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Um método de monitoramento acessível HIV-1 Resistência às Drogas para recursos configurações limitadas

Medicine
 

Summary

Testes de resistência aos medicamentos para o HIV-1 indivíduos infectados não responderam à terapia anti-retroviral (ART) pode orientar futuras terapias e melhorar os resultados do tratamento. Otimizando individual e populacional resultados de saúde em alta prevalência de HIV, mas contextos de recursos limitados, em última análise exigem genotipagem resistência aos medicamentos disponíveis e acessíveis e métodos de interpretação.

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Manasa, J., Danaviah, S., Pillay, S., Padayachee, P., Mthiyane, H., Mkhize, C., Lessells, R. J., Seebregts, C., de Wit, T. F., Viljoen, J., Katzenstein, D., De Oliveira, T. An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings. J. Vis. Exp. (85), e51242, doi:10.3791/51242 (2014).

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Abstract

HIV-1 resistência à droga tem o potencial de comprometer seriamente a eficácia eo impacto da terapia anti-retroviral (ART). Como os programas de arte em África subsaariana continua a expandir-se, os indivíduos em TARV devem ser cuidadosamente monitorizados para o aparecimento de resistência às drogas. Vigilância da resistência às drogas transmitida para acompanhar a transmissão de cepas virais já resistentes a ART também é crítica. Infelizmente, o teste de resistência a drogas ainda não é facilmente acessível em contextos de recursos limitados, porque a genotipagem é caro e requer laboratório sofisticado e infra-estrutura de gerenciamento de dados. Um método de monitoramento da resistência genotípica acesso aberto para gerir pessoas e avaliar a resistência aos medicamentos transmitida é descrito. O método utiliza o software livre de código aberto para a interpretação dos padrões de resistência às drogas e à geração de relatórios individuais dos pacientes. O protocolo de genotipagem tem uma taxa de amplificação maior do que 95% para as amostras de plasma com avcarga Iral> 1000 de HIV-1 de cópias de ARN / ml. A sensibilidade diminui significativamente para cargas virais <1000 cópias de RNA do HIV-1 / ml. O método descrito aqui foi validado contra um método de HIV-1 resistência a drogas de teste aprovados pelos Estados Unidos Food and Drug Administration (FDA), o método de genotipagem comercial Viroseq. As limitações do método aqui descrito incluem o facto de que não é automatizado e que também não conseguiu amplificar a forma circulante CRF02_AG recombinante a partir de um painel de amostras de validação, embora amplificado subtipos A e B a partir do mesmo painel.

Introduction

A epidemia de HIV na África Austral vem evoluindo rapidamente 1, com um aumento exponencial concomitante em indivíduos em terapia anti-retroviral (ART), especialmente na África do Sul 2, 3. Como evidência sobre o impacto epidemiológico de programas de tratamento em larga escala na redução da incidência 4 e aumento da expectativa de vida em contextos de recursos limitados (SPI) 5 continua a acumular, os esforços para aumentar a cobertura ART será intensificado. A evolução das orientações para a utilização de tratamento como um instrumento de prevenção de 6, 7, sob o teste e programas de tratamento significa que o número absoluto de indivíduos em tratamento irá aumentar. Um grande número de pessoas estará em ART por longos períodos de tempo em que a expectativa de vida média das pessoas em TARV que se aproxima da população não infectada pelo HIV 8. O desenvolvimento e transmissão de resistência ao HIV tem always sido considerado uma ameaça para as conquistas da ART 9-12. Assim, há uma necessidade de vigilância e monitorização da resistência aos medicamentos mais rigoroso quanto mais pessoas são iniciadas no ART.

Testes de resistência genotípica (GRT) tem sido usado com sucesso em países desenvolvidos, tanto para a vigilância, bem como o monitoramento do HIV-1 resistência a drogas em indivíduos que recebem ART. Nesses ambientes, GRT foi integrado no continuum de cuidados para o HIV-1 indivíduos infectados. A maioria das diretrizes internacionais recomendam GRT para pacientes adultos ou pediátricos falhando ART (de primeira linha e de segunda linha) 13-15, pacientes pediátricos expostos a prevenção da transmissão mãe-filho (PMTCT) regimes, mas posteriormente infectou 16, e em locais com altos níveis de resistência a drogas transmitido entre os indivíduos com infecção aguda 13-15. No entanto, os requisitos de custo, tecnologia e infra-estrutura têm limitado a implementação de abordagens semelhantes para o monitoramento da resistência de droga em RLS.

O tratamento Africano Sul HIV e diretrizes de monitoramento atualmente não recomendam o uso de GRT para orientar escolha de ART para indivíduos falhando regimes de primeira linha 17. Os indivíduos estão ligados principalmente com base em (HIV-1 RNA carga viral) parâmetros virológicos. No entanto, em 2012, o Sul Africano HIV médicos Society publicou as primeiras diretrizes de teste a resistência aos medicamentos ARV Africano do Sul 18. Estas diretrizes recomendam o teste GRT para todos os adultos na falta de primeira linha e de segunda linha ART e para crianças infectadas e crianças expostas ao pMTCT 18. No entanto, não é recomendado GRT 18 para indivíduos com infecção aguda, porque não há evidência atual para altos níveis de resistência a drogas transmitida no sul da África 19-29. Espera-se que algumas destas recomendações será integrado ao longo do tempo para o tre nacionaltamento e acompanhamento das diretrizes dos diversos países da região. Já, nas diretrizes de tratamento 2013 Sul-Africano agora há recomendação do TAB no momento da falha de segunda linha para adultos e no momento da falha regime de primeira ou de segunda linha baseada em PI para as crianças 30.

Demonstrou-se que a incorporação de TAB em orientações de tratamento na África do Sul seria potencialmente custo-neutro. Considerando o custo dos medicamentos de segunda linha regimen que são relativamente mais caro do que as drogas de primeira linha, usando TAB para identificar os pacientes que realmente precisam para ser transferido para tratamento de segunda linha não acarretará qualquer custo adicional para o programa. Além disso, o TAB também pode identificar outras razões para o fracasso, conservar as opções de tratamento e gerar informações sobre os padrões de resistência emergentes 31. Portanto, é necessário reduzir o custo dos métodos de monitoramento de resistência a drogas ainda mais, a fim de melhorar o acesso, a qualidade dos cuidados de umd resultados.

Aqui, apresentamos um método GRT projetado para usar genéricos (open source) primers para a transcrição reversa, reação em cadeia da polimerase (PCR) e seqüenciamento (Tabela 1), bem como software de código aberto na maior parte para a interpretação resistência aos medicamentos. Para abordagem clínica, o protocolo é complementado por uma análise e descrição método abrangente, com interpretação especialista do relatório resistência a drogas de laboratório, com cerca adesão às diretrizes nacionais de tratamento. O protocolo é dividido em quatro componentes diferentes: 1) Ácido HIV ribonucleico (ARN) de extracção, 2) da transcrição reversa e reacção de polimerase em cadeia (PCR) amplificação de alvos virais, 3) Sequenciação e 4) métodos de bioinformática para análise dos cromatogramas, alinhamento, curadoria e interpretação de dados de seqüência.

Protocol

1. Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) de processamento de sangue inteiro

Nota: O sangue pode ser processadas imediatamente após a recolha dos podem ser armazenados a 4 ° C durante não mais do que 24 horas.

  1. Trabalhando em uma cabine de segurança biológica, permite a todo EDTA amostra de sangue para atingir a temperatura ambiente.
  2. Para cada amostra, rotular criotubos suficientes com a identificação da amostra (ID), material de armazenamento (plasma), e data.
  3. Centrifugar as amostras durante 10 min a 1000 x g. Não use os freios para parar centrífuga. Isso vai render três camadas (de cima para baixo): plasma, leucócitos (buffy coat) - uma camada muito fina - e eritrócitos, incluindo plaquetas.
  4. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante (plasma) e alíquota de 500 mL em cada frasco de congelação. Tome cuidado para não perturbar a camada de células (buffy coat) ou transferir quaisquer células.
  5. Armazenar a -80 ° C até ser necessário para a extração de RNA ou proceder à extração de RNA imediatamente.
ve_title "> 2. Extração de RNA

  1. Prepare uma folha de extração com as identificações das amostras a serem extraídos, incluindo controles de plasma positivas e negativas.
  2. Para cada amostra a ser extraído, rotular um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml esterilizado, com a identificação da amostra, a data de extracção e "ARN". Também rotular uma coluna de recolha e tubo montado, bem como um tubo de microcentrifugação de 2 ml contendo solução de lise de trabalhar com números correspondentes da folha de extracção.
  3. Trabalhando no Gabinete Bio-Segurança, adicione 200 mL de amostra para o correspondente 2 ml tubo de microcentrífuga de solução de lise de funcionar.
  4. Bem vortex e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
  5. Após 10 min, centrifugar o tubo brevemente.
  6. Adicionar 800 ml de etanol absoluto para cada um dos tubos.
  7. Misture em vórtice de pulso e brevemente centrífuga.
  8. Transfira 600 mL desta solução para o conjunto do tubo de coluna / coleção correspondente. Centrifugar a 6.000 xg durante 1 min.
  9. Transferir coluna para um novo tubo de coleta e descarte o tubo de coleta de idade que contém o filtrado. Repita o passo acima de 2,8 (acima) mais duas vezes.
  10. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem AW1 para cada coluna e centrifugar a 6000 x g durante 1 min.
  11. Descartar o tubo filtrado e coleta e transferir a coluna para um novo tubo de coleta.
  12. Adicionar 500 ul foi AW2 tampão e centrifuga-se a 20.000 xg durante 3 min. Repita o passo 2.11.
  13. Centrifugar em um novo tubo de recolha a 20000 xg durante mais 2 minutos adicionais.
  14. Descarte coluna filtrado e coloque em 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
  15. Adicionar 60 ul de tampão de AVE (RNase isenta de água) para o meio da coluna de assegurar que não distribuir o líquido sobre o lado da coluna.
  16. Incubar à temperatura ambiente durante 1 min.
  17. Centrifugar a 6000 xg por 2 min.
  18. Descarte a coluna e tampar os 1,5 ml microtubos.
  19. As amostras estão agora prontas para reversi transcrição.
  20. Se o teste deve ser realizado imediatamente, armazenar a 4 ° C por até 6 horas. No entanto, se o teste é de ser adiada em seguida, coloque a -80 ° C imediatamente. NB: não congelar / descongelar as amostras mais do que 3x.

3. Preparação de reagentes para a transcrição reversa

  1. Antes de começar, calcular os volumes de cada um dos reagentes necessários para o número de amostras a serem processados, incluindo os controlos de plasma positivas e negativas. Também adicionar um controle de reagente.
  2. Usando os volumes calculados a partir do passo 3.1 (supra), preparar o trifosfato de desoxirribonucleótido mistura (dNTP)-iniciador de um, estéril de 200 mL limpo tubo de PCR, seguido por agitação em vórtex breve pulso. Cada amostra deve ter 0,5 ul de iniciador inverso rt21 e 0,5 ul de dNTP, ver Tabela 2.
  3. Alíquota 1,0 mL da mistura de dNTP-primer para 200 tubos PCR mL.
  4. Prepare a transcriptase reversa (RT) mistura de enzima por adição de 1 μ; L de tampão de transcrição reversa 10 x, 1 ul de 0,1 M de DTT e 2 ul de 25 mM MgCl 2 para um tubo esterilizado seguido por agitação em vórtice e centrifugando rapidamente, ver Tabela 3.
  5. Adicionar 0,5 mL de cada uma das enzimas RNAseOUT e Sobrescrito III transcriptase reversa para o tubo de mistura de enzimas e toque suavemente o tubo para misturar.
  6. Manter os tubos com as misturas dNTP primer e mistura de enzimas em um bloco frio e ir para a estação de RNA.

4. Transcrição Reversa

  1. Adicionar 6 ml da amostra de RNA para o tubo de mistura de dNTP-iniciador, seguido por vortex brevemente para misturar.
  2. Após a adição do ARN, se mover para a sala de PCR com os dois dNTP / primer / mistura de RNA e RT Enzima misturar os tubos em um bloco de gelado ou sorvete.
  3. Resumidamente centrifugar os tubos dNTP / mix primer / RNA (a partir do passo 4.2) e colocá-los em um termociclador.
  4. Aquece-se a 65 ° C durante 5 minutos para desnaturar o ARN.
  5. Rapidamente arrefecer a 4 ° C, segure por 2min.
  6. Pause o termociclador e ainda a 4 ° C; tirar os tubos.
  7. Rapidamente adicionar 5 uL da mistura de enzimas, mantendo os tubos em um bloco de gelado.
  8. Misture suavemente batendo o tubo em seguida, centrifugar brevemente os tubos e voltar ao termociclador.
  9. Segurar os tubos a 50 ° C durante 60 min para a transcrição reversa do ARN seguido por desnaturação da enzima a 85 ° C durante 5 minutos para impedir a transcrição reversa.
  10. Arrefece-se até 37 ° C. Assim a temperatura chega a 37 ° C, pausa e tirar o tubo para fora do termociclador.
  11. Rapidamente adicionar 0,5 mL de RNAse H para os tubos e retornar para o termociclador.
  12. Manter a 37 ° C durante 20 min e em seguida arrefecer a 4 ° C.
  13. O DNA complementar (cDNA) pode ser usada imediatamente ou pode ser armazenada a -20 ° C ou menos até ser necessária. No entanto, o armazenamento a longo prazo de cDNA deve ser a -80 ° C.

5. Preparação do reagente para PCR

  1. Before partida, calcular os volumes de cada um dos reagentes necessários para o número de amostras a serem tratados e os controlos. Além dos três controles (positivo, negativo, e de reagente), você também pode adicionar um controle de PCR (DNA HIV). As primeira e segunda misturas de PCR redondas podem ser preparados em simultâneo e a segunda mistura principal armazenada a -20 ° C até ser necessário. Misturas podem ser armazenados durante aproximadamente 8 horas.
  2. Adicionar 18.4 ul de água, 2,5 ul de tampão 10x, 1,0 mL de MgCl 2, 0,5 de dNTPs ul, e 0,25 mL de cada um dos iniciadores, como mostrado na Tabela 4 e vortex.
  3. Adicionar 0,1 mL de Platinum Taq polimerase (5U/μl) e misture delicadamente o tubo tocando nela.
  4. Alíquota de 23 mL da mistura principal para 200 tubos PCR mL.
  5. Com os tubos master mix em um bloco de gelo frio ou movimento para a sala de PCR.

6. Nested PCR

  1. Adicionar 2 l de ADNc de 23 ul da primeira ronda de PCR master misturar.
  2. Feche os tubos, colocar as amostras no termociclador e utilizar as seguintes condições de ciclo de PCR: 94 ° C durante 2 min, 30 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 20 seg, e 72 ° C durante 2 min, seguido por uma extensão final a 72 ° C durante 10 minutos, como mostrado na Figura 1.

Figura 1
Figura 1. Condições de ciclismo Nested PCR. Clique aqui para ver imagem ampliada.

  1. Continue para a 2 ª etapa PCR redonda ou armazenar os produtos de PCR primeira rodada a -20 ° C ou mais frio até que seja necessário, numa fase posterior.
  2. Para segunda PCR rodada, adicione 2 mL da 1 ª rodada do produto PCR a 23 mL da segunda rodada PCR master mix umd usar o mesmo programa de PCR na Figura 1.

7. Eletroforese em Gel

  1. Preparação Gel
    1. Adicionar um comprimido de 0,5 g de agarose para um frasco de 250 ml de vidro e adicionar 50 ml de tampão 1 x TBE com o balão.
    2. Calor em microondas para ferver; rodar com freqüência (aproximadamente a cada 30 segundos) até que esteja completamente solubilizado. Use um aperto de silicone ou silicone Luva de Forno para agarrar o frasco quente. A solução de agarose pode ferver para fora do frasco muito facilmente, então acompanhar de perto este processo.
    3. Arrefecer à temperatura ambiente por cerca de 10 min.
    4. Despeje de agarose para um tabuleiro de vazamento de gel contendo pente de tamanho apropriado; gel está pronto para usar em cerca de 20-30 min.
    5. Coloque gel na câmara de electroforese e executado tal como recomendado pelo fabricante.
  2. Eletroforese em gel e visualização.
    1. Suco Novel Vortex durante 10 segundos antes de ser utilizado.
    2. Diluir 1 ml de suco Novel com 5 mL de DAmostra NA e mix.
    3. Diluir 3 l de suco Novel com 3 l de marcador de peso molecular e misturar.
    4. Coloque as misturas de secções 7.2.2 e 7.2.3 (acima) e executar o gel a 100 V e 400 mA durante 40 min para avaliar a amplificação por PCR.
    5. Amplificação positiva podem ser visualizados sob luz UV como fragmento 1315 bp, Figura 2.

    Figura 2
    Figura 2. Gel confirmação de amplificação PCR por eletroforese em gel de agarose a 1% e uma escada de 200 pb. Clique aqui para ver imagem ampliada.

    1. Não deve haver qualquer amplificação nos controlos negativos e reagentes, indicando assim a ausência de contaminação.

    8. PCR Cleanup produtos

    1. Em preparação para a reação de seqüenciamento, o segundo produtos positivos de PCR redondas são limpas utilizando o kit de purificação PureLink PCR.
    2. Adicionar 80 ul de tampão de ligação de trabalho de alta corte (B3) a 20 ul de produto de PCR e mistura pipeta.
    3. Adicionar a amostra misturada com o tampão de ligação a uma coluna de centrifugação num tubo de recolha.
    4. Centrifugar a 10000 xg durante 1 min. Transferir a coluna para um novo tubo de recolha.
    5. Lava-se a coluna com 650 ul de tampão de lavagem com etanol.
    6. Centrifugar a 10000 xg durante 1 min. Transferir a coluna para um novo tubo de recolha.
    7. Centrifugar a coluna à velocidade máxima durante 2-3 minutos para remover qualquer tampão de lavagem residual.
    8. Coloque a coluna volta em um tubo limpo de 1,7 ml de eluição fornecido com o kit.
    9. Adicionar 40 ul de tampão de eluição para o centro da coluna e incuba-se a coluna a temperatur ambientee durante 1 min.
    10. Centrifugar a coluna à velocidade máxima durante 2 min (> 10.000 x g).
    11. O tubo de eluição contém o produto de PCR purificado pronto para o seqüenciamento. Descartar a coluna.
    12. Determinar a concentração e a qualidade do ADN, utilizando um Nanodrop.
    13. Se não há instalações de sequenciação em casa estão disponíveis, os produtos de PCR purificados podem ser enviadas para um laboratório de sequenciação comercial, nesta fase.

    9. Reações de sequenciação

    1. Os produtos de PCR são sequenciados utilizando o kit de corante terminador grande versão 3.1 e 4 iniciadores para cada uma das amostras (duas à frente e duas reversa). As sequências dos iniciadores são apresentadas na Tabela 2. Portanto, após o seqüenciamento de execução, cada amostra terá quatro sequências a serem montados em um contig.
    2. Defina-se as reacções de sequenciação tal como indicado na Tabela 5 para cada um dos quatro iniciadores.
    3. Misture o tampão de sequenciação e os iniciadores em vortex antes da utilização.
    4. Misture oágua, tampão e o iniciador antes da adição do corante grande sequenciação. Misture em vortex.
    5. Misture delicadamente a mistura principal após a adição da mistura grande seqüenciamento corante invertendo o tubo ou tocando-a suavemente.
    6. Aliquota 9 ul de mistura principal para uma placa óptica de 96 poços.
    7. A fim de executar 24 amostras / placa, configure a placa conforme indicado abaixo Figura 3.

    Figura 3
    Figura 3. Representação Esquema de uma placa de 96 poços com 12 amostras de pacientes sendo seqüenciado com 4 primers cada (RTC1F, RTC2R, RTC3F e RTC4R). Clique aqui para ver imagem ampliada.

    1. Adicionar 1,0 mL da amostra de ADN (~ 20-40 ng), cobrir a placa com umn adesivo tampa de alumínio e, em seguida, misturá-lo com cuidado.
    2. Centrifugar a 3.000 xg durante 1 min. Retire a tampa de alumínio e adicionar um tapete de borracha de vedação.
    3. Colocar a placa no termociclador e executar o seguinte programa de ciclos mostra a Figura 4.

    Figura 4
    Figura 4. PCR condições de ciclismo para o seqüenciamento. Clique aqui para ver imagem ampliada.

    1. Quando a PCR terminar, limpar o produto de seqüenciamento imediatamente.

    10. Limpeza de Seqüenciamento

    1. Para cada reacção de sequenciação, misturar 50 mL de etanol absoluto e 5 mL de 3 M de acetato de sódio.
    2. Utilizando uma pipeta multicanal, adicione 55 &# 956; l da solução de acetato de sódio / EtOH a cada poço.
    3. Selar poços com tampa de alumínio adesiva, assegurando que cada cavidade é selada adequadamente.
    4. Centrifugar a 3.000 xg durante 20 min.
    5. Depois de 20 minutos, retire a tampa e inverter a placa, em um movimento suave, em um tecido laboratório dobrado (NÃO bater para se livrar do sobrenadante como isso vai desalojar a pelota!).
    6. Centrifugar a placa invertida sobre o mesmo tecido a 150 xg durante 2 min.
    7. Imediatamente adicionar 150 mL frio etanol 70%. NÃO atrasar adição de etanol nesta etapa.
    8. Selo com a mesma capa de alumínio adesivo e vortex.
    9. Centrifugar a 3000 xg durante 5 min.
    10. Inverta placa sobre um novo tecido dobrado e centrífuga invertido em 150 xg durante 1 min.
    11. Após a centrifugação, colocar a descoberto no termociclador e secá-lo a 50 ° C durante 2 min.
    12. Uma vez que as placas é seco, selá-lo com capas folha adesiva, embrulhe em papel alumínio e armazenar a -20 ˚ C até que esteja pronto para prosseguir wiª eletroforese seqüenciamento.
    13. Quando estiver pronto para seqüência, dissolver produtos de sequenciamento limpos em 10 ml de Hi-Di formamida, desnaturar e carga para eletroforese.

    11. Bioinformática

    1. Assembléia Sequence
      1. Lançamento do programa de Geneious.
      2. Criar uma pasta de trabalho para armazenar as sequências.
      3. Importe os arquivos ABI gerados pela máquina de sequenciamento para a pasta de trabalho usando a ferramenta de importação. Geneious vai atribuir pontuação de qualidade percentual para cada seqüência importado.
      4. Seqüências abertas, com índices de qualidade> 70%, clicando duas vezes sobre eles.
      5. Cada arquivo deve ser aberto em uma nova janela. O software indicam a qualidade em cada posição de nucleótido do cromatograma da qualidade da sequência utilizando barras azuis-claras. Quanto maior for a barra, melhor será a qualidade da chamada base.
      6. Usando o cursor, selecione a seção meados da seqüência deixando de fora as extremidades, que são geralmente de má qualidade. Clique no botão extract para extrair a região com seqüência boa qualidade.
      7. Selecione todos os quatro seqüências extraídas para cada amostra e montá-los contra uma seqüência de referência.
      8. Inspecione a seqüência montada para garantir que você está na fase de leitura correta. Se você está na fase de leitura correta, o início da Protease deve começar com os seguintes aminoácidos: PQITLW. O início da RT vai começar com PISPIE.
      9. Extrato da região contig cobrindo o início do PR para o 300 º RT códon. Durante este processo, também verificar a existência de inserções ou exclusões.
      10. Vá através da sequência de consenso do contig extraído, identificando quaisquer ambiguidades e verificar posições com bases mistas inspecionando qualidade (simetria, altura, fundo e os ombros de regiões flanqueadoras) das chamadas bases.
      11. Selecione a seqüência consenso e clique no botão extrato para criar um arquivo separado da seqüência consenso dos quatro primers e Label-lo adequadamente.
      12. Exportar a seqüência de uma pasta de armazenamento de backup no computador ou uma pasta de rede.
    2. Seqüência de Avaliação da Qualidade (HIVDB)
      1. Analisar a sequência utilizando o programa de HIVDB http://hivdb.stanford.edu .
      2. Verifique se há deleções e inserções nos dados resumidos e garantir que a seqüência abrange todos os 99 da protease (PR) códons e os 1 300 códons RT.
      3. Verifique se há algum destaque a garantia de qualidade (QA) problemas em ambas as regiões PR e RT, como códons de parada, quadro turnos, posições ambíguas e resíduos incomuns.
    3. Controle de Qualidade de Seqüenciamento
      1. Explodi a nova seqüência contra um banco de dados de seqüência local a partir de execução anterior.
      2. Se a nova seqüência é> 97% semelhante a qualquer seqüência no banco de dados, todas as etapas do protocolo deve ser revisto, a partir da análise de sequência e voltar para a extração de RNA para assegue que não houve mistura ups (comutação amostra, tachar) ou contaminação.
      3. Se forem identificados problemas, repita a análise de ambos os antigos e novas amostras a partir da extracção de RNA.
      4. Se as seqüências ainda são> 97% semelhante, reveja o histórico do paciente para avaliar a qualquer ligação epidemiológica entre os indivíduos.
    4. Análise filogenética
      1. Alinhar todas as seqüências do banco de dados usando o programa ClustalW em Geneious.
      2. Verificar manualmente o alinhamento para seqüências desalinhadas, exclusões e inserções e editar em conformidade.
      3. Construir uma árvore filogenética usando PHYML, Geneious construtor árvore ou outros construtores de árvores em Geneious.
      4. Examine a árvore para amostras com comprimentos curtos filiais.
      5. Reveja as amostras com comprimentos curtos do ramo para uma possível contaminação.

    12. REGA DB Informática

    1. Seqüência de carregamento
      1. Faça o login no RegaDB usando um nome de usuário e senha exclusivos.
      2. No menu drop-down, sob ID do paciente, selecione "começa com".
      3. Adicione o ID do paciente e selecionar o indivíduo cujo genótipo é para ser carregado.
      4. No menu à esquerda, selecione "isolado viral".
      5. Das opções em isolado viral selecionar "adicionar".
      6. Digite a data da amostra, Amostra ID, ID de seqüência e data Sequence.
      7. Selecione "Escolher arquivo" e, em seguida, navegue até o arquivo fasta da seqüência a ser carregado.
      8. Após selecionar o arquivo fasta para ser carregado, clique em upload.
      9. Uma vez que a seqüência carregado aparece na caixa de nucleotídeo sob os identifica e datas de seqüência, clique no botão OK na parte inferior direita da janela.
      10. Verifique se há PR e RT alinhamento proteína clicando no botão proteína e selecionando PR ou RT.
      11. Verifique se há a mutação de resistência da droga, clicando no botão de resistência. Isto dáos perfis de resistência de três algoritmos: ANRS, Stanford HIVDB e RegaDB.
    2. Geração de relatórios utilizando REGA
      1. Faça o login no RegaDB usando seu nome de usuário e senha exclusivos.
      2. No menu drop-down, sob ID do paciente, selecione "começa com".
      3. Adicione o ID do paciente e selecionar o indivíduo cujo relatório deve ser gerado.
      4. No menu à direita, selecione isolado viral.
      5. Das opções em isolado viral clique em "view".
      6. Clique duas vezes sobre o isolado viral para a qual você deseja criar um relatório.
      7. Na janela isolado viral, clique na guia relatório isolado viral.
      8. Selecione os algoritmos para a interpretação do genótipo a partir do menu drop-down e selecione modelo de relatório para usar.
      9. Uma vez que o algoritmo eo modelo são selecionados, clique no botão "Gerar".
      10. Download do documento rtf gerado.
      11. Abra o orkut fazercument como um documento do Word.
      12. Redimensionar o gráfico histórico do tratamento.
      13. Após o gráfico, adicione a seção "Tabela de Clínica e interpretação resistência".
      14. Usando os dados na tabela a resistência e o quadro clínico, adicionar uma descrição do perfil a resistência do paciente começando com a história de tratamento do paciente, e as drogas a que o isolado virai é resistente. Também adicionar uma descrição da carga viral do paciente e perfis de contagem de células CD4 + do gráfico.
      15. Enviar o relatório para as Doenças Infecciosas (ID) especializadas para análise e recomendações sobre a gestão futura do paciente. Este processo é também uma fase de controlo de qualidade muito importante. Quaisquer erros no genótipo ou inconsistências na história do tratamento, perfis virológicos e imunológicos podem ser identificados e analisados ​​antes de um relatório final é enviado, com todas as recomendações, para o clínico gestão do paciente.

Representative Results

O método validado foi uma modificação de um método previamente relatado 20. O método de genotipagem comercial Viroseq, que foi aprovado pela FDA, foi usado como o método de referência para a validação. Um painel de amostras de ensaios de proficiência obtidas a partir das Agências Nacional Francês para Pesquisa sobre Aids e Hepatites Virais (ANRS) foi usado na comparação preliminar entre os dois métodos. Os dois métodos de genotipagem foram 100% concordantes na identificação de todas as mutações clinicamente importantes associadas a resistência a drogas como interpretado pelo programa HIVDB para as amostras que foram amplificados com sucesso por ambos os métodos. Como mostrado na Tabela 6, as sequências de nucleótidos dos três pares foram de 99,5% idênticas. As sequências de aminoácidos previstas eram 100% idêntica. Uma amostra de cada cinco não poderia ser amplificado com sucesso por comercial Viroseq. Em adição à amostra amplificada não por comercial Viroseq, o método em casa não conseguiu amplificar uma segunda amostra que foi mostradoser um vírus recombinante circulante (CRF02_AG) pelo comercial Viroseq. As três amostras que amplificaram com as duas metodologias foram subtipo B (duas amostras) e subtipo A (uma amostra).

Figura 5
Figura 5. O uso de um vizinho Juntando árvore HKY feito como parte da garantia de qualidade seqüência. Há quatro pares / grupos de seqüência com as distâncias genéticas muito curtos. A distância genética entre RES655 e RES655_1 (mesmas amostras seqüenciadas em dias diferentes) é 0,003. O é um erro potencial com o par RES637_1/RES638 como sua distância genética é muito curta (0,075) para amostras de diferentes indivíduos não vinculados epidemiologicamente. Há um outro RES637 na árvore com uma distância de 0,075 quando comparado com RES638_1. O aglomerado CQ01/CQ02 sugere que as duas amostrasa partir do painel são duplicados da mesma amostra. Eles agrupam com a sequência de referência subtipo B confirmando o subtipo atribuído pela ferramenta REGA subtipos. CQ05 e CQ04 agrupado com os subtipos A e G, respectivamente, enquanto que a ferramenta REGA subtyping deles classificados como A e CRF02_AG respectivamente. Outra ferramenta útil para subtipagem e recombinação do HIV é SCUEL, que está disponível no http://www.datamonkey.org. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Um painel de cinco amostras foi usado para avaliar a precisão do método de casa. Dez genótipos replicados foram gerados para cada uma das cinco amostras. Usando o analisador genético 16 capilar 3130xl, 48 dos 50 genótipos foram gerados a partir de 24 pistas, preparados no mesmo dia. Para todas as cinco amostras, as sequências de aminoácidos previstas eram 100% concordante entre repetições. Para sequências de ácidos nucleicos a, there era> 99% de similaridade aos pares.

Durante os primeiros dois anos da utilização deste método, sessenta amostras foram repetidas aleatoriamente de extracção de ARN para a sequenciação. Não houve diferenças estatisticamente significativas entre o índice de qualidade de sequência eo número de bases mistas entre as repetições. Ambas as sequências de nucleótidos e de aminoácidos para as comparações de pares sessenta pares foram maiores do que 99% idêntica. Assim, as mutações de resistência para todos os pares foram 100% concordantes.

Redução de custos

Os volumes de reacção de RT, PCR e sequenciação foram reduzidas em pelo menos a metade, em relação ao método original de 20, 32, sem comprometer a qualidade das sequências geradas. Isto permitiu uma redução no custo de 50% para as etapas de RT e PCR.

O novo método foi originalmente concebido para funcionar com seis seqüenciamento cartilha para seqüência todos os 99 codões do gene da protease e os primeiros 300 codões do gene da transcriptase reversa 20, 32. Métodos semelhantes também utilizar seis a oito iniciadores 33, 34. Alguns métodos publicados recentemente usaram menos de seis primers, embora às vezes o seqüenciamento do protease e genes RT seprately 35, 36. Buscou-se reduzir o número de iniciadores de sequenciação de seis para quatro, (Figura 6)

Figura 6
A Figura 6. Comparação de sequências contíguas de seis vs quatro iniciadores de sequenciação para a geração da sequência pol 1197 pb abrangendo todos os 99 HIV-1 codões e os primeiros 300 codões do gene da transcriptase reversa.242/51242fig6highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.

Sequências de um conjunto de 17 amostras geradas a partir de seis iniciadores foram comparados com sequências geradas após a exclusão de dois iniciadores (MAW46 e RTY). Os subtipos foram 14 subtipo C, dois subtipo B, e um subtipo A. Não houve diferenças significativas nos índices de qualidade de seqüência. Mais uma vez, a identidade emparelhados média entre os 17 pares de ácido nucleico era de 99% e 100% em relação ao nível de aminoácidos. Assim, reduzindo os iniciadores de sequenciação de seis para quatro resultou numa redução no custo de sequenciação em quase um terço.

A única ferramenta de software proprietário usado neste protocolo foi Geneious para montagem seqüência. As ferramentas de interpretação resistência às drogas, bem como o relatório de geração de ferramentas são todos, ferramentas gratuitas de acesso aberto. Isto reduz o custo adicional, eliminando os custos associados com o uso de software proprietário. Além disso, CollectiVe negociação permitiu que os reagentes para este protocolo para ser empacotado em um kit para facilitar o acesso da Life Technologies e está disponível como as Tecnologias de Saturno / Vida método 37 genotipagem. Além disso, os membros Saturno pode acessar os reagentes a um preço com desconto.

Ambiente clínico

O protocolo descrito foi implementado no monitoramento e vigilância da resistência às drogas em uma comunidade rural na província de KwaZulu-Natal. Um total de 604 genótipos foram gerados a partir de amostras clínicas, entre dezembro de 2010 e maio de 2013, uma taxa de ampliação de 95% para as amostras com carga viral> 1.000 RNA cópias / ml. Este estudo clínico resistência ao HIV foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica da Universidade de KwaZulu-Natal (ref. BF052/10) e do Comitê de Investigação da Saúde do Departamento de KwaZulu-Natal da Saúde (ref. HRKM 176/10). Relatórios individuais dos pacientes foram gerados e enviados de volta para as clínicaspara o doente.

Setenta e dois (72) genótipos também foram gerados como parte de um sistema de vigilância de resistência a drogas estudo transmitida, aninhada dentro de um estudo de vigilância de grande potencial de base populacional HIV. As amostras primárias foram todo agulha picada sangue coletado em microtubos EDTA. Na genotipagem houve uma taxa de ampliação de 79% 19. Aprovação de Ética para a genotipagem de amostras a partir do estudo de vigilância foi obtida a partir da Universidade do Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica KwaZulu-Natal (ref. BE066107).

Nome do iniciador Seqüência Comprimento Direção Posição HXB2
MAW-26 TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC 23 Para a frente 2028-2050 1 ª eliminatória PCR
RT-21 CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG 31 Reverso 3539-3509 1 ª eliminatória PCR
Pro-1 TAGAGCCAACAGCCC cacca 20 Para a frente 2147-2166 2 PCR rodada
RT-20 CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC 22 Reverso 3462-3441 2 PCR rodada
RTC1F ACCTACACCTGTCAA CATAATTG 23 Para a frente 2486-2508 Sequenciamento
RTC2R TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG 27 Reverso 2630-2604 Sequenciamento
RTC3F CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC 30 Para a frente 2956-2994 Sequenciamento
RTC4R CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC 29 Reverso 3129-3101 Sequenciamento
RT-y GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG 22 Reverso 2967-2946 Sequenciamento
MAW-46 TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC 27 Para a frente 2251-2277 Sequenciamento

Tabela 1. Transcrição, PCR e iniciadores de sequenciação personalizados utilizados na geração de um fragmento de 1197 pb de pol cobrindo todas as 99 HIV-1 protease e os codões dos primeiros 300 codões do gene trascriptase inversas.

Rt21 (5pmol/ml) 0,5 0,2
de dNTP (10 mM) 0,5 0,4
Total 1

Tabela 2. dNTP / mistura de iniciadores para a reacção de transcrição reversa.

Reagente Volume (ml) / reação Concentração / reação
First Strand Buffer (10x) 1 1
MgCl2 (25 mM) 2 4
DTT (0,1 M) 1 0.008
RNaseOUT (40 U / ml) 0,5 16
Sobrescrito III transcriptase reversa (200U/ml) 0,5 8
Total 5

Tabela 3. Enzima misturar para a reacção de transcrição reversa.

Reagente Volume (ml) / reação Concentração Final / Reaction
DEPC água tratada 18,4 - </ Td>
Tampão de PCR (10x) 2,5 1
MgCl 2 (50 mM) 1 2
mistura de dNTP (10 mM) 0,5 0,2
Froward iniciador (5 pmol / ml) 0,25 0,05
Primer reverso (5 pmol / ml) 0,25 0,05
Platinum Taq polimerase (5 U / ml) 0,1 0,02
Subtotal 23 -

Tabela 4. Mix Master para a PCR aninhada.

Reagente Volume (ml) / reação Concentração / reação
DEPC água tratada 6.1
Sequenciamento Buffer (5x) 2 1
Iniciador (3,2 pmol / mL) 0,5 0,16
Big Dye terminator mix Seqüenciamento 0,4 -
Total 9

Tabela 5. Mix Master para as reações de seqüenciamento.

Comercial Viroseq Inhouse Similaridade% de NA
Amostra ID Subtipo Índice de qualidade PR Mutações Mutações RT Subtipo Índice de qualidade Mutações PR RT Mutações
CQ01 B 99,9 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q B 99,2 M46L, I54L, V82Um, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q 100
CQ02 B 99.5 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q B 99.5 M46L, I54L, V82A, L90M D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q 100
CQ03 NA NA NA NA NA NA
CQ04 CRF02_AG 98,4 I54V, V82F, I84V M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C NA NA NA NA NA
CQ05 A 99,7 K103N A 93 K103N 100

Tabela 6. Resul Comparativats de uma análise paralela entre o método de genotipagem comercial Viroseq e o método em casa, utilizando um painel de amostras fornecidas pelo ANRS.

Discussion

Vários de baixo custo em casa métodos têm sido descritos em esforços para tentar fazer a genotipagem do HIV resistência aos medicamentos mais acessíveis 33, 34, 36. Não há dúvida sobre a necessidade de integrar os testes de resistência à continuidade dos cuidados para as pessoas em terapia anti-retroviral em contextos de recursos limitados. No entanto, a maioria dos métodos relatados focar a aplicação da genotipagem resistência aos medicamentos na vigilância da resistência aos medicamentos em nível populacional. O método de genotipagem Saturno / Life Technologies é um protocolo totalmente integrado para vigilância e monitorização da resistência aos medicamentos. Este método foi projetado para ser um protocolo acessível implementação principalmente de código aberto e aberto recursos de bioinformática de acesso para a interpretação da resistência às drogas e geração de relatórios para a gestão clínica.

Foi mostrado através de comparação com o método de genotipagem aprovado pela FDA para ser comercial Viroseqpreciso na identificação de mutações de resistência a partir de um painel de ANRS amostras de ensaios de proficiência, em 100% das amostras do painel de laboratório que foram amplificados com sucesso. A precisão também foi avaliada em amostras clínicas de vírus subtipo C, o subtipo mais dominante na África Austral. O método foi o mais preciso sobre amostras do subtipo C como foi no subtipo A e B. No entanto, se o método poderia ser usado em outras partes do mundo onde CRF02_AG é predominante, há uma necessidade para a modificação dos iniciadores, uma vez o método falhou para amplificar uma das amostras do painel que foi mostrado ter CRF02_AG. Alternativamente, um conjunto degenerado de iniciadores sensíveis a todos os vírus do grupo M 33, 36 podiam ser utilizados em regiões em que a distribuição do subtipo é mais heterogénea 38.

A sensibilidade da transcrição reversa e PCR, pode ser aumentada através da extracção de ARN a partir de volumes mais elevados de plasma, tais como 500 ml. O plasma pode ser centrifuged a 21.000 xg durante 90 minutos para concentrar as partículas virais antes de prosseguir com o protocolo como descrito por o mini kit de extração de RNA viral QIAamp.

Como mostrado, o novo método tem uma vantagem adicional que produz relatórios abrangentes para a gestão individual do paciente. Estes relatórios são uma consolidação do genótipo, o imunológicos e virológicos dados de monitoramento, bem como a história clínica eo tratamento de RegaDB. Isto é acompanhado por uma interpretação laboratorial detalhada do perfil de resistência seguida de uma análise igualmente detalhada da história clínica do paciente, bem como as recomendações de tratamento. O uso de um especialista médico para examinar os relatórios e fornecer recomendações de tratamento para os pacientes fornece a orientação muito necessária para os profissionais de enfermagem, bem como os médicos inexperientes, que estão cada vez mais oferecendo ART na África do Sul, como parte das recomendações da OMS para o revezamento de tarefas. Estes clínicarelatórios têm se mostrado eficazes auxiliares de ensino para médicos com pouca ou nenhuma experiência em gestão de resistência aos medicamentos. Do ponto de vista do paciente, o nosso método reduz a necessidade de viajar para locais centralizados para acessar serviços de HIV especializadas.

Assim, o protocolo descrito como um todo oferece uma boa plataforma através da qual a gestão resistência ao HIV podem ser integrados, a um custo acessível, para a continuidade dos cuidados para as pessoas infectadas pelo HIV não ART. Os dados gerados podem ser usados ​​para fins epidemiológicos para avaliar a evolução e transmissão de resistência às drogas na comunidade. O tamanho do fragmento pol gerado é bom o suficiente para a análise filogenética mais complexo, que irá produzir um melhor entendimento da epidemia a nível populacional.

Disclosures

Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), União Europeia (SANTE 2007 147-790), o Centro dos EUA para Controle de Doenças via CAPRISA (título do projeto: Fortalecimento dos Sistemas de Saúde e falência de tratamento do HIV (HIV- TFC)), eo Programa de Investigação Suíça Sul-Africano Conjunta (SSJRP) bolsa de pesquisa intitulado "Swiss Prot / África do Sul: Proteína Bioinformatics Resource Development para importantes patógenos relacionados com a saúde". RL é apoiado pelo Wellcome Trust (número de concessão 090999 / Z / 09 / Z). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a todos os colegas que fizeram este trabalho possível, especialmente Maya Balamane, Elizabeth Johnston Branco, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, e Lungani Ndwandwe. Os autores também gostariam de agradecer a todo o pessoal do Departamento de Saúde e pessoal África Centro que trabalham no tratamento do HIV e Hlabisa Programa Care.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superscript III 1st strand Synthesis kit Life Technologies 18080051 Reverse Transcription
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers Life Technologies 4473517 PCR
Platinum Taq Life Technologies 10966026 PCR
PureLink QUICK PCR Purification Kit Life Technologies K310002 PCR
Viroseq ABBOTT 4J94-20 Reverse Transcription and PCR
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) BIOLINE BIO-41027 PCR
TBE Buffer MERCK 1.06177.2500 PCR
O'Range Ruler 200 bp DNA Ladder Fermentas FE SM0633 PCR
Novel Juice GeneDireX LD001-1000 PCR
MiniBis Bioimaging System DNR Bioimaging Systems Ltd Gel Documentation
Power Pac 300  BIORAD Gel Electrophoresis
Big Dye Terminator Kit version 3.1 Life Technologies 4337456 Sequencing
Arrays Life Technolgies 4319899 Sequencing
PoP Life Technologies 4363785 Sequencing
10x EDTA Buffer Life Technologies 402824 Sequencing
Formamide Life Technologies 4311320 Sequencing
5x Sequencing Buffer Life Tecgnologies 4336697 Sequencing
3130 xl Genetic Analyzer Life Technologies Sequencing
GeneAmp PCR System 9700 Life Technologies RT/PCR/Sequencing
Centrifuge 5804 EPPENDORF Sample Processing
Centrifuge 5415R EPPENDORF RNA Extraction
Centrifuge 5415R EPPENDORF RT and PCR
Centrifuge 5415D EPPENDORF PCR Product Clean up
Centrifuge 5810 EPPENDORF Sequencing Clean up
Picofuge BIORAD C1301-230V RT and PCR
Vortex Genius 3 IKA RNA extraction and reagent preparation
Vortex mixer IKA Sequencing Cleanup
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer ThermoScientific DNA quantification 
3 M Sodium Acetate MERCK 567422 Sequencing Clean up
Absolute Ethanol MERCK SAAR2233540LP Sequencing Cleanup
1.5 ml SARSTEDT Tubes BIODEX 72.692.005 RNA Extraction
2 ml SARSTEDT  Tubes BIODEX 72.693.005 RNA Extraction
2 ml Collection tubes SCIENTIFIC GROUP MCT-200-NC/S RNA Extraction
Optical MicroAmp 96-well reaction plates Life Technologies N8010560 Sequencing
200 µl 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps STAR Lab - supplied by CELTIC A1402-3700 RT and PCR
200 µl PCR individual tubes Scientific Group CR/3745 RT and PCR
Geneious  Biomatters Sequence analysis
Internet Access Preferrably high speed
Web resources
hivdb.stanford.edu Stanford University Drug reistance analysis
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB SATuRN database
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html SATuRN Sequence quality tool

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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