioner, såsom stopcodoner, frame skift, tvetydige holdninger og usædvanlige rester.
    3. Sequencing Kvalitetskontrol
      1. Blast den nye sekvens mod en lokal sekvens database fra tidligere løb.
      2. Hvis den nye sekvens er> 97% svarende til en sekvens i databasen, bør alle faser af protokollen revideres, startende med sekvensanalyse og gå tilbage til RNA ekstraktion til sike, at der ikke var nogen mix ups (prøve switching, fejlmærkning) eller forurening.
      3. Hvis der konstateres nogen problemer, gentages analysen af ​​både de gamle og nye prøver fra RNA ekstraktionen.
      4. Hvis sekvenserne er stadig> 97% ens, gennemgå patientens historie at vurdere for enhver epidemiologisk forbindelse mellem individer.
    4. Phylogenetisk Analyse
      1. Juster alle sekvenser fra databasen ved hjælp ClustalW program i Geneious.
      2. Kontrollere manuelt justering til fejljusteret sekvenser, sletninger og indsættelser og redigere i overensstemmelse hermed.
      3. Konstruere et fylogenetisk træ ved hjælp PHYML, Geneious træ bygherre eller andre træ bygherrer i Geneious.
      4. Undersøg træet for prøver med korte gren længder.
      5. Gennemgå prøverne med korte gren længder for eventuel forurening.

    12.. Rega DB Informatik

    1. Sequence Upload
      1. Log ind på RegaDB ved hjælp af et unikt brugernavn og adgangskode.
      2. På rullemenuen under patient-id, skal du vælge "Begynder med".
      3. Tilsæt patient-id, og vælg den person, hvis genotype er at blive uploadet.
      4. På menuen til venstre skal du vælge "viral isolat".
      5. Fra valgmuligheder under viral isolat vælge "add".
      6. Indtast Sample dato, Prøve-id, Sequence id og Sequence dato.
      7. Vælg "vælg fil" og derefter navigere til FastA fil af sekvensen, der skal uploades.
      8. Efter valg af FASTA fil, der skal uploades, skal du klikke på upload.
      9. Når den uploadede sekvens vises i nukleotid boksen under sekvens identificerer og datoer ved at klikke på OK-knappen nederst til højre i vinduet.
      10. Check for PR og RT protein tilpasning ved at klikke på knappen protein og vælge enten PR eller RT.
      11. Check for stoffet resistensmutation ved at klikke på knappen modstand. Det giverdu modstandsgrupperne profiler fra tre algoritmer: ANRS, Stanford HIVDB og RegaDB.
    2. Rapport generation bruger REGA
      1. Log ind på RegaDB hjælp af din unikke brugernavn og adgangskode.
      2. På rullemenuen under patient-id, skal du vælge "Begynder med".
      3. Tilsæt patient-id, og vælg den person, hvis rapporten skal genereres.
      4. På menuen til højre vælge, viral isolat.
      5. Fra valgmuligheder under viral isolat klik på "view".
      6. Dobbeltklik på den virale isolat, som du vil oprette en rapport.
      7. På den virale isolat, skal du klikke på den virale isolat rapport fane.
      8. Vælg de algoritmer for fortolkning af genotypen fra drop down menuen og vælg derefter rapport skabelon til brug.
      9. Når algoritmen og skabelonen er valgt, skal du klikke på knappen "Generate".
      10. Download rtf dokument genereres.
      11. Åbn rtf gørecument som et word dokument.
      12. Resize behandlingen historie chart.
      13. Efter diagrammet, tilføjes afsnittet "Klinisk diagram og modstand fortolkning."
      14. Ved hjælp af data om resistens bordet og kliniske diagram, tilføje en beskrivelse af patientens modstand profil begyndende med patientens behandling historie og de lægemidler, for hvilke den virale isolat er resistent. Også tilføje en beskrivelse af patientens virale belastning og CD4 + celletallet profiler fra diagrammet.
      15. Send rapporten til Infektionsmedicinsk (ID) specialist til gennemgang og anbefalinger om den fremtidige patientbehandling. Denne proces er også en meget vigtig kvalitetssikring fase. Eventuelle fejl i genotypen eller inconsistences i behandlingen historie kan virologiske og immunologiske profiler identificeres og revideret før en endelig rapport er sendt, med alle de anbefalinger, klinikeren styre patienten.

Representative Results

Den validerede metode var en modifikation af en tidligere rapporteret metode 20. Den Viroseq genotypebestemmelse metode, som er blevet godkendt af FDA, blev brugt som referencemetode i valideringen. Et panel af præstationsprøvning prøver fra de franske nationale kontorer for Forskning om aids og viral hepatitis (ANRS) blev anvendt i det primære sammenligning mellem de to metoder. De to genotypebestemmelse metoder var 100% overensstemmende identificere alle klinisk vigtige lægemiddelresistens mutationer som fortolket af HIVDB program for de prøver, der blev succesfuldt forstærkes ved begge metoder. Som vist i tabel 6, nukleotidsekvenserne af de tre par var 99,5% identiske. De forudsagte aminosyresekvenser var 100% identiske. En prøve ud af fem ikke med held kunne forstærkes ved Viroseq. Ud over at prøven ikke amplificeret ved Viroseq den interne metode undladt at amplificere en anden prøve, som blev vistat være en cirkulerende rekombinant virus (CRF02_AG) af Viroseq. De tre prøver, der forstærkes med begge metoder var subtype B (to prøver) og subtype A (en prøve).

Figur 5
Figur 5. Anvendelse af en HKY Neighbor Vær træ udført som en del af sekvens kvalitetssikring. Der er fire par / klynger af sekvens med meget korte genetiske afstande. Den genetiske afstand mellem RES655 og RES655_1 (samme prøver sekventeret på forskellige dage) er 0,003. Det er en potentiel fejl med RES637_1/RES638 parret som deres genetiske afstand er for kort (0,075) for prøver fra forskellige epidemiologisk tilkoblede individer. Der er en anden RES637 på træet med en afstand på 0,075 sammenlignet med RES638_1. Den CQ01/CQ02 klynge antyder, at de to prøverfra panelet er dubletter af samme prøve. De klynge sammen med undertype B referencesekvensen bekræfter subtype tildelt af Rega Subtypebestemmelse værktøj. CQ05 og CQ04 grupperet med undertyper A og G, mens der Rega subtypning værktøj klassificeret dem som A og CRF02_AG hhv. Et andet nyttigt værktøj for HIV undertypebestemmelse og rekombination er SCUEL, der er tilgængelig på http://www.datamonkey.org. Klik her for at se større billede.

Et panel af fem prøver blev anvendt til at vurdere nøjagtigheden af ​​den interne metode. Ti replikate genotyper blev frembragt for hver af de fem prøver. Ved hjælp af 16 Kapillær 3130xl genetiske analysator, 48 af de 50 genotyper blev frembragt fra 24 kørsler, fremstillet på den samme dag. For alle fem prøver, de forudsagte aminosyresekvenser var 100% overensstemmende blandt gentagelser. For nukleinsyresekvenser, there var> 99% parvise lighed.

I løbet af de første to år af brugen af ​​denne metode blev tres prøver gentaget tilfældigt fra RNA ekstraktion til sekventering. Der var ingen statistisk signifikante forskelle mellem sekvensen kvalitet score og antallet af blandede baser mellem gentagelser. Både nucleotid og aminosyre parvise sammenligninger for de tres par var større end 99% identiske. Således drug resistente mutationer for alle parrene var 100% overensstemmende.

Omkostningsreduktion

Reaktionsbetingelserne mængder for RT PCR og sekventering blev reduceret med mindst halvdelen i forhold til den oprindelige metode 20, 32, uden at gå på kompromis med kvaliteten af sekvenser genereres. Dette muliggjorde en reduktion i omkostningerne på 50% for de RT og PCR etaper.

Den nye metode blev oprindeligt designet til at arbejde med seks sekvenseringsprimer til sekvens alle 99 kodoner af proteasegenet og de ​​første 300 codoner reverse transkriptase-gen 20, 32. Lignende metoder også bruge seks til otte primere 33, 34. Nogle nyligt offentliggjorte metoder har brugt mindre end seks primere, men nogle gange sekventering af protease og RT generne seprately 35, 36. Vi søgte at reducere antallet af sekvensprimere fra seks til fire, (figur 6)

Figur 6
Figur 6. Sammenligning af sammenhængende sekvenser fra seks vs fire sekvensprimere til generering af 1197 bp pol-sekvens, der omfatter alle 99 HIV-1-protease-kodoner og de ​​første 300 codoner af revers transkriptase-genet.242/51242fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Sekvenser fra et sæt af 17 prøver genereret fra seks primere blev sammenlignet med sekvenser genereret efter udelukkelse af to primere (MAW46 og bh). De undertyper var 14 subtype C, to undertype B, og én subtype A. Der var ingen signifikante forskelle i rækkefølge kvalitetsresultater. Igen gennemsnitlige parvise identitet mellem de 17 par af nukleinsyre var 99% og 100% på aminosyreniveauet. Således reducere sekventeringsprimere fra seks til fire resulterede i en reduktion i sekventering omkostninger med næsten en tredjedel.

Den eneste proprietær software værktøj, der anvendes i denne protokol var Geneious for sekvens forsamling. De lægemiddelresistens fortolkningsværktøjer samt rapporten genererer værktøjer er alle gratis, open access værktøjer. Dette reducerer omkostningerne yderligere ved at fjerne de omkostninger, der er forbundet med brugen af ​​beskyttet software. Endvidere Collective forhandling tilladt reagenserne til denne protokol, der skal pakkes ind i et kit for nem adgang fra Life Technologies og er tilgængelig som Saturn / Life Technologies genotypebestemmelse metode 37.. Desuden kan Saturn medlemmer adgang reagenserne til en nedsat pris.

Klinisk indstilling

Den beskrevne protokol er blevet implementeret i kontrol og overvågning af resistens i et landligt samfund i KwaZulu-Natal. I alt 604 genotyper blev genereret fra kliniske prøver mellem december 2010 og maj 2013 ved en forstærkning på 95% for prøver med viral belastning> 1000 RNA kopier / ml. Denne kliniske HIV resistens undersøgelse blev godkendt af Biomedical Research Ethics Committee fra University of KwaZulu-Natal (ref. BF052/10) og forskningsudvalget i KwaZulu-Natal Department of Health (ref. HRKM 176/10) Sundhed. Enkelte patients rapporter blev genereret og sendt tilbage til klinikkernefor patientbehandlingen.

Halvfjerds to (72) genotyper blev også genereres som en del af en overvågning af transmitteret resistens undersøgelse indlejret i en stor prospektiv populationsbaseret hiv-overvågning studie. De primære prøver var nålestik fuldblod opsamles i EDTA mikrorør. På genotypebestemmelse var der en forstærkning på 79% 19. Etik godkendelse til genotypebestemmelse af prøver fra overvågningen undersøgelse blev indhentet fra University of KwaZulu-Natal Biomedical Research Ethics Committee (ref. BE066107).

Primer navn Sequence Længde Retning HXB2 holdning
MAW-26 TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC 23. Fremad 2028-2050 1. runde PCR
RT-21 CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG 31 Reverse 3539-3509 1. runde PCR
Pro-1 TAGAGCCAACAGCCC CACCA 20 Fremad 2147-2166 2. runde PCR
RT-20 CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC 22 Reverse 3462-3441 2. runde PCR
RTC1F ACCTACACCTGTCAA CATAATTG 23. Fremad 2486-2508 Sequencing
RTC2R TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG 27 Reverse 2630-2604 Sequencing
RTC3F CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC 30 Fremad 2956-2994 Sequencing
RTC4R CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC 29 Reverse 3129-3101 Sequencing
RT-y GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG 22 Reverse 2967-2946 Sequencing
MAW-46 TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC 27 Fremad 2251-2277 Sequencing

Tabel 1. Revers transkription og PCR og sekventering tilpassede primere der anvendes til generering af et 1197 bp pol-fragment, der omfatter alle de 99 HIV-1-protease kodoner og de ​​første 300 codoner fra den omvendte trascriptase genet.

RT21 (5pmol/ml) 0.5 0.2
dNTP (10 mM) 0.5 0.4
Samlet 1

Tabel 2. dNTP / Primer blandes i revers transkription reaktion.

Reagens Volumen (ml) / reaktion Koncentration / reaktion
First Strand Buffer (10x) 1 1
MgCl2 (25 mM) 2 4.
DTT (0,1 M) 1 0.008
RNaseOUT (40 U / ml) 0.5 16
Hævet III reverse transkriptase (200U/ml) 0.5 8.
Samlet 5.

Tabel 3. Enzym blandes i revers transkription-reaktionen.

Reagens Volumen (ml) / reaktion Endelig koncentration / Reaction
DEPC behandlet vand 18.4 - </ Td>
PCR-buffer (10x) 2.5 1
MgCl2 (50 mM) 1 2
dNTP-blanding (10 mM) 0.5 0.2
Overskud overført primer (5 pmol / ml) 0.25 0.05
Reverse primer (5 pmol / ml) 0.25 0.05
Platinum Taq Polymerase (5 U / ml) 0.1 0.02
Subtotal 23. -

Tabel 4. Master mix for nested PCR.

Reagens Volumen (ml) / reaktion Koncentration / reaktion
DEPC behandlet vand 6.1
Sequencing Buffer (5x) 2 1
Primer (3,2 pmol / ml) 0.5 0.16
Big Dye Terminator Sequencing mix 0.4 -
Samlet 9

Tabel 5. Master mix for sekventeringsreaktionerne.

Viroseq Inhouse % NA lighed
Prøve-id Undertype Kvalitet score PR Mutationer RT-mutationer Undertype Kvalitet score PR mutationer RT Mutationer
CQ01 B 99,9 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q B 99,2 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q 100
CQ02 B 99.5 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q B 99.5 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q 100
CQ03 NA NA NA NA NA NA
CQ04 CRF02_AG 98,4 I54V, V82F, I84V M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C NA NA NA NA NA
CQ05 A 99,7 K103N A 93 K103N 100

Tabel 6. Sammenlignende results fra en parallel analyse mellem Viroseq genotypebestemmelse metode og den interne metode ved hjælp af et panel af prøver tilvejebragt af ANRS.

Discussion

Adskillige lavpris in-house metoder er blevet beskrevet i bestræbelserne på at forsøge at gøre hiv-resistens genotypebestemmelse mere overkommelige 33, 34, 36. Der er ingen tvivl om behovet for at integrere modstand narkotikatests i kontinuum af omsorg for personer på antiretroviral behandling i områder med begrænsede ressourcer. Imidlertid fokuserer de fleste af de rapporterede metoder for anvendelsen af ​​resistens genotypebestemmelse i overvågningen af ​​resistens på populationen. Saturn / Life Technologies genotypebestemmelse metode er en fuldt integreret protokol for overvågning og kontrol af resistens. Denne metode blev udviklet til at være en overkommelig protokol gennemførelse af det meste open source og åbne ressourcer adgang bioinformatik for fortolkningen af ​​lægemiddelresistens og generering af rapporter til klinisk ledelse.

Det blev vist ved sammenligning med FDA godkendte Viroseq genotypebestemmelse metode til at værepræcis at identificere drug resistente mutationer fra et panel af ANRS præstationsprøvning prøver i 100% af laboratorie panel prøver, der blev succesfuldt forstærket. Præcisionen blev også vurderet på kliniske prøver af subtype C virus, den mest dominerende subtype i det sydlige Afrika. Fremgangsmåden var som nøjagtig på undertype C prøver som det var på undertype A og B. Men hvis metode skal anvendes i andre dele af verden, hvor CRF02_AG er fremherskende, er der et behov for ændring af primerne, idet fremgangsmåden undladt at forstærke en af ​​panelets prøver, der viste sig at have CRF02_AG. Alternativt kan et degenereret sæt af primere, der er følsomme for alle gruppe M virus 33, 36 kan anvendes i områder, hvor subtype fordelingen mere heterogen 38.

Følsomheden af ​​revers transkription og PCR kan øges ved at ekstrahere RNA fra større mængder af plasma, såsom 500 ml. Plasmaet kan centrifugaluged ved 21.000 xg i 90 min for at koncentrere de virale partikler før du fortsætter med den protokol, som beskrevet af QIAamp virale RNA-ekstraktion mini kit.

Som vist den nye fremgangsmåde har en yderligere fordel, at den producerer omfattende rapporter til individuel patient. Disse rapporter er en konsolidering af genotype, immunologiske og virologiske overvågningsdata samt kliniske og behandling historie fra RegaDB. Dette er ledsaget af en detaljeret laboratorium fortolkning af modstand profil efterfulgt af en lige så detaljeret gennemgang af patientens kliniske historie samt behandling anbefalinger. Brugen af ​​en specialist læger til at gennemgå rapporterne og give behandling anbefalinger for patienterne giver den tiltrængt mentorskab for sygeplejerske praktiserende læger samt uerfarne klinikere, som i stigende grad leverer ART i Sydafrika som en del af WHO-anbefalingerne for opgaven gearskift. Disse kliniskerapporter har vist sig at være effektive undervisningsmateriale til klinikere med lidt eller ingen erfaring med resistens management. Fra en patient perspektiv, vores metode mindsker behovet for at rejse til centrale steder for at få adgang til specialiserede hiv-tjenester.

Således beskrevne protokol som helhed giver en god platform, hvorigennem HIV resistens management kan integreres, til en overkommelig pris, i et kontinuum af omsorg for HIV-smittede personer ikke ART. De data, der genereres kan anvendes til epidemiologiske formål at vurdere udviklingen og overførsel af resistens i samfundet. Størrelsen af ​​den pol-fragmentet genereret er godt nok til mere komplekse fylogenetisk analyse, som vil producere en bedre forståelse af epidemien i befolkningen.

Disclosures

Dette arbejde blev støttet af Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), Den Europæiske Union (SANTE 2007 147-790), det amerikanske Center for Sygdomskontrol via CAPRISA (projekt titel: styrkelse af sundhedssystemerne og HIV behandlingssvigt (HIV- TFC)) og den schweiziske South fælles forskningsprogram afrikansk (SSJRP) forskningsbevilling titlen "Swiss Prot / Sydafrika: Protein Bioinformatik Resource Development til vigtige Sundhedsrelaterede Patogener". RL er støttet af Wellcome Trust (tilskud nummer 090.999 / Z / 09 / Z). De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende alle de kolleger, der har gjort dette arbejde muligt, især Maya Balamane, Elizabeth Johnston Hvid, Sharon Sjöblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, og Lungani Ndwandwe. Forfatterne vil også gerne takke alle medarbejdere på Institut for Sundhed og Africa Centre personale, der arbejder Hlabisa HIV Behandling og pleje-programmet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superscript III 1st strand Synthesis kit Life Technologies 18080051 Reverse Transcription
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers Life Technologies 4473517 PCR
Platinum Taq Life Technologies 10966026 PCR
PureLink QUICK PCR Purification Kit Life Technologies K310002 PCR
Viroseq ABBOTT 4J94-20 Reverse Transcription and PCR
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) BIOLINE BIO-41027 PCR
TBE Buffer MERCK 1.06177.2500 PCR
O'Range Ruler 200 bp DNA Ladder Fermentas FE SM0633 PCR
Novel Juice GeneDireX LD001-1000 PCR
MiniBis Bioimaging System DNR Bioimaging Systems Ltd Gel Documentation
Power Pac 300  BIORAD Gel Electrophoresis
Big Dye Terminator Kit version 3.1 Life Technologies 4337456 Sequencing
Arrays Life Technolgies 4319899 Sequencing
PoP Life Technologies 4363785 Sequencing
10x EDTA Buffer Life Technologies 402824 Sequencing
Formamide Life Technologies 4311320 Sequencing
5x Sequencing Buffer Life Tecgnologies 4336697 Sequencing
3130 xl Genetic Analyzer Life Technologies Sequencing
GeneAmp PCR System 9700 Life Technologies RT/PCR/Sequencing
Centrifuge 5804 EPPENDORF Sample Processing
Centrifuge 5415R EPPENDORF RNA Extraction
Centrifuge 5415R EPPENDORF RT and PCR
Centrifuge 5415D EPPENDORF PCR Product Clean up
Centrifuge 5810 EPPENDORF Sequencing Clean up
Picofuge BIORAD C1301-230V RT and PCR
Vortex Genius 3 IKA RNA extraction and reagent preparation
Vortex mixer IKA Sequencing Cleanup
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer ThermoScientific DNA quantification 
3 M Sodium Acetate MERCK 567422 Sequencing Clean up
Absolute Ethanol MERCK SAAR2233540LP Sequencing Cleanup
1.5 ml SARSTEDT Tubes BIODEX 72.692.005 RNA Extraction
2 ml SARSTEDT  Tubes BIODEX 72.693.005 RNA Extraction
2 ml Collection tubes SCIENTIFIC GROUP MCT-200-NC/S RNA Extraction
Optical MicroAmp 96-well reaction plates Life Technologies N8010560 Sequencing
200 µl 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps STAR Lab - supplied by CELTIC A1402-3700 RT and PCR
200 µl PCR individual tubes Scientific Group CR/3745 RT and PCR
Geneious  Biomatters Sequence analysis
Internet Access Preferrably high speed
Web resources
hivdb.stanford.edu Stanford University Drug reistance analysis
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB SATuRN database
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html SATuRN Sequence quality tool

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, Y., Williamson, C. The HIV-1 epidemic: low- to middle-income countries. Cold Spring Harbor Persp. Med. 2, (2012).
  2. Mutevedzi, P. C., et al. Scale-up of a decentralized HIV treatment programme in rural KwaZulu-Natal, South Africa: does rapid expansion affect patient outcomes. Bull. World Health Organ. 88, 593-600 (2010).
  3. Houlihan, C. F., et al. Cohort profile: Hlabisa HIV treatment and care programme. Int. J. Epidemiol. 40, 318-326 (2011).
  4. Tanser, F., Barnighausen, T., Grapsa, E., Zaidi, J., Newell, M. L. High coverage of ART associated with decline in risk of HIV acquisition in rural KwaZulu-Natal. South Africa. Science. 339, 966-971 (2013).
  5. Bor, J., Herbst, A. J., Newell, M. L., Barnighausen, T. Increases in adult life expectancy in rural South Africa: valuing the scale-up of HIV treatment. Science. 339, 961-965 (2013).
  6. Montaner, J. S., et al. The case for expanding access to highly active antiretroviral therapy to curb the growth of the HIV epidemic. Lancet. 368, 531-536 (2006).
  7. Granich, R. M., Gilks, C. F., Dye, C., De Cock, K. M., Williams, B. G. Universal voluntary HIV testing with immediate antiretroviral therapy as a strategy for elimination of HIV transmission: a mathematical model. Lancet. 373, 48-57 (2009).
  8. Johnson, L. F., et al. Life expectancies of South african adults starting antiretroviral treatment: collaborative analysis of cohort studies. PLoS Med. 10, (2013).
  9. Blower, S., Ma, L., Farmer, P., Koenig, S. Predicting the impact of antiretrovirals in resource-poor settings: preventing HIV infections whilst controlling drug resistance. Curr. Drug Targets. 3, 345-353 (2003).
  10. Geretti, A. M. Epidemiology of antiretroviral drug resistance in drug-naive persons. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 22-32 (2007).
  11. Larder, B. A., Darby, G., Richman, D. D. HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy. Science. 243, 1731-1734 (1989).
  12. Erice, A., et al. Brief report: primary infection with zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1. N. Engl. J. Med. 328, 1163-1165 (1993).
  13. Williams, I., et al. British HIV Association guidelines for the treatment of HIV-1-positive adults with antiretroviral therapy. HIV Med. 13 Suppl 2, 1-85 (2012).
  14. DHHS, US Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. (2012).
  15. Vandamme, A. M., et al. European recommendations for the clinical use of HIV drug resistance testing: 2011 update. AIDS Rev. 13, 77-108 (2011).
  16. DHHS, US Panel on Antiretroviral Therapy and Medical Management of HIV-Infected Children. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection. (2012).
  17. Department of Health. Clinical guidelines for the management of HIV & AIDS in adults and adolescents. Department of Health. (2010).
  18. Conradie, F., et al. The 2012 southern African ARV drug resistance testing guidelines. S. Afr. J.HIV Med. 13, 162-167 (2012).
  19. Manasa, J., et al. Primary Drug Resistance in South Africa: Data from 10 Years of Surveys. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 558-565 (2012).
  20. Tshabalala, M., et al. Surveillance of transmitted antiretroviral drug resistance among HIV-1 infected women attending antenatal clinics in Chitungwiza, Zimbabwe. PLoS ONE. 6, (2011).
  21. Bartolo, I., et al. Antiretroviral drug resistance surveillance among treatment-naive human immunodeficiency virus type 1-infected individuals in Angola: evidence for low level of transmitted drug resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 3156-3158 (2009).
  22. Bartolo, I., et al. HIV-1 genetic diversity and transmitted drug resistance in health care settings in Maputo, Mozambique. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 51, 323-331 (2009).
  23. Hamers, R. L., et al. HIV-1 drug resistance in antiretroviral-naive individuals in sub-Saharan Africa after rollout of antiretroviral therapy: a multicentre observational study. Lancet Infect. Dis. 11, 750-759 (2011).
  24. Hamers, R. L., et al. HIV-1 Drug Resistance Mutations Are Present in Six Percent of Persons Initiating Antiretroviral Therapy in Lusaka, Zambia. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. (2010).
  25. Nwobegahay, J., Selabe, G., Ndjeka, N. O., Manhaeve, C., Bessong, P. O. Low prevalence of transmitted genetic drug resistance in a cohort of HIV infected naive patients entering antiretroviral treatment programs at two sites in northern South Africa. J. Med. Virol. 84, 1839-1843 (2012).
  26. Iweriebor, B. C., et al. Molecular epidemiology of HIV in two highly endemic areas of northeastern South Africa. Arch. Virol. 157, 455-465 (2012).
  27. Parboosing, R., Naidoo, A., Gordon, M., Taylor, M., Vella, V. Resistance to antiretroviral drugs in newly diagnosed, young treatment-naive HIV-positive pregnant women in the province of KwaZulu-Natal South Africa. J. Med. Virol. 83, 1508-1513 (2011).
  28. Nwobegahay, J. M., et al. Prevalence of antiretroviral drug resistance mutations and HIV-I subtypes among newly-diagnosed drug-naive persons visiting a voluntary testing and counselling centre in northeastern South Africa. J. Health Popul. Nutr. 29, 303-309 (2011).
  29. Nwobegahay, J., et al. Prevalence of drug-resistant mutations in newly diagnosed drug-naive HIV-1-infected individuals in a treatment site in the waterberg district, limpopo province). S. Afr. Med. J. 101, (2011), 335-337 (2011).
  30. Rosen, S., Long, L., Sanne, I., Stevens, W. S., Fox, M. P. The net cost of incorporating resistance testing into HIV/AIDS treatment in South Africa: a Markov model with primary data. J. Int. AIDS Soc. 14, 24 (2011).
  31. Dalai, S. C., et al. Evolution and molecular epidemiology of subtype C HIV-1 in Zimbabwe. AIDS. 23, 2523-2532 (2009).
  32. Chen, J. H., et al. In-house human immunodeficiency virus-1 genotype resistance testing to determine highly active antiretroviral therapy resistance mutations in Hong Kong. Hong Kong Med. 18, 20-24 (2012).
  33. Lee, C. K., et al. An in-house HIV genotyping assay for the detection of drug resistance mutations in Southeast Asian patients infected with HIV-1. J. Med. Virol. 84, 394-401 (2012).
  34. Aitken, S. C., et al. A Pragmatic Approach to HIV-1 Drug Resistance Determination in Resource-Limited Settings by Use of a Novel Genotyping Assay Targeting the Reverse Transcriptase-Encoding Region Only. J. Clin. Microbiol. 51, 1757-1761 (2013).
  35. Zhou, Z., et al. Optimization of a low cost and broadly sensitive genotyping assay for HIV-1 drug resistance surveillance and monitoring in resource-limited settings. PLoS One. 6, (2011).
  36. , Life Technologies. Life Technologies and SATuRN Collaborate to Increase Access to HIV Testing in Africa. Available from: https://ir.lifetechnologies.com/releasedetail.cfm?releaseid=694585 (2012).
  37. Lihana, R. W., Ssemwanga, D., Abimiku, A., Ndembi, N. Update on HIV-1 diversity in Africa: a decade in review. AIDS Rev. 14, 83-100 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics