ארגון סליל של דם קרישת פקטור VIII ביפידים צינוריות

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מציגים שילוב של מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים, ננוטכנולוגיה שומנים בדם, וניתוח מבנה מיושם כדי לפתור את מבנה הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד: אדם וחזירי. המתודולוגיה שפותחה במעבדה שלנו כדי לארגן helically שתי צורות FVIII רקומביננטי פונקציונליות על צינורות טעונים שלילי שומנים (LNT) הוא תאר.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Miller, J., Dalm, D., Koyfman, A. Y., Grushin, K., Stoilova-McPhie, S. Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes. J. Vis. Exp. (88), e51254, doi:10.3791/51254 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים (Cryo-EM) 1 היא גישה רבת עוצמה כדי לחקור את המבנה התפקודי של חלבונים ומתחמים בסביבת מדינה וקרום התייבשות 2.

קרישת פקטור VIII (FVIII) 3 הוא גליקופרוטאין פלזמה דם מרובה תחומים. פגם או חסר של FVIII הוא הגורם לסוג המופיליה - הפרעת דימום חמורה. עם הפעלת מפרקי חלבונים, FVIII נקשר לפרוטאז סרין פקטור IXA על הממברנה של טסיות הדם הטעונה השלילי, שהוא קריטי לקרישת דם נורמלית 4. למרות התפקיד המרכזי FVIII משחק בקרישה, מידע מבני למצב הקרום הנכנס שלה הוא 5 לא שלמים. תרכיז FVIII רקומביננטי הוא התרופה היעילה ביותר נגד סוג המופיליה וFVIII זמין מסחרי יכול לבוא לידי ביטוי כאנושי או חזירי, שני מתחמים פונקציונליים להרכיב עם אדם פקטור IXA 6,7.

"> במחקר זה אנו מציגים שילוב של מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים (Cryo-EM), ניתוח ננוטכנולוגיה שומנים בדם והמבנה מיושם כדי לפתור את מבנה הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד:. אנושי וחזירי המתודולוגיה שפותחה במעבדה שלנו לארגן helically שתי צורות FVIII רקומביננטי פונקציונליות על צינורות טעונים שלילי שומנים (LNT) מתואר. תוצאות הנציג להוכיח כי הגישה שלנו היא רגישה מספיק כדי להגדיר את ההבדלים בארגון הסליל בין שני מאוד הומולוגי ברצף (זהות רצף 86% חלבונים). פרוטוקולים מפורטים לארגון הסליל, Cryo-EM וטומוגרפיה אלקטרון (רכישת נתונים) ET מקבלים. דו ממדי (2D) וניתוח מבנה התל ממדים (3D) מיושם כדי להשיג שחזורי 3D של אדם וחזירי FVIII-LNT נדונה. מבני FVIII-LNT הציגו אנושיים וחזיריים להראות את הפוטנציאל של המתודולוגיה המוצעת לcalculatדואר הארגון הפונקציונלי, הקרום הנכנס של פקטור VIII קרישת דם ברזולוציה גבוהה.

Introduction

קרישת דם פקטור VIII (FVIII) הוא גליקופרוטאין גדול של 2,332 חומצות אמינו מאורגן בשישה תחומים: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. על טרומבין הפעלת FVIII פועל כcofactor לפקטור IXA במתחם Tenase הקרום הנכנס. עקידת FVIII הופעל (FVIIIa) לFIXa באופן תלויי קרום משפרת את יעילות פרוטאוליטי FIXa יותר מ -10 5 פעמים, שהוא קריטי לקרישת דם יעילה 4. למרות התפקיד החשוב FVIII משחק בקרישה וההיווצרות המורכבת Tenase, מבנה FVIII קרום הנכנס הפונקציונלי הוא עדיין לא נפתר.

לכתובת זו, צינורות בודדים bilayer שומנים (LNT) עשירים בphosphatidylserine (PS), מסוגלים מחייב FVIII עם זיקה גבוהה 8, 9 ומזכיר את משטח טסיות הדם מופעל פותחו 10. ארגון סליל רצוף של FVIII חייב LNT הוכח להיות effectiיש לקביעת מבנה של מדינת קרום הנכנס FVIII ידי Cryo-EM 5. פונקציונליות LNT הן מערכת אידיאלית ללמוד חלבונים וחלבונים אינטראקציות קרום של חלבוני קרום הקשורים מאורגנים helically ידי 11 Cryo-EM, 12. יש Cryo-EM היתרון על פני שיטות מבניות מסורתיות כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן ותמ"ג, כפי שהדגימה נשמרה בקרוב ביותר לסביבה הפיזיולוגית (חיץ, קרום, pH), ללא תוספים ואיזוטופים. במקרה של FVIII, לומד את מבנה הקרום הנכנס עם טכניקה זו היא אפילו יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, כמו LNT דומה בגודל, צורה והקומפוזיציה pseudopodia של טסיות הדם מופעל בו מתחמי Tenase להרכיב in vivo.

פגמים וחסרים של סיבת FVIII המופיליה, הפרעת דימום חמורה המשפיעה על 1 ב 5,000 זכרים של האוכלוסייה האנושית 4, 6. רוב הדוארטיפול ffective להמופיליה הוא מנהל לכל חיים של FVIII רקומביננטי אדם (hFVIII). סיבוך משמעותי של טיפול FVIII המופיליה רקומביננטי הוא הפיתוח של נוגדנים מעכבים לצורה האנושית המשפיעה על כ 30% מחולי המופיליה 13. במקרה זה, משמש להתרכז FVIII חזירי (pFVIII), כפי שמציג FVIII חזירי תגובתיות צולבת נמוכה עם נוגדנים מעכבים כנגד FVIII וצורות מתחמים פונקציונליים עם FIXa אדם 7 בני אדם. הקמת ארגון הקרום הנכנס של שניהם חזיריים וצורות FVIII אדם חשובה להבין את הבסיס המבני של פונקצית cofactor FVIII והשלכות לעצירת דימום דם.

במחקר זה, אנו מתארים שילוב של ננוטכנולוגיה שומנים בדם, Cryo-EM, וניתוח מבנה שנועד לפתור את ארגון הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד. הנתונים שהוצגו Cryo-EM ומבני 3D עבור porci המאורגן helicallyFVIII ne והאנושי על LNT הטעונה שלילי להראות את הפוטנציאל של ננוטכנולוגיה הוצעה כבסיס לקביעת מבנה של FVIII וגורמי קרישת קרום הנכנס ומתחמים בסביבת קרום פיזיולוגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. לדוגמא הכנה

  1. אדם מטבע חיץ FVIII-BDD 14 והחזירי 15 FVIII-BDD נגד חיץ HBS-Ca (20 HEPES מ"מ, 150 mM NaCl, 5 מ"מ CaCl 2, pH = 7.4) ולהתרכז ל1.2 מ"ג / מיליליטר. שמור את פתרון החלבון ב -80 ° C.
  2. הכן צינורות שומנים (LNT) על ידי ערבוב GalactosylCeramide (GC) וphosphatidylserine (PS) ב1:04 w / פרופורציות בכלורופורם. להתאדות כלורופורם תחת ארגון וsolubilize השומנים בחיץ HBS עד 1 מ"ג / מיליליטר. שמור את פתרון LNT ב 4 ° C.

2. מיקרוסקופית האלקטרונים cryo-של FVIII-LNT

  1. לדוגמא הכנת Cryo-EM
    1. זוהר פריקה 300 רשת R2 / 2 רשתות Quantifoil נחושת (עד צד פחמן) בתערובת של O 2 ו-H 2 גז ל10 שניות ב50 וו
    2. מערבבים את פתרונות FVIII וLNT במאגר HBS-Ca ב01:01 w / פרופורציות ודגירה של 15 דקות בטמפרטורת חדר.
    3. החל ירידה של 2.5 μlמדגם FVIII-LNT למיקרוסקופ אלקטרונים לרשת הידרופילי בתא humidified Vitrobot Mark IV (לחות 100%).
    4. כתם ופלאש להקפיא את הרשת (כתם אחד ל-3.5 שניות, הכוח למחוק 1) בC 2 H 6 הנוזלי, מקורר על ידי נוזל N 2 כדי להשיג את קרח אמורפי.
    5. רשתות חנות בקופסות אחסון מתחת לנוזלי N 2 (LN2).
  2. אוסף נתונים Cryo-EM
    הערה: JEM2100-LaB6 (השנה 2010) מצויד במערכת ההפעלה TEMCON המורכבת ממחשב המחובר למיקרוסקופ האלקטרונים, מסך עם חלונות קריאת מערכת הוואקום, מערכת תאורה, HT, זרמי עדשה וכך הלאה, ושני פנלים: שמאל וימין, שהונח על הצד השני של העמודה. X משמרת הקורה, ידיות Y (SHIFT Y, לנפות Y) ותכליתי (DEF / סטיג) כפתורים נמצאים משני הלוחות. בפנל השמאלי הוא כפתור התאורה (BRIGTHNESS). בלוח השמאלי הם: הגדלה (אורך MAG / CAM) ומוקד ידיות (פוקוס) ולדמיין שלושg (MAG1, MAG2, LOWMAG) ועקיף (הבדל) כפתורי מצבים. אנו רוכשים את הנתונים שלנו בMAG1 באלפא 2. תנאי מינימום מינון התאורה (MDS) הנדרשים לרכישת נתונים Cryo-EM נקבעים עם F1 באמצעות כפתורי F6, שורה העליונה בפנל ימני. בפרוטוקול זה הגדרות גנריות משמשות: F1 - להעלות / מסך נמוך יותר, F2 - מצב חיפוש, F3 - מצב פוקוס, F4 - מצב צילום, F5 - MDS OFF ON / וF6 - BEAM ריק, משמשים להגן על הדגימה מקרינה נזק על ידי להסיט את הקרן.
    1. הנח את cryo-מחזיק לcryo-התחנה ולמלא את דיואר של בעל וcryo-התחנה עם LN2. כאשר הטמפרטורה מגיעה -192 ° C, תריס פתוח בקצה בעל, המקום קפוא בעבר רשת Cryo-EM למקום המיועד ובטוח עם מהדק טבעת.
    2. הכנס את cryo-מחזיק במיקרוסקופ האלקטרונים. למלא את דיואר של cryo-בעל וקאמרי אנטי contaminator עם LN2. לחכות לבעל לייצוב ל30-60 דקות. הקש F6 ובלהפוך את חוט הלהט ב. כאשר חוט הלהט רווי, הקש F6 תריס ומפתוח למחזיק כדי להציג את הרשת.
    3. הקש נמוך מאג / אלפא 1 (נקבע על mag 200X) ולאתר אזורים עם קרח דק על הרשת.
    4. לעבור לפרקליטות הצבאית 1/alpha 2 להגדיר מינון מינימאלי מצב (MDS) ולרכוש נתונים Cryo-EM במינונים אלקטרונים נמוכים, ללא פגיעה בדגימה.
      1. הקש על F2 כדי להגדיר את מצב חיפוש. הגדר הגדלה ב40,000 x. הגדלת קורה עם ידית BRIGTNESS למינון מינימאלי אלקטרון ~ 0.04 דואר - / 2 · s. עיתונות DIFF כדי לעבור למצב עקיפה. להגדיר את אורך מצלמה 120 סנטימטר עם ידית אורך MAG / CAM. אתר אזורים על הרשת בתוך האזורים שנבחרו מראש בLOWMAG כי צינורות שומנים בחורים של סרט פחמן.
      2. הקש F4 כדי להגדיר מצב תמונה בהגדלת 40,000 X ולהגדיר תאורה עם ידית BRIGHTNESS במינונים של 16-25 דואר - / 2 · s. לחץ על לחצן תקן פוקוס לקבוע תנאי מוקד התאמת Z-הגובהשל הדגימה עם למעלה כפתורי Z / למטה (בלוח בקרה מימין). defocus הגדר בין -1.5 ו-2.5 מיקרומטר.
      3. יישר לחפש ומצב צילום על ידי ציור ריבוע בחלון התצוגה בזמן האמת על צג המצלמה הדיגיטלי במצב החיפוש המתאים לאזור להיות צילם במצב צילום.
      4. הקש על F3 כדי להגדיר מצב פוקוס ב100,000 הגדלה X. פוקוס תאורה כדי לכסות את שבב CCD (~ 4 - 5 סנטימטר רדיוס) ואת הציר שלא להקרין את האזור להיות צילם במצב צילום. התאם defocus ל~ -1.5 ו-2.5 מיקרומטר עם ידית FOCUS והנכון לאסטיגמציה של התמונה עם ידיות DEF / סטיג.
    5. בחר FVIII-LNT להיות צילמה במצב חיפוש באמצעות רכישת תמונות בשידור חי בחלון התצוגה בזמן האמת על מסך המצלמה הדיגיטלי. מרכז את FVIII-LNT בכיכר שצוירה על חלון התצוגה בזמן האמת.
    6. הקלט תמונה דיגיטלית על מצלמת CCD ב52,000 הגדלה X יעילה ו0.5 חשיפת שניות על ידי מעבר למצב תמונה ולחיצה על ACQUIRכפתור E על צג המצלמה מיקרוסקופ הדיגיטלי. תנאי רכישת תמונה מוגדרים כגון ריק הקורה (תריסים) הפתוח רק כאשר התמונה שנרכשה במצב צילום.
    7. בדוק את האיכות וdefocus של התמונה נרכשה על ידי לחיצה על Ctrl-F כדי להשיג Fast Fourier Transform (FFT).

3. שיקום 3D

הערה: תוכנת ניתוח תמונה המשמשת לניתוח 2D and 3D: EMAN2 וIHRSR זמינים באופן חופשי. EMAN2 ניתן להוריד מhttp://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. ניתן להשיג את תוכנת IHRSR מהפרוף Egelman: egelman@virginia.edu. חידודי IHRSR הסופיים מנוהלים על טקסס התקדם מחשוב אשכול מרכז: http://www.tacc.utexas.edu/ באוניברסיטת טקסס, אוסטין. אלגוריתם שחזור 3D מוצג באיור 1 מורכב משני שלבים עיקריים: בחירת סט אחיד של מגזרי סליל (חלקיקים) עם alignme ההתייחסות חופשית 2D הראשוןאלגוריתמי NT (RFA) מיושמים באימאן 2, שני השגת שחזור 3D מבוסס על הפרמטרים הסליל ואלגוריתמי הקרנה האחוריים התאגדו בIHRSR. הצעד הראשון מנצל את התוכניות שפותחו עבור בחירת ערכות חלקיקים הומוגני לשחזור 3D עם ספא חלקיק יחיד (אלגוריתמים) שעבורו EMAN2 פותח במיוחד והפיץ: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. צעד זה הותאם לנתונים Cryo-EM. הצעד השני מושגת עם אלגוריתם IHRSR, אשר תוכנן במיוחד עבור הסוג של מכלולי סליל שהושגו עם צורות פקטור VIII רקומביננטי. אלגוריתם זה תועד בהרחבה דרך 12 הספרות המדעית.

  1. לבצע ניתוח תמונת 2D עם חבילת EMAN2 המדעית עיבוד תמונה: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 כדי לבחור חלקיקים הומוגני סטים (מגזר סליל) לשיקום סליל.
    1. בחר micrographs Cryo-EM עם straigHT ומאורגן היטב צינורות סליל עם תוכנת מצלמה הדיגיטלית וכלים להדמיה.
    2. הפוך, לנרמל ולסנן לפיקסלים רנטגן בGUI e2workflow.py, שחזור אחיד חלקיקי אופציה (SPR): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. ייבא את התמונות הפוכות, מנורמלות ופיקסל רנטגן מסונן בGUI e2helixboxer.py. בחר צינורות סליל FVIII-LNT וקטע ב256 x 256 פיקסלים (2.9 A / Pix) עם חפיפה 90% באמצעות: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. להעריך את defocus מmicrographs המקורי ולהחיל את פונקצית העברת ניגוד תיקון (CTF) (רק תיקון שלב) למגזרי הסליל מאותו micrographs עם אפשרות e2ctf.py התאגדה בe2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
    5. ליצור חלקיקים ראשוניים (מגזרי סליל) קובע בGUI e2workflow.py - אפשרות SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
    6. לחשב ממוצעי כיתת 2D עם אלגוריתם e2refine2d.py החלת סיווג k-ממוצע התייחסות חופשית לבחור ערכות נתונים אחידות עם אותו LNT הקוטר ומידת הסדר סליל (איור 2), בעקבות התסריט: 'e2refine2d.py - iter = 8 - Naliref = 5 - nbasisfp = 8 - נתיב = r2d_001 - קלט = INPUT.hdf - ncls = 51 - simcmp = נקודה - = rotate_translate_flip simalign - classaligncmp = נקודה - classraligncmp = שלב - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = ממוצע - normproj-classkeepsig ', שינוי ערך ncls בהתאם.
      1. לסווג את הנתונים הראשוניים שנקבעו ב'ncls = 151 '150 כיתות מעל 8 חזרות עם' classkeep = 0.8 ', כלומר, חלקיקים בעלי דמיון פחות מ 80% לממוצע בכיתה אינם נכללים במעמד נתון. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. מיזוג חלקיקים מממוצעים בכיתהעם עקיפת סליל בולטת בe2display.py ליצור ערכת נתונים ביניים.
      3. לסווג את נתוני ביניים שנקבעו ב'ncls = 51 '50 כיתות להבדיל כיתות עם אותו קוטר ומידה של סדר.
      4. מיזוג חלקיקים מכיתות עם אותו קוטר ומידת הסדר בe2display.py כדי ליצור את הסט האחרון נתונים לשחזור תלת ממדי: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
  2. בצע שחזור סליל עם אלגוריתם איטרטיבי סליל נדל שיקום חלל (IHRSR), כפי שמתואר ב17 Egelman, 18.
    1. להעריך את העלייה, Δz (א) לסליל FVIII-LNT משילוב פורייה להפוך של החלקיקים בערכת הנתונים הסופי.
    2. הגדר את זווית azimuthal ΔΦ (מעלות) על ידי הפעלת חידודי IHRSR מקביל Δz קבוע, הגדלת ΔΦ מ576; ל60 ° ב 5 מעלות במרווחים.
    3. הפעל 100 מחזורי IHRSR ברציפות עבור כל הנתונים סופיים שנקבעו עם צילינדר ייחוד כנפח ראשוני ופרמטרי הסליל הראשוניים Δz וΔΦ כהגדרתו ב3.2.1. ו3.2.2.
    4. בדוק את הכמויות הסופיות להתכנסות של הפרמטרים סליל והתכתבות בין ממוצעי כיתה מסיווג 2D של ערכת הנתונים הסופית והתחזיות משיקום IHRSR הסופי.
    5. להטיל סימטריה ל3D השחזורים הסופיים, המקביל להפצת היחידה סימטרית נצפתה בכרכי 3D סימטריים הסופיים: פי 4 לFVIII-LNT אדם ופי 5 לFVIII-LNT החזיריות. הפעל עוד 100 מחזורי עידון ליצור שחזור 3D symmetrized סופי.
    6. חשב את עקומת המתאם פורייה המעטפת לשני כרכים על ידי ההפרדה הראשונה נתונים המקביל שנקבעו במוזר ואפילו: 'e2proc2d.py <infile> <outfilדואר> - פיצול = 2 '. ואז להריץ 100 IHRSR חידודים ברציפות כפי שמתואר ב3.2.3. לחשב את FSC של כרכי 3D שנוצרו ממערכי הנתונים מוזרים ואפילו: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
  3. דמיינו ומגזר כרכי FVIII-LNT בקליפורניה בסן פרנסיסקו הכימרה.
    1. פתח את הכרכים הסופיים מהצעד 3.2.5. בקליפורניה בסן פרנסיסקו כימרה ולהגדיר את רמת מתאר ל0.005 בכלים> נתוני נפח> אפשרות VIEWER נפח.
    2. בכלים> נתוני נפח> MAP מגזר, נפח בחר בכרטיסיית MAP מגזר ולחץ על מגזר למגזר את עוצמת הקול.
    3. מגזרי קבוצה מתאימים לתא יחידה אחת על ידי בחירה עם CTRL + SHIFT וקבוצת לחיצה.
    4. צבע את הפלחים על ידי תא יחידה וסליל עם פעולות> אפשרות צבע כדי להדגיש את התכונות המבניות.

4. אלקטרונים טומוגרפיה

  1. לדוגמא הכנת FVIII-LNT צבעונית שלילי
      <li> הכן דגימות FVIII-LNT כלניסויי Cryo-EM.
    1. זוהר פולט רשת מצופה פחם 300 רשת נחושת (עד צד פחמן) בתערובת של O 2 ו-H 2 גז ל10 שניות ב50 W כמו לניסויי Cryo-EM.
    2. החל ירידה של 2.5 השעיה FVIII-LNT μl עם חלקיקי זהב colloidal 6 ננומטר לרשת, למחוק את הנוזל העודף ולהכתים באופן שלילי על ידי יישום פתרון 5 μl 1% אצטט uranyl למשך 2 דקות. למחוק את הנוזל והאוויר העודפים לייבש את הרשת.
  2. אוסף נתונים אלקטרונים טומוגרפיה
    1. להעביר את הרשת לבעל הטיה אחת.
    2. העבר את המחזיק במיקרוסקופ האלקטרונים.
    3. סדרה להטות לאסוף באופן אוטומטי עם תוכנת SerialEM 19 ב2 ° מרווחים מעל טווח הזוויתי של -60 ° ל+60 תמונות ° ולהקליט עם מצלמת CCD ב52,000 X ההגדלה אפקטיבית, -6 ל-10 defocus מיקרומטר ומינון אלקטרונים 150 של - 170 ele2 · s לכל tomogram ctrons / a.
  3. אלקטרונים טומוגרפיה שחזור FVIII-LNT
    הערה: בנייה מחדש של הסדרה מוטה pFVIII-LNT וhFVIII-LNT נרכשה ב4.2. עם אפשרות ETomo של תוכנת IMOD הבאה ההדרכה: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
    1. שימוש בחלון מסוף, פותח את tomogram ב3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
    2. סל tomogram ידי 4 עם BINVOL IMOD הפקודה כדי להקטין את הגודל של tomogram.
    3. בחר את הזווית הנכונה כדי לסובב את Nanotube השומנים בדם לאורך ציר ה-Y בtomogram זרקת לפח באמצעות פקודת IMOD ROTATEVOL.
    4. סובב את tomogram המלא עם פיקוד IMOD ROTATEVOL.
    5. לחתוך את Nanotube השומנים שנבחר בכיוון לאורך ציר Y עם פקודת שינוי גודל CLIP IMOD.
    6. פתח את תת tomogram הקצוץ עם 3DMOD.
    7. לחץ על tomogram לדמיין את הסידור של מולקולות פקטור VIII יחדפרוסות בציר ה-Z ולאורך ציר ה-Y בתת tomogram הנפח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנושי רקומביננטי וFVIII חזירי אורגנו בהצלחה על helically טעון שלילי LNT bilayer יחידה, שמזכירים את משטח טסיות הדם מופעל. ארגון הסליל של האדם והחזירי FVIII-LNT היה עקבי דרך micrographs הדיגיטלי שנאסף (איור 2). LNT השליטה והאנושית וצינורות סליל FVIII-LNT חזיריות נבחרו ומפולח עם GUI e2helixboxer.py וערכות נתונים ראשוניים שנוצרו עם GUI e2workflow.py, אפשרות חלקיקים בודדת (טבלת 1).

כדי הסליל של אדם הקרום הנכנס וFVIII-LNT חזירית הוערך מההתמרה של ממוצעי הכיתה עם GUI e2display.py (EMAN2) (איור 3). Bilayer השומנים בממוצעי כיתת 2D LNT השליטה הטובים ביותר מוגדר היטב. העלון הפנימי וחיצוני והצפיפות נמוכה יותר של הליבה הידרופובי הקרום נראה בבירור ( (3B דמויות ו3 ג). התפנית בולטת יותר לצינורות סליל FVIII-LNT אדם מצביעה על כך שחלבוני האינטראקציות בין מולקולות FVIII קרום הנכנס הסמוכות שונות באופן עקבי לצורות שני FVIII (3B דמויות ו3 ג). חלקיקים מממוצעים בכיתה מראה ארגון טוב סליל (דפוס עקיפה סליל) מוזגו בGUI e2display.py כדי ליצור קבוצת ביניים חלקיקים (טבלת 1). חלקיקים מקבוצות חלקיקי ביניים סווגו שוב ב50 כיתות עם אותו האילוצים. חלקיקים מממוצעים בכיתה עם אותו הקוטר מוזגו בנתונים הסופייםסטים (טבלה 1).

שחזורי 3D ראשוניים לFVIII-LNT האנושית והחזירית בוצעו עם 1,000 חלקיקי נציג האנושי הסופיות וערכות נתונים FVIII-LNT חזיריות. מאה חזרות IHRSR רצופות היו לרוץ לכל שחזור 3D עם צילינדר ייחוד (160 Å פנימי ו500 קוטר חיצוני א), כנפח ראשוני. העלייה צירית (Δz) מחושבת משילוב פורייה להפוך ממגזרי הסליל (חלקיקים מוגדרים) שווה ל41 לFVIII-LNT אדם ו36 Å לFVIII-LNT חזירית (4A ומספרים 4 ב). הזווית הראשונית azimuthal (ΔΦ) המוגדרת מחיפוש איטרטיבי מוערכת ב40.0 ° לFVIII-LNT אדם וב35.0 ° לFVIII-LNT החזיריות. הכרכים הסופיים נבדקים להתכנסות של הפרמטרים סליל והתכתבות בין ממוצעי כיתה ותחזיות מreconstr הסופיuction, גם בעקבות הקריטריונים שמתוארים ב 5. 3D השחזורים שנבחרו ומתאים פרמטרים סליל מוטלים כאמצעי אחסון ראשוני ופרמטרי סליל ראשוניים לעידון IHRSR שני של 100 מחזורים שהתכנסו לארגון סליל ארבעה להתחיל לFVIII-LNT האנושית עם Δz = 41.1 Å וΔΦ = 42.0 ° וארגון סליל חמש להתחיל לFVIII-LNT החזיריות עם Δz = 35.5 Å וΔΦ = 34.8 °. סופיות 100 IHRSR חזרות הטלת פי 4 וסימטרית סליל פי 5 לאדם ושחזורי FVIII-LNT חזיריות בהתאמה מתבצעות עם אמצעי אחסון ראשוני ופרמטרי סליל מתאימים מחידודי IHRSR סימטריים האחרונים (4C דמויות ו4D). הכרכים הסופיים מראים 8 FVIII אדם ו10 מולקולות קרום הנכנס חזיריות FVIII המאורגן סביב ציר הסליל (איור 5 א). כל אדםמולקולת FVIII מתורגמת 41.2 Å ומסובב 42.0 ° מהקודם וכל מולקולת FVIII חזירית מתורגמת 35.9 Å ומסובב 35.2 º מקודמו, המקביל לפרמטרי הסליל של השחזורים הסופיים 3D (איור 5).

Tomograms האלקטרונים המשוחזר לאשר את ההבדל בארגון הסליל בין FVIII-LNT האנושית והחזירית שהושגה באותם תנאי הניסוי. השוואה בין ההשקפות העליונה מtomograms שוחזר וכרכי 3D משיקום הסליל שנצפו בכיוון ניצבת לציר הסליל, נוסף מאמתת את נכונותו של 3D השחזורים מעודנים עם הפרמטרים סליל IHRSR (איור 6). ממדי התא היחידה 2D סימטרי לשיקום FVIII-LNT 3D האדם הם: = 17.8 ננומטר, ב = 8.2, γ = 84 ° ולשיקום FVIII-LNT 3D חזירי: =18.4, b = 7.2 וγ = 70 ° (איור 6). ממדי התא היחידה של FVIII האנושי מאורגן בגבישים 2D קרום הנכנס הם: = 8.1, b = 7.0 וγ = 67 º, אשר תואם את השטח המכוסה על ידי מולקולת FVIII אחד שנצפו לכיוון קרום הקרקע 20. השוואת ממדי התא היחידה בין FVIII המאורגן ב2D וגבישי סליל מצביעה על כך שגם אדם ומולקולות FVIII חזיריים יוצרים הדימרים כאשר מאורגן helically על פני השטח LNT.

איור 1
איור 1. תרשים זרימת ניתוח מבנה. הצעדים אחריו לניתוח סיווג 2D המבוסס על אלגוריתמי יישור התייחסות חופשית מיושמים בEMAN2 16 הם הקיפו בכחול. הצעדים אחריו לניתוח 3D שבוצע עם אמיתי סליל איטרטיבי אלגוריתמי שיקום החלל (IHRSR) הם מוקפים בעיגול אדום. מחזורי IHRSR איטרטיבי מסומנים עם חצים מקווקוים.

איור 2
איור 2. Micrographs Cryo-EM הדיגיטלי. (4,096 x 4,096 פיקסלים, 2.9 A / Pix) של צינורות שומנים (LNT) עם ובלי FVIII המאוגד. א הבקרה LNT. B. האדם FVIII-LNT. ג בשר חזירים FVIII-LNT . קצו של החור בסרט פחמן שבFVIII-LNT מושעה בקרח אמורפי מצויינים עם כוכב לבן. צפיפות החלבון ושומנים בדם הן בצבע שחור. הנופים מוגדלים (ריבועי) של 512 x 512 קצוצים אזורים (לבן מקווקו מרובע) להמחיש את ההבדל בארגון הסליל של האדם וFVIII חזירי, בהתאמה. סרגל קנה המידה הוא 100 ננומטר.ig2highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. ממוצעי הנציג 2D כיתה (שורה העליונה) והתמרות מקבילות פורייה (בשורה תחתונה) מסטי חלקיקי ביניים (טבלת 1) סווגו ב50 כיתות. א בקרת LNT B. האדם FVIII-LNT ג בשר חזירים FVIII-LNT. מספר הכיתה ומספר החלקיקים הכלולים בכל כיתה מצוין. ההבדל במטרה סליל בין FVIII האנושי והחזירי נראה בבירור בתמונות ואושר על ידי דפוסי התאבכות המתקבלים מהפורה הופך לתמונות האלה. אנא לחץ כאן לצפייהגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. שחזורי סליל 3D של אדם והחזירי FVIII-LNT. א המשולב התמרת מ1,000 מגזרי סליל. שורת השכבה הראשונה ושנייה מרוכזות ב1/82 Å -1 ו1/41 Å -1 לאדם FVIII-LNT, וב1/72 Å -1 ו1/36 Å -1 לחזירית FVIII-LNT (לבן חיצים). הייצוג ב Surface של אדם בורוד (Δz = 41.1 Å, ΔΦ = 42.0 מעלות) וחזירי בכחול (Δz = 35.9 Å, ΔΦ = 35.2 º) שחזורי סליל FVIII-LNT 3D. שני הכרכים מוצגים ברמת מתאר 0.005 (צפיפות מינימאלית היא 0 וצפיפות מקסימלית 0.02, כפי שמחושבת בקליפורניה בסן פרנסיסקו פעמוןra, אפשרות הצופה נפח 21). אורכו של צינור FVIII-LNT הוא 256 פיקסלים ב2.9 A / pix. מתאם ג פורייה מעטה (FSC) מגרשים לאנושיים והחזירית FVIII-LNT מראה רזולוציה של 20.5 Å בFSC = 0.5.

איור 5
איור 5. ארגון סליל של FVIII-LNT. ייצוג פני השטח מקוטע אנושי וחזירי של שחזורים אנושיים וחזיריים FVIII-LNT סליל, המוצגים באיור 4. הכרכים מפולחים לאחר הטלת סימטריה של פי 4 לFVIII-LNT האדם והסימטריה פי 5 לFVIII-LNT החזיריות. היחידות סימטריות בצבע מקודדות צהובה אדומה לFVIII-LNT האדם וכחול ירוק לצפיות FVIII-LNT. א החזיריים לאורך ציר הסליל מצויינים עם ריבוע לאדם וכמומחומש לFVIII-LNT החזיריות. מבנה FVIII-LNT האדם מציג 8 מולקולות מאורגנות סביב קרום LNT החיצוני ומבנה FVIII חזירי תערוכות 10 מולקולות מאורגנות סביב קרום LNT החיצוני, שמסומנות במספרים. צפיות ב 'בניצב לציר הסליל. FVIII-LNT האנושית היא מבנה סליל 4 הזנק וFVIII-LNT החזיריות היא מבנה סליל 5-להתחיל. סלילים מתחילים אדם אחד מסומנים במספרים ובמקודדים בצבע. יש לנו הדגשתי אחד מהסלילים מכל מבנה עם (*) וקווים ירוקים. סרגל קנה המידה הוא 20 ננומטר.

איור 6
איור 6. השוואה בין שחזורי הסליל וטומוגרפיה 3D. האדם FVIII-LNT () ושחזורי 3D סליל FVIII-LNT (C) חזיריים מוצגות perpendicular על ציר הסליל. כל תא יחידה וסלילים בודדים כמו באיור בצבעים 5. ב '. ו-D. הם ייצוגי צפיפות של שחזורי טומוגרפיה 3D, שנצפו בניצב לציר הסליל. סריג 2D המשקף את הסדר הסליל של מולקולות FVIII מוצג עם קווים ירוקים.

דוגמאות cLNT hFVIII-LNT pFVIII-LNT
Micrographs הראשוני 61 474 542
ערכות חלקיקים ראשוניות 29,113 60395 64,665
Defocus (ננומטר) -4051 ± 502 -3643 ± 737 -3443 ± 1,086
ערכות חלקיקים ביניים 25,907 27,305 22,773
ערכות חלקיקים סופיות 25,907 10,455 10,430

טבלת 1. סטטיסטיקת ניתוח 2D הבאה האלגוריתם שהוצג בתרשים הזרימה באיור 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבודה זו המתודולוגיה מוצגת להבחין בין שני ארגוני קרום הנכנס של חלבונים הומולוגיים מאוד: FVIII האנושי והחזירי בצינורות שומנים בדם בתנאים נתקלו בגוף האדם התאספו עצמי.

בהליך המתואר, אנושי וחזירי FVIII מאורגן בהצלחה helically על צינורות שומנים בדם, המהווים את השלב הקריטי ביותר. השלב הקריטי הבא הוא לשמר את הדגימה בקרח אמורפי דק על ידי הבזק הקפאה בנוזל N ליד 2 טמפרטורה. שימור הדגימה בטמפרטורת קרח וLN2 אמורפי שומר על צינורות סליל התייבשות ומכלולי macromolecular חלבון שומנים פעילים מבחינה פיזיולוגית. השלב הקריטי הסופי רכישת נתונים Cryo-EM בכמות ובאיכות מספיקות למבנה 3D ברזולוציה גבוהה בטמפרטורת LN2 קרובה. איסוף נתונים בטמפרטורת LN2 קרוב עוד יותר מונע התייבשות של המדגם בגבוה vacuum נזק מיקרוסקופ וקרינה מקרן האלקטרונים.

כדי לחשב את מבנה הקרום הנכנס של FVIII הצעד הקריטי הראשון הוא להשיג חלקיקים הומוגני (מגזרי סליל) סטים ידי החלת סיווג בחינם התייחסות 2D ולשלב חלקיקים מכיתות עם אותו הקוטר ומידה של סדר. השלב הקריטי השני הוא להטיל את אמצעי האחסון ראשוני ופרמטרי סליל (עלייה וזווית azimuthal) לשיקום הסליל. השלב הקריטי השלישי והאחרון הוא לאמת את מבנה הסליל על ידי השוואת מפות 3D מתקבלות על ידי טומוגרפיה הסליל ואלקטרונים (ללא סימטריה שהוטלה) שחזורים של אותה הדגימה.

המתודולוגיה שהוצגה היא ייחודית ביכולתה לפתור את המבנה התפקודי של חלבוני קרום הקשורים בתנאים פיסיולוגיים קרובים. LNT שפותחה במעבדה שלנו יכולה להיותשימש בהצלחה כפלטפורמה לארגון סליל של גורמי קרישת דם קרום הנכנס פונקציונליים ולהשיג רזולוציה טובה יותר מאשר לFVIII המאורגן בגבישים 2D קרום הנכנס וכמו חלקיקים בודדים. המטרה שלנו היא להגדיל עוד יותר את הרזולוציה של שחזורי הסליל שלנו על ידי שיפור האחידות והאיכות של קבוצות החלקיקים הסופיות. איסוף יותר micrographs Cryo-EM בתנאים טובים יותר Cryo-EM (אקדח פליטת שדה, מסנן אנרגיה, גלאי מצלמה DE) של חוטי סליל FVIII-LNT ולכן כוללים ערכות חלקיקים ראשוניות גדולות יותר לשיקום 2D יהיה להשיג זאת. שיפור ההרכבה סליל FVIII-LNT ואלגוריתמי שחזור 3D יאפשר לנו להשיג תת ננומטר וליד רזולוציה אטומית, אשר באופן חד משמעי להגדיר את ארגון הקרום הנכנס של זה קריטי לחלבון קרישת דם.

גם ארגון צורות FVIII helically הומולוגיות נותן לנו את opportunity לאפיין איך הבדל ברצף יכול לתאם להבדלים במבנה ותפקוד. פתרון מבני קרום הנכנס האנושיים וחזיריים FVIII ידי השיטות מתוארות במאמר זה יכול לעזור לזהות את הרצפים, שכאשר הותאמו ישפר את תפקוד FVIII רקומביננטי. ידע זה יהיה השלכות קליניות משמעותיות לגילוי סמים בשני השדות פקקת וhemostasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה, והם יכולים להיות קשר ישיר לגבי כל הנהלים שפורסמו בכתב היד הזה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק לאומי למדען לפיתוח מאיגוד הלב האמריקאי: 10SDG3500034 וUTMB-NCB להתחיל את הכספים לSSM. המחברים מודים מתקני Cryo-EM ומדעי מחשוב במרכז Sealy לביולוגיה מבנית בUTMB (www.scsb.utmb.edu), כמו גם בני הזוג. סטיב Ludtke ואד Egelman לעזרה עם אלגוריתמי שיקום סליל 2D and 3D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM2100 with LaB6 JEOL Ltd. JEM-2100 operated at 200 kV
with TEMCON software JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder Gatan, Inc. 626.DH cooled to -175 °C
with temperature controler unit Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera Gatan, Inc. US4000 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV FEI
Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid Ted Pella 01821 plasma cleaned for 10 sec on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh Electron Microscopy Sciences Q225-CR2 Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes 
Uranyl acetate dihydrate Ted Pella 19481 1% solution, filtered
Galactosyl ceramide Avanti Polar Lipids Inc. 860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids Inc. 840035
EM software Digital Micrograph Gatan, Inc. http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN free download http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
EM software Spider free download http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR free download Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD) free download http://bio3d.colorado.edu/imod/ 
EM software (SerialEM) free download ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera free download http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
  2. Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
  3. Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
  4. Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
  5. Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. (2013).
  6. Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
  7. Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
  8. Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
  9. Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
  10. Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
  11. Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
  12. Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
  13. Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
  14. Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
  15. Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
  16. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
  17. Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
  18. Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
  20. Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
  21. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics