Helical Organisering av koagulasjonsfaktor VIII på Lipid Nanorør

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi beskriver her en kombinasjon av Cryo-elektronmikroskopi, lipid nanoteknologi, og struktur-analyse anvendt for å løse membranbundet struktur av to sterkt homologe FVIII former: humane og porcine. Metodikken er utviklet i vårt laboratorium for å helically organisere de to funksjonelle rekombinante FVIII skjemaer på negativt ladet lipid nanorør (LNT) er beskrevet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Miller, J., Dalm, D., Koyfman, A. Y., Grushin, K., Stoilova-McPhie, S. Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes. J. Vis. Exp. (88), e51254, doi:10.3791/51254 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) 1 er en kraftig metode for å undersøke den funksjonelle struktur av proteiner og komplekser i en hydratisert tilstand og membranmiljø 2..

Koagulasjonsfaktor VIII (FVIII) 3 er et multi-domene blodplasma glykoprotein. Defekt eller mangel av FVIII er årsaken for hemofili type A - en alvorlig blødersykdom. Etter proteolytisk aktivering, FVIII bindes til serin protease faktor IXa på den negativt ladede blodplate-membran, som er avgjørende for normal blodpropper 4.. Til tross for den sentrale rollen FVIII spiller i koagulasjon, er strukturell informasjon for sin membran-bundet tilstand ufullstendig fem. Rekombinant faktor VIII-konsentrat er det mest effektivt medikament mot hemofili type A og kommersielt tilgjengelig FVIII kan uttrykkes som humane eller porcine, begge danner funksjonelle komplekser med human Faktor IXa 6,7.

"> I denne studien presenterer vi en kombinasjon av Cryo-elektron mikroskopi (Cryo-EM), anvendt lipid nanoteknologi og struktur analyse for å løse membran-bundet struktur av to svært homologe FVIII former:. Mennesker og svin Metodikken er utviklet i vårt laboratorium til helisk organisere de to funksjonelle rekombinant FVIII former på negativt ladet lipid nanorør (LNT) er beskrevet. de representative resultater viser at vår tilnærming er tilstrekkelig følsom til å angi forskjeller i den spiralformede organisasjon mellom de to sterkt homologe i sekvens (86% sekvensidentitet ) proteiner. Detaljerte protokoller for den spiralformede organisasjon, Cryo-EM, og elektron-tomografi (ET) datainnsamling er gitt. den to-dimensjonale (2D), og tre-dimensjonale (3D) struktur-analyse anvendt for å oppnå de 3D rekonstruksjoner av human-og porcin FVIII-LNT er diskutert. som presenteres menneskelige og svin FVIII-LNT strukturer viser potensialet av den foreslåtte metoden for å beregnese den funksjonelle, membran-bundet organisering av koagulasjonsfaktor VIII med høy oppløsning.

Introduction

Koagulasjonsfaktor VIII (FVIII) er et stort glykoprotein av 2332 aminosyrer organisert i seks domener: A1-A2-B-A3-C1-C2 tre. Ved aktivering av FVIII Trombin virker som kofaktor for faktor IXa i membranbundet Tenase kompleks. Binding av aktivert faktor VIII (FVIIIa) til FIXa i en membran-avhengig måte forbedrer FIXa proteolytisk effektivitet mer enn 10 fem ganger, noe som er kritisk for effektiv blodkoagulering 4.. Til tross for den viktige rollen FVIII spiller i koagulasjon og Tenase kompleks formasjon, er den funksjonell membran-bundet FVIII struktur ennå ikke er løst.

For å løse dette, har enkelt lipidbllag nanorør (LNT) rik på fosfatidylserin (PS), i stand til å binde FVIII med høy affinitet 8, 9 og likner den aktiverte blodplater overflaten er utviklet 10. Fortløpende spiralformede organiseringen av FVIII bundet til LNT har vist seg å være effective for strukturbestemmelse av FVIII membran-bundet tilstand av Cryo-EM 5. Funksjon LNT er et ideelt system for å studere protein-protein-og protein-membran interaksjoner av helically organiserte membran-assosiert proteiner av Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM har den fordel i forhold til tradisjonelle konstruksjonsmetoder som røntgen-krystallografi og NMR, som prøven blir bevart i det nærmest den fysiologiske miljø (buffer, membran, pH), uten tilsetningsstoffer og isotoper. I tilfelle av FVIII, studere membranbundet struktur med denne teknikk er enda mer fysiologisk relevant, da den LNT likne av størrelse, form og sammensetning av pseudopodia av de aktiverte blodplater, hvor de Tenase komplekser montere in vivo.

