Винтовая Организация свертывания крови фактора VIII на липидный нанотрубок

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Мы представляем сочетание крио-электронной микроскопии, липидов нанотехнологии и структурного анализа применяется для решения мембраносвязанное структуру двух весьма гомологичных FVIII формах: человека и свиньи. Методология, разработанная в нашей лаборатории, чтобы спирально организовать две функциональные рекомбинантные формы FVIII на отрицательно заряженных липидных нанотрубок (LNT) описывается.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Miller, J., Dalm, D., Koyfman, A. Y., Grushin, K., Stoilova-McPhie, S. Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes. J. Vis. Exp. (88), e51254, doi:10.3791/51254 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Крио-электронной микроскопии (Крио-EM) 1 является мощным подход исследовать функциональную структуру белков и комплексов в гидратной государственной и мембранной среды 2.

Фактор свертывания крови VIII (фактора VIII) 3 многодоменный плазмы крови гликопротеин. Дефект или недостаток фактора VIII является причиной гемофилии типа А - тяжелое расстройство кровотечения. По протеолитической активации фактора VIII связывается с серинпротеазы Фактор IXa на отрицательно заряженной мембраны тромбоцитов, которая имеет решающее значение для нормального свертывания крови 4. Несмотря на ключевую роль фактора VIII играет в коагуляции, структурная информация для его мембраносвязанного государства является неполной 5. Рекомбинантный FVIII концентрат является наиболее эффективным средством против типа гемофилии А и коммерчески доступны FVIII может быть выражена как человека или свиньи, как при формировании функциональных комплексов с человеческим фактором IXa 6,7.

"> В этом исследовании мы представляем сочетание крио-электронной микроскопии (Крио-EM), липидов нанотехнологии и структурный анализ применяется для решения мембраносвязанное структуру двух весьма гомологичных форм фактора VIII:. Человеческий и свиной Методология, разработанная в нашей лаборатории на спирально организовать две функциональные рекомбинантные формы FVIII на отрицательно заряженных липидных нанотрубок (LNT) описывается. Представительные результаты показывают, что наш подход является достаточно чувствительным, чтобы определить различия в спиральной организации между ними высоко гомологичны в последовательности (идентичность последовательности 86% ) белки. Подробные протоколы для спиральной организации, Cryo-EM и электронной томографии (ET) сбора данных приведены. двумерной (2D) и трехмерной (3D) структурный анализ применяется для получения 3D-реконструкций человека и свиньи фактора VIII-LNT обсуждается. Представленные человека и свиньи структуры фактора VIII-LNT показать потенциал предлагаемой методологии для вычисэ функционал, связанный с мембраной организация свертывания крови фактора VIII с высоким разрешением.

Introduction

Фактор свертывания крови VIII (FVIII) является большой гликопротеин 2332 аминокислот, организованных в шесть областей: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. После активации тромбин FVIII действует как кофактор к фактору IXa в связанной с мембраной Тэнасе комплекса. Связывание активированного фактора VIII (FVIIIa) в FIXa в мембранный-зависимости образом повышает FIXa эффективность указанных протеолитических более 10 5 раз, что имеет решающее значение для эффективного свертывания крови 4. Несмотря на важную роль фактора VIII играет в коагуляции и образования комплекса Тэнасе, функциональная мембраносвязанный структура фактора VIII до сих пор не решен.

Для решения этой проблемы, одиночные липидного бислоя нанотрубки (LNT), богатые фосфатидилсерином (PS), способные связываться FVIII с высоким сродством 8, 9 и напоминающие поверхности активированных тромбоцитов были разработаны 10. Последовательный винтовая организация фактора VIII обязаны LNT было доказано быть эффективнойве для структуры определения фактора VIII мембраносвязанного государства по Cryo-EM 5. Функционализированный LNT являются идеальной системой для изучения белок-белковых и белок-мембрана взаимодействия спирально организованных мембранных белков, ассоциированных с Cryo-EM 11, 12. Криогенная EM имеет преимущество по сравнению с традиционными структурных методов, таких как рентгеновской кристаллографии и ЯМР, как образец сохраняется в ближайший к физиологической среде (буфер, мембраны, Ph), без добавок и изотопов. В случае фактора VIII, изучая мембраносвязанное структуру с этой техникой еще более физиологически значимым, так как LNT сильно напоминают по размеру, форме и составу псевдоподий из активированных тромбоцитов, где Тэнасе комплексы собирают в естественных условиях.

Дефекты и дефицит фактора VIII причины гемофилии А, тяжелым расстройством кровотечения, влияющих 1 в 5000 самцов человеческой популяции 4, 6. Наиболее еffective терапия для гемофилии А является пожизненное администрация рекомбинантного человеческого фактора VIII (hFVIII). Значительное осложнение рекомбинантного фактора VIII Гемофилия А терапии является развитие ингибирующих антител к человеческой форме, влияющих около 30% больных гемофилией А 13. В этом случае свиной FVIII (pFVIII) концентрат используется, как свиньи FVIII отображает низкой перекрестной реактивностью с ингибирующих антител против человеческого фактора VIII и форм функциональные комплексы с человеческим FIXa 7. Установление мембраносвязанное организацию как свиньи и форм человеческих FVIII важно понимать структурную основу функции кофактора фактора VIII и последствия для гемостаза крови.

В этом исследовании мы описываем сочетание липидов нанотехнологии, Cryo-EM и структурного анализа разработан, чтобы решить мембраносвязанное организацию двух весьма гомологичных форм фактора VIII. Представленные данные Крио-EM и 3D структуры для спирально организованной Porciпе и человеческого фактора VIII на отрицательно заряженной LNT показать потенциал предлагаемой нанотехнологии как основы для структуры определения фактора VIII и связанных с мембраной факторов и комплексов в физиологической среде мембраны коагуляции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка образца

  1. Буфер обмена человеческого фактора VIII-BDD 14 и свиной FVIII-BDD 15 против HBS-Ca буфера (20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl 2, рН = 7,4) и концентрируют до 1,2 мг / мл. Держите белкового раствора при температуре -80 ° С.
  2. Подготовка липидов нанотрубок (LNT) путем смешивания GalactosylCeramide (GC) и фосфатидилсерин (PS) в 1:04 в / в соотношении в хлороформом. Упаривают хлороформ в атмосфере аргона и солюбилизации липидов в HBS буфере до 1 мг / мл. Держите LNT решение при 4 ° С.

2. Крио-электронной микроскопии фактора VIII-LNT

  1. Крио-ЭМ Подготовка образцов
    1. Тлеющий разряд 300 сетка Quantifoil R2 / 2 медных сетей (побочные углерода до) в смеси O 2 и H 2 газа в течение 10 сек при 50 W.
    2. Смешайте растворы FVIII и LNT в HBS-буфере Ca в 1:01 вес / вес отношение и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
    3. Нанесите каплю 2,5 мклиз фактора VIII-LNT образца с гидрофильным электронной микроскопии сетки в Vitrobot Mark IV влажной камере (100% влажности).
    4. Клякса и флэш заморозить сетку (один пятно в течение 3,5 сек, промокните силу 1) в жидком C 2 H 6, охлаждается жидким N 2, чтобы получить аморфный лед.
    5. Храните сетки в ящики для хранения в жидком N 2 (LN2).
  2. Крио-ЭМ сбора данных
    ПРИМЕЧАНИЕ: JEM2100-LaB6 (2010 год) оснащен операционной системой TEMCON, состоящей из компьютера, подключенного к электронным микроскопом, экраном с окнами чтения вакуумную систему, систему освещения, HT, объектив токи и так на и два панели: с обеих сторон, размещены по обе стороны колонны. Сдвиг луч X, Y ручки (SHIFT Y, SIFT Y) и многофункциональные (DEF / STIG) ручки находятся на обеих панелях. На левой панели находится регулятор освещения (BRIGTHNESS). На правой панели расположены: увеличение (МАГ / CAM длина) и фокусировки (Фокус) ручки и три Imaginг (MAG1, MAG2, LOWMAG) и дифракционной (DIFF) кнопки режимов. Мы приобретаем наши данные в MAG1 на альфа-2. Минимальная доза условия освещения (MDS), необходимые для сбора данных Крио-EM устанавливаются с F1 до F6 кнопок, верхнем ряду на правой панели. В этом протоколе используются общие настройки: F1 - поднять / опустить экран, F2 - режим поиска, F3 - режим фокусировки, F4 - Режим ФОТО, F5 - MDS OFF / ON и F6 - ЛУЧ ПУСТО, используются для защиты образца от радиации повредить, отклоняя луч.
    1. Поместите Крио-держатель в крио-станции и наполнять сосуд Дьюара держателя и крио-станции с LN2. Когда температура достигает -192 ° C, открытый затвор на кончике держателя, место ранее заморожены Крио-EM сетки в отведенном для этого месте и закрепите с кольцевой зажим.
    2. Вставьте крио-держатель в электронном микроскопе. Заполните Дьюара в крио-держателем и анти-загрязнитель камеры с LN2. Подождите, пока держатель для стабилизации в течение 30-60 мин. Нажмите F6, иповерните нить на. Когда нить насыщенный, нажмите F6 и откройте затвор на держатель, чтобы посмотреть в сетку.
    3. Пресс Низкий Mag / альфа-1 (установлен на уровне 200X MAG) и размещает места тонким льдом на сетке.
    4. Перейти к MAG 1/alpha 2 установить минимальную дозу режим (MDS) и получать данные Крио-EM при низких электронных дозах, не повреждая образца.
      1. Нажмите F2, чтобы установить режим поиска. Установите увеличение в 40000 х. Увеличить пучок с BRIGTNESS ручки к минимальной дозе электронного ~ 0,04 э - / A 2 · с. Пресс DIFF для переключения в режим дифракции. Установите длину камеры до 120 см с ручкой МАГ / CAM длина. Найдите области на сетке в пределах предварительно выбранных районов в LOWMAG которые имеют липидные нанотрубки в отверстия углеродной пленки.
      2. Нажмите F4, чтобы установить режим фото при 40000-кратном увеличении и установить освещение с яркостью ручки в дозах 16-25 е - / A 2 · с. Нажмите кнопку Стандартный фокус установить фокус условия регулировки Z-высотаобразца с Z вверх / вниз (панель П контроль). Установите расфокусировки от -1,5 до -2,5 мкм.
      3. Совместите ПОИСК и режим ФОТО рисуя квадрат в окне Live View на цифровом мониторе фотокамеры в режим поиска соответствующей области для включения в образ в режиме фотосъемки.
      4. Нажмите F3, чтобы установить режим фокусировки при 100000-кратном увеличении. Фокус освещение для покрытия чип CCD (~ 4 - 5 Радиус см) и от оси не облучать область, которая будет отображается в режиме PHOTO. Отрегулируйте расфокусировки до ~ -1.5 и -2.5 мкм с FOCUS ручкой и правильным для астигматизма изображения с DEF / Стиг ручек.
    5. Выберите фактора VIII-LNT для включения в образ в режим поиска путем приобретения изображения в реальном времени в окне Live View на цифровом мониторе фотокамеры. Сосредоточьте фактора VIII-LNT на площади нарисованного на окне Live View.
    6. Запись цифрового изображения на ПЗС-камеры на 52000 X эффективного увеличения и 0,5 воздействия сек за счет перехода в режим Фото и нажав обретенияE кнопку на цифровой микрофотографии мониторе фотокамеры. Условия получения изображения устанавливаются такие как луч заготовки (жалюзи) открытой только тогда, когда образ приобрел в режиме фотосъемки.
    7. Проверьте качество и расфокусировки полученного изображения, нажав CTRL-F для получения быстрого преобразования Фурье (БПФ).

3. 3D Реконструкция

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа изображений используются для 2D и 3D анализа: EMAN2 и IHRSR находятся в свободном доступе. EMAN2 можно загрузить с http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. Программное обеспечение IHRSR можно получить от профессора Egelman: egelman@virginia.edu. Окончательные уточнения IHRSR запускаются на Техас расширенный Computing Center кластер: http://www.tacc.utexas.edu/ в Университете Техаса, Остин. Алгоритм восстановления 3D показано на рисунке 1 состоит из двух основных этапов: Первый выбора гомогенной набор спиральных сегментов (частиц) с эталонным бесплатно alignme 2Dнт (RFA) алгоритмы реализованы в EMAN 2, второй достижения 3D-реконструкция на основе винтовых параметров и обратно алгоритмов проекционных включены в IHRSR. Первый шаг использует программы, разработанные для выбора однородных наборов частиц для 3D реконструкции с одиночной SPA частиц (алгоритмов), на которые EMAN2 был специально разрабатываются и распространяются: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Этот шаг был адаптирован к данным Крио-ЭМ. Второй шаг достигается с помощью алгоритма IHRSR, который специально предназначен для данного типа винтовых агрегатов, полученных с рекомбинантных форм фактора VIII. Этот алгоритм был документально по разным странам через научной литературе 12.

  1. Выполнить анализ 2D изображения с EMAN2 научной обработки изображений пакет: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16, чтобы выбрать однородную частицу (винтовая сегмент) Наборы для спиральной реконструкции.
    1. Выберите Крио-EM микрофотографии с straigHT и хорошо организованной спиральные трубки с цифровым программным обеспечением камеры и средств визуализации.
    2. Обратить, нормализуют и фильтр для рентгеновских пикселей в e2workflow.py GUI, реконструкции одной частицы опции (SPR): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. Импорт перевернутые, нормированные и рентгеновской пикселей отфильтрованные изображения в e2helixboxer.py GUI. Выберите фактора VIII-LNT спиральные трубки и сегмент в 256 х 256 пикселей (2.9 A / PIX) с 90% перекрытием с помощью: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. Оцените расфокусировки от оригинальных снимках и применять контрастный передаточную функцию (CTF) коррекции (только фаза коррекции) в спиральных сегментов из тех же снимках с e2ctf.py опции включены в e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
    5. Создать начальные частицы (спиральные сегменты) устанавливает в e2workflow.py GUI - SPR вариант: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
    6. Рассчитать средние 2D класса с алгоритм e2refine2d.py применения опорного бесплатно K-среднее классификацию, чтобы выбрать однородных наборов данных с тем же LNT диаметра и степени винтовой порядке (рис. 2), после сценария: 'e2refine2d.py - ИТЭР = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - путь = r2d_001 - вход = INPUT.hdf - NCLs = 51 - simcmp = точка - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = точка - classraligncmp = фаза - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = средняя - normproj-classkeepsig ', изменение NCLs значение соответственно.
      1. Оцените начальные установленные в 150 классов »NCLs = 151" более 8 итераций с "classkeep = 0,8 'данные, а это означает, что частицы с менее 80% сходства с в среднем классе, исключаются из данного класса. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Слияние частиц из средних классовс ярко выраженным спиральным дифракции в e2display.py создать промежуточный набор данных.
      3. Классифицировать промежуточные данные, установленные в 50 классов »NCLs = 51", чтобы дифференцировать классы с таким же диаметром и степени упорядоченности.
      4. Слияние частиц из классов с таким же диаметром и степени упорядоченности e2display.py создать окончательный набор данных для трехмерной реконструкции: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
  2. Выполните спиральную реконструкции с Итерационное Винтовая реальном пространстве Реконструкция (IHRSR) алгоритма, как описано в Egelman 17, 18.
    1. Оцените рост, DZ (а) спирали фактора VIII-LNT из объединенного преобразования Фурье из частиц в конечном наборе данных.
    2. Определите азимутальный угол ΔΦ (º), запустив параллельные уточнения IHRSR с постоянным Δz, увеличивая ΔΦ от 576; до 60 ° с шагом 5 °.
    3. Запустите 100 последовательных IHRSR циклов для каждого конечного набора данных с безликой цилиндра в качестве начального объема и начальных винтовых параметров Δz и ΔΦ, как определено в 3.2.1. и 3.2.2.
    4. Осмотрите окончательные объемы сходимости винтовых параметров и переписки между класса средних с 2D классификации окончательного набора данных и проекций от окончательного реконструкции IHRSR.
    5. Накладывают симметрию в конечные 3D реконструкции, соответствующие асимметричным распределением единичной наблюдаемого в конечных объемах асимметричных 3D: 4-кратный для человеческого фактора VIII-LNT и 5-кратное для свиного фактора VIII-LNT. Запустите еще 100 циклов уточнения для формирования окончательного симметризованное 3D-реконструкция.
    6. Рассчитайте корреляционная кривая Фурье Shell для обоих томов, сначала отделяя соответствующие установленные в четные и нечетные данные: 'e2proc2d.py <infile> <outfilе> - сплит = 2 '. Затем запустите 100 IHRSR уточнения последовательных, как описано в пункте 3.2.3. Рассчитайте FSC из 3D томах, созданных из четных и нечетных наборов данных: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
  3. Визуализация и сегмент объемы фактора VIII-LNT в UCSF химеры.
    1. Откройте окончательные объемы, начиная с шага 3.2.5. в UCSF Химеры и установить уровень контура до 0,005 в Инструменты> объем данных> параметр программы просмотра VOLUME.
    2. В Сервис> объем данных> СЕГМЕНТ MAP, выберите объем в закладке отображения сегмента и нажмите сегмента к сегменту громкости.
    3. Сегменты Группа, соответствующая одной элементарной ячейки, выбрав с CTRL + SHIFT и нажав группы.
    4. Цвет сегменты по элементарной ячейки и спирали с Действия> цветной вариант, чтобы подчеркнуть особенности строения.

4. Электронной томографии

  1. Отрицательно Витражи фактора VIII-LNT Подготовка образцов
      <литий> Подготовка образцов фактора VIII-LNT как для экспериментов Крио-ЭМ.
    1. Тлеющего разряда углерода покрытием 300-сетки медную сетку (со стороны углерода вверх) в смеси O 2 и H 2 газа в течение 10 сек при 50 Вт, как для Крио-ЭМ экспериментов.
    2. Нанесите каплю 2,5 мкл фактора VIII-LNT подвески с 6-нм коллоидных наночастиц золота в сетке, промокните излишки жидкости и отрицательно пятно с применением 5 мкл 1% уранилацетатом решение в течение 2 мин. Промокните лишнюю жидкость и воздух сухой сетку.
  2. Электронной томографии Сбор данных
    1. Трансфер сетку в одиночный держатель наклона.
    2. Передача держатель в электронном микроскопе.
    3. Сбор наклона серии автоматически с программным обеспечением SerialEM 19 на 2 ° с шагом в угловом диапазоне от -60 ° до 60 ° и записи изображений с ПЗС-камеры на 52000 X эффективного увеличения, -6 до -10 мкм расфокусировки и электронной дозе 150 - 170 элементctrons / A 2 · с на томограмме.
  3. Электронной томографии Реконструкция фактора VIII-LNT
    Примечание: Реконструировать наклонена серию pFVIII-LNT и hFVIII-LNT приобретенные в 4.2. с возможностью ETomo программного обеспечения УПМ следующем уроке: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
    1. Использование окно терминала, открыть томограмму в 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
    2. Bin томограмма на 4 с УПМ BINVOL команду, чтобы уменьшить размер томограммы.
    3. Выберите правильный угол, чтобы повернуть липидов нанотрубки вдоль оси Y. в Binned томограммы, используя команду УПМ ROTATEVOL.
    4. Поверните полный томограмму с помощью команды УПМ ROTATEVOL.
    5. Обрезка выбранного липидный нанотрубки ориентированы вдоль оси ординат с помощью команды CLIP ИЗМЕНИТЬ РАЗМЕР УПМ.
    6. Откройте обрезанной суб-томограмму с 3DMOD.
    7. Нажмите на томограмме визуализировать расположение молекул фактора VIII вместеломтики в Z-оси и вдоль оси ординат в объеме суб-томограммы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рекомбинантный человеческий и свиной фактора VIII были успешно организованы по спирали на отрицательно заряженные одного двухслойную LNT, напоминающие поверхности активированных тромбоцитов. Спиральная организация человеческого и свиного фактора VIII-LNT был последователен через собранных цифровых снимках (рис. 2). Контроль LNT и человека и свиньи фактора VIII-LNT спиральные трубки были отобраны и сегментирован с e2helixboxer.py GUI и начальных наборов данных, созданных с помощью e2workflow.py GUI, вариант одной частицы (табл. 1).

Спиральная порядок мембраносвязанного человека и свиньи фактора VIII-LNT оценивали преобразования Фурье из класса средних с e2display.py GUI (EMAN2) (рис. 3). Липидный бислой в лучших средних 2D класса управления LNT корректно. Внутренний и наружный листок и низкая плотность мембраны гидрофобного ядра четко видны ( (фиг. 3В и 3С). Более выраженным поворот для человека фактора VIII-LNT спиральных труб показывает, что белок-белковые взаимодействия между соседними мембраной молекул фактора VIII последовательно различны для двух FVIII форм (Цифры 3B и 3C). Частицы класса средних показывая хорошую спиральную организацию (винтовая дифракционной картины) были объединены в e2display.py GUI с образованием промежуточного набор частиц (табл. 1). Частицы из промежуточных наборов частиц снова классифицированы в 50 классов с теми же ограничениями. Частицы из средних классов с одинаковым диаметром были объединены в окончательном данныхНаборы (табл. 1).

Первоначальные 3D реконструкции для человеческого и свиного фактора VIII-LNT проводились с 1000 представительных частиц из конечного человека и свиньи наборов данных фактора VIII-LNT. Сто последовательных IHRSR итераций проводились для каждого 3D-реконструкции с безликой цилиндра (160 Å внутренней и 500 Å наружный диаметр), а первоначального объема. Осевая рост (Δz) рассчитывается из объединенного преобразования Фурье спиральных сегментов (частицы комплект) равен 41 Å человеческого фактора VIII-LNT и 36 Å для свиного фактора VIII-LNT (рис. 4А и 4В). Первоначальный азимутальный угол (ΔΦ) определяется из итерационного поиска оценивается в 40,0 ° для человеческого фактора VIII-LNT и на 35,0 ° для свиного фактора VIII-LNT. Окончательные объемы на предмет наличия сходимости винтовых параметров и переписки между класса средних и прогнозов от окончательного Reconstrед ен ие, также в соответствии с критериями, описанными в 5. Выбранные 3D реконструкции и соответствующие спиральные параметры накладываются в качестве исходных объемов и начальных винтовых параметров для второго IHRSR уточнению 100 циклов, которые конвергентных до четырехлетнего начать спиральной организации для человеческого фактора VIII-LNT с Δz = 41,1 Å и ΔΦ = 42.0 ° и пять начать винтовая организация для свиного фактора VIII-LNT с Δz = 35,5 Å и ΔΦ = 34,8 °. Окончательное 100 IHRSR итераций введения в 4 раза и 5-кратное спиральную симметрию для человека и свиньи реконструкций фактора VIII-LNT соответственно осуществляются с начальными объемами и соответствующих винтовых параметров из последних асимметричных IHRSR уточнений (рис. 4C и 4D). Окончательные объемы показать 8 человеческий фактор VIII и 10 свиных FVIII мембраной молекул, организованных вокруг оси спирали (рис. 5А). Каждый человекФактора VIII молекула переводится 41,2 Å и вращается 42,0 ° от предыдущего, и каждый свиной молекула фактора VIII переводится 35,9 Å и вращается 35,2 º от предыдущего, соответствующих винтовых параметров последних 3D реконструкции (рис. 5б).

Восстановленные электронные томограммы подтвердить разницу в спиральной организации между человеческим и свиным фактора VIII-LNT, полученного при тех же экспериментальных условиях. Сравнение лучших видов из реконструированных томограмм и объемов 3D от спиральной реконструкции смотреть в направлении, перпендикулярном к оси спирали, еще раз подтверждает правильность 3D реконструкции рафинированных с винтовыми параметров IHRSR (рис. 6). Асимметричные размеры 2D элементарной ячейки для человеческого фактора VIII-LNT 3D реконструкции являются: а = 17,8 нм, б = 8,2, γ = 84 ° и для свиного фактора VIII-LNT 3D реконструкции: =18.4, б = 7,2 и γ ​​= 70 ° (рис. 6). Размеры элементарной ячейки человеческого фактора VIII, организованного в мембраносвязанных 2D кристаллов: а = 8,1, б = 7,0 и γ = 67 °, что соответствует поверхности, покрытой одной молекуле фактора VIII если смотреть в направлении мембранного поверхности 20. Сравнивая размеры элементарной ячейки между FVIII организованные в 2D и винтовых кристаллов показывает, что как человеческие, так и свинина молекулы фактора VIII образуют димеры, когда спирально организована на поверхности LNT.

Рисунок 1
Рисунок 1. Анализ блок-схема Структура. Выполняемые для анализа 2D классификации в соответствии с эталонных алгоритмов без выравнивания, реализованных в EMAN2 16 обведены синим цветом. Выполняемые для анализа 3D осуществляется с итеративной винтовой реального алгоритмы пространство реконструкции (IHRSR) обведены красным. Итерационные циклы IHRSR обозначены пунктирными стрелками.

Рисунок 2
Рисунок 2. Крио-EM цифровые микрофотографии. (4096 х 4096 пикселей, 2.9 A / пикс) липидных нанотрубок (LNT) с и без связанного фактора VIII. А. Контроль LNT. Б. Человек фактора VIII-LNT. С. свиней фактора VIII-LNT . Край отверстие в пленке углерода, в котором FVIII-ЛСТ суспендируют в аморфный лед обозначается белой звездой. Плотность белков и липидов в черный. Увеличенного просмотров (вкладки) из 512 х 512 обрезается области (белый штриховой квадрат) иллюстрируют разницу в спиральной организации человека и свиньи фактора VIII, соответственно. Масштабная линейка составляет 100 нм.ig2highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Средние Рисунок 3. Представитель 2D класса (верхний ряд) и соответствующие преобразования Фурье (нижний ряд) из промежуточных наборов частиц (табл. 1) классифицируется в 50 классах. А. Контроль LNT Б. Человек фактора VIII-LNT С. свиней фактора VIII-LNT. Класс число и число частиц, включенных в каждом классе указаны. Разница в спиральной того между человеческим и свиным FVIII хорошо видно на изображениях и подтверждено дифракционных картин, полученных из преобразований Фурье этих изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотретьувеличенное рисунке.

Рисунок 4
Рисунок 4. 3D спиральные реконструкции человеческого и свиного фактора VIII-LNT. А. комбинированных преобразования Фурье от 1000 спиральных сегментов. Первый и второй линии слой сосредоточены при выдержке 1/82 A-1 и 1/41 Å -1 для человеческого фактора VIII-LNT, а в 1/72 Å -1 и 1/36 Å -1 на свиные фактора VIII-LNT (белый стрелки). Б. Поверхность представление человека в розовом (Δz = 41.1 Å, ΔΦ = 42.0 º) и свиной в голубом (Δz = 35,9 А, ΔΦ = 35.2 º) фактора VIII-LNT 3D спиральные реконструкций. Оба тома представлены на 0,005 уровне контура (минимальная плотность равна 0 и максимальная плотность 0,02, рассчитанная в UCSF Chimeра, вариант 21 Объем зритель). Длина фактора VIII-LNT трубы составляет 256 пикселей на 2,9 A / пикс. Ш. Фурье Shell корреляции (ФСБ) участки для человека и свиньи фактора VIII-LNT показывая разрешение 20,5 Å в ФСБ = 0,5.

Рисунок 5
Рисунок 5. Винтовая организация человеческого и свиного фактора VIII-LNT. Сегментированной представления поверхности человека и свиньи фактора VIII-LNT винтовых реконструкций, показанных на рисунке 4В. Объемы сегментированы после наложения 4-кратной симметрией для человеческого фактора VIII-LNT и 5-кратным симметрии к свиного фактора VIII-LNT. Асимметричные блоки цветом желто-красный для человеческого фактора VIII-LNT и сине-зеленый для свиней фактора VIII-LNT. А. видом вдоль оси спирали, указанного с квадрата на человека и какпятиугольник для свиного фактора VIII-LNT. Человеческая структура фактора VIII-LNT показывает 8 молекул, организованных вокруг внешнего LNT мембраны и свиной структура фактора VIII показывает 10 молекул, организованные вокруг внешнего LNT мембраны, указано с числами. В. Просмотров перпендикулярно оси спирали. Человеческого фактора VIII-LNT является 4-начать спиральная структура и свиной фактора VIII-LNT находится в 5-начать спиральная структура. Отдельные один старт спирали указаны с номерами и цветом. Мы подчеркивали одну из спиралей от каждой структуры с (*) и зелеными линиями. Масштабная линейка составляет 20 нм.

Рисунок 6
Сравнение между спиральными и томографии 3D реконструкции. Человеческого фактора VIII-LNT (а) и свиных фактора VIII-LNT (С) винтовая 3D реконструкции Рисунок 6. Показаны perpendicular оси спирали. Каждый блок клеток и отдельные спирали имеют цветовую маркировку как показано на рисунке 5. Б. и D. являются представлениями плотность томографии реконструкций 3D, просматриваемые перпендикулярно оси спирали. 2D решетка отражает спиральную расположение молекул фактора VIII показана с зелеными линиями.

Образцы CLNT hFVIII-LNT pFVIII-LNT
Первоначальные Микрофотографии 61 474 542
Наборы начальной частицы 29113 60395 64665
Расфокусировкой (нм) -4051 ± 502 -3643 ± 737 -3443 ± 1086
Наборы промежуточная частица 25907 27305 22773
Наборы конечной частицы 25907 10455 10430

Таблица 1. Статистика 2D анализа следующие алгоритм, представленный в блок-схеме на рисунке 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой работе методика представлена ​​различать два мембраносвязанных организаций высоко гомологичных белков: человеческий и свиной FVIII самоорганизующихся на липидных нанотрубок в условиях, встречающихся в организме человека.

В описанной процедуры, человеческий и свиной фактора VIII успешно организован по спирали на липидных нанотрубок, который является наиболее важным шагом. Следующим важнейшим шагом является сохранение образца в тонкой аморфного льда с помощью флэш-замораживание в ближайшее жидком азоте 2 температуры. Сохранение образца в аморфный лед и LN2 температуре сохраняет спиральные трубки гидратированных и белок-липидных макромолекулярных ансамблей физиологически активным. Окончательный важным шагом приобретает Крио-ЭМ данные достаточного количества и качества для 3D структуры с высоким разрешением в ближайшее температуры LN2. Сбор данных в ближайшем температуры LN2 дальше предотвращает обезвоживание образца в высоком Vacuum из микроскопа и радиационной ущерба от электронного пучка.

Для расчета мембраносвязанное структуру фактора VIII первым важным шагом является получение однородных частиц (спиральные сегменты) наборы, применяя 2D опорный бесплатно классификацию и объединить частиц из классов с того же диаметра и степени упорядоченности. Второй важный шаг заключается в установлении правильного первоначального объема и спиральные параметры (подъем и азимутальный угол) для спиральной реконструкции. Третий и последний важный шаг состоит в проверке спиральную структуру, сравнивая 3D карты, полученные спиральной и электронной томографии (без наложенного симметрии) реконструкций того же образца.

Представленная методика является уникальным в своей способности решить функциональную структуру мембранных белков, ассоциированных в вблизи физиологических условиях. LNT разработан в нашей лаборатории может бытьуспешно используется в качестве платформы для спиральной организации функциональных мембраной факторов свертывания крови и достичь лучшее разрешение, чем для фактора VIII, организованного в мембраносвязанных 2D кристаллов и в виде отдельных частиц. Наша цель заключается в дальнейшем увеличить разрешение наших винтовых реконструкций путем улучшения однородности и качества конечной наборов частиц. Сбор более Крио-EM микрофотографии на лучших условиях Крио-EM (пистолет Полевая эмиссия, энергетической фильтра, DE камеры детекторов) из фактора VIII-LNT спиральных нитей и, следовательно, в том числе больших начальных наборов частиц для реконструкции 2D добьемся этого. Улучшение винтовую сборку фактора VIII-LNT и 3D алгоритмы реконструкции позволит нам получить субнанометровым и рядом атомным разрешением, который будет однозначно определить мембраносвязанное организацию этот критический для белка свертывания крови.

Организация по спирали гомологичные формы FVIII дает нам также возможти охарактеризовать как разница в последовательности может коррелировать с различиями в структуре и функции. Разрешая человека и свиньи FVIII мембраной структуры от методов, описанных в этой статье, могут помочь определить последовательности, которые, когда изменение улучшат рекомбинантный функцию фактора VIII. Это знание будет иметь значительные клинические последствия для открытия новых лекарств в обоих тромбоза и гемостаза полей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовый интерес и с ними можно связаться напрямую отношении любых процедур, опубликованных в этой рукописи.

Acknowledgements

Эта работа поддержана грантом Национального Ученый развития от American Heart Association: 10SDG3500034 и UTMB-NCB запуска средства для SSM. Авторы признают, средства Крио-EM и высокопроизводительные вычисления в Сили Центра структурной биологии UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), а также д-ра. Стив Ludtke и Эд Egelman за помощь в спиральных алгоритмов реконструкции 2D и 3D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM2100 with LaB6 JEOL Ltd. JEM-2100 operated at 200 kV
with TEMCON software JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder Gatan, Inc. 626.DH cooled to -175 °C
with temperature controler unit Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera Gatan, Inc. US4000 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV FEI
Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid Ted Pella 01821 plasma cleaned for 10 sec on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh Electron Microscopy Sciences Q225-CR2 Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes 
Uranyl acetate dihydrate Ted Pella 19481 1% solution, filtered
Galactosyl ceramide Avanti Polar Lipids Inc. 860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids Inc. 840035
EM software Digital Micrograph Gatan, Inc. http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN free download http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
EM software Spider free download http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR free download Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD) free download http://bio3d.colorado.edu/imod/ 
EM software (SerialEM) free download ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera free download http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
  2. Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
  3. Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
  4. Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
  5. Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. (2013).
  6. Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
  7. Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
  8. Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
  9. Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
  10. Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
  11. Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
  12. Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
  13. Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
  14. Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
  15. Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
  16. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
  17. Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
  18. Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
  20. Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
  21. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics