लिपिड नैनोट्यूब पर रक्त जमावट फैक्टर आठवीं की पेचदार संगठन

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Bioengineering

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Summary

मानव और सुअर: हम दो अत्यधिक मुताबिक़ FVIII रूपों की झिल्ली ही सीमित संरचना को हल करने के लिए लागू किया क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, लिपिड नैनो, और संरचना विश्लेषण का एक संयोजन प्रस्तुत करते हैं. कुंडलित नकारात्मक आरोप लगाया लिपिड नैनोट्यूब (LNT) पर दो कार्यात्मक पुनः संयोजक FVIII रूपों को व्यवस्थित करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में विकसित की कार्यप्रणाली में वर्णित है.

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Miller, J., Dalm, D., Koyfman, A. Y., Grushin, K., Stoilova-McPhie, S. Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes. J. Vis. Exp. (88), e51254, doi:10.3791/51254 (2014).

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Abstract

क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) 1 एक हाइड्रेटेड राज्य और झिल्ली पर्यावरण 2 में प्रोटीन और परिसरों के कार्यात्मक संरचना की जांच के लिए एक शक्तिशाली तरीका है.

जमावट फैक्टर आठवीं (FVIII) 3 एक बहु - डोमेन रक्त प्लाज्मा ग्लाइकोप्रोटीन है. एक गंभीर खून बह रहा विकार - दोष या FVIII की कमी हीमोफिलिया एक प्रकार का कारण है. Proteolytic सक्रियण पर, FVIII सामान्य रक्त के थक्के 4 के लिए महत्वपूर्ण है जो नकारात्मक आरोप लगाया प्लेटलेट झिल्ली, पर सेरीन प्रोटीज फैक्टर IXa को बांधता है. FVIII जमावट में खेलता निर्णायक भूमिका होने के बावजूद इसकी झिल्ली ही सीमित राज्य के लिए संरचनात्मक जानकारी अधूरी 5 है. संयोजक FVIII ध्यान केंद्रित हीमोफिलिया ग्रुप ए के खिलाफ सबसे प्रभावी दवा है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध FVIII मानव या सुअर, मानव फैक्टर IXa 6,7 के साथ दोनों के गठन कार्यात्मक परिसरों के रूप में व्यक्त किया जा सकता है.

"> इस अध्ययन में हम क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) का एक संयोजन पेश, लिपिड नैनो और संरचना विश्लेषण दो अत्यधिक मुताबिक़ FVIII रूपों की झिल्ली ही सीमित संरचना को हल करने के लिए आवेदन किया. मानव और सुअर हमारी प्रयोगशाला में विकसित की कार्यप्रणाली कुंडलित नकारात्मक आरोप लगाया लिपिड नैनोट्यूब (LNT) पर दो कार्यात्मक पुनः संयोजक FVIII रूपों को संगठित करने का वर्णन किया गया है. प्रतिनिधि परिणाम हमारे दृष्टिकोण अनुक्रम में अत्यधिक मुताबिक़ दो (86% अनुक्रम पहचान के बीच पेचदार संगठन में मतभेद को परिभाषित करने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील है कि दिखाना ) प्रोटीन. पेचदार संगठन, क्रायो EM और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (ईटी) डाटा अधिग्रहण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल. दो आयामी (2 डी दिया) और तीन आयामी (3 डी) संरचना विश्लेषण मानव और सुअर के 3D पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए आवेदन कर रहे हैं FVIII-LNT चर्चा की है. प्रस्तुत मानव और सुअर का FVIII-LNT संरचनाओं प्रस्तावित पद्धति का संभावित calculat को दिखानेउच्च संकल्प में रक्त जमावट फैक्टर आठवीं की ई कार्यात्मक, झिल्ली ही सीमित संगठन.

Introduction

रक्त जमावट फैक्टर आठवीं (FVIII) छह डोमेन में संगठित 2,332 अमीनो एसिड की एक बड़ी ग्लाइकोप्रोटीन है: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. थ्रोम्बिन सक्रियण FVIII झिल्ली ही सीमित Tenase परिसर के भीतर फैक्टर IXa को cofactor के रूप में कार्य करता है पर. एक झिल्ली के आधार ढंग से FIXa को सक्रिय FVIII (FVIIIa) की बाइंडिंग FIXa प्रोटियोलिटिक दक्षता कुशल रक्त जमावट 4 के लिए महत्वपूर्ण है जो 10 से अधिक 5 बार, बढ़ाता है. FVIII जमावट और Tenase जटिल गठन में खेलता महत्वपूर्ण भूमिका होने के बावजूद कार्यात्मक झिल्ली ही सीमित FVIII संरचना हल किया जाना अभी बाकी है.

इस पते, उच्च आत्मीयता 8, 9 के साथ FVIII बाध्यकारी और सक्रिय प्लेटलेट सतह दिखने में सक्षम Phosphatidylserine (पी एस) में अमीर एकल लिपिड bilayer नैनोट्यूब (LNT), 10 विकसित किया गया है. LNT करने के लिए बाध्य FVIII की लगातार पेचदार संगठन प्रभावकारिता होना सिद्ध किया गया हैक्रायो ईएम 5 से FVIII झिल्ली ही सीमित राज्य की संरचना निर्धारण के लिए किया है. Functionalized LNT क्रायो ईएम 11, 12 से प्रोटीन, प्रोटीन और घुमावदार ढंग से संगठित झिल्ली जुड़े प्रोटीन का प्रोटीन झिल्ली बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श व्यवस्था कर रहे हैं. नमूना मनोवैज्ञानिक वातावरण (बफर, झिल्ली, पीएच) में निकटतम में संरक्षित है के रूप में क्रायो ईएम additives और आइसोटोप के बिना, इस तरह के एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर के रूप में पारंपरिक संरचनात्मक तरीकों से अधिक लाभ है. LNT आकार, आकृति और रचना Tenase परिसरों विवो में इकट्ठा जहां सक्रिय प्लेटलेट्स की pseudopodia द्वारा बारीकी से मेल खाता रूप FVIII के मामले में, इस तकनीक के साथ झिल्ली ही सीमित संरचना का अध्ययन, और भी अधिक physiologically प्रासंगिक है.

दोष और FVIII कारण हीमोफिलिया ए, मानव आबादी 4, 6 की 1 5000 में पुरुषों को प्रभावित एक गंभीर खून बह रहा विकार की कमी. अधिकांश ईहीमोफिलिया के लिए ffective चिकित्सा पुनः संयोजक मानव FVIII (hFVIII) के जीवन भर प्रशासन है. पुनः संयोजक FVIII हीमोफिलिया एक चिकित्सा का एक महत्वपूर्ण जटिलता हीमोफिलिया के रोगियों 13 के लगभग 30% को प्रभावित मानव प्रपत्र को निरोधात्मक एंटीबॉडी का विकास है. इस मामले में, सुअर का FVIII (pFVIII) ध्यान केंद्रित मानव FVIII और मानव FIXa 7 के साथ रूपों कार्यात्मक परिसरों के खिलाफ निरोधात्मक एंटीबॉडी के साथ सुअर का FVIII प्रदर्शित करता है कम पार जेट के रूप में प्रयोग किया जाता है. सुअर और मानव FVIII रूपों दोनों की झिल्ली ही सीमित संगठन की स्थापना FVIII cofactor समारोह और रक्त रक्तस्तम्भन के लिए निहितार्थ के संरचनात्मक आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है.

इस अध्ययन में, हम लिपिड नैनो, क्रायो-EM, और दो अत्यधिक मुताबिक़ FVIII रूपों की झिल्ली ही सीमित संगठन को हल करने के लिए डिज़ाइन संरचना विश्लेषण का एक संयोजन का वर्णन. कुंडलित आयोजन porci के लिए प्रस्तुत क्रायो-EM डेटा और 3 डी संरचनाओंनकारात्मक आरोप लगाया LNT पर पूर्वोत्तर और मानव FVIII FVIII की संरचना निर्धारण और झिल्ली ही सीमित जमावट कारकों और एक शारीरिक झिल्ली वातावरण में परिसरों के लिए आधार के रूप में प्रस्तावित नैनो की क्षमता दिखा.

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Protocol

1. नमूना तैयार

  1. बफर विनिमय मानव FVIII-BDD 14 और HBS-सीए बफर के खिलाफ सुअर का FVIII-BDD 15 (20 मिमी HEPES, 150 मिमी NaCl, 5 मिमी 2 CaCl, = पीएच 7.4) और 1.2 मिलीग्राम / एमएल के लिए ध्यान देना. -80 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन समाधान रखें
  2. 01:04 डब्ल्यू / क्लोरोफॉर्म में अनुपात डब्ल्यू पर GalactosylCeramide (जीसी) और Phosphatidylserine (पी एस) के मिश्रण से लिपिड नैनोट्यूब (LNT) तैयार करें. आर्गन के तहत क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना और 1 मिलीग्राम / एमएल के लिए HBS बफर में लिपिड solubilize. 4 डिग्री सेल्सियस पर LNT समाधान रखें

FVIII-LNT के 2. क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. क्रायो-EM नमूना तैयार
    1. 300 50 डब्ल्यू पर 10 सेकंड के लिए ओ 2 और एच 2 गैस का एक मिश्रण में Quantifoil R2 / 2 तांबे ग्रिड (कार्बन ऊपर की ओर) जाल मुक्ति ग्लो
    2. 1:1 डब्ल्यू / अनुपात डब्ल्यू पर HBS-सीए बफर में FVIII और LNT समाधान मिक्स और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
    3. 2.5 μl की एक बूंद लागू करेंVitrobot मार्क चतुर्थ humidified कक्ष (100% नमी) में हाइड्रोफिलिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड को FVIII-LNT नमूना की.
    4. ब्लाट और फ्लैश तरल सी 2 एच 6 में ग्रिड (3.5 सेकंड के लिए एक दाग, दाग बल 1) फ्रीज, अनाकार बर्फ प्राप्त करने के लिए तरल एन 2 से नीचे ठंडा.
    5. तरल एन 2 (LN2) के तहत भंडारण बक्से में स्टोर ग्रिड.
  2. क्रायो-EM डेटा संग्रह
    नोट: JEM2100-LaB6 (वर्ष 2010) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप, निर्वात प्रणाली, प्रकाश व्यवस्था, हिंदुस्तान टाइम्स, लेंस धाराओं और इतने पर पढ़ने खिड़कियों के साथ एक स्क्रीन है, और दो से जुड़े कम्प्यूटर से मिलकर TEMCON ऑपरेटिंग सिस्टम से लैस है पैनल: बाएँ और दाएँ, स्तंभ के दोनों ओर रखा. किरण पारी एक्स, वाई knobs (शिफ्ट वाई झारना वाई) और multifunction (डेफ / Stig) knobs दोनों पैनलों पर हैं. बाईं पैनल पर रोशनी (BRIGTHNESS) घुंडी है. सही पैनल पर हैं: बढ़ाई (पत्रिका / सीएएम लंबाई) और फोकस (फोकस) knobs और तीन कल्पनाजी (MAG1, MAG2, LOWMAG) और एक विवर्तन (अन्तर) मोड बटन. हम अल्फा 2 में MAG1 में हमारे डेटा प्राप्त. क्रायो-EM डाटा अधिग्रहण के लिए आवश्यक न्यूनतम खुराक रोशनी शर्तों (एमडीएस) सही पैनल पर F6 बटन, शीर्ष पंक्ति के माध्यम से एफ 1 के साथ स्थापित कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल में सामान्य सेटिंग्स उपयोग कर रहे हैं: F1 - उठाना / कम स्क्रीन, F2 - खोज मोड, F3 - फोकस मोड, F4 - तस्वीर मोड, F5 - एमडीएस बंद / F6 - बीम रिक्त, विकिरण से नमूना ढाल इस्तेमाल किया किरण deflecting द्वारा नुकसान पहुंचा.
    1. क्रायो स्टेशन में क्रायो धारक प्लेस और धारक और LN2 साथ क्रायो स्टेशन के देवर भरें. तापमान -192 डिग्री सेल्सियस, धारक टिप पर खुला शटर तक पहुँच जाता है, जगह पहले से नामित जगह में क्रायो-EM ग्रिड जमे हुए और एक अंगूठी दबाना के साथ सुरक्षित है.
    2. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में क्रायो धारक डालें. क्रायो धारक और LN2 साथ विरोधी contaminator चैंबर के देवर फिर से भरना. धारक 30-60 मिनट के लिए स्थिर करने के लिए प्रतीक्षा करें. प्रेस पर F6 औररेशा पर बारी. ग्रिड देखने के लिए धारक पर रेशा संतृप्त किया जाता है, प्रेस F6 बंद और खुले शटर.
    3. प्रेस कम पत्रिका / अल्फा -1 (200X पत्रिका में सेट) और ग्रिड पर बर्फ की पतली परत के साथ क्षेत्रों का पता लगाने.
    4. न्यूनतम खुराक (एमडीएस) मोड सेट और नमूना को नुकसान पहुँचाए बिना, कम इलेक्ट्रॉन खुराक पर क्रायो ईएम डेटा प्राप्त करने के लिए पत्रिका 1/alpha 2 पर जाएँ.
      1. प्रेस F2 खोज मोड सेट करने के लिए. 40,000 एक्स पर बढ़ाई सेट करें. / एक 2 · एस - न्यूनतम इलेक्ट्रॉन खुराक के लिए BRIGTNESS दस्ता ~ 0.04 ई के साथ किरण बढ़ाना है. प्रेस DIFF विवर्तन मोड में स्विच करने के लिए. पत्रिका / सीएएम लंबाई दस्ता के साथ 120 सेमी करने के लिए कैमरे की लंबाई निर्धारित करें. कार्बन फिल्म के छेद में लिपिड नैनोट्यूब है कि LOWMAG में पूर्व चयनित क्षेत्रों में ग्रिड पर क्षेत्रों का पता लगाएँ.
      2. F4 दबाएं 40,000 एक्स बढ़ाई फोटो मोड सेट और 16-25 ई की खुराक पर चमक दस्ता के साथ रोशनी स्थापित करने के लिए - / A 2 · है. जेड ऊंचाई समायोजन फोकस की स्थिति स्थापित करने के लिए प्रेस स्टैंडर्ड फोकस बटनजेड ऊपर / नीचे बटन (सही नियंत्रण कक्ष) के साथ नमूना की. -1.5 और -2.5 माइक्रोन के बीच सेट defocus.
      3. तस्वीर मोड में imaged किया जा क्षेत्र के लिए इसी खोज मोड में डिजिटल कैमरे की निगरानी पर लाइव देखें खिड़की में एक वर्ग ड्राइंग द्वारा खोज और तस्वीर मोड संरेखित करें.
      4. प्रेस F3 100,000 एक्स बढ़ाई पर फोकस मोड सेट करने के लिए. तस्वीर मोड में imaged किया जा क्षेत्र चमकाना नहीं करने के लिए - (5 सेमी त्रिज्या ~ 4) और अक्ष बंद सीसीडी चिप कवर करने के लिए रोशनी ध्यान दें. ध्यान केंद्रित घुंडी और डेफ / STIG knobs के साथ छवि की दृष्टिवैषम्य के लिए सही के साथ ~ -1.5 और -2.5 माइक्रोन तक defocus समायोजित करें.
    5. डिजिटल कैमरे की निगरानी पर लाइव देखें खिड़की में रहते छवियों को प्राप्त करने से खोज मोड में imaged किया जा FVIII-LNT का चयन करें. लाइव देखें खिड़की पर तैयार वर्ग में FVIII-LNT केंद्र.
    6. फोटो मोड में जाने और acquir क्लिक करके 52,000 एक्स प्रभावी बढ़ाई और 0.5 सेकंड के जोखिम पर सीसीडी कैमरे पर एक डिजिटल छवि रिकॉर्डडिजिटल माइक्रोग्राफ कैमरे की निगरानी पर ई बटन. छवि अधिग्रहण की स्थिति ऐसी छवि तस्वीर मोड में अधिग्रहण कर लिया है केवल जब खुला किरण रिक्त (बंद) के रूप में स्थापित कर रहे हैं.
    7. एक फास्ट फूरियर (FFT) रूपांतरण प्राप्त करने के लिए Ctrl-F दबाकर प्राप्त कर लिया छवि की गुणवत्ता और defocus की जाँच करें.

3. 3 डी पुनर्निर्माण

नोट: 2 डी और 3 डी के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर: EMAN2 और IHRSR आसानी से उपलब्ध हैं. EMAN2 http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install से डाउनलोड किया जा सकता है. Egelman@virginia.edu: IHRSR सॉफ्टवेयर प्रोफेसर Egelman से प्राप्त किया जा सकता है. अंतिम IHRSR शोधन टेक्सास पर चलाए जा रहे केंद्र क्लस्टर कंप्यूटिंग उन्नत: http://www.tacc.utexas.edu/ टेक्सास विश्वविद्यालय के ऑस्टिन में. चित्रा 1 पर दिखाया 3D पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म दो मुख्य चरण होते हैं: पहले 2 डी संदर्भ मुक्त alignme साथ पेचदार क्षेत्रों (कण) का एक समरूप सेट का चयनNT (RFA) एल्गोरिदम दूसरा IHRSR में शामिल पेचदार मापदंडों और वापस प्रक्षेपण एल्गोरिदम पर आधारित एक 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने, EMAN 2 में लागू किया है. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2: पहला कदम एक कण एसपीए EMAN2 विशेष रूप से विकसित और वितरित किया गया है जिसके लिए (एल्गोरिदम) के साथ 3 डी पुनर्निर्माण के लिए समरूप कण सेट के चयन के लिए विकसित कार्यक्रमों का इस्तेमाल करता. यह कदम क्रायो ईएम डेटा के लिए अनुकूलित किया गया है. दूसरे चरण के लिए विशेष रूप से पुनः संयोजक फैक्टर आठवीं रूपों के साथ प्राप्त पेचदार असेंबलियों के प्रकार के लिए बनाया गया है जो IHRSR एल्गोरिथ्म के साथ हासिल की है. इस एल्गोरिथ्म वैज्ञानिक साहित्य 12 के माध्यम से बड़े पैमाने पर प्रलेखित किया गया है.

  1. समरूप कण पेचदार पुनर्निर्माण के लिए (पेचदार खंड) सेट का चयन करने के http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16: EMAN2 वैज्ञानिक छवि प्रसंस्करण सूट के साथ 2 डी छवि विश्लेषण करते हैं.
    1. Straig साथ क्रायो-EM micrographs का चयन करेंहिंदुस्तान टाइम्स और डिजिटल कैमरा सॉफ्टवेयर और दृश्य उपकरणों के साथ पेचदार ट्यूब अच्छी तरह का आयोजन.
    2. पलटना, मानक के अनुसार और e2workflow.py जीयूआई में एक्स - रे, बॉलीवुड, एक कण पुनर्निर्माण (एसपीआर) विकल्प के लिए फिल्टर: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. E2helixboxer.py जीयूआई में, उल्टे सामान्यीकृत और एक्स - रे पिक्सेल फ़िल्टर की छवियों को आयात. का उपयोग कर 90% ओवरलैप के साथ 256 x 256 पिक्सल (2.9 ए / PIX) पर FVIII-LNT पेचदार ट्यूब और खंड का चयन करें: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. मूल micrographs से defocus मूल्यांकन और e2workflow.py में शामिल e2ctf.py विकल्प के साथ एक ही micrographs से पेचदार क्षेत्रों के विपरीत हस्तांतरण समारोह (CTF) सुधार (केवल चरण सुधार) लागू: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
    5. प्रारंभिक कणों (पेचदार क्षेत्रों) उत्पन्न e2workflow.py जीयूआई में डूबता - एसपीआर विकल्प: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
    6. आईटीईआर = 8 - 'e2refine2d.py: e2refine2d.py एल्गोरिथ्म स्क्रिप्ट निम्नलिखित, एक ही व्यास LNT और पेचदार आदेश की डिग्री (चित्रा 2) के साथ समरूप डेटा सेट का चयन करने के संदर्भ मुफ्त कश्मीर मतलब वर्गीकरण लागू करने के साथ 2 डी वर्ग के औसत की गणना - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - पथ = r2d_001 - इनपुट = INPUT.hdf - ncls = 51 - simcmp = डॉट - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = डॉट - classraligncmp = चरण - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = मतलब है - normproj-classkeepsig ', तदनुसार ncls मूल्य बदल रहा है.
      1. वर्ग औसत करने के लिए कम से कम 80% समानता के साथ कणों दी वर्ग से बाहर रखा गया है, जिसका अर्थ है 'classkeep = 0.8' के साथ 8 पुनरावृत्तियों से अधिक 150 वर्गों '= 151 ncls' में सेट प्रारंभिक डेटा वर्गीकृत. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. वर्ग मूविंग से कणों मर्जमध्यवर्ती डेटा सेट बनाने के लिए e2display.py में स्पष्ट पेचदार विवर्तन के साथ.
      3. आदेश के एक ही व्यास और डिग्री के साथ कक्षाएं अलग करने के लिए 50 वर्गों '= 51 ncls' में सेट मध्यवर्ती डेटा वर्गीकृत.
      4. Http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector: तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए अंतिम डेटा सेट बनाने के लिए e2display.py में आदेश की एक ही व्यास और डिग्री के साथ कक्षाओं से कणों मिलाएं.
  2. Egelman 17, 18 में वर्णित है, चलने का पेचदार असली अंतरिक्ष पुनर्निर्माण (IHRSR) एल्गोरिथ्म के साथ पेचदार पुनर्निर्माण कार्य करें.
    1. वृद्धि का अनुमान है, संयुक्त फूरियर से FVIII-LNT हेलिक्स की Δz (क) अंतिम डेटा सेट में कणों का बदलना.
    2. 5 से ΔΦ में वृद्धि, एक निरंतर Δz साथ समानांतर IHRSR शोधन चलाकर दिगंशीय कोण ΔΦ (º) को परिभाषित करें76; 5 डिग्री वेतन वृद्धि में 60 डिग्री करने के लिए.
    3. एक प्रारंभिक मात्रा के रूप में एक कुरूप सिलेंडर और 3.2.1 के रूप में परिभाषित प्रारंभिक पेचदार मापदंडों Δz और ΔΦ के साथ सेट प्रत्येक अंतिम डेटा के लिए 100 लगातार IHRSR चक्र चलाते हैं. और 3.2.2.
    4. वर्ग के फाइनल डेटा सेट के 2 डी वर्गीकरण से औसत और अंतिम IHRSR पुनर्निर्माण से अनुमानों के बीच पेचदार मापदंडों और पत्राचार के अभिसरण के लिए अंतिम संस्करणों का निरीक्षण किया.
    5. अंतिम असममित 3 डी संस्करणों में मनाया असममित इकाई वितरण के लिए इसी अंतिम 3 डी पुनर्निर्माण के लिए समरूपता थोपना: मानव FVIII-LNT के लिए 4 गुना और सुअर का FVIII-LNT के लिए 5 गुना. एक अंतिम symmetrized 3D पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए एक और 100 शोधन चक्र चलाते हैं.
    6. 'E2proc2d.py <infile> <outfil: पहले भी अजीब और में सेट संगत डेटा को अलग करके दोनों संस्करणों के लिए फूरियर शैल सहसंबंध वक्र की गणनाई> - विभाजन = 2 '. 3.2.3 में वर्णित के रूप में तो 100 IHRSR लगातार शोधन चलाते हैं. यहां तक ​​कि अजीब और डेटासेट से बनाया 3 डी संस्करणों की एफएससी की गणना: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
  3. UCSF कल्पना में FVIII-LNT मात्रा में कल्पना और खंड.
    1. कदम 3.2.5 से अंतिम संस्करणों खोलें. UCSF कल्पना में और उपकरण> मात्रा डेटा> Volume दर्शक विकल्प में 0,005 समोच्च स्तर निर्धारित किया है.
    2. उपकरण में> मात्रा डेटा> खंड एमएपी, खंड एमएपी टैब में चयन की मात्रा और खंड मात्रा करने के लिए खंड पर क्लिक करें.
    3. समूह खंडों Ctrl + Shift और क्लिक समूह के साथ चयन करके एक इकाई सेल से संबंधित.
    4. यूनिट सेल द्वारा खंडों रंग और ढांचागत सुविधाओं पर जोर देना क्रियाएँ> रंग विकल्प के साथ हेलिक्स.

4. इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी

  1. नकारात्मक दाग FVIII-LNT नमूना तैयार
      <ली> क्रायो ईएम प्रयोगों के लिए के रूप में FVIII-LNT नमूने तैयार करते हैं.
    1. क्रायो ईएम प्रयोगों के लिए w ​​के रूप में 50 पर 2 हे और 10 सेकंड के लिए एच 2 गैस का एक मिश्रण में कार्बन लेपित 300 जाल तांबा ग्रिड (कार्बन ऊपर की ओर) निर्वहन ग्लो.
    2. ग्रिड से 6 एनएम कोलाइडयन सोने के नैनोकणों के साथ 2.5 μl FVIII-LNT निलंबन की एक बूंद लागू करें, अतिरिक्त तरल दाग और नकारात्मक 2 मिनट के लिए 5 μl 1% uranyl एसीटेट समाधान लगाने से दाग. ग्रिड सूखी अतिरिक्त तरल और हवा दाग.
  2. इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी डाटा संग्रह
    1. एकल झुकाव धारक में ग्रिड स्थानांतरण.
    2. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में धारक स्थानांतरण.
    3. 52,000 एक्स प्रभावी बढ़ाई पर एक सीसीडी कैमरे के साथ 60 डिग्री और छवियों को रिकार्ड करने के लिए -60 डिग्री के कोणीय सीमा से अधिक 2 डिग्री वेतन वृद्धि पर SerialEM सॉफ्टवेयर 19 से स्वतः झुकाव श्रृंखला लीजिए, -6 -10 माइक्रोन defocus और 150 के इलेक्ट्रॉन खुराक - 170 हाथीctrons / A 2 · एस रण प्रति.
  3. FVIII-LNT के इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी पुनर्निर्माण
    नोट: 4.2 में अधिग्रहण pFVIII-LNT और hFVIII-LNT झुका श्रृंखला पुनर्निर्माण किया. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html: ट्यूटोरियल निम्नलिखित IMOD सॉफ्टवेयर की ETomo विकल्प के साथ
    1. एक टर्मिनल विंडो का उपयोग करना, 3DMOD में रण खुला. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
    2. बिन IMOD BINVOL साथ 4 से रण रण के आकार को कम करने के लिए आदेश.
    3. IMOD ROTATEVOL आदेश का उपयोग binned रण में वाई अक्ष के साथ लिपिड नैनोट्यूब को घुमाने के लिए उचित कोण का चयन करें.
    4. IMOD ROTATEVOL कमांड के साथ पूरा रण घुमाएँ.
    5. IMOD क्लिप का आकार बदलने के आदेश के साथ वाई अक्ष के साथ उन्मुख चयनित लिपिड नैनोट्यूब फसल.
    6. 3DMOD साथ फसली उप रण खोलें.
    7. साथ फैक्टर आठवीं अणुओं की व्यवस्था करने के लिए कल्पना रण पर क्लिक करेंZ-अक्ष में और उप रण मात्रा में वाई अक्ष के साथ स्लाइस.

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Representative Results

पुनः संयोजक मानव और सुअर का FVIII सफलतापूर्वक पर नकारात्मक सक्रिय प्लेटलेट सतह जैसी ही bilayer LNT आरोप लगाया कुंडलित का आयोजन किया गया. मानव और सुअर का FVIII-LNT के पेचदार संगठन (चित्रा 2) एकत्र डिजिटल micrographs के माध्यम से संगत किया गया था. नियंत्रण LNT और मानव और सुअर का FVIII-LNT पेचदार ट्यूब चयनित और e2helixboxer.py जीयूआई और e2workflow.py जीयूआई, एक कण विकल्प (तालिका 1) के साथ बनाया प्रारंभिक डेटा सेट के साथ खंडों थे.

झिल्ली ही सीमित मानव और सुअर का FVIII-LNT के पेचदार आदेश e2display.py जीयूआई (EMAN2) (चित्रा 3) के साथ वर्ग के औसत के बदलने फूरियर से मूल्यांकन किया गया था. सबसे अच्छा नियंत्रण LNT 2 डी वर्ग मूविंग में लिपिड bilayer अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है. भीतरी और बाहरी पत्रक और झिल्ली हाइड्रोफोबिक मूल के कम घनत्व (स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं (आंकड़े 3B और 3 सी) के बीच पेचदार संगठन में बदलाव से पता चलता है. मानव FVIII-LNT पेचदार ट्यूबों के लिए और अधिक स्पष्ट मोड़ आसन्न झिल्ली ही सीमित FVIII अणुओं के बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत दो FVIII रूपों (आंकड़े 3B और 3 सी) के लिए लगातार अलग हैं कि इंगित करता है. अच्छा पेचदार संगठन (पेचदार विवर्तन पैटर्न) दिखा वर्ग के औसत से कणों एक मध्यवर्ती कण सेट (तालिका 1) के रूप में e2display.py जीयूआई में विलय कर दिया गया. मध्यवर्ती कण सेट से कणों फिर उसी की कमी के साथ 50 वर्गों में वर्गीकृत किया गया है. एक ही व्यास के साथ वर्ग के औसत से कणों अंतिम आंकड़ों में विलय कर दिया गयासेट (1 टेबल).

मानव और सुअर का FVIII-LNT के लिए प्रारंभिक 3D पुनर्निर्माण अंतिम मानव और सुअर का FVIII-LNT डेटा सेट से 1,000 प्रतिनिधि कणों के साथ किए गए. एक सौ लगातार IHRSR पुनरावृत्तियों प्रारंभिक मात्रा के रूप में, एक कुरूप सिलेंडर (160 भीतरी और 500 एक बाहरी व्यास) के साथ प्रत्येक 3 डी पुनर्निर्माण के लिए चलाए जा रहे थे. संयुक्त फूरियर से गणना की अक्षीय वृद्धि (Δz) पेचदार क्षेत्रों (कणों सेट) के बदलने सुअर का FVIII-LNT के लिए मानव FVIII-LNT और 36 के लिए 41 के बराबर है (आंकड़े -4 ए और 4 बी). चलने खोज से परिभाषित प्रारंभिक दिगंशीय कोण (ΔΦ) मानव FVIII-LNT के लिए 40.0 डिग्री पर और सुअर का FVIII-LNT के लिए 35.0 डिग्री रहने का अनुमान है. अंतिम संस्करणों अंतिम reconstr से कक्षा औसत और अनुमानों के बीच पेचदार मापदंडों और पत्राचार के अभिसरण के लिए निरीक्षण कर रहे हैंuction, भी 5 में वर्णित मापदंड निम्नलिखित. चयनित 3D पुनर्निर्माण और पेचदार मापदंडों इसी प्रारंभिक संस्करणों और Δz = 41.1 ए और ΔΦ साथ मानव FVIII-LNT के लिए एक चार शुरू पेचदार संगठन के लिए जुटे जो 100 चक्र का एक दूसरा IHRSR शोधन के लिए प्रारंभिक पेचदार मानकों के रूप में लागू कर रहे हैं = 42.0 डिग्री और Δz = 35.5 ए और ΔΦ = 34.8 डिग्री के साथ सुअर का FVIII-LNT के लिए एक पांच शुरू पेचदार संगठन. एक 4 गुना और मानव और सुअर का FVIII-LNT पुनर्निर्माण के लिए एक 5 गुना पेचदार समरूपता भव्य अंतिम 100 IHRSR पुनरावृत्तियों क्रमशः प्रारंभिक संस्करणों और पिछले असममित IHRSR शोधन (आंकड़े 4C और 4D) से इसी पेचदार मानकों के साथ किया जाता है. अंतिम संस्करणों 8 मानव FVIII और पेचदार अक्ष (चित्रा 5A) के आसपास का आयोजन 10 सुअर का FVIII झिल्ली ही सीमित अणुओं दिखा. प्रत्येक मानवFVIII अणु 41.2 एक अनुवाद और पिछले एक से 42.0 डिग्री घुमाया और प्रत्येक सुअर का FVIII अणु 35.9 एक अनुवाद है और अंतिम 3D पुनर्निर्माण (चित्रा 5 ब) के पेचदार मापदंडों के अनुरूप, पिछले एक से 35.2 डिग्री घुमाया जा रहा है.

खंगाला इलेक्ट्रॉन tomograms ही प्रयोगात्मक शर्तों पर प्राप्त मानव और सुअर का FVIII-LNT के बीच पेचदार संगठन में अंतर की पुष्टि करें. पेचदार अक्ष को सीधा दिशा में देखी पेचदार पुनर्निर्माण से खंगाला tomograms और 3 डी संस्करणों से ऊपर देखा की तुलना, आगे IHRSR पेचदार मानकों (चित्रा 6) के साथ परिष्कृत 3D पुनर्निर्माण की शुद्धता पुष्टि की. मानव FVIII-LNT 3D पुनर्निर्माण के लिए असममित 2D इकाई सेल आयाम हैं: एक = 17.8 एनएम, बी = 8.2, γ = 84 डिग्री और सुअर का FVIII-LNT 3D पुनर्निर्माण के लिए: एक =18.4, बी = 7.2 और γ = 70 ° (चित्रा 6). झिल्ली ही सीमित 2 डी क्रिस्टल में आयोजित मानव FVIII की इकाई सेल आयाम हैं: एक = 8.1, बी = झिल्ली सतह 20 की ओर देखा एक FVIII अणु द्वारा कवर सतह से मेल खाती है = 67 º 7.0 और γ,. 2 डी और पेचदार क्रिस्टल में आयोजित FVIII के बीच इकाई सेल आयाम मुकाबले कुंडलित LNT सतह पर आयोजित जब मानव और सुअर का FVIII अणुओं दोनों dimers कि फार्म का संकेत है.

चित्रा 1
चित्रा 1. संरचना विश्लेषण प्रवाह चार्ट. कदम EMAN2 16 में लागू संदर्भ मुक्त संरेखण एल्गोरिदम पर आधारित 2D वर्गीकरण विश्लेषण के लिए पीछा नीले रंग में परिक्रमा कर रहे हैं. 3 डी विश्लेषण चलने का पेचदार असली के साथ बाहर ले के लिए कदम पीछे अंतरिक्ष पुनर्निर्माण एल्गोरिदम (IHRSR) लाल रंग में परिक्रमा कर रहे हैं. चलने का IHRSR चक्र धराशायी तीर के साथ चिह्नित हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. क्रायो ईएम डिजिटल micrographs. (4096 x 4096 पिक्सल, 2.9 ए / PIX) लिपिड नैनोट्यूब (LNT) के. नियंत्रण LNT. बी मानव FVIII-LNT. सी. सुअर FVIII-LNT साथ और बाध्य FVIII बिना . FVIII-LNT अनाकार बर्फ में निलंबित कर दिया है, जिसमें कार्बन फिल्म में छेद के किनारे एक सफेद स्टार के साथ संकेत दिया है. प्रोटीन और लिपिड घनत्व काले रंग में हैं. X 512 512 के आवर्धित दृश्य (insets) (सफेद वर्ग धराशायी) क्रमश: मानव और सुअर का FVIII की पेचदार संगठन में अंतर बताने के क्षेत्रों फसली. पैमाने बार 100 एनएम है.ig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रतिनिधि 2D वर्ग मूविंग (शीर्ष पंक्ति) और मध्यवर्ती कण सेट (1 टेबल) से इसी फूरियर (नीचे पंक्ति) 50 वर्गों. ए नियंत्रण LNT बी मानव FVIII-LNT सी. सुअर FVIII-LNT में वर्गीकृत. वर्ग संख्या और प्रत्येक वर्ग में शामिल कणों की संख्या संकेत कर रहे हैं. मानव और सुअर का FVIII के बीच पेचदार क्रम में अंतर स्पष्ट रूप से छवियों पर देखा और इन चित्रों के बदल फूरियर से प्राप्त विवर्तन पैटर्न से इसकी पुष्टि की है. एक देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का बड़ा संस्करण.

चित्रा 4
चित्रा 4. मानव और सुअर का FVIII-LNT. ए संयुक्त फूरियर की 3 डी पेचदार पुनर्निर्माण 1,000 पेचदार क्षेत्रों से बदलना. पहली और दूसरी परत लाइन 1/82 एक पर केंद्रित -1 और 1/41 -1 मानव FVIII-LNT के लिए, और 1/72 में एक -1 और 1/36 एक -1 सुअर का FVIII-LNT (सफेद के लिए कर रहे हैं तीर). बी भूतल गुलाबी में मानव का प्रतिनिधित्व (Δz = 41.1 Å, ΔΦ = 42.0 डिग्री) और नीले (Δz = 35.9 Å, ΔΦ = 35.2 डिग्री) FVIII-LNT 3D पेचदार पुनर्निर्माण में सुअर का. दोनों संस्करणों (न्यूनतम घनत्व UCSF झंकार में गणना के रूप में, 0 और अधिकतम घनत्व 0.02 0.005 समोच्च स्तर पर प्रस्तुत कर रहे हैंआरए, खंड दर्शक विकल्प 21). FVIII-LNT ट्यूब की लंबाई 2.9 ए / पिक्स पर 256 पिक्सल. सी. फूरियर शैल सहसंबंध (एफएससी) मानव और सुअर का FVIII-LNT FSC में 20.5 ए के एक संकल्प दिखा = 0.5 के लिए भूखंडों है.

चित्रा 5
चित्रा 5. 4B चित्रा में दिखाया गया है मानव और सुअर का FVIII-LNT पेचदार पुनर्निर्माण के मानव और सुअर का FVIII-LNT. खंडों सतह प्रतिनिधित्व की पेचदार संगठन. संस्करणों मानव FVIII-LNT और सुअर का FVIII-LNT तक 5 गुना समरूपता के लिए 4 गुना समरूपता लगाने के बाद खंडित कर रहे हैं. असममित इकाइयों रंग मानव FVIII-LNT और मानव के लिए एक वर्ग के साथ संकेत दिया पेचदार धुरी के साथ और के रूप में सुअर का FVIII-LNT. दर्शनों के लिए नीले, हरे के लिए पीले, लाल कोडित रहे हैंसुअर का FVIII-LNT के लिए एक पेंटागन. मानव FVIII-LNT संरचना बाहरी LNT झिल्ली के आसपास का आयोजन 8 अणुओं से पता चलता है और सुअर का FVIII संरचना बाहरी LNT झिल्ली के आसपास का आयोजन 10 अणुओं, संख्या के साथ संकेत दिया. बी दृश्य पेचदार अक्ष को सीधा दिखाता है. मानव FVIII-LNT एक 4 शुरू पेचदार संरचना है और सुअर का FVIII-LNT 5 शुरू पेचदार संरचना है. व्यक्ति एक शुरुआत हेलिसिस संख्या के साथ संकेत दिया है और रंग कोडित रहे हैं. हम एक (*) और हरे रंग की लाइनों के साथ प्रत्येक संरचना से हेलिसिस में से एक पर जोर दिया है. पैमाने बार 20 एनएम है.

चित्रा 6
चित्रा 6. पेचदार और टोमोग्राफी 3D पुनर्निर्माण. मानव FVIII-LNT (ए) और सुअर का FVIII-LNT (सी) पेचदार 3D पुनर्निर्माण के बीच तुलना perpe दिखाए जाते हैंपेचदार धुरी के ndicular. प्रत्येक इकाई में सेल और व्यक्तिगत हेलिसिस रंग कोडित चित्रा में के रूप में 5. बी हैं. और डी. पेचदार अक्ष को सीधा देखी 3D टोमोग्राफी पुनर्निर्माण, का घनत्व प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. FVIII अणुओं की पेचदार व्यवस्था को दर्शाती 2D जाली हरे रंग की लाइनों के साथ दिखाया गया है.

नमूने cLNT hFVIII-LNT pFVIII-LNT
प्रारंभिक micrographs 61 474 542
प्रारंभिक कण सेट 29113 60,395 64,665
Defocus (एनएम) -4051 ± 502 -3643 ± 737 -3443 ± 1,086
इंटरमीडिएट कण सेट 25,907 27,305 22,773
अंतिम कण सेट 25,907 10,455 10,430

तालिका 1. चित्रा 3 पर फ्लोचार्ट में प्रस्तुत एल्गोरिथ्म निम्नलिखित 2D विश्लेषण आंकड़े.

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Discussion

इस काम में एक पद्धति अत्यधिक मुताबिक़ प्रोटीन के दो झिल्ली ही सीमित संगठनों के बीच अंतर करने के लिए प्रस्तुत किया है: मानव और सुअर का FVIII आत्म इकट्ठे मानव शरीर में सामना करना पड़ा स्थितियों में लिपिड नैनोट्यूब पर.

वर्णित प्रक्रिया में, मानव और सुअर का FVIII सफलतापूर्वक सबसे महत्वपूर्ण कदम है, जो लिपिड नैनोट्यूब पर घुमावदार ढंग से आयोजित कर रहे हैं. अगले महत्वपूर्ण कदम के आसपास तरल एन 2 तापमान में फ़्लैश ठंड से पतली अनाकार बर्फ में नमूना की रक्षा करना है. अनाकार बर्फ और LN2 तापमान में नमूना संरक्षण हाइड्रेटेड पेचदार ट्यूब और प्रोटीन लिपिड macromolecular विधानसभाओं physiologically सक्रिय रहता है. अंतिम महत्वपूर्ण कदम निकट LN2 तापमान में एक उच्च संकल्प 3 डी संरचना के लिए पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता के क्रायो-EM डेटा प्राप्त कर रही है. निकट LN2 तापमान पर डेटा एकत्रित आगे उच्च वि में नमूना की निर्जलीकरण से बचाता हैइलेक्ट्रॉन बीम से माइक्रोस्कोप और विकिरण क्षति के acuum.

FVIII की झिल्ली ही सीमित संरचना की गणना करने के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम 2D संदर्भ मुक्त वर्गीकरण लागू करने और व्यवस्था का एक ही व्यास और डिग्री के साथ कक्षाओं से कणों गठबंधन द्वारा समरूप कणों (पेचदार क्षेत्रों) सेट प्राप्त करने के लिए है. दूसरा महत्वपूर्ण कदम पेचदार पुनर्निर्माण के लिए सही प्रारंभिक मात्रा और पेचदार मानकों (वृद्धि और दिगंशीय कोण) लागू करने के लिए है. तीसरे और अंतिम महत्वपूर्ण कदम (लगाया समरूपता के बिना) पेचदार और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी एक ही नमूना के पुनर्निर्माण के द्वारा प्राप्त 3 डी नक्शे की तुलना द्वारा पेचदार संरचना करने के लिए मान्य है.

प्रस्तुत कार्यप्रणाली के पास शारीरिक शर्तों पर झिल्ली जुड़े प्रोटीन के कार्यात्मक संरचना को हल करने के लिए अपनी क्षमता में अद्वितीय है. हमारी प्रयोगशाला में विकसित LNT हो सकता हैसफलतापूर्वक कार्यात्मक झिल्ली ही सीमित रक्त जमावट कारकों की पेचदार संगठन के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया और झिल्ली ही सीमित 2 डी क्रिस्टल में और एक कण के रूप में संगठित FVIII के लिए की तुलना में बेहतर प्रस्ताव प्राप्त करने के. हमारा लक्ष्य आगे अंतिम कण सेट की एकरूपता और गुणवत्ता में सुधार के द्वारा हमारे पेचदार पुनर्निर्माण का संकल्प वृद्धि हुई है. 2 डी पुनर्निर्माण के लिए बड़ा प्रारंभिक कण सेट सहित इसलिए बेहतर क्रायो ईएम शर्तों (क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक, ऊर्जा फिल्टर, डे कैमरा डिटेक्टरों) FVIII-LNT पेचदार तंतुओं की और कम से अधिक क्रायो-EM micrographs एकत्रित इस लक्ष्य को हासिल करेंगे. FVIII-LNT पेचदार विधानसभा और 3 डी पुनर्निर्माण एल्गोरिदम के सुधार में उप नैनोमीटर और असंदिग्ध रूप से रक्त जमावट प्रोटीन के लिए इस महत्वपूर्ण की झिल्ली ही सीमित संगठन को परिभाषित करेगा जो परमाणु संकल्प, के पास प्राप्त करने के लिए अनुमति देगा.

कुंडलित मुताबिक़ FVIII रूपों आयोजन भी हमें अवसर देता हैTy अनुक्रम में अंतर संरचना और समारोह में मतभेद के सहसंबंधी कर सकते हैं कि कैसे चिह्नित करने के लिए. इस आलेख में वर्णित विधि से मानव और सुअर का FVIII झिल्ली ही सीमित संरचनाओं को हल करने के लिए संशोधित जब पुनः संयोजक FVIII समारोह में सुधार होगा जो दृश्यों को पहचानने में मदद कर सकते हैं. इस ज्ञान दोनों घनास्त्रता और hemostasis क्षेत्रों में दवाओं की खोज के लिए महत्वपूर्ण नैदानिक ​​निहितार्थ हो जाएगा.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित है और वे इस पांडुलिपि में प्रकाशित प्रक्रियाओं में से किसी के बारे में सीधे संपर्क किया जा सकता है कि घोषित.

Acknowledgements

10SDG3500034 और UTMB-एनसीबी एसएसएम के लिए धन शुरू: इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से एक राष्ट्रीय वैज्ञानिक विकास अनुदान द्वारा समर्थित है. लेखकों सीली UTMB में स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के लिए केंद्र (कम से क्रायो EM और वैज्ञानिक कंप्यूटिंग सुविधाओं को स्वीकार करते हैं www.scsb.utmb.edu ), साथ ही डीआरएस. 2 डी और 3 डी पेचदार पुनर्निर्माण एल्गोरिदम के साथ मदद के लिए स्टीव Ludtke और एड Egelman.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM2100 with LaB6 JEOL Ltd. JEM-2100 operated at 200 kV
with TEMCON software JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder Gatan, Inc. 626.DH cooled to -175 °C
with temperature controler unit Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera Gatan, Inc. US4000 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV FEI
Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid Ted Pella 01821 plasma cleaned for 10 sec on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh Electron Microscopy Sciences Q225-CR2 Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes 
Uranyl acetate dihydrate Ted Pella 19481 1% solution, filtered
Galactosyl ceramide Avanti Polar Lipids Inc. 860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids Inc. 840035
EM software Digital Micrograph Gatan, Inc. http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN free download http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
EM software Spider free download http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR free download Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD) free download http://bio3d.colorado.edu/imod/ 
EM software (SerialEM) free download ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera free download http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

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References

  1. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
  2. Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
  3. Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
  4. Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
  5. Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. (2013).
  6. Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
  7. Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
  8. Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
  9. Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
  10. Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
  11. Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
  12. Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
  13. Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
  14. Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
  15. Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
  16. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
  17. Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
  18. Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
  20. Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
  21. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).

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