Organisation hélicoïdale de facteur VIII de coagulation du sang sur les lipides nanotubes

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Bioengineering

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Summary

Nous présentons une combinaison de cryo-microscopie électronique, lipides nanotechnologies, et l'analyse de la structure appliquée pour résoudre la structure membranaire des deux formes de FVIII hautement homologues: les droits et les porcins. La méthodologie développée dans notre laboratoire à organiser de manière hélicoïdale les deux formes de FVIII recombinants fonctionnels sur les nanotubes de lipides chargés négativement (LNT) est décrite.

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Miller, J., Dalm, D., Koyfman, A. Y., Grushin, K., Stoilova-McPhie, S. Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes. J. Vis. Exp. (88), e51254, doi:10.3791/51254 (2014).

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Abstract

Cryo-microscopie électronique (cryo-ME) 1 est une approche puissante pour étudier la structure fonctionnelle des protéines et complexes dans un environnement hydraté de l'Etat et de la membrane 2.

Le facteur de coagulation VIII (FVIII) 3 est une glycoprotéine du plasma sanguin multi-domaines. Défaut ou l'insuffisance de facteur VIII est la cause pour le type d'hémophilie A - un trouble de saignement grave. Lors de l'activation protéolytique du FVIII se lie à la sérine protéase du facteur IXa sur la membrane plaquettaire chargée négativement, ce qui est essentiel pour la coagulation sanguine normale 4. Malgré le rôle essentiel dans la coagulation FVIII joue, des informations structurelles pour son état ​​membranaire est incomplète 5. Recombinant concentré de facteur VIII est le médicament le plus efficace contre le type de l'hémophilie A et disponibles dans le commerce FVIII peut être exprimée comme humaine ou porcine, les deux complexes fonctionnels formant avec le facteur humain IX 6,7.

"> Dans cette étude, nous présentons une combinaison de cryo-microscopie électronique (cryo-ME), lipides nanotechnologie et de la structure d'analyse appliquée pour résoudre la structure de deux formes de FVIII hautement homologues membranaire. Humain et porcin La méthodologie développée dans notre laboratoire d'organiser de manière hélicoïdale les deux formes de FVIII recombinants fonctionnels sur les nanotubes de lipides chargés négativement (LNT) est décrite. Les résultats représentatifs montrent que notre approche est suffisamment sensible pour définir les différences dans l'organisation hélicoïdale entre les deux fortement homologue en séquence (identité de séquence de 86% ) des protéines. protocoles détaillés pour l'organisation hélicoïdale, Cryo-EM et la tomographie électronique (ET) d'acquisition de données sont donnés. bidimensionnel (2D) et en trois dimensions (3D) analyse de la structure appliquées pour obtenir les reconstructions 3D humaine et porcine FVIII-LNT est discutée. Les structures humaines et porcines FVIII-LNT présentés montrent le potentiel de la méthodologie proposée pour Calculate l'organisation fonctionnelle, liée à la membrane de la coagulation sanguine facteur VIII à haute résolution.

Introduction

La coagulation du sang de facteur VIII (FVIII) est une grande glycoprotéine de 2332 acides aminés organisés en six domaines: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Lors de l'activation de la thrombine FVIII agit comme cofacteur pour le facteur IXa dans le complexe tenase liée à la membrane. La liaison de FVIII activé (FVIIIa) pour FIXa d'une manière à la membrane augmente en fonction FIXa efficacité protéolytique plus de 10 5 fois, ce qui est critique pour l'efficacité de coagulation de sang 4. Malgré le rôle important dans la coagulation FVIII joue et la formation du complexe tenase, la structure de FVIII membranaire fonctionnel est encore à résoudre.

Pour y remédier, nanotubes de bicouche lipidique (LNT) riche en phosphatidylsérine (PS), capables de se lier avec une forte affinité FVIII 8, 9 et ressemblant à la surface des plaquettes activées ont été mises au point 10. Organisation hélicoïdale consécutive de FVIII lié à LNT a été prouvé pour être effive pour déterminer la structure de FVIII état ​​liée à la membrane par Cryo-EM 5. Fonctionnalisé LNT sont un système idéal pour étudier la protéine-protéine et des interactions protéine-membrane des protéines associées à la membrane de manière hélicoïdale organisées par cryo-EM 11, 12. Cryo-EM présente l'avantage par rapport aux procédés traditionnels de structure telles que la cristallographie aux rayons X et résonance magnétique nucléaire, que l'échantillon est conservé à la plus proche de l'environnement physiologique (tampon, une membrane, le pH), sans additifs et des isotopes. Dans le cas du FVIII, étude de la structure membranaire avec cette technique est encore plus physiologiquement pertinents, comme la LNT ressemblent beaucoup par la taille, la forme et la composition des pseudopodes des plaquettes activées où les complexes de tenase assemblent in vivo.

Les défauts et les carences de la cause FVIII hémophilie A, un trouble de saignement grave qui affecte de 1 à 5000 hommes de la population humaine 4, 6. La plupart des ethérapie éfficace pour l'hémophilie A est l'administration long de la vie du FVIII humain recombinant (facteur VIII humain). Une complication importante de la thérapie FVIII recombinant hémophilie A est le développement d'anticorps inhibiteurs de la forme humaine qui touche environ 30% des patients atteints d'hémophilie A 13. Dans ce cas, le FVIII porcin (pFVIII) concentré est utilisé, en tant que facteur VIII porcin affichages faible réactivité croisée avec des anticorps inhibiteurs contre le FVIII humain et forme des complexes fonctionnels avec FIXa humain 7. Fixant l'organisation liée à la membrane des deux porcine et formes de FVIII humains est important de comprendre la base structurelle de la fonction et les implications pour l'hémostase de sang cofacteur FVIII.

Dans cette étude, nous décrivons une combinaison de lipides nanotechnologies, Cryo-EM, et analyse de la structure visant à résoudre l'organisation liée à la membrane de deux formes de FVIII hautement homologues. Les données Cryo-EM présentés et structures 3D pour Porci hélice organiséFVIII humain ne et chargée négativement sur LNT montrent le potentiel de la nanotechnologie proposé comme base pour la détermination de structure et des facteurs FVIII et de complexes dans un environnement de membrane physiologique coagulation liés à la membrane.

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Protocol

1. Préparation de l'échantillon

  1. l'échange de tampon FVIII humain BDD-FVIII porcin et 14 BDD-15 contre du tampon HBS-Ca (20 mM d'HEPES, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, pH = 7,4) et on concentre à 1,2 mg / ml. Conserver la solution de protéine à -80 ° C.
  2. Préparer nanotubes lipidiques (LNT) en mélangeant galactosylcéramide (GC) et la phosphatidylsérine (PS) à 01:04 en poids / poids dans du chloroforme rapport. On évapore le chloroforme sous atmosphère d'argon et de solubiliser les lipides dans un tampon HBS à 1 mg / ml. Conserver la solution de LNT à 4 ° C.

2. Cryo-microscopie électronique de FVIII-LNT

  1. Cryo-EM Préparation de l'échantillon
    1. Décharge luminescente 300 mesh Quantifoil R2 / 2 grilles de cuivre (côté de carbone jusqu'à) dans un mélange de O 2 et H 2 gaz pendant 10 secondes à 50 W.
    2. Mélanger les solutions FVIII et LNT dans un tampon HBS-Ca 1:1 w / w rapport et incuber pendant 15 min à température ambiante.
    3. Appliquez une goutte de 2,5 piéchantillon de FVIII-LNT à la grille de microscopie électronique hydrophile dans la chambre humidifiée Vitrobot Mark IV (100% d'humidité).
    4. Blot et flash geler la grille (un blot pour 3.5 sec, la force effacer 1) en liquide C 2 H 6, refroidi par liquide N 2 pour obtenir de la glace amorphe.
    5. réseaux de magasins dans des boîtes de rangement sous N2 liquide (LN2).
  2. Collecte de données Cryo-EM
    NOTE: Le JEM2100-LaB6 (année 2010) est équipé d'un système d'exploitation TEMCON constitué d'un ordinateur connecté au microscope électronique, un écran avec des fenêtres de lecture du système de vide, le système d'illumination, HT, les courants de lentille et ainsi en marche, et deux panneaux: gauche et droite, placée de chaque côté de la colonne. Le passage du faisceau X, Y boutons (MAJ Y, Y EIPD) et le multifonctions (DEF / STIG) boutons sont sur les deux tableaux. Sur le panneau de gauche est le bouton d'éclairage (brigthness). Sur le panneau de droite sont: le grossissement (MAG / CAM LONGUEUR) et mise au point (FOCUS) boutons et les trois Imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) et un réseau de diffraction (DIFF) modes boutons. Nous acquérons nos données dans MAG1 à alpha 2. Les conditions minimales de la dose d'illumination (MDS) nécessaires à l'acquisition de données Cryo-EM sont fixés F1 à F6, boutons de la rangée du haut sur le panneau arrière. Dans ce protocole, les paramètres génériques sont utilisés: F1 - lever / abaisser l'écran, F2 - mode de recherche, F3 - Mode FOCUS, F4 - mode PHOTO, F5 - MDS OFF / ON et F6 - BEAM BLANC, utilisé pour protéger l'échantillon de rayonnement endommager en déviant le faisceau.
    1. Placez le porte-cryo dans le cryo-poste et remplir le vase de Dewar de la porte et la cryo-poste avec LN2. Lorsque la température atteint -192 ° C, obturateur ouvert sur la pointe de la titulaire, le lieu préalablement congelé grille Cryo-EM dans l'endroit désigné et sûr d'un collier de serrage.
    2. Insérez le porte-cryo dans le microscope électronique. Remplir le Dewar du porte-cryo et la chambre anti-contaminateur avec LN2. Attendez que le titulaire se stabiliser pendant 30-60 min. Appuyez sur F6 sur ettourner le filament sur. Lorsque le filament est saturée, appuyez sur F6 au large et l'ouverture du volet sur le support pour afficher la grille.
    3. Appuyez sur Bas Mag / alpha 1 (fixé à 200X mag) et de localiser les zones de glace mince sur la grille.
    4. Mettez à MAG 1/alpha 2 pour régler la dose minimum de mode (MDS) et l'acquisition de données Cryo-EM à de faibles doses d'électrons, sans endommager l'échantillon.
      1. Appuyez sur F2 pour régler le mode de recherche. Réglez l'agrandissement à 40 000 x. Agrandir poutre avec brigtness bouton de dose d'électrons minimale ~ 0,04 e - / A 2 · s. Appuyez sur DIFF pour passer en mode de diffraction. Régler la longueur de l'appareil photo à 120 cm avec bouton MAG / CAM LONGUEUR. Localiser les zones de la grille à l'intérieur des zones pré-sélectionnées dans LOWMAG qui ont des nanotubes lipidiques dans les trous de la couche de carbone.
      2. Appuyez sur F4 pour passer en mode photo à 40 000 X grossissement et mis en lumière avec LUMINOSITE bouton à des doses de 16-25 e - / 2 · s. Appuyez sur le bouton standard mise au point de fixer les conditions de mise au point le réglage de la hauteur Zde l'échantillon avec les Z touches UP / DOWN (du panneau de commande à droite). Réglez défocalisation entre -1,5 et -2,5 um.
      3. Alignez RECHERCHE et le mode PHOTO par dessiner un carré dans la fenêtre Live View sur l'écran numérique de l'appareil photo en mode de recherche correspondant à la zone à imager en mode PHOTO.
      4. Appuyez sur F3 pour régler le mode de mise au point à 100 000 X grossissement. Concentrez-éclairage pour couvrir le capteur CCD (~ 4 - 5 cm de rayon) et hors axe pour ne pas irradier la zone à imager en mode PHOTO. Réglez défocalisation à ~ -1,5 et -2,5 um avec le bouton FOCUS et correcte pour l'astigmatisme de l'image avec les boutons DEF / STIG.
    5. Sélectionnez le FVIII-LNT à imager en mode de recherche par l'acquisition d'images en direct dans la fenêtre Live View sur l'écran de l'appareil photo numérique. Centrez le FVIII-LNT dans le carré dessiné sur la fenêtre de vue en direct.
    6. Enregistrer une image numérique sur la caméra CCD à 52000 grossissement X efficace et 0,5 exposition sec pour passer en mode photo et en cliquant sur le acquirE bouton sur l'écran de la caméra de micrographie numérique. Les conditions d'acquisition d'image sont définis comme le blanc de faisceau (de VOLETS) ouvert uniquement lorsque l'image est acquise en mode PHOTO.
    7. Vérifier la qualité et la défocalisation de l'image acquise en appuyant sur CTRL-F pour obtenir une transformée de Fourier rapide (FFT).

3. Reconstruction 3D

REMARQUE: Le logiciel d'analyse d'images utilisés pour l'analyse 2D et 3D: EMAN2 et IHRSR sont disponibles gratuitement. EMAN2 peuvent être téléchargés à partir de http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. Le logiciel IHRSR peut être obtenu à partir de professeur Egelman: egelman@virginia.edu. Les améliorations de IHRSR finales sont exécutés sur le Texas Advanced Computing cluster central: http://www.tacc.utexas.edu/ à l'Université du Texas, Austin. L'algorithme de reconstruction 3D montre la figure 1 se compose de deux étapes principales: la sélection d'abord un ensemble homogène de segments hélicoïdaux (particules) avec la référence libre alignme 2Dnt (RFA) des algorithmes mis en oeuvre dans EMAN 2, deuxième réalisation d'une reconstruction 3D à partir des paramètres hélicoïdaux et des algorithmes de rétroprojection incorporés dans IHRSR. La première étape utilise les programmes développés pour la sélection des ensembles de particules homogènes pour la reconstruction 3D avec seule particule SPA (algorithmes) pour lesquels EMAN2 a été spécialement développés et distribués: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Cette étape a été adapté aux données Cryo-EM. La seconde étape est obtenue avec l'algorithme IHRSR, qui est spécifiquement conçu pour le type d'ensembles hélicoïdaux obtenus avec les formes du facteur VIII recombinant. Cet algorithme a été largement documenté dans la littérature scientifique 12.

  1. Effectuer l'analyse d'image 2D avec le EMAN2 scientifique bains de traitement d'image: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 pour sélectionner particule homogène (segment hélicoïdal) des ensembles pour la reconstruction hélicoïdale.
    1. Sélectionnez micrographies Cryo-EM avec straight et bien organisé tubes hélicoïdaux avec le logiciel de l'appareil photo numérique et des outils de visualisation.
    2. Inverser, normaliser et filtrer les pixels rayons X dans l'interface graphique e2workflow.py, la reconstruction de particules unique d'option (SPR): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. Importez les images inversées, normalisées et pixel X-ray filtré dans l'interface graphique de e2helixboxer.py. Sélectionnez tubes hélicoïdaux FVIII-LNT et le segment à 256 x 256 pixels (2,9 Å / pix) avec 90% de chevauchement à l'aide: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. Évaluer la défocalisation des micrographies originaux et appliquer contraste fonction de transfert (FCT) de correction (uniquement de correction de phase) pour les segments hélicoïdaux des mêmes micrographies avec l'option e2ctf.py incorporé dans le e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
    5. Générer des particules initiales (segments hélicoïdaux) définit dans l'interface graphique e2workflow.py option - SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
    6. Calculer des moyennes de classe 2D avec l'algorithme de e2refine2d.py appliquer référence sans classification k-moyenne pour sélectionner les ensembles de données homogènes avec le même LNT de diamètre et le degré de l'ordre hélicoïdale (figure 2), à la suite du script: «e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - entrée = INPUT.hdf - NCL = 51 - simcmp = point - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = point - classraligncmp = Phase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = moyenne - normproj-classkeepsig ', en changeant la valeur NCL en conséquence.
      1. Classer l'ensemble dans de les LNC = 151 '150 catégories de plus de 8 itérations avec' classkeep = 0,8 'données initiales, ce qui signifie que les particules de moins de 80% de similarité avec la moyenne de la classe sont exclus de la classe donnée. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Fusionner des particules à partir des moyennes de classeavec diffraction hélicoïdale prononcée dans e2display.py pour créer ensemble de données intermédiaire.
      3. Classer l'ensemble dans de les LNC = 51 '50 catégories de différencier les classes avec le même diamètre et le degré de l'ordre des données intermédiaires.
      4. Fusionner des particules à partir des classes de même diamètre et le degré de l'ordre dans e2display.py pour créer l'ensemble de données final pour la reconstruction tridimensionnelle: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
  2. Effectuer reconstruction hélicoïdale avec l'algorithme itératif hélicoïdal réel espace de reconstruction (IHRSR), comme décrit dans Egelman 17, 18.
    1. Estimer la hausse, Az (A) de l'hélice FVIII-LNT de Fourier combinée transformer des particules dans l'ensemble de données final.
    2. Définir l'angle azimutal ΔΦ (º) en exécutant un critère de IHRSR parallèles avec une Az constant, croissant ΔΦ de 576; 60 ° à 5 °.
    3. Exécutez 100 cycles IHRSR consécutives pour chaque ensemble d'un cylindre sans relief comme un volume initial et les paramètres hélicoïdaux initiales Az et ΔΦ tels que définis au point 3.2.1 des données finales. et 3.2.2.
    4. Inspectez les derniers volumes de la convergence des paramètres hélicoïdaux et la correspondance entre les moyennes de classe de la classification 2D de l'ensemble de données final et les projections de la reconstruction de IHRSR finale.
    5. Imposer une symétrie aux reconstructions 3D finale, correspondant à la distribution de l'unité asymétrique observé dans les volumes finaux asymétriques 3D: quatre fois pour le FVIII humain-LNT et 5 fois pour le FVIII porcin-LNT. Exécutez un autre 100 cycles de raffinement, pour une reconstruction finale 3D symétrisé.
    6. Calculer la courbe de corrélation Fourier Shell pour les deux volumes en séparant d'abord l'ensemble de paires et impaires données correspondantes: «e2proc2d.py <infile> <outfile> - split = 2 '. Ensuite, exécutez 100 IHRSR améliorations consécutives comme décrit au paragraphe 3.2.3. Calculer le FSC des volumes 3D créés à partir des ensembles de données pairs et impairs: «e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc.
  3. Visualisez et Segment volumes FVIII-LNT dans UCSF chimère.
    1. Ouvrez les derniers volumes de l'étape 3.2.5. dans UCSF Chimera et définir le niveau de contour à 0,005 dans le OUTILS> données de volume> option Volume Viewer.
    2. Dans OUTILS> données de volume> Carte Segment, sélectionnez le volume dans l'onglet PLAN DU SEGMENT et cliquez sur un segment à volume.
    3. segments du groupe correspondant à une cellule de l'unité en sélectionnant avec CTRL + SHIFT et le groupe de clic.
    4. Colorer les segments par la cellule de l'unité et l'hélice avec ACTIONS> option de couleur pour souligner les caractéristiques structurelles.

4. Tomographie Electron

  1. Négativement Stained FVIII-LNT Préparation de l'échantillon
      <li> Préparez échantillons FVIII-LNT que pour les expériences Cryo-EM.
    1. Effluves grille de cuivre à 300 mailles recouverte de carbone (côté vers le haut du carbone) dans un mélange de O 2 et de H 2 gazeux pendant 10 sec à 50 W, comme pour les expériences Cryo-EM.
    2. Appliquez une goutte de 2,5 pi suspension FVIII-LNT avec 6 nm nanoparticules d'or colloïdal sur la grille, éponger l'excès de liquide et tacher négativement en appliquant 5 pi solution à 1% d'acétate d'uranyle pendant 2 min. Éponger l'excès de liquide et de l'air sec de la grille.
  2. Collecte de données de tomographie électronique
    1. Transférer la grille dans le support d'inclinaison unique.
    2. Transférer le support dans le microscope électronique.
    3. Collecter automatiquement série d'inclinaison avec le logiciel de SerialEM 19 à 2 ° par incréments sur une plage angulaire de -60 ° à 60 images ° et enregistrer avec une caméra CCD à 52 000 X grossissement efficace, de -6 à -10 um défocalisation et la dose d'électrons de 150 - 170 élémentctrons / Å 2 · s par tomographie.
  3. Electron tomographie reconstruction du FVIII-LNT
    Remarque: Reconstruire la série inclinée pFVIII-LNT et le facteur VIII humain-LNT acquis en 4.2. avec l'option ETomo du logiciel IMOD suivant le tutoriel: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
    1. En utilisant une fenêtre de terminal, ouvrez la tomographie en 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
    2. Bin la tomographie par 4 avec le IMOD BINVOL commande pour diminuer la taille de la tomographie.
    3. Choisissez le bon angle pour faire tourner le nanotube lipidique long de l'axe Y dans la tomographie en cellule en utilisant la commande IMOD ROTATEVOL.
    4. Tournez la tomographie complète avec la commande IMOD ROTATEVOL.
    5. Recadrer le lipide nanotube choisi, orienté selon l'axe Y avec la commande CLIP REDIMENSIONNER IMOD.
    6. Ouvrez le sous-tomographie recadrée avec 3DMOD.
    7. Cliquez sur la tomographie de visualiser l'agencement des molécules de facteur VIII longles tranches dans de l'axe Z et le long de l'axe Y dans le volume sous-tomogramme.

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Representative Results

FVIII porcin recombinant humain et ont été organisés avec succès en hélice sur chargée négativement unique LNT bicouche, ressemblant à la surface des plaquettes activées. L'organisation hélicoïdale de l'humain et porcin FVIII-LNT était conforme à travers les micrographies numériques collectées (Figure 2). La LNT de contrôle et de l'humain et de tubes hélicoïdaux FVIII-LNT porcine ont été sélectionnés et segmentés avec l'interface graphique de e2helixboxer.py et des ensembles de données initiaux créés avec l'interface graphique de e2workflow.py, l'option unique de particules (tableau 1).

L'ordre hélicoïdal de l'humain et liée à la membrane porcine FVIII-LNT a été évaluée à partir de la transformée de Fourier de la moyenne de la classe avec l'interface graphique e2display.py (EMAN2) (figure 3). La bicouche lipidique dans les meilleures moyennes de classe 2D contrôle de LNT est bien défini. Le feuillet interne et externe et de plus faible densité du noyau hydrophobe de la membrane sont nettement visibles ( (figures 3B et 3C) clairement. La torsion plus prononcé pour les tubes hélicoïdaux FVIII-LNT humains indique que les interactions protéine-protéine entre les molécules de FVIII adjacentes membranaires sont systématiquement différente pour les deux formes de FVIII (figures 3B et 3C). Particules de moyennes de groupe montrant une bonne organisation hélicoïdale (diagramme de diffraction hélicoïdale) ont été fusionnées dans l'interface graphique e2display.py pour former un ensemble de particules intermédiaire (tableau 1). Les particules à partir des ensembles de particules intermédiaires ont été à nouveau classés en 50 catégories, avec les mêmes contraintes. Les particules de moyenne de classe avec le même diamètre ont été fusionnées dans les données finalesdes ensembles (tableau 1).

Reconstructions 3D initiales pour le FVIII-LNT humain et porcin ont été réalisées avec 1000 particules représentatives de l'ensemble de données FVIII-LNT porcine humaine et finale. Cent itérations IHRSR consécutives ont été effectuées pour chaque reconstruction 3D avec un cylindre sans relief (160 Å intérieur et le diamètre extérieur de 500 Å), en tant que volume initial. La montée axiale (Az) calculée à partir de la transformée de Fourier transformée combinée des segments hélicoïdaux (particules SET) est égal à 41 Å de FVIII humain LNT et 36 Å pour les porcins FVIII-LNT (figures 4A et 4B). L'angle azimutal initial (ΔΦ) définie à partir de la recherche itérative est estimé à 40,0 ° pour le FVIII humain LNT et à 35,0 ° pour le FVIII porcin-LNT. Les derniers volumes sont inspectés pour la convergence des paramètres hélicoïdaux et la correspondance entre les moyennes de classe et les projections de la reconstituées finaleuction, également suivant les critères décrits dans 5. Les reconstructions 3D sélectionnés et les paramètres hélicoïdaux correspondant sont imposées comme des volumes initiaux et les paramètres hélicoïdaux initiales pour un deuxième raffinement de IHRSR de 100 cycles qui ont convergé à un quatre démarrer organisation hélicoïdale pour le FVIII-LNT humain avec Az = 41,1 Å et ΔΦ = 42,0 ° et cinq commencer organisation hélicoïdale pour le FVIII porcin-LNT avec Az = 35,5 Å et ΔΦ = 34,8 °. A 100 derniers IHRSR itérations imposant une fois 4 et 5 symétrie hélicoïdale pour le porc reconstructions FVIII-LNT humaine et respectivement sont réalisées avec des volumes initiaux et correspondant paramètres hélicoïdaux des dernières asymétriques raffinements IHRSR (figures 4C et 4D). Les volumes finaux 8 montrent FVIII humain et 10 des molécules liées à la membrane de FVIII porcins organisés autour de l'axe d'hélice (figure 5A). Chaque être humainmolécule de FVIII est traduite 41,2 Å et 42,0 ° en rotation par rapport au précédent, et chaque molécule de facteur VIII porcin est traduite 35,9 Å et 35,2 ° en rotation par rapport au précédent, correspondant à des paramètres hélicoïdales des reconstructions 3D finale (Figure 5B).

Les tomographies d'électrons reconstruits confirmer la différence dans l'organisation hélicoïdale entre le FVIII-LNT humain et porcin obtenu dans les mêmes conditions expérimentales. Comparaison des vues de dessus des tomographies reconstruits et les volumes 3D de la reconstruction hélicoïdale vu dans la direction perpendiculaire à l'axe de l'hélice, valide encore davantage l'exactitude des reconstructions 3D raffinés avec les IHRSR paramètres hélicoïdaux (figure 6). Les dimensions de la cellule unitaire 2D asymétriques pour la reconstruction 3D LNT-FVIII humain sont: a = 17,8 nm, b = 8,2, γ = 84 ° et pour la reconstruction 3D LNT-FVIII porcin: a =18,4, b = 7,2 et γ = 70 ° (figure 6). Les dimensions de la maille unitaire du FVIII humain organisé en cristaux 2D liés à la membrane sont les suivantes: a = 8,1, b = 7,0 et γ = 67 °, ce qui correspond à la surface couverte par une molécule de FVIII vu en direction de la membrane de la surface 20. La comparaison des dimensions de la cellule unitaire entre FVIII organisés en 2D et en cristaux hélicoïdaux indique que les deux molécules de facteur VIII humain et porcin forment des dimères lorsque organisée de façon hélicoïdale sur la surface du LNT.

Figure 1
Figure 1. Organigramme de l'analyse de la structure. Les étapes suivies pour l'analyse de classification 2D basé sur référence libre algorithmes d'alignement mis en œuvre dans EMAN2 16 sont entourés en bleu. Les étapes suivies pour l'analyse 3D réalisée avec le vrai hélicoïdal itératif reconstruction de l'espace algorithmes (IHRSR) sont entourés en rouge. Les cycles itératifs IHRSR sont indiqués par des flèches en pointillés.

Figure 2
Figure 2. Micrographies Cryo-EM numériques. (4096 x 4096 pixels, 2,9 Å / pix) de nanotubes lipidiques (LNT) avec et sans FVIII lié. A. LNT contrôle. B. humain FVIII-LNT. C. porcine FVIII-LNT . Le bord du trou dans le film de carbone, dans lequel le FVIII-LNT sont mis en suspension dans de la glace amorphe est indiqué par une étoile blanche. Les densités de protéines et de lipides sont en noir. Les vues agrandies (de encarts) de 512 x 512 superficies cultivées (blanche pointillée carré) illustrer la différence dans l'organisation hélicoïdale de l'humain et du FVIII porcin, respectivement. La barre d'échelle est de 100 nm.ig2highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Moyennes de classe représentative 2D (rangée du haut) et transformées de Fourier correspondantes (rangée du bas) à partir des ensembles de particules intermédiaires (tableau 1) classés dans 50 catégories. A. Contrôle LNT B. humain FVIII-LNT C. porcine FVIII-LNT. Le nombre de classes et le nombre de particules comprises dans chaque catégorie sont indiqués. La différence afin hélicoïdale entre le FVIII humain et porcin est clairement visible sur les images et confirmée par les motifs de diffraction obtenus à partir de la transformée de Fourier de ces images. S'il vous plaît cliquer ici pour voir uneune plus grande version de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Reconstructions 3D hélice de l'homme et porcine FVIII-LNT. A. combinée à transformée de Fourier à partir de 1000 segments hélicoïdaux. La première et la deuxième ligne de la couche sont centrées à 1/82 Å -1 et 1/41 A -1 pour humain FVIII-LNT, et à 1/72 Å -1 et 1/36 Å -1 pour les porcins FVIII-LNT (blanc flèches). B. Représentation de surface de l'homme en rose (Az = 41,1 Å, ΔΦ = 42,0 º) et porcine en bleu (Az = 35,9 Å, ΔΦ = 35,2 º) reconstructions hélicoïdaux FVIII-LNT 3D. Les deux volumes sont présentés à 0,005 niveau du contour (densité minimale est 0 et la densité maximale de 0,02, tel que calculé à l'UCSF carillonra, l'option Volume de spectateur 21). La longueur du tube FVIII-LNT est de 256 pixels à 2,9 Å / pix. Corrélation C. Fourier Shell (FSC) des parcelles à usage humain et porcin FVIII-LNT montrant une résolution de 20,5 Å FSC = 0,5.

Figure 5
Figure 5. Organisation hélicoïdale du FVIII-LNT. Représentation de surface segmentée humaine et porcine de reconstructions hélicoïdaux FVIII-LNT humains et porcins, montré à la figure 4B. Les volumes sont segmentés après avoir imposé 4 symétrie au FVIII humain LNT et 5 symétrie au FVIII porcin-LNT. Les unités asymétriques sont codées en couleur jaune-rouge pour le FVIII humain LNT et bleu-vert pour les porcins FVIII-LNT. A. Vues le long de l'axe hélicoïdal indiqué par un carré pour l'être humain et queun pentagone pour le FVIII porcin-LNT. La structure-FVIII humain LNT 8 montre molécules organisés autour de la membrane externe LNT et la structure de FVIII porcin montre 10 molécules organisés autour de la membrane externe LNT, indiqués par des nombres. B. Vues perpendiculaire à l'axe d'hélice. Le FVIII-LNT humain est un 4-commencer structure hélicoïdale et le porc-FVIII LNT est à 5 commencer structure hélicoïdale. Les particuliers un hélices de départ sont indiquées avec les chiffres et un code de couleur. Nous avons mis l'accent sur l'une des hélices de chaque structure avec un (*) et les lignes vertes. La barre d'échelle est de 20 nm.

Figure 6
Figure 6. Comparaison entre les reconstructions 3D hélicoïdaux et tomographie. L'humain FVIII-LNT (A) et porcine FVIII-LNT (C) reconstructions 3D hélicoïdale sont présentées perpéndicular à l'axe d'hélice. Chaque cellule élémentaire et les hélices individuelles sont codés par couleur comme sur la figure 5. B. et D. sont des représentations de densité des reconstructions tomographiques en 3D, vus perpendiculairement à l'axe d'hélice. Le treillis 2D reflétant l'agencement en hélice des molécules de FVIII est représenté avec des lignes vertes.

ÉCHANTILLONS clnt le facteur VIII humain-LNT pFVIII-LNT
Clichés initiales 61 474 542
Des ensembles de particules initiales 29113 60395 64665
Défocalisation (nm) -4051 ± 502 -3643 ± 737 -3443 ± 1086
Des ensembles de particules intermédiaires 25907 27305 22773
Ensembles de particules finales 25907 10455 10430

Tableau 1. Statistiques d'analyse 2D suivantes de l'algorithme présenté dans l'organigramme de la figure 3.

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Discussion

Dans ce travail, une méthodologie est présentée à la différence entre les deux organisations de protéines hautement homologues membranaires: FVIII humain et porcin auto-assemblée sur des nanotubes lipidiques dans les conditions rencontrées dans le corps humain.

Dans la procédure décrite, humain et porcin FVIII sont organisées de façon hélicoïdale avec succès sur des nanotubes de lipides, qui est l'étape la plus critique. La prochaine étape cruciale est de conserver l'échantillon dans de la glace amorphe mince par surgélation à l'azote liquide près de 2 température. La préservation de l'échantillon dans la glace et LN2 température amorphe maintient les tubes hélicoïdaux hydratés et les assemblages macromoléculaires protéines-lipides physiologiquement active. L'étape finale critique acquiert données Cryo-EM de quantité et de qualité suffisante pour une structure 3D de haute résolution à la température de près de LN2. La collecte de données à la température de près de LN2 empêche la poursuite de la déshydratation de l'échantillon dans le haut vacuum du microscope et les dommages causés par le rayonnement du faisceau d'électrons.

Pour calculer la structure membranaire de la FVIII la première étape critique est d'obtenir des particules homogènes (segments hélicoïdaux) ensembles en appliquant 2D classification libre de référence et de combiner des particules de classes ayant le même diamètre et le degré de l'ordre. La deuxième étape critique est d'imposer le volume droit initial et les paramètres hélicoïdaux (lieu et l'angle azimutal) pour la reconstruction hélicoïdale. La troisième et dernière étape critique est de valider la structure hélicoïdale en comparant les cartes 3D obtenues par la tomographie hélicoïdale et électrons (sans symétrie imposée) reconstructions du même spécimen.

La méthodologie présentée est unique dans sa capacité à résoudre la structure fonctionnelle des protéines associées à la membrane dans des conditions proches physiologiques. La LNT développé dans notre laboratoire peut êtreutilisés avec succès en tant que plate-forme pour l'organisation hélicoïdale des facteurs de coagulation du sang membranaires fonctionnelles et parvenir à une meilleure résolution que pour le FVIII organisé en cristaux 2D liées à la membrane et en tant que particules individuelles. Notre but est d'augmenter davantage la résolution de nos reconstructions hélicoïdales en améliorant l'homogénéité et de la qualité des ensembles de particules finales. Collecte plus micrographies Cryo-EM à de meilleures conditions Cryo-EM (Field Emission arme à feu, filtre d'énergie, Camera de détecteurs) du FVIII-LNT filaments hélicoïdaux et donc y compris les ensembles de particules initiales plus importantes pour la reconstruction 2D atteindre cet objectif. Améliorer l'ensemble hélicoïdal FVIII-LNT et des algorithmes de reconstruction 3D va nous permettre d'obtenir des sub-nanométrique et près de résolution atomique, qui définir sans ambiguïté l'organisation liée à la membrane de cette critique de la protéine de coagulation du sang.

Organisation des formes de FVIII hélice homologues nous donne aussi la opportunitésté de caractériser comment la différence dans la séquence peut corréler à des différences dans la structure et la fonction. Résoudre les FVIII membranaires structures humaines et porcines par les méthodes décrites dans cet article peut aider à identifier les séquences qui, une fois modifié sera d'améliorer la fonction de facteur VIII recombinant. Cette connaissance aura des implications cliniques importantes pour la découverte de médicaments dans les deux champs Thrombose et Hémostase.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier compétition et ils peuvent être contactés directement en ce qui concerne l'une des procédures publiées dans ce manuscrit.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par une subvention de développement national scientifique de l'American Heart Association: 10SDG3500034 et UTMB-BCN fonds de démarrage pour SSM. Les auteurs remercient les installations Cryo-EM et calcul scientifique au Centre de Sealy pour la biologie structurale à l'UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), ainsi que les Drs. Steve Ludtke et Ed Egelman de l'aide avec les algorithmes de reconstruction hélicoïdaux 2D et 3D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM2100 with LaB6 JEOL Ltd. JEM-2100 operated at 200 kV
with TEMCON software JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder Gatan, Inc. 626.DH cooled to -175 °C
with temperature controler unit Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera Gatan, Inc. US4000 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV FEI
Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid Ted Pella 01821 plasma cleaned for 10 sec on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh Electron Microscopy Sciences Q225-CR2 Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes 
Uranyl acetate dihydrate Ted Pella 19481 1% solution, filtered
Galactosyl ceramide Avanti Polar Lipids Inc. 860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids Inc. 840035
EM software Digital Micrograph Gatan, Inc. http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN free download http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
EM software Spider free download http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR free download Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD) free download http://bio3d.colorado.edu/imod/ 
EM software (SerialEM) free download ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera free download http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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