Defekter og mangel av FVIII årsaken hemofili A, en alvorlig blødning lidelse som påvirker en i 5000 hanner av den menneskelige befolkning 4, 6. Den mest effective terapi for hemofili A er livslang behandling med rekombinant human FVIII (hFVIII). En betydelig komplikasjon av det rekombinante faktor VIII Hemophilia A terapi er utviklingen av inhibitoriske antistoffer mot human formen som påvirker omtrent 30% av hemofili A-pasienter 13. I dette tilfellet, er svin FVIII (pFVIII) konsentrat brukes, som svin FVIII skjermer med lav kryssreaksjon med hemmende antistoffer mot human FVIII og skjemaer funksjonelle komplekser med humant FIXa 7. Er viktig å etablere en membranbundet organisering av både svin og menneske FVIII skjemaer for å forstå den strukturelle grunnlaget for FVIII kofaktor funksjon og implikasjoner for blod hemostase.

I denne studien, beskriver vi en kombinasjon av lipid nanoteknologi, Cryo-EM, og struktur analyse laget for å løse membranbundne organisering av to svært homologe FVIII former. De presenterte Cryo-EM data og 3D-strukturer for helically organisert porcine og menneskelig faktor VIII på negativt ladet LNT viser potensialet av den foreslåtte nanoteknologi som grunnlag for strukturbestemmelse av FVIII og membranbundne koagulasjonsfaktorer og komplekser i en fysiologisk membran miljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Prøvepreparering

  1. Buffer utveksling human faktor VIII-BDD 14 og porcine FVIII-BDD 15 mot HBS-Ca-buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH = 7,4) og konsentrer til 1,2 mg / ml. Hold proteinløsningen ved -80 ° C.
  2. Forbered lipid nanorør (LNT) ved å blande GalactosylCeramide (GC) og fosfatidylserin (PS) på 01:04 w / w forholdet i kloroform. Fordamp kloroformen under argon og oppløse lipidene i HBS-buffer til 1 mg / ml. Hold LNT løsning ved 4 ° C.

2. Cryo-elektron mikroskopi av FVIII-LNT

  1. Cryo-EM Prøvepreparering
    1. Glødeutladning på 300 mesh Quantifoil R2 / 2 kobbernett (carbon siden opp) i en blanding av O-2 og H-2-gass i 10 sekunder ved 50 watts
    2. Bland FVIII og LNT løsninger i HBS-buffer Ca på 1:1 vekt / vekt-forhold og inkuberes i 15 min ved romtemperatur.
    3. Påfør en dråpe 2,5 mLFVIII-LNT prøven til den hydrofile elektronmikrosgitteret i Vitrobot Mark IV fuktet kammer (100% fuktighet).
    4. Blot og flash fryse risten (en blot for 3,5 sek, blot kraft 1) i flytende C 2 H 6, avkjølt av flytende N2 for å oppnå amorfe is.
    5. Butikknett i oppbevaringsbokser i henhold flytende N 2 (LN2).
  2. Cryo-EM Datainnsamling
    MERK: JEM2100-LaB6 (år 2010) er utstyrt med en TEMCON driftssystem som består av en datamaskin koblet til elektronmikroskop, en skjerm med vinduer lesevakuumsystemet, belysningssystem, HT, linse strømmer og så-on, og to paneler: Venstre og høyre, plassert på begge sider av søylen. Strålen skift X, Y knotter (SHIFT Y, SIFT Y) og multifunksjons (DEF / STIG) knotter er på begge paneler. På venstre panel er belysningen (brigthness) ratt. På høyre panel er: forstørrelsen (MAG / CAM LENGDE) og fokus (Fokus) knotter og tre imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) og diffraksjon (DIFF) moduser knapper. Vi kjøper våre data i MAG1 på alfa 2. Minstedosebelysningsforhold (MDS) som kreves for Cryo-EM datainnsamling er satt med F1 til F6 knapper, øverste rad på høyre panel. I denne protokollen de generiske innstillingene brukes: F1 - heve / senke skjermen, F2 - søkemodus, F3 - fokusmodus, F4 - FOTO modus, F5 - MDS AV / PÅ og F6 - BEAM BLANK, brukes til å skjerme prøven fra stråling skade ved å avbøye strålen.
    1. Plasser cryo-holderen inn i cryo-stasjonen og fylle Dewar av holderen og cryo-stasjon med LN2. Når temperaturen når -192 ° C, åpne lukkeren på holderen spissen, sted tidligere frosset Cryo-EM rutenett inn i anvist plass og fest med en ring klemme.
    2. Sett cryo-holderen i elektronmikroskopet. Fyll på Dewar av cryo-holderen og den anti-contaminator kammer med LN2. Vent på at holderen for å stabilisere seg i 30 til 60 min. Trykk F6 på ogslå filament på. Når glødetråden er mettet, trykker du F6 og åpne lukkeren på holderen for å vise rutenettet.
    3. Trykk Lav Mag / alpha 1 (satt til 200X mag) og lokalisere områder med tynn is på rutenettet.
    4. Bytt til MAG 1/alpha to for å sette minimumsdose (MDS) modus og skaffe Cryo-EM data ved lave elektron doser, uten å skade prøven.
      1. Trykk F2 for å sette søkemodus. Sett forstørrelse på 40.000 x. Enlarge bjelke med og lysstyrke knott til minimal elektron dose ~ 0,04 e - / Å 2 · s. Trykk DIFF å bytte til diffraksjon modus. Still kamera lengden til 120 cm med MAG / CAM LENGDE knott. Finn områder på nettet i løpet av de pre-utvalgte områder i LOWMAG som har lipid nanorør i hullene av karbon film.
      2. Trykk F4 for å sette fotomodus på 40 000 x forstørrelse og satt belysning med lysstyrke knott i doser på 16-25 e - / A 2 · s. Trykk Standard Focus-knappen for å angi fokus forhold justere Z-høydeav prøven med Z OPP / NED-knappene (høyre panel). Sett defokus mellom -1,5 og -2,5 mikrometer.
      3. Rett SØK-og fotomodus ved å tegne en firkant i live view-vindu på den digitale kameraskjermen i søkemodus som tilsvarer det området som skal avbildes i fotomodus.
      4. Trykk F3 for å sette fokus modus på 100 000 x forstørrelse. Fokus belysning for å dekke CCD-brikke (~ 4-5 cm radius) og på aksen å ikke strålebehandling området til å bli fotografert i fotomodus. Juster defokus til ~ -1,5 og -2,5 mikrometer med FOCUS knott og riktig for astigmatisme av bildet med DEF / STIG knotter.
    5. Velg FVIII-LNT å bli fotografert i søkemodus ved å skaffe levende bilder i Live View-vinduet på det digitale kameraskjermen. Sentrer FVIII-LNT på torget tegnet på live view-vindu.
    6. Spill et digitalt bilde på CCD-kamera på 52000 X effektiv forstørrelse og 0,5 sek eksponering ved å bytte til fotomodus og klikke acquirE-knappen på den digitale micrograph kameraskjermen. Bildeinnlastingen forholdene er satt som strålen blank (skodder) åpen kun når bildet er ervervet i fotomodus.
    7. Sjekk kvaliteten og defokus av den oppkjøpte bildet ved å trykke CTRL-F for å få en Fast Fourier Transform (FFT).

Tre. 3D Rekonstruksjon

MERK: bildeanalyse programvare som brukes for 2D-og 3D-analyse: EMAN2 og IHRSR er fritt tilgjengelig. EMAN2 kan lastes ned fra http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. Den IHRSR programvare kan fås ved henvendelse til professor Egelman: egelman@virginia.edu. De endelige IHRSR forbedringer blir drevet på Texas Advanced Computing sentrum klynge: http://www.tacc.utexas.edu/ ved University of Texas, Austin. Den 3D rekonstruksjon algoritmen er vist på figur 1 består av to hovedtrinn: det første å velge et homogent sett av skrueformede segmenter (partikler) med 2D referanse frie alignment (RFA) algoritmer implementert i EMAN 2, andre oppnå en 3D rekonstruksjon basert på de spiralformede parametere og bak projeksjon algoritmer innlemmet i IHRSR. Det første trinnet benytter programmer utviklet for å velge homogene partikkelsett for 3D rekonstruksjon med enkelt partikkel SPA (algoritmer) hvor EMAN2 har blitt spesielt utviklet og distribuert: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Dette trinnet har blitt tilpasset Cryo-EM-data. Det andre trinnet oppnås med IHRSR algoritme, som er spesielt utformet for den type av skrueformede sammenstillinger som oppnås med de rekombinante faktor VIII-former. Denne algoritmen er dokumentert grundig gjennom den vitenskapelige litteraturen 12.

  1. 2D-bildeanalyse utføre med EMAN2 vitenskapelige bildebehandlings suite: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 å velge homogen partikkel (spiralformede segment) sett for spiralformede rekonstruksjon.
    1. Velg Cryo-EM mikrografer med straight og velorganisert spiralformede rør med digitalkamera programvare og visualiseringsverktøy.
    2. Inverter, normalisere og filtrere for X-ray piksler i e2workflow.py GUI, enkelt partikkel rekonstruksjon (SPR) alternativ: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. Importer de inverterte, normaliserte og X-ray pixel filtrert bilder i e2helixboxer.py GUI. Velg FVIII-LNT spiralformede rør og segment på 256 x 256 piksler (2,9 Å / pix) med 90% overlapping hjelp: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. Vurdere defokus fra de opprinnelige mikrografer og gjelder kontrast transferfunksjon (CTF) korreksjon (kun fase korreksjon) til de spiralformede segmenter fra de samme mikrografer med e2ctf.py alternativet innlemmet i e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
    5. Generere innledende partikler (spiralformede segmenter) setter i e2workflow.py GUI - SPR alternativ: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
    6. Beregn 2D klasse gjennomsnitt med e2refine2d.py algoritmen søker referansen gratis k-middelklassifisering å velge homogene datasett med samme diameter LNT og grad av spiralformede rekkefølge (Figur 2), etter manus: 'e2refine2d.py - ITER = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - inngang = INPUT.hdf - ncls = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = fase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = bety - normproj-classkeepsig ', endre ncls verdi tilsvarende.
      1. Klassifisere de første datasettet i 150 klassenes ncls = 151 "over 8 iterasjoner med 'classkeep = 0,8', som betyr at partikler med mindre enn 80% likhet til klassen gjennomsnittet er ekskludert fra den gitte klassen. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Flett partikler fra klasse gjennomsnittmed uttalt spiralformede diffraksjon i e2display.py å lage mellomliggende datasettet.
      3. Klassifisere de mellomliggende datasettet i 50 klassenes ncls = 51 'for å skille klasser med samme diameter og grad av orden.
      4. Flett partikler fra klasser med samme diameter og grad av orden i e2display.py å skape den endelige datasettet for tredimensjonal rekonstruksjon: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
  2. Utfør spiralformede rekonstruksjon med iterativ Helical Fast Space Reconstruction (IHRSR) algoritme, som beskrevet i Egelman 17, 18.
    1. Estimer oppover, aZ (Å) av FVIII-LNT helix fra den kombinerte Fourier transform av partiklene i den endelige datasett.
    2. Definer asimutvinkelen ΔΦ (º) ved å kjøre parallelle IHRSR avgrensninger med en konstant åZ, økende ΔΦ fra 576; til 60 ° i 5 ° intervaller.
    3. Løpe 100 påfølgende IHRSR sykluser for hver endelige datasett med et særpreg sylinder som et første volum og de første skrueformede parametre åZ og ΔΦ som definert i 3.2.1. og 3.2.2.
    4. Inspiser de endelige volumer for konvergens av de spiralformede parametere og korrespondanse mellom klasse gjennomsnitt fra 2D klassifisering av den endelige datasettet og anslagene fra den endelige IHRSR gjenoppbygging.
    5. Ilegge symmetri til de endelige 3D rekonstruksjoner, svarende til den asymmetriske enheten fordelingen observert i slutt asymmetriske 3D-volum: 4-fold for human faktor VIII-LNT og 5-fold til den porcine FVIII-LNT. Kjør ytterligere 100 raffinement sykluser for å generere en endelig symmetrized 3D rekonstruksjon.
    6. Beregn Fourier Shell Korrelasjon kurve for begge volumene ved først å skille de tilsvarende datasettet i partall og oddetall: 'e2proc2d.py <infile> <outfile> - split = 2 '. Deretter kjører 100 IHRSR påfølgende forbedringer som beskrevet i 3.2.3. Beregn FSC av 3D volumer opprettet fra odd og selv datasett: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
  3. Visualisere og Segment de FVIII-LNT volumer i UCSF chimera.
    1. Åpne den endelige volumer fra trinn 3.2.5. i UCSF Chimera og sett konturen nivå til 0.005 i TOOLS> VOLUM DATA> VOLUM VIEWER alternativet.
    2. I TOOLS> VOLUM DATA> Segment MAP, velger du volum i segment MAP-kategorien og klikk på segmentene volumet.
    3. Konsernets segmenter som tilsvarer en enhet celle ved å velge med CTRL + SKIFT og klikke gruppe.
    4. Color segmentene av enhetscelle og helix med Handlinger> COLOR muligheten til å legge vekt på de strukturelle trekk.

4. Electron Tomography

  1. Negativt farget FVIII-LNT Prøvepreparering
      <li> Forbered FVIII-LNT prøver som for Cryo-EM eksperimenter.
    1. Glød utslipp karbon-belagte 300-mesh kobbernett (karbon siden opp) i en blanding av O-2 og H-2-gass i 10 sekunder ved 50 W som for Cryo-EM-eksperimenter.
    2. Påfør et fall på 2,5 mL FVIII-LNT suspensjon med 6-nm kolloidale gull nanopartikler til rutenettet, blot overflødig væske og negativt flekker ved å bruke 5 mL 1% uranyl acetate løsning for 2 min. Blot overflødig væske og luft tørke rutenettet.
  2. Electron Tomography Datainnsamling
    1. Overfør rutenettet inn singelen tilt holderen.
    2. Overfør holderen i elektronmikroskop.
    3. Samle tilt serien automatisk med SerialEM programvare 19 på 2 ° intervaller over en vinkelområde på -60 ° til 60 ° og ta bilder med en CCD-kamera på 52000 X effektiv forstørrelse, -6 til -10 mikrometer defokus og elektron dose av 150 - 170 electrons / Å 2 · s per tomogram.
  3. Electron Tomography Rekonstruksjon av FVIII-LNT
    Merk: rekonstruere pFVIII-LNT og hFVIII-LNT vippet serien ervervet i 4.2. med ETomo alternativet i IMOD programvare følgende opplæringen: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
    1. Ved hjelp av et terminalvindu, åpner tomogram i 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
    2. Bin den tomogram av fire med IMOD BINVOL kommandoen til å redusere størrelsen på tomogram.
    3. Velg riktig vinkel for å rotere lipid nanorør langs Y-aksen i binned tomogram bruker IMOD ROTATEVOL kommandoen.
    4. Roter hele tomogram med IMOD ROTATEVOL kommandoen.
    5. Beskjære den valgte lipid nanorør orientert langs Y-aksen med IMOD CLIP RESIZE kommando.
    6. Åpne beskårede sub-tomogram med 3DMOD.
    7. Klikk på tomogram å visualisere ordningen med faktor VIII molekyler sammenskivene i Z-aksen og langs Y-aksen i det sub-tomogram volum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekombinant human-og svin FVIII ble med hell arrangert i skruelinjeform på negativt ladede enkelt bilags LNT, likner den aktiverte blodplateoverflaten. Spiral organisering av human-og porcin faktor VIII-LNT var konsistent gjennom de innsamlede digitale mikrografer (figur 2). Kontrollen LNT og den menneskelige og svin FVIII-LNT spiralformede rør ble valgt og segmentert med e2helixboxer.py GUI og innledende datasett som er opprettet med e2workflow.py GUI, Single partikkel alternativ (tabell 1).

Den spiralformede rekkefølgen av membranbundet human-og porcin faktor VIII-LNT ble evaluert fra Fourier-transformasjon av klassen gjennomsnitt med e2display.py GUI (EMAN2) (figur 3). Lipidbiskiktet i de beste kontroll LNT 2D klasse gjennomsnitt er godt definert. Den indre og ytre paknings og lavere tetthet av membranen hydrofob kjerne er klart synlige ( (figurene 3B og 3C). Jo mer uttalt vri for den menneskelige faktor VIII-LNT spiralformede rør indikerer at protein-protein interaksjoner mellom tilstøtende membranbundne FVIII molekyler er konsekvent forskjellig for de to FVIII former (Tall 3B og 3C). Partikler fra klasse gjennomsnitt viser god spiral organisasjon (spiralformede diffraksjon mønster) ble slått sammen i e2display.py GUI for å danne en mellom partikkel sett (Tabell 1). Partiklene fra de mellomliggende partikkel-settene ble igjen klassifisert i 50 klasser med de samme begrensninger. Partiklene fra klassen gjennomsnitt med samme diameter ble slått sammen i det endelige datasett (Tabell 1).

Innledende 3D rekonstruksjoner for human-og porcin faktor VIII-LNT ble utført med 1,000 representative partikler fra den endelige human og svin FVIII-LNT datasett. Ett hundre påfølgende IHRSR gjentakelser ble kjørt for hver 3D-rekonstruksjon med et særpreg sylinder (160 Å indre og 500 Å ytre diameter), som opprinnelig volum. Den aksiale stigning (åZ) beregnet ut fra den kombinerte Fourier-transform av de skrueformede segmenter (partikler angitt) er lik 41 Å for human faktor VIII-LNT og 36 Å for porcin faktor VIII-LNT (figurene 4A og 4B). Den innledende asimutvinkler (ΔΦ) definert fra iterativ søk er anslått til 40,0 ° for den menneskelige faktor VIII-LNT og ved 35,0 ° for svin FVIII-LNT. De endelige volumer skal inspiseres for konvergens av de spiralformede parametere og korrespondanse mellom klasse gjennomsnitt og anslag fra den endelige reconstruction, også etter de kriteriene som er beskrevet i fem. De valgte 3D rekonstruksjoner og tilsvarende spiralformede parametere er pålagt som første bindene og innledende spiralformede parametere for en andre IHRSR avgrensning av 100 sykluser som konvergerte til en fire-start spiral organisasjon for den menneskelige faktor VIII-LNT med åZ = 41,1 Å og ΔΦ = 42,0 ° og en fem-start spiral organisasjon for svin FVIII-LNT med åZ = 35,5 Å og ΔΦ = 34,8 °. En endelig 100 IHRSR gjentakelser imponerende en 4-fold og en 5-fold spiral symmetri for det menneskelige og svin FVIII-LNT rekonstruksjoner henholdsvis gjennomføres med innledende volumer og tilsvarende spiralformede parametere fra de siste asymmetriske IHRSR avgrensninger (Tall 4C og 4D). De endelige volumer viser 8 menneskelige faktor VIII og 10 svin FVIII membranbundne molekyler organisert rundt spiralaksen (figur 5A). Hvert menneskeFVIII molekyl omsettes 41,2 Å og roteres 42,0 ° fra den foregående, og hver porcin faktor VIII-molekylet er oversatt 35,9 Å og roteres 35,2 ° fra den foregående, som svarer til de skrueformede parametere av de endelige 3D rekonstruksjoner (figur 5B).

De rekonstruerte elektron tomografi bekrefter forskjellen i den spiralformede organisasjon mellom human-og porcin faktor VIII-LNT erholdt ved de samme eksperimentelle betingelser. Sammenligning av topp utsikt fra rekonstruerte tomografi og 3D-volumer fra den spiralformede oppbyggingen sett i retning vinkelrett på den heliske aksen, validerer ytterligere riktigheten av 3D rekonstruksjoner raffinert med IHRSR skrueformede parametere (figur 6). De asymmetriske 2D enhetscelledimensjoner for human faktor VIII-LNT 3D rekonstruksjon er: a = 17,8 nm, b = 8,2, γ = 84 °, og for den porcine FVIII-LNT 3D rekonstruksjon: a =18,4, b = 7,2 og γ = 70 ° (fig. 6). De enhetscelledimensjonene av human faktor VIII-ordnet i membran-bundet 2D krystaller er: a = 8,1, b = 7,0 og γ = 67 °, som svarer til overflaten dekket av en FVIII molekyl sett mot membran-flate 20. Sammenligning av enhetscelledimensjonene mellom FVIII organisert i 2D og spiralformede krystaller indikerer at både menneskelige og svin FVIII molekyler danner dimerer når helically organisert på LNT overflaten.

Figur 1
Figur 1. Struktur analyse flytskjema. Trinnene fulgt for 2D-klassifisering analyse basert på referanse gratis justering algoritmer implementert i EMAN2 16 er sirklet i blått. Fremgangsmåten som følges for 3D-analysen utføres med iterativ skrueformet fast plass rekonstruksjonsalgoritmer (IHRSR) er sirklet i rødt. Den iterative IHRSR sykluser er merket med stiplede piler.

Fig. 2
Figur 2. Cryo-EM digitale mikrografer. (4096 x 4096 piksler, 2,9 Å / pix) av lipid nanorør (LNT) med og uten bundet FVIII. A. Kontroll LNT. B. Menneskelig FVIII-LNT. C. Porcine FVIII-LNT . Kanten av hullet i karbonfilm hvori FVIII-LNT er suspendert i amorf is merkes med en hvit stjerne. The protein og lipid tettheter er i svart. De forstørrede visninger (innfellinger) på 512 x 512 beskjæres områder (hvite stiplede firkanten) illustrere forskjellen i den spiralformede organiseringen av human-og porcin faktor VIII hhv. Målestokk er 100 nm.ig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representant 2D klasse gjennomsnitt (øverste rad) og tilsvarende Fourier transformasjoner (nederste rad) fra de mellomliggende partikkel sett (Tabell 1) klassifisert i 50 klasser. A. Kontroll LNT B. Menneskelig FVIII-LNT C. Porcine FVIII-LNT. Den klassenummer og antall partikler som inngår i hver klasse, er angitt. Forskjellen i spiralformede orden mellom det menneskelige og svin FVIII er tydelig på bildene og bekreftet av diffraksjon mønstre hentet fra Fourier forvandler av disse bildene. Vennligst klikk her for å se enstørre versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. 3D spiralformede rekonstruksjoner av menneskelige og svin FVIII-LNT. A. Kombinert Fourier transform fra 1000 spiralformede segmenter. Det første og andre laget linje er sentrert på 1/82 A -1 og 1/41 A -1 for human faktor VIII-LNT, og til 1/72 Å -1 og 1/36 A -1 for porcin faktor VIII-LNT (hvitt piler). B. Overflate representasjon av menneskelig i rosa (åZ = 41,1 Å, ΔΦ = 42,0 º) og svin i blått (åZ = 35,9 Å, ΔΦ = 35,2 º) FVIII-LNT 3D spiral rekonstruksjoner. Begge volumene blir presentert på 0.005 contour nivå (minimum tetthet er 0 og maksimal tetthet 0,02, som beregnet i UCSF Chimera, Volume viewer opsjon 21). Lengden av FVIII-LNT røret er 256 piksler med 2,9 Å / pix. C. Fourier Shell korrelasjon (FSC) tomter for mennesker og svin FVIII-LNT viser en oppløsning på 20,5 A ved FSC = 0,5.

Figur 5
Figur 5. Helical organisering av menneskelige og svin FVIII-LNT. Segmentert overflaten representasjon av menneskelige og svin FVIII-LNT spiralformede rekonstruksjoner, vist i figur 4B. Volumene er segmentert etter imponerende 4-fold symmetri til den menneskelige faktor VIII-LNT og 5-fold symmetri til svin FVIII-LNT. De asymmetriske enheter er fargekodet gul-rødt for den menneskelige faktor VIII-LNT og blå-grønne for svin FVIII-LNT. A. utsikt langs spiral aksen indikert med en firkant for mennesket og somen femkant for svin FVIII-LNT. Den menneskelige faktor VIII-LNT struktur viser 8 molekyler organisert rundt den ytre LNT membran og svin FVIII strukturen viser 10 molekyler organisert rundt den ytre LNT membran, angitt med tall. B. utsikt vinkelrett på spiralaksen. Den menneskelige faktor VIII-LNT er et 4-start heliske struktur, og den porcine FVIII-LNT er en 5-start spiralformede struktur. De enkelte en start helikser er angitt med tall og fargekodet. Vi har lagt vekt på en av helikser fra hver konstruksjon med en (*) og grønne linjer. Målestokk er 20 nm.

Figur 6
Figur 6. Sammenligning mellom de spiralformede og tomografi 3D rekonstruksjoner. Den menneskelige faktor VIII-LNT (A) og svin FVIII-LNT (C) spiral 3D rekonstruksjoner er vist perpendicular til den spiralformede akse. Hver enhet celle og individuelle helikser er fargekodet som i figur 5. B. og D. er tettheten representasjoner av 3D-tomografi rekonstruksjoner, sett vinkelrett på den spiralformede akse. 2D gitter reflekterer den spiralformede anordning av FVIII-molekyler er vist med grønne linjer.

PRØVER cLNT hFVIII-LNT pFVIII-LNT
Innledende Mikrografer 61 474 542
Innledende Particle sett 29113 60395 64665
Defokus (nm) -4051 ± 502 -3643 ± 737 -3443 ± 1086
Intermediate Particle sett 25907 27305 22773
Endelige partikkel sett 25907 10455 10430

Tabell 1.. 2D analyse statistikk følgende algoritmen vist i flytskjemaet på figur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet er presentert en metode for å skille mellom to membranbundne organisasjoner av svært homologe proteiner human-og porcin faktor VIII selv montert på lipid nanorør i de forhold som var tilstede i den menneskelige kroppen.

I den beskrevne fremgangsmåten, blir human-og porcin faktor VIII med hell arrangert i spiralform på lipid nanorør, som er det mest kritiske trinn. Den neste kritiske trinnet er å bevare prøven i tynn amorfe isen ved flash frysing på nær flytende N 2 temperatur. Sikrer prøven i amorf is og LN2 temperaturen holder spiralformede rør hydrert og protein-lipid makromolekylære forsamlinger fysiologisk aktiv. Den endelige kritiske trinnet er å anskaffe Cryo-EM data av tilstrekkelig mengde og kvalitet for en høyoppløselig 3D-struktur på nær LN2 temperatur. Innsamling av data på nær LN2 temperatur hindrer ytterligere dehydrering av utvalget i den høye vacuum av mikroskopet og strålingsskade fra elektronstrålen.

For å beregne den membran-bundne struktur av FVIII den første kritiske trinnet er å skaffe homogene partikler (heliske segmenter) settene ved å anvende 2D henvisning fri klassifisering og kombinere partikler fra klasser med samme diameter og graden av orden. Den andre kritiske trinnet er å innføre rett innledende volum og spiralformede parametere (økning og Azimuth vinkel) for den spiralformede rekonstruksjon. Det tredje og siste trinn er kritisk for å validere den heliske struktur, ved å sammenligne de 3D baner fremstilt ved den spiralformede og elektron tomografi (uten pålagt symmetri) rekonstruksjoner av den samme prøven.

Den presenterte metoden er unik i sin evne til å løse funksjonelle struktur av membran-assosiert proteiner i nærheten av fysiologiske forhold. Den LNT utviklet i vårt laboratorium kan blimed hell anvendes som en plattform for skruelinjeformet organisering av funksjonelle membranbundne blodkoagulasjonsfaktorer og oppnå bedre oppløsning enn for FVIII organisert i membran-bundet 2D-krystaller, og som enkeltpartikler. Vårt mål er å ytterligere øke oppløsningen av våre spiralformede rekonstruksjoner ved å forbedre homogenitet og kvaliteten på de endelige partikkel settene. Samle flere Cryo-EM mikrografer på bedre Cryo-EM forhold (Feltet utslipp pistol, energi filter, DE kamera detektorer) av FVIII-LNT spiralfilamenter og derfor inkludert større innledende partikkel sett for 2D rekonstruksjon vil oppnå dette. Forbedring av FVIII-LNT spiralformede montering og 3D rekonstruksjonsalgoritmer vil tillate oss å få sub-nanometer og nær atom-oppløsning, noe som vil entydig definere membranbundne organisering av denne kritiske for blod koagulasjon protein.

Organisere helically homologe FVIII former gir oss også muligheterty til å karakterisere hvor forskjellen i rekkefølge kan korrelere til forskjeller i struktur og funksjon. Løsing av de humane og porcine FVIII membranbundne strukturer ved de metoder som er beskrevet i denne artikkelen, kan bidra til å identifisere sekvenser som når de modifiseres vil forbedre det rekombinante faktor VIII-funksjon. Denne kunnskapen vil ha betydelige kliniske implikasjoner for legemiddelforskning i både trombose og hemostase felt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen å konkurrere økonomisk interesse, og de kan kontaktes direkte angående noen av prosedyrene som er publisert i dette manuskriptet.

Acknowledgements

Dette arbeidet støttes av en nasjonal Scientist Development stipend fra American Heart Association: 10SDG3500034 og UTMB-NCB starte opp midler til SSM. Forfatterne erkjenner Cryo-EM og Scientific Computing fasilitetene på Sealy senter for strukturbiologi på UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), samt legene. Steve Ludtke og Ed Egelman for hjelp med 2D og 3D spiralformede rekonstruksjonsalgoritmer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM2100 with LaB6 JEOL Ltd. JEM-2100 operated at 200 kV
with TEMCON software JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder Gatan, Inc. 626.DH cooled to -175 °C
with temperature controler unit Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera Gatan, Inc. US4000 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV FEI
Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid Ted Pella 01821 plasma cleaned for 10 sec on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh Electron Microscopy Sciences Q225-CR2 Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes 
Uranyl acetate dihydrate Ted Pella 19481 1% solution, filtered
Galactosyl ceramide Avanti Polar Lipids Inc. 860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids Inc. 840035
EM software Digital Micrograph Gatan, Inc. http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN free download http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
EM software Spider free download http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR free download Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD) free download http://bio3d.colorado.edu/imod/ 
EM software (SerialEM) free download ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera free download http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
  2. Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
  3. Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
  4. Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
  5. Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. (2013).
  6. Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
  7. Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
  8. Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
  9. Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
  10. Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
  11. Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
  12. Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
  13. Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
  14. Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
  15. Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
  16. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
  17. Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
  18. Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
  20. Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
  21. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics