Tandhjulsgear Organization of Blood koagulationsfaktor VIII på Lipid Nanorør

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi præsenterer en kombination af Cryo-elektronmikroskopi, lipid nanoteknologi og struktur analyse anvendes for at løse den membranbundne struktur med to meget homologe FVIII former: menneskelige og svin. Den metode, udviklet i vores laboratorium for at skruelinieform organisere de to funktionelle rekombinante FVIII formularer på negativt ladede lipid-nanorør (LNT) er beskrevet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Miller, J., Dalm, D., Koyfman, A. Y., Grushin, K., Stoilova-McPhie, S. Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes. J. Vis. Exp. (88), e51254, doi:10.3791/51254 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) 1 er en kraftfuld metode til at undersøge den funktionelle struktur af proteiner og komplekser i en hydratiseret tilstand, og membranen miljø 2.

Koagulationsfaktor VIII (FVIII) 3 er et multi-domæne blodplasma glycoprotein. Defekt eller mangel på FVIII er årsagen til hæmofili type A - en alvorlig blødersygdom. Ved proteolytisk aktivering FVIII binder til serinprotease faktor IXa på negativt ladede blodplademembranen, hvilket er kritisk for normal blodpropper 4. På trods af den centrale rolle FVIII spiller i koagulation, strukturel information for sin membran-bundne tilstand er ufuldstændig 5. Rekombinant FVIII-koncentrat er den mest effektive lægemiddel mod hæmofili type A og kommercielt tilgængelig FVIII kan udtrykkes som human eller porcin begge danner funktionelle komplekser med human faktor IXa 6,7.

"> I denne undersøgelse præsenterer vi en kombination af Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM), lipid nanoteknologi og struktur-analyse anvendes for at løse den membranbundne struktur med to meget homologe FVIII former:. Human og porcin Den metode udviklet i vores laboratorium at spiralformet organisere to funktionelle rekombinante FVIII formularer på negativt ladede lipid nanorør (LNT) er beskrevet. De repræsentative resultater viser, at vores fremgangsmåde er tilstrækkelig følsom til at definere forskellene i den spiralformede organisation mellem de to meget homologe i sekvens (86% sekvensidentitet ) proteiner. Detaljerede protokoller for de spiralformede organisation, Cryo-EM og elektron tomografi (ET) dataopsamling er givet. De to-dimensionelle (2D) og tre-dimensionelle (3D) struktur analyse anvendes til at opnå 3D rekonstruktioner af menneskelige og svin FVIII-LNT diskuteres. De præsenterede menneskelige og svin FVIII-LNT strukturer viser potentialet i den foreslåede metode til berege funktionelle, membranbundet organisering af blodkoagulationsfaktor VIII med høj opløsning.

Introduction

Blodkoagulationsfaktor VIII (FVIII) er et stort glycoprotein 2.332 aminosyrer organiseret i seks områder: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Ved trombinaktivering FVIII fungerer som cofaktor for faktor IXa under den membranbundne tenasekompleks. Binding af aktiverede FVIII (FVIIIa) til FIXa i en membran-afhængig måde forbedrer FIXa proteolytiske effektivitet mere end 10 5 gange, hvilket er afgørende for en effektiv blodets koagulation 4. På trods af den vigtige rolle, FVIII spiller i koagulation og tenasekompleks formationen, funktionel membranbundet FVIII struktur er endnu ikke løst.

For at løse dette, enkeltdoser lipiddobbeltlaget nanorør (LNT) rig på phosphatidylserin (PS), der er i stand til at binde FVIII med høj affinitet 8, 9 og ligner den aktiverede blodpladeoverfladen blevet udviklet 10. Fortløbende spiralformet organisering af FVIII bundet til LNT har vist sig at være effective for struktur bestemmelse af FVIII membranbundne tilstand af Cryo-EM 5.. Funktionaliserede LNT er et ideelt system til at studere protein-protein-og protein-membran interaktioner af spiralformet arrangeret membran-associerede proteiner Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM har den fordel i forhold til traditionelle strukturelle metoder såsom røntgenkrystallografi og NMR, som prøven er bevaret på tættest på det fysiologiske miljø (puffer, membran, pH), uden tilsætningsstoffer og isotoper. I tilfælde af FVIII, studerer den membranbundne struktur med denne teknik er endnu mere fysiologisk relevant, da LNT ligner nøje af størrelse, form og sammensætning pseudopodia af de aktiverede blodplader, hvor TENase komplekser samles in vivo.

Mangler og mangel på FVIII årsag Hæmofili A, en alvorlig blødning lidelse, der rammer 1 ud af 5.000 hanner af den menneskelige befolkning 4, 6. Den mest eFFEKTIV terapi for Hæmofili A er livslang administration af rekombinant humant FVIII (hFVIII). En væsentlig komplikation af den rekombinante FVIII Hæmofili A-behandling er udviklingen af inhiberende antistoffer til den menneskelige form påvirker cirka 30% af hæmofili A-patienter 13. I dette tilfælde er porcin FVIII (pFVIII) koncentrat anvendes som svin FVIII viser lav krydsreaktivitet med inhiberende antistoffer mod human faktor VIII og danner funktionelle komplekser med human FIXa 7. Er vigtigt Etablering den membranbundne organisering af både porcin og human FVIII former til at forstå det strukturelle grundlag FVIII cofaktor funktion og konsekvenser for blod hæmostase.

I denne undersøgelse beskriver vi en kombination af lipid nanoteknologi, Cryo-EM, og struktur-analyse, der skal løse den membranbundne tilrettelæggelsen af ​​to meget homologe FVIII former. De præsenterede Cryo-EM data og 3D-strukturer for skruelinieform organiseret porcine og menneskelig FVIII på negativt ladede LNT viser potentialet i den foreslåede nanoteknologi som grundlag for strukturen bestemmelse af FVIII og membranbundne koagulationsfaktorer og komplekser i en fysiologisk membran miljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Prøveforberedelse

  1. Pufferudbytning human FVIII-BDD 14 og porcin FVIII BDD 15 imod HBS-Ca-buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCI, 5 mM CaCl2, pH = 7,4) og koncentreres til 1,2 mg / ml. Hold proteinopløsningen ved -80 ° C.
  2. Forbered lipidnanorør (LNT) ved at blande galactosylceramid (GC) og phosphatidylserin (PS) ved 1:04 w / w-forholdet i chloroform. Afdampes chloroform under argon og solubilisere lipider i HBS-buffer til 1 mg / ml. Hold LNT opløsning ved 4 ° C.

2. Cryo-elektron-mikroskopi FVIII-LNT

  1. Cryo-EM Prøveforberedelse
    1. Glow decharge for 300 mesh Quantifoil R2 / 2 kobber net (kulstof side op) i en blanding af O 2 og H 2 gas i 10 sek ved 50 W.
    2. Bland FVIII og LNT løsninger i HBS-Ca-buffer på 1:01 vægt / vægt-forhold og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
    3. Påfør en dråbe af 2,5 piFVIII-LNT prøve til den hydrofile elektronmikroskopi gitter i Vitrobot Mark IV befugtet kammer (100% fugtighed).
    4. Blot og flash fryse nettet (en skamplet for 3,5 sekund, skamplet kraft 1) i flydende C 2 H 6, nedkøles med flydende N 2 for at opnå amorf is.
    5. Opbevar gitre i opbevaringskasser under flydende N2 (LN2).
  2. Cryo-EM Dataindsamling
    BEMÆRK: JEM2100-LaB6 (år 2010) er udstyret med et TemCon styresystem består af en computer tilsluttet til elektron mikroskop, en skærm med vinduer læsning vakuum-system, belysning system HT, linse strømme og så-on, og to paneler: venstre og højre, placeret på begge sider af søjlen. Strålen skift X, Y drejeknapper (SHIFT Y, støvtætte Y) og multifunktion (DEF / STIG) drejeknapper er på begge paneler. På venstre panel er det belysning (brigthness) drejeknap. På højre panel er: forstørrelsen (MAG / CAM længde) og fokus (Fokus) drejeknapper og tre imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) og en diffraktion (DIFF) modes knapper. Vi opnår vores data i MAG1 på alfa-2. Minimumskravene dosis lysforhold (MDS), der kræves for erhvervelse Cryo-EM-data er angivet med F1 til F6 knapper, øverste række på højre panel. I denne protokol anvendes de generiske indstillinger: F1 - hæve / sænke skærm, F2 - SEARCH mode, F3 - FOCUS-mode, F4 - PHOTO mode F5 - MDS OFF / ON og F6 - bjælkeråemne, der anvendes til at beskytte prøven mod stråling skade ved at afbøje strålen.
    1. Placer cryo-holderen i cryo-station og fylde Dewar af indehaveren og cryo-station med LN2. Når temperaturen når -192 ° C, åben lukker på holderen tip, tidligere sted frosne Cryo-EM gitter i de udpegede sted, og fastgør med en ring klemme.
    2. Sæt cryo-holderen i elektronmikroskop. Fyld Dewar af cryo-holder og den anti-Contaminator kammer med LN2. Vent for indehaveren til at stabilisere i 30-60 min. Tryk på F6, ogtænde glødetråden på. Når glødetråden er mættet, skal du trykke på F6 slukket og åben lukker på indehaveren for at se nettet.
    3. Tryk Low Mag / alfa 1 (fastsat til 200X mag) og find områder med tynd is på nettet.
    4. Skift til MAG 1/alpha 2 for at indstille minimum dosis (MDS)-tilstand og erhverve Cryo-EM data på lave doser elektron, uden at beskadige prøven.
      1. Tryk på F2 for at indstille søgningen mode. Indstil forstørrelse på 40.000 x. Forstør stråle med brigtness knop til minimal elektron dosis ~ 0,04 e - / Å 2 · s. Tryk DIFF at skifte til diffraktion tilstand. Indstil kamera længde til 120 cm med MAG / CAM LENGHT knop. Find områder på nettet inden for de på forhånd udvalgte områder i LOWMAG der har lipidnanorør i hullerne i carbonfilm.
      2. Tryk på F4 for at indstille tilstanden Foto ved 40.000 x forstørrelse og sæt belysning med BRIGHTNESS knop ved doser på 16-25 e - / A 2 · s. Tryk Standard Focus-knappen for at sætte fokus betingelser justere Z-højdeaf prøven med Z op / ned knapperne (HØJRE Kontrolpanel). Indstil Defocus mellem -1.5 og -2.5 um.
      3. Juster SØG og PHOTO mode ved at tegne en firkant i vinduet Live View på det digitale kamera monitor i SØG funktion, der svarer til det område, der skal afbildes i PHOTO mode.
      4. Tryk på F3 for at sætte fokus tilstand ved 100.000 X forstørrelse. Fokus belysning til dækning af CCD-chip (~ 4. - 5. cm radius) og off akse til ikke bestråle det område, der skal afbildes i PHOTO mode. Juster Defocus til ~ -1.5 og -2.5 um med fokus knop og korrigere for bygningsfejl af billedet med DEF / STIG drejeknapper.
    5. Vælg FVIII-LNT skal afbildes i SEARCH mode ved at erhverve livebilleder i vinduet Live View på det digitale kamera skærm. Centrer FVIII-LNT på pladsen trukket på LIVE VIEW-vinduet.
    6. Optag et digitalt billede på CCD-kameraet på 52.000 X effektiv forstørrelse og 0,5 sek eksponering ved at skifte til tilstanden Foto og klikke erhverveE-tasten på det digitale micrograph kameraets skærm. Betingelserne Image Acquisition er indstillet som bjælkeråemnet (SHUTTERS) kun åben, når billedet er erhvervet i PHOTO mode.
    7. Kontroller kvaliteten og Defocus af den erhvervede billede ved at trykke på CTRL-F for at få en Fast Fourier Transform (FFT).

3.. 3D Genopbygning

BEMÆRK: billedanalyse software, der bruges til 2D og 3D-analyse: EMAN2 og IHRSR er frit tilgængelige. EMAN2 kan downloades fra http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. Den IHRSR software kan fås fra professor Egelman: egelman@virginia.edu. De endelige IHRSR raffinementer er kørt på Texas Advanced Computing Center klynge: http://www.tacc.utexas.edu/ på University of Texas, Austin. 3D rekonstruktion algoritme vist på figur 1 består af to trin: Først vælge en homogen sæt spiralformede segmenter (partikler) med 2D henvisning fri alignment (RFA) algoritmer implementeret i EMAN 2, andet opnå en 3D-rekonstruktion baseret på de spiralformede parametre og bagprojektion algoritmer indarbejdet i IHRSR. Det første skridt udnytter de programmer, der er udviklet til at vælge homogene partikel sæt til 3D rekonstruktion med enkelt partikel SPA (algoritmer), for hvilke EMAN2 er specielt udviklet og distribueret: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Dette skridt er blevet tilpasset de Cryo-EM-data. Det andet trin er nået med IHRSR algoritme, som er specielt designet til den type spiralformede forsamlinger opnås med rekombinant faktor VIII-former. Denne algoritme er blevet dokumenteret i vid udstrækning gennem den videnskabelige litteratur 12..

  1. Udføre 2D-billede analyse med EMAN2 videnskabelig billedbehandling suite: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 at vælge homogen partikel (spiralformet segment) sæt til spiralformet genopbygning.
    1. Vælg Cryo-EM mikrografer vaflerht og velorganiseret spiralformede rør med det digitale kamera software og visualiseringsværktøjer.
    2. Inverter, normalisere og filtrere for røntgen-pixels i e2workflow.py GUI, enkelt partikel genopbygning (spr) mulighed: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. Importer de omvendte, normaliserede og røntgen pixel filtrerede billeder i e2helixboxer.py GUI. Vælg FVIII-LNT spiralformede rør og segment på 256 x 256 pixel (2,9 Å / pix) med 90% overlap med: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. Vurdere Defocus fra de oprindelige micrographs og anvende kontrast overføringsfunktion (CTF) korrektion (kun fasekorrektion) til de spiralformede segmenter fra de samme mikrografier med e2ctf.py option indbygget i e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
    5. Generer indledende partikler (spiralformede segmenter) sætter i e2workflow.py GUI - SPR mulighed: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
    6. Beregn 2D klasse gennemsnit med e2refine2d.py algoritmen anvender henvisning fri k-gennemsnitlige klassificering til at vælge homogene datasæt med samme diameter LNT og graden af spiralformet orden (figur 2), efter scriptet: »e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - input = INPUT.hdf - NCIS = 51 - simcmp = prik - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = prik - classraligncmp = fase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = middelværdi - normproj-classkeepsig ', ændre NCIS værdi i overensstemmelse hermed.
      1. Klassificere de oprindelige datasæt i 150 klasser 'NCIS = 151' over 8 gentagelser med 'classkeep = 0,8', hvilket betyder, at partikler med mindre end 80% lighed med gennemsnittet i klassen, er udelukket fra den givne klasse. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Flet partikler fra klassen gennemsnitmed udtalt spiralformet diffraktion i e2display.py at skabe mellemliggende datasæt.
      3. Klassificere mellemliggende datasæt i 50 klasser 'NCIS = 51' for at skelne klasser med samme diameter og grad af orden.
      4. Flet partikler fra klasser med samme diameter og grad af orden i e2display.py at skabe den endelige datasæt for de tre-dimensionelle rekonstruktion: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
  2. Udfør spiralformet rekonstruktion med den iterative Tandhjulsgear Fast Space Reconstruction (IHRSR) algoritme, som beskrevet i Egelman 17, 18.
    1. Skøn stigning, Az (Å) i FVIII-LNT helix fra den kombinerede Fouriertransformation af partiklerne i det endelige datasæt.
    2. Definer azimutalvinkel ΔΦ (º) ved at køre parallelle IHRSR raffinementer med en konstant Az, øge ΔΦ fra 576; til 60 ° i 5 ° trin.
    3. Kør 100 konsekutive IHRSR cyklusser for hver endelige datasæt med en karakterløs cylinder som en indledende volumen og de første spiralformede parametre Az og ΔΦ som defineret i 3.2.1. og 3.2.2.
    4. Inspicere den endelige mængder for konvergens af de spiralformede parametre og korrespondance mellem klasse gennemsnit fra 2D klassificeringen af ​​det endelige datasæt, og de fremskrivninger fra sidste IHRSR genopbygning.
    5. Pålægge symmetri til det endelige 3D rekonstruktioner, der svarer til den asymmetriske enhed fordeling observeres i de endelige asymmetriske 3D volumen: 4-fold for den humane FVIII-LNT og 5-gange for den porcine FVIII-LNT. Kør yderligere 100 raffinement cykler for at generere en endelig symmetrized 3D-rekonstruktion.
    6. Beregn Fourier Shell korrelationskurve for begge volumener ved først at adskille de tilsvarende datasæt i lige og ulige: 'e2proc2d.py <infile> <outfile> - split = 2 '. Derefter køre 100 IHRSR hinanden følgende justeringer som beskrevet i 3.2.3. Beregn FSC af 3D volumener oprettet fra de ulige og endda datasæt: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
  3. Visualiser og Segment FVIII-LNT mængder i UCSF kimære.
    1. Åbn endelige mængder fra trin 3.2.5. i UCSF Chimera og indstille konturen niveauet til 0,005 i TOOLS> datamængde> Volume Viewer mulighed.
    2. I TOOLS> datamængde> SEGMENT MAP, vælg volumen i segment kortsektionen og klik på segment til segment lydstyrken.
    3. Koncernens segmenter svarende til en enhed celle ved at vælge med CTRL + SHIFT og klikke gruppe.
    4. Farve de segmenter ved enhed celle og helix med Handlinger> COLOR indstilling til at fremhæve de strukturelle træk.

4.. Electron Tomography

  1. Negativt farvet FVIII-LNT Prøveforberedelse
      <li> Forbered FVIII-LNT prøver som for Cryo-EM eksperimenter.
    1. Glow udledninger kulovertrukne 300 mesh kobber gitter (carbon opad) i en blanding af O2 og H2-gas i 10 sek ved 50 W som for Cryo-EM eksperimenter.
    2. Påfør et fald på 2,5 ul FVIII-LNT suspension med 6-nm kolloidt guld nanopartikler til nettet, skamplet overskydende væske og negativt pletter ved at anvende 5 ul 1% uranylacetat løsning for 2 min. Dup overskydende væske og lufttørre nettet.
  2. Electron Tomography Dataindsamling
    1. Overfør gitteret i det indre tilt holderen.
    2. Overfør holderen i elektronmikroskop.
    3. Saml tilt serie automatisk med SerialEM software 19 ved 2 ° intervaller over et vinkelområde på -60 ° til +60 ° og optage billeder med et CCD-kamera på 52.000 X effektiv forstørrelse, -6 til -10 um Defocus og elektron dosis på 150 - 170 electrons / Å 2 · s pr tomogram.
  3. Electron Tomography Rekonstruktion af FVIII-LNT
    Bemærk: Genskab pFVIII-LNT og hFVIII-LNT vippes serie erhvervet i 4.2. med ETomo mulighed for den israelske forsvarsminister software efter tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
    1. Ved hjælp af en terminal vindue åbne tomogram i 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
    2. Bin den tomogram ved 4 med israelske forsvarsminister BINVOL kommandoen for at formindske størrelsen på tomogram.
    3. Vælg den korrekte vinkel for at rotere lipidnanorør langs Y-aksen i det sammenflettede tomogram vha. israelske forsvarsminister ROTATEVOL kommando.
    4. Drej fuld tomogram med israelske forsvarsminister ROTATEVOL kommando.
    5. Beskære det lipidnanorør orienteret langs Y-aksen med den israelske forsvarsminister CLIP RESIZE kommando.
    6. Åbn beskårne sub-tomogram med 3DMOD.
    7. Klikke på tomogram at visualisere placeringen af ​​faktor VIII-molekyler sammenskiverne i Z-aksen og langs Y-aksen i sub-tomogram volumen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekombinant human og svin FVIII blev afholdt med succes helisk på negativt ladede enkelt tolags LNT, der ligner den aktiverede blodpladeoverfladen. Den spiralformede organisering af de menneskelige og svin FVIII-LNT var konsistent gennem de indsamlede digitale micrographs (figur 2). Styringen LNT og mennesket og svin FVIII-LNT spiralformede rør blev udvalgt og segmenteret med e2helixboxer.py GUI og indledende datasæt oprettet med e2workflow.py GUI, Single partikel option (tabel 1).

Den spiralformede orden membranbundne menneskelige og svin FVIII-LNT blev evalueret fra Fouriertransformation af klassens gennemsnit med e2display.py GUI (EMAN2) (Figur 3). Lipiddobbeltlaget i den bedste kontrol LNT 2D klasse gennemsnit er veldefineret. Den indre og ydre folder og lavere tæthed af membranen hydrofobe kerne er klart synlige ( (fig. 3B og 3C). Mere udtalte drejning for de humane FVIII-LNT spiralformede rør viser, at protein-protein interaktioner mellem tilstødende membranbundne FVIII molekyler er konsekvent forskelligt for de to FVIII former (figur 3B og 3C). Partikler fra klassen gennemsnit viser god spiralformet organisation (spiralformet diffraktionsmønster) blev fusioneret i e2display.py GUI til at danne et mellemliggende partikel sæt (tabel 1). Partiklerne fra de mellemliggende partikel sæt blev igen inddeles i 50 klasser med de samme begrænsninger. Partiklerne fra klassen gennemsnit med samme diameter blev fusioneret i det endelige datasæt (tabel 1).

Indledende 3D rekonstruktioner for den menneskelige og svin FVIII-LNT blev udført med 1.000 repræsentative partikler fra det endelige menneske og svin FVIII-LNT datasæt. Et hundrede træk IHRSR iterationer blev kørt for hver 3D-rekonstruktion med en karakterløs cylinder (160 Å indre og 500 Å ydre diameter), som oprindelige mængde. Den aksiale stigning (Az) beregnet ud fra den kombinerede Fouriertransformation af de spiralformede segmenter (partikler SET) er lig med 41 A til human FVIII-LNT og 36 Å for svin FVIII-LNT (figur 4A og 4B). Den indledende azimutalvinkel (ΔΦ) defineret ud fra den iterative søgning anslås til 40,0 ° for den menneskelige FVIII-LNT og ved 35,0 ° for svin FVIII-LNT. De endelige mængder inspiceres for konvergens af de spiralformede parametre og korrespondance mellem klasse gennemsnit og fremskrivninger fra sidste Reconstruction, også efter de kriterier, der er beskrevet i 5.. De valgte 3D-rekonstruktioner og tilsvarende spiralformede parametre pålægges som oprindelige volumener og indledende spiralformede parametre for en anden IHRSR forfinelse af 100 cykler, der konvergeret til en fire-start spiralformet organisation for den menneskelige FVIII-LNT med Az = 41,1 Å og ΔΦ = 42,0 ° og en fem-start spiralformet organisation til svin FVIII-LNT med Az = 35,5 Å og ΔΦ = 34,8 °. En sidste 100 IHRSR iterationer indførelse af en 4-fold og en 5-fold spiralformet symmetri for den menneskelige og svin FVIII-LNT rekonstruktioner henholdsvis udføres med oprindelige volumener og tilsvarende spiralformede parametre fra de sidste asymmetriske IHRSR raffinementer (figur 4C og 4D). De endelige mængder viser 8 menneskelig FVIII og 10 svin FVIII membranbundne molekyler organiseret omkring spiralformede akse (figur 5A). Hvert menneskeFVIII molekyle omsættes 41,2 Å og roteres 42,0 ° fra den foregående, og hver porcin faktor VIII-molekyle er oversat 35,9 Å og roteres 35,2 ° fra den foregående, svarer til de spiralformede parametre for de endelige 3D rekonstruktioner (figur 5B).

De rekonstruerede elektron tomogrammer bekræfte forskellen i den spiralformede organisation mellem human og porcin faktor VIII-LNT opnået ved de samme eksperimentelle betingelser. Sammenligning af de øverste udsigt fra rekonstruerede tomogrammer og 3D-mængder fra spiralformet genopbygning ses i retning vinkelret på spiralformede akse, validerer yderligere rigtigheden af de 3D-rekonstruktioner raffineret med IHRSR spiralformede parametre (Figur 6). De asymmetriske 2D enhedscelle dimensioner for den menneskelige FVIII-LNT 3D rekonstruktion er: a = 17,8 nm, b = 8,2, γ = 84 °, og for svin FVIII-LNT 3D rekonstruktion: a =18,4, b = 7,2 og γ = 70 ° (fig. 6). Enhedscellen dimensioner af human FVIII organiseret i membranbundne 2D krystaller er: a = 8,1, b = 7,0 og γ = 67 °, hvilket svarer til overfladen er dækket af en FVIII molekyle set mod membran-overflade 20. Sammenligning Enhedscellen dimensioner mellem FVIII organiseret i 2D og spiralformede krystaller viser, at både mennesker og svin FVIII molekyler danner dimerer når skruelinieform organiseres på LNT overflade.

Figur 1
Figur 1.. Struktur analyse flow chart. De skridt følges for 2D klassificering analyse baseret på reference-fri justeringsalgoritmer implementeret i EMAN2 16 er cirklede i blåt. De skridt følges for 3D-analyse udført med den iterative spiralformede real space rekonstruktionsalgoritmer (IHRSR) er rød cirkel. Iterative IHRSR cyklusser er betegnet med punkterede pile.

Figur 2
Figur 2.. Cryo-EM digitale mikrografer. (4.096 x 4.096 pixels, 2,9 Å / pix) af lipid-nanorør (LNT) med og uden bundet FVIII. A. Kontrol LNT. B. Humant FVIII-LNT. C. Svin FVIII-LNT . Kanten af ​​hullet i carbon film, hvor FVIII-LNT suspenderes i amorf is angivet med en hvid stjerne. De protein-og lipid-tætheder i sort. De forstørrede visninger (mellemværker) af 512 x 512 beskåret områder (hvid stiplet firkant) illustrere forskellen i den spiralformede organisering af de menneskelige og svin FVIII, hhv. Skalaen bar er 100 nm.ig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3.. Repræsentant 2D klasse gennemsnit (øverste række) og tilsvarende Fouriertransformationer (nederste række) fra de mellemliggende partikel sæt (tabel 1) er klassificeret i 50 klasser. A. Kontrol LNT B. Humant FVIII-LNT C. Svin FVIII-LNT. Er angivet klassenummer og antallet af partikler, der indgår i hver klasse. Forskellen i spiralformet orden mellem den menneskelige og svin FVIII ses tydeligt på billederne og bekræftet af diffraktionsmønstre opnået fra Fouriertransformationer af disse billeder. Klik her for at få vist enstørre version af dette tal.

Figur 4
Figur 4.. 3D spiralformede rekonstruktioner af human og porcin FVIII-LNT. A. Kombineret Fouriertransformation fra 1.000 helicale segmenter. Det første og det andet lag linje er centreret ved 1/82 a -1 og 1/41 A -1 for human FVIII-LNT, og 1/72 Å -1 og 1/36 Å -1 for porcin FVIII-LNT (hvid pile). B. Surface repræsentation af menneskelig i pink (Az = 41,1 Å, ΔΦ = 42,0 º) og svin i blå (Az = 35,9 Å, ΔΦ = 35,2 º) FVIII-LNT 3D spiralformede rekonstruktioner. Begge mængder er præsenteret på 0,005 kontur niveau (minimum tæthed er 0 og maksimum tæthed, 0,02, som beregnet i UCSF Chimera, Volume seeren option 21). Længden af FVIII-LNT rør er 256 pixels ved 2,9 Å / pix. C. Fourier Shell korrelation (FSC) grunde til human og porcin FVIII-LNT viser en opløsning på 20,5 Å ved FSC = 0,5.

Figur 5
Figur 5.. Tandhjulsgear organisering af human og porcin FVIII-LNT. Segmenteret overflade repræsentation af menneskelige og svin FVIII-LNT spiralformede rekonstruktioner, vist i figur 4B. Mængderne er segmenteret efter pålægge 4-fold symmetri til den menneskelige FVIII-LNT og 5-fold symmetri porcin FVIII-LNT. De asymmetriske enheder er farvekodede gul-rød for den menneskelige FVIII-LNT og blå-grøn til svin FVIII-LNT. A. udsigt langs spiralformede akse angives med en firkant for den menneskelige og somen femkant for svin FVIII-LNT. Den menneskelige FVIII-LNT struktur viser 8 molekyler organiseret omkring den ydre LNT membranen og svin FVIII struktur viser 10 molekyler organiseret omkring den ydre LNT membran, der angives med tal. B. Views vinkelret på spiralformede akse. Den humane FVIII-LNT er et 4-start spiralformet struktur og svine-FVIII-LNT er en 5-start helical struktur. De enkelte man starte helices er angivet med tal og farvekoder. Vi har understreget en af ​​helixerne fra hver struktur med en (*) og grønne linjer. Skalaen bar er 20 nm.

Figur 6
Figur 6.. Sammenligning mellem de spiralformede og tomografi 3D rekonstruktioner. Den menneskelige FVIII-LNT (A) og svin FVIII-LNT (C) spiralformet 3D rekonstruktioner vises perpendicular til den spiralformede akse. Hver enhed celle og individuelle helixerne er farvekodede som i fig. 5. B. og D. er tæthed repræsentationer af 3D-tomografi rekonstruktioner, set vinkelret på spiralformede akse. 2D gitter afspejler den spiralformede arrangement af FVIII-molekyler er vist med grønne striber.

PRØVER CLNT hFVIII-LNT pFVIII-LNT
Indledende Micrographs 61 474 542
Indledende Partikel sæt 29113 60395 64665
Defocus (nm) -4051 ± 502 -3643 ± 737 -3.443 ± 1.086
Intermediate Partikel sæt 25.907 27.305 22.773
Afsluttende Partikel sæt 25.907 10.455 10.430

Tabel 1. Analyse statistikker 2D efter algoritmen præsenteres i rutediagrammet på figur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbejde en metode præsenteres at differentiere mellem to membranbundne organisationer af meget homologe proteiner: human og porcin FVIII selvstændig samlet på lipidnanorør i de betingelser, der er stødt på i den menneskelige krop.

I den beskrevne procedure, er mennesker og svin FVIII organiseret succes i spiralform på lipidnanorør, som er det mest afgørende skridt. Den næste kritiske trin er at bevare prøven i tynd amorf is ved flash frysning på nær flydende N2 temperatur. Bevarelse af prøven i amorf is og LN2 temperaturen holder spiralformede rør hydreret og protein-lipid makromolekylære forsamlinger fysiologisk aktive. Det sidste afgørende skridt er at erhverve Cryo-EM data af tilstrækkelig mængde og kvalitet for en høj opløsning 3D struktur på nær LN2 temperatur. Indsamling af data på nær LN2 temperatur yderligere forhindrer dehydrering af prøven i den høje vhedsstøvsugere af mikroskopet og stråleskader fra elektronstrålen.

For at beregne den membranbundne struktur FVIII den første kritiske trin er at opnå homogene partikler (helicale segmenter) sæt ved anvendelse af 2D henvisning friklassificering og kombinere partikler fra klasser med samme diameter og grad af orden. Det andet afgørende skridt er at pålægge den rigtige oprindelige volumen og spiralformede parametre (stigning og azimutalvinkel) for den spiralformede genopbygning. Den tredje og sidste afgørende skridt er at validere den spiralformede struktur ved at sammenligne de 3D-kort fremstillet ved spiralformet og elektron tomografi (uden pålagt symmetri) rekonstruktioner af samme præparat.

De præsenterede metode er enestående i sin evne til at løse den funktionelle struktur af membran-associerede proteiner ved nær fysiologiske betingelser. Den LNT udviklet i vores laboratorium kan væresucces brugt som en platform for spiralformet organisering af funktionelle membranbundne blod koagulationsfaktorer og opnå bedre opløsning end for FVIII organiseret i membranbundne 2D krystaller og som enkelte partikler. Vores mål er yderligere at øge opløsningen af ​​vores spiralformede rekonstruktioner ved at forbedre homogeniteten og kvaliteten af ​​det endelige partikel sæt. Indsamling flere Cryo-EM mikrografer på bedre Cryo-EM betingelser (Field emission pistol, energi-filter, DE kamera detektorer) af FVIII-LNT spiralfilamenter og derfor herunder større indledende partikel sæt til 2D genopbygning vil opnå dette. Forbedring af FVIII-LNT spiralformet samling og 3D-rekonstruktion algoritmer vil give os mulighed for at opnå sub-nanometer og nær atomar opløsning, som entydigt vil definere membranbundne organisation af denne kritisk for blodets koagulation protein.

Organisering skruelinieform homologe FVIII former giver os også mulighety til at karakterisere hvordan forskel i sekvens kan korrelere forskelle i struktur og funktion. Løse de menneskelige og svin FVIII membranbundne strukturer ved de metoder, der er beskrevet i denne artikel kan hjælpe med at identificere de sekvenser, som når modificeret vil forbedre rekombinante FVIII-funktionen. Denne viden vil have signifikante kliniske konsekvenser for lægemiddelforskning i både Trombose og Hæmostase felter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomisk interesse, og de kan kontaktes direkte om nogen af ​​de procedurer, der er offentliggjort i dette manuskript.

Acknowledgements

Dette arbejde er støttet af et nationalt Scientist Development tilskud fra American Heart Association: 10SDG3500034 og UTMB-NCB opstart midler til SSM. Forfatterne anerkender Cryo-EM og Scientific Computing faciliteter på Sealy Center for Strukturel Biologi ved UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), samt Drs. Steve Ludtke og Ed Egelman for hjælp med 2D og 3D spiralformede genopbygning algoritmer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM2100 with LaB6 JEOL Ltd. JEM-2100 operated at 200 kV
with TEMCON software JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder Gatan, Inc. 626.DH cooled to -175 °C
with temperature controler unit Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera Gatan, Inc. US4000 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV FEI
Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid Ted Pella 01821 plasma cleaned for 10 sec on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh Electron Microscopy Sciences Q225-CR2 Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes 
Uranyl acetate dihydrate Ted Pella 19481 1% solution, filtered
Galactosyl ceramide Avanti Polar Lipids Inc. 860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids Inc. 840035
EM software Digital Micrograph Gatan, Inc. http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN free download http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
EM software Spider free download http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR free download Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD) free download http://bio3d.colorado.edu/imod/ 
EM software (SerialEM) free download ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera free download http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
  2. Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
  3. Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
  4. Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
  5. Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. (2013).
  6. Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
  7. Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
  8. Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
  9. Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
  10. Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
  11. Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
  12. Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
  13. Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
  14. Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
  15. Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
  16. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
  17. Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
  18. Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
  20. Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
  21. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics