एक बहु दवा प्रतिरोधी दिखाते

Immunology and Infection

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Summary

एक प्रवर्धन माइक्रोएरे काफी अंत उपयोगकर्ता के लिए माइक्रोएरे कार्यप्रवाह streamlines जो एक ही कक्ष में असममित पीसीआर प्रवर्धन और माइक्रोएरे संकरण को जोड़ती है. माइक्रोएरे कार्यप्रवाह सरल नियमित कम संसाधन वातावरण में इस्तेमाल किया जा सकता है कि माइक्रोएरे आधारित निदान बनाने के लिए एक आवश्यक पहला कदम है.

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Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Qu, P., Knickerbocker, C., Cooney, C. G., Chandler, D. P. Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray. J. Vis. Exp. (86), e51256, doi:10.3791/51256 (2014).

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Abstract

माइक्रोएरे कार्यप्रवाह सरल नियमित कम संसाधन वातावरण में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एमडीआर टीबी माइक्रोएरे आधारित निदान बनाने के लिए एक आवश्यक पहला कदम है. एक प्रवर्धन माइक्रोएरे एक समाधान के भीतर और एक microfluidic चेंबर में असममित पीसीआर प्रवर्धन, लक्ष्य आकार चयन, लक्ष्य लेबलिंग, और माइक्रोएरे संकरण को जोड़ती है. एक बैच प्रसंस्करण विधि बहु - दवा प्रतिरोधी माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एमडीआर टीबी) जीनोटाइपिंग के लिए एक 9 परिसर असममित मास्टर मिश्रण और कम घनत्व जेल तत्व माइक्रोएरे के साथ प्रदर्शन किया है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल 6 घंटा में पूरा किया और जीनोमिक डीएनए के कम से कम 1,000 सेल समकक्ष के साथ सही जीनोटाइपिंग प्रदान किया जा सकता है. पर चिप धोने कदम शामिल एक पूरी तरह से बंद amplicon विधि और प्रणाली में जो परिणाम होगा, संभव है. एक प्रवर्धन माइक्रोएरे साथ बहुसंकेतन की हद अंततः एक मास्टर एम में जोड़ा जा सकता है कि प्राइमर जोड़े की संख्या से विवश हैनौवीं और अभी भी बल्कि सरणी पर स्थिर रहे हैं कि जांच की संख्या की तुलना में वांछित संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदर्शन मेट्रिक्स, को प्राप्त करने. इसी तरह, कुल विश्लेषण समय विशिष्ट उद्देश्य का उपयोग, अनुसंधान सवाल है, और पता लगाने के लिए वांछित सीमा के आधार पर छोटा या lengthened किया जा सकता है. फिर भी, सामान्य दृष्टिकोण काफी मैन्युअल रूप से गहन और समय लेने वाली प्रसंस्करण कदम की संख्या को कम करने से अंत उपयोगकर्ता के लिए माइक्रोएरे कार्यप्रवाह streamlines, और नियमित नैदानिक ​​व्यवहार में माइक्रोएरे आधारित निदान के अनुवाद के लिए एक सरल जैव रासायनिक और microfluidic रास्ता प्रदान करता है.

Introduction

जल्दी मामले का पता लगाने और तेजी से उपचार माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एमटीबी) संचरण 1 कम करने के लिए सबसे प्रभावी नियंत्रण रणनीति पर विचार किया, और देखभाल (पीओसी) की या पीओसी परीक्षण के निकट एक बिंदु एक साथ टीबी का निदान करने के लिए कि टीबी समुदाय में एक व्यापक सहमति वहाँ अब कर रहे हैं और दवा प्रतिरोध (डा.) की जरूरत है. ऐसे Cepheid के GeneXpert और अन्य न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन परीक्षण के रूप में प्रौद्योगिकियों के कई टीबी रोगियों के लिए निदान के लिए समय कम है, और rifampin या अन्य पहली या दूसरी लाइन ड्रग्स 2 के लिए प्रतिरोध प्रदान चयनित परिवर्तन करने के लिए प्रतिरोध का संकेत एक तेजी से पढ़ने के लिए बाहर प्रदान करते हैं. वास्तविक समय और इज़ोटेर्माल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन परीक्षण एमडीआर टीबी के लिए नेतृत्व कि दवा प्रतिरोध म्यूटेशनों की पहचान करने के लिए डिजाइन कर रहे हैं, वे पता लगाने के परिवर्तन के स्पेक्ट्रम, रोगी की दवा प्रतिरोध प्रोफाइल को इसी एक individualized दवा आहार डिजाइन करने के लिए अक्सर अपर्याप्त है और संबंधित तकनीकी बाधाओंऑप्टिकल पार से बात या प्रवर्धन और रिपोर्टिंग chemistries की जटिलता को 3-7 loci या पता चला रहे हैं कि परिवर्तन की संख्या सीमित कर सकता है. इस प्रकार, उच्च बहुसंकेतन क्षमता के साथ प्रौद्योगिकियों का पता लगाने एमडीआर टीबी पीओसी निदान में जाना जाता अंतराल को संबोधित करने के लिए आवश्यक हैं.

प्रोटीन और डब्ल्यूएचओ का समर्थन किया हैं लाइन जांच assays एमडीआर टीबी 8-29 निदान की "कई जीन, कई म्यूटेशनों" चुनौती का पता कर सकते हैं. दुर्भाग्य से, इन संकरण आधारित, मल्टिप्लेक्स पता लगाने प्लेटफार्मों Multistep, जटिल, और आणविक तकनीक में महत्वपूर्ण प्रशिक्षण और दक्षता की आवश्यकता है कि खुले amplicon प्रोटोकॉल का उपयोग करें. प्रवर्धन माइक्रोएरे 30 इन माइक्रोएरे काम के प्रवाह और परिचालन संबंधी चिंताओं का कुछ पता करने के लिए डिजाइन किया गया था. सरल बनाने fluidic सिद्धांतों, बढ़ाना संकरण, और एक microfluidic कक्ष के भीतर न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य का पता लगाने के लिए कर रहे हैं. उपयोगकर्ता न्यूक्लिक एसिड और प्रवर्धन मास का परिचयआतंकवाद एक विंदुक के साथ एक fluidic चेंबर में मिश्रण और थर्मल साइकिल प्रोटोकॉल शुरू होता है. यहाँ दिखाया बैच प्रसंस्करण विधि के लिए, प्रोटीन बाद में, थोक समाधान में धोया सूखे, और imaged हैं. इस अध्ययन rpoB के लिए एक एमडीआर टीबी माइक्रोएरे परीक्षण (30 म्यूटेशन), katG (2 उत्परिवर्तन), Inha (4 म्यूटेशन), rpsL (2 उत्परिवर्तन), embB (1 उत्परिवर्तन), IS1245, IS6110 का उपयोग कर एक प्रवर्धन माइक्रोएरे की कार्यक्षमता को दर्शाता है , और एक आंतरिक प्रवर्धन और संकरण नियंत्रण. माइक्रोएरे जांच (wildtype (WT) और एकल nucleotide उत्परिवर्ती (यू)) के कम से कम एक जोड़ी मिलान ब्याज की प्रत्येक उत्परिवर्तन के लिए शामिल है. बहु - दवा प्रतिरोधी एम. से शुद्ध न्यूक्लिक एसिड तपेदिक टीडीआर क्षय रोग तनाव बैंक 31 से कर रहे हैं. कहीं 32 में वर्णित के रूप में जेल तत्व प्रोटीन हम polymeriz में हर जांच 4% monomer और 0.05 मिमी का उपयोग, सिवाय इसके कि अनिवार्य रूप से copolymerization द्वारा ग्लास substrates पर निर्मित कर रहे हैंव्यावहारिक मिश्रण. सारणियों का उपयोग करने से पहले एक 50 मिलीलीटर गैस्केट से घिरे हुए हैं. थर्मल साइकिल, संकरण, और धोने के कदम के बाद, प्रवर्धन प्रोटीन एक Akonni पोर्टेबल विश्लेषक पर imaged हैं. पृष्ठभूमि सही, एकीकृत संकेत तीव्रता कच्चे से प्राप्त कर रहे हैं. एक निश्चित सर्कल कलन विधि का उपयोग TIF छवियाँ. प्रत्येक जेल तत्व के लिए शोर स्थानीय मौके पृष्ठभूमि के तीन बार मानक विचलन के रूप में गणना की है. शोर अनुपात (SNR) के लिए संकेत के लिए ≥ 3 मूल्यों जीन लक्ष्य आमतौर पर detectable माना जाता है. प्रत्येक जीन या कोडोन में एक विशिष्ट उत्परिवर्तन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण करने के लिए, एक विभेदक अनुपात (WT-यू) / (गुम्मट + यू) के रूप में SNR मूल्यों से गणना की है. विभेदक अनुपात 0 जंगली प्रकार के अनुक्रम का संकेत कर रहे हैं <अनुपात जबकि 0, ठिकाना पर एक दवा प्रतिरोध उत्परिवर्तन का संकेत कर रहे हैं>.

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Protocol

यूनिवर्सल पीसीआर सावधानियों का पालन कि प्रयोगशालाओं के लिए, यह कई प्रवर्धन प्रोटीन और सब्सट्रेट प्रति गास्केट में शामिल हैं और यहां वर्णित के रूप में, एक थोक कंटेनर में एक साथ सभी प्रवर्धन प्रोटीन धोने के लिए सक्रिय और अधिक कुशल है. कहीं 30,33 रिपोर्ट में उपभोज्य प्रारूपों, एक पूरी तरह से सील बंद amplicon परीक्षण में बाद प्रवर्धन माइक्रोएरे धोने चरणों का प्रदर्शन करने के लिए उपलब्ध हैं.

1. सेटअप

  1. निकालें और पसंद की एक विधि के साथ उचित जैव सुरक्षा शर्तों के तहत नमूना से न्यूक्लिक एसिड शुद्ध. आवश्यकता न्यूक्लिक एसिड असममित, मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रवर्धन के लिए पर्याप्त पवित्रता का होना है.
  2. Decontaminating समाधान के साथ सतहों और उपकरण पोंछते द्वारा कार्यक्षेत्र तैयार करें.
  3. बर्फ या ठंडे ब्लॉक पर प्रवर्धन अभिकर्मकों रखें.
  4. प्रवर्धन मास्टर मिश्रण के लिए एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब लेबल, और एक बाँझ 0.2 मिलीलीटर microfuge तू लेबलप्रत्येक नमूने के लिए हो.
  5. अभिकर्मकों, संक्षेप में भंवर thawed और एक मिनी अपकेंद्रित्र में एक नाड़ी स्पिन के साथ ट्यूब के नीचे करने के लिए सामग्री इकट्ठा कर रहे हैं. Taq पोलीमरेज़ भंवर मत करो. धीरे मिश्रण और मिनी अपकेंद्रित्र में एक नाड़ी स्पिन के साथ पालन करने के लिए ट्यूब झटका.
  6. तालिका 1 में दिखाया प्रति नमूना प्रतिक्रिया संस्करणों का उपयोग कर एक प्रवर्धन मास्टर मिश्रण तैयार करें. संभव pipetting अशुद्धियों के लिए खाते में, कार्रवाई की जा रही नमूनों की कुल संख्या की तुलना में कम से कम एक प्रतिक्रिया मात्रा तैयार करते हैं. मास्टर मिश्रण अतिरिक्त Taq पोलीमरेज़, पर और muliplex पीसीआर बफर के साथ प्रदान की जाती है जो ऊपर होता है ध्यान दें. केवल अन्य सभी अभिकर्मकों संयुक्त रहे हैं के बाद मास्टर मिश्रण को प्रवर्धन / निषेध नियंत्रण जोड़ने के लिए, और शेयर अभिकर्मक ट्यूब भंडारण के लिए लौट आए.
अभिकर्मक प्रति नमूना मात्रा (μl) <मजबूत> अंतिम []
HotStar Taq प्लस के साथ Mulitplex पीसीआर बफर 25 1x
गोजातीय सीरम albumin (BSA) 0.55 0.6 मिलीग्राम / मिलीलीटर
Formamide 3.8 7.6%
अतिरिक्त Taq पोलीमरेज़ 0.8 इकाइयों / μl (4 इकाइयों कुल)
एमडीआर टीबी प्राइमर मिश्रण 15.75 -
RNase मुक्त एच 2 2.1 -
प्रवर्धन / निषेध नियंत्रण 1 5.0 FG / μl
संपूर्ण 49

तालिका 1. एमडीआर टीबी प्रवर्धन माइक्रोएरे मास्टर मिश्रण रचना.

  1. भंवर मास्टर मिश्रण और एक मिनी अपकेंद्रित्र में एक नाड़ी स्पिन के साथ ट्यूब के नीचे करने के लिए सामग्री इकट्ठा.
  2. मास्टर मिश्रण के 49 μl और एम. के 1 μl जुडा ऊपर 1.4 कदम से नमूना ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए तपेदिक के डीएनए. एक बाहरी के लिए, कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी), एम. के स्थान पर आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी की 1 μl का उपयोग तपेदिक डीएनए नमूना. भंवर और नाड़ी स्पिन जब समाप्त ट्यूब (ओं).

2. प्रवर्धन डीएनए लोड

  1. माइक्रोएरे ही स्पर्श नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है, उनके संबंधित प्रोटीन के केंद्र पर प्रत्येक मास्टर मिश्रण / नमूना के 48 μl जोड़ें.
  2. माइक्रोएरे कक्ष में किसी भी हवाई बुलबुले नहीं फंसाने के लिए सावधान किया जा रहा है, माइक्रोएरे गैसकेट और मुहर के शीर्ष पर एक कवर पर्ची रखें. एयर बुलबुले नकारात्मक प्रवर्धन क्षमता को प्रभावित कर सकते हैंऔर कलाकृतियों या बाद में माइक्रोएरे छवि में शोर पैदा हो सकती है.

3. थर्मल साइकिल

  1. एक बार सभी प्रोटीन फ्लैट ब्लॉक थर्मल cycler पर नमूना, जगह substrates के साथ लोड कर रहे हैं. गर्म ढक्कन विकल्प "बंद" कर दिया है कि यह सुनिश्चित करें. Akonni Biosystems से प्राप्त उपकरण पहले से ही उपयोग के लिए prequalified किया जाएगा. अन्यथा, यह फ्लैट ब्लॉक थर्मल cycler (एस) सभी माइक्रोएरे substrates के पार (ओं) वर्दी, लगातार हीटिंग प्रदान सत्यापित करें कि बहुत महत्वपूर्ण है.
  2. , थर्मल cycler सॉफ्टवेयर खोलें उपयुक्त प्रोग्राम का चयन करें, प्रतिक्रिया मात्रा के लिए "50 μl" दर्ज करें, और रन आरंभ. यहाँ वर्णित थर्मल साइकिल प्रोटोकॉल के होते हैं:
    थर्मल साइकिल कदम
    1 88 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
    2 88 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
    3 55 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट
    4 65 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
    5 50 चक्रों के लिए कदम (2-4) दोहराएँ
    6 65 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट
    7 55 डिग्री सेल्सियस 3 घंटा
  3. कुल थर्मल चक्रों की संख्या और 55 डिग्री सेल्सियस के बाद प्रवर्धन पकड़ समय की जरूरत है या विशिष्ट प्रयोग के लिए उपयुक्त के रूप में उपयोगकर्ता, संशोधित कर सकता है कि स्वतंत्र चर रहे हैं. एमडीआर टीबी मास्टर मिश्रण असममित (मुख्य रूप से एकल असहाय) amplicons बनाता है, अन्यथा यह एक पारंपरिक, घातीय पीसीआर प्रवर्धन प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किया जा सकता है और अधिक से अधिक थर्मल चक्र शामिल करने के लिए आम तौर पर उपयोगी है.
  4. थर्मल साइकिल और संकरण कार्यक्रम के पूरा होने पर, कार्यक्रम के अंत प्रवर्धन प्रोटीन को हटाने, सॉफ्टवेयर बंद करें, और थर्मल cycler (ओं) को बंद करें.

4. धो और सूखी

  1. 0.1% ट्राइटन X-100 धोने बफर, और कम से कम 250 विआयनीकृत मिलीलीटर या मिल्ली क्यू ग्रेड पानी प्रत्येक के साथ दो कंटेनर - एक साथ 24 substrates के लिए ऊपर धोने के लिए, कम से कम 250 मिलीलीटर 1x एसएसपीई तैयार करते हैं. धोने बफर अग्रिम में तैयार किया जा सकता है.
  2. ध्यान से फ्लैट अंत संदंश का उपयोग प्रत्येक प्रवर्धन माइक्रोएरे कक्ष से कवर पर्ची और गैसकेट को हटा दें. यह कदम शारीरिक रूप से हानिकारक जेल तत्व सरणियों का सबसे बड़ा खतरा है, जिस पर बिंदु है. प्रवर्धित न्यूक्लिक एसिड के प्रसार को रोकने के लिए उचित पीसीआर संदूषण नियंत्रण का प्रयोग करें काम के माहौल के भीतर.
  3. एक ऊतक विज्ञान स्लाइड धारक में माइक्रोएरे substrates, जगह और धोने बफर युक्त धोने बिन में सभी स्लाइड्स जगह है. एक ढक्कन के साथ कंटेनर कवर.
  4. कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए प्रोटीन धो लें.
  5. प्रोटीन तीन विआयनीकृत की लगातार दो washes में बार प्रत्येक या डुबकीमिल्ली क्यू ग्रेड पानी, और हवा शुष्क.

5. इमेजिंग

असममित एमडीआर टीबी प्राइमर मिश्रण Cy3 लेबल amplicons उत्पन्न करता है. जेल तत्व प्रोटीन इमेजिंग Cy3 में सक्षम किसी भी मानक माइक्रोएरे इमेजर साथ imaged किया जा सकता है. निम्नलिखित इमेजिंग प्रक्रिया Akonni द्वारा प्रदान एमडीआर टीबी मास्टर मिश्रण, Dx2100 क्षेत्र पोर्टेबल इमेजर, और स्वचालित विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए विशिष्ट है.

  1. इमेजर से ईथरनेट केबल कंप्यूटर से जुड़ा है सुनिश्चित करें.
  2. इमेजर पर मुड़ें. सत्ता परिवर्तन के साधन के पीछे पैनल पर स्थित है. इमेजर पर संचालित है जब इमेजर के मोर्चे पर नीले एलईडी रोशन करेंगे.
  3. कंप्यूटर पर मुड़ें.
  4. कंप्यूटर डेस्कटॉप पर डबल स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर लांच करने के लिए सॉफ्टवेयर आइकन पर क्लिक करें.
  5. इमेजर कैमरा के साथ सम्पर्क स्थापित करने के लिए सॉफ्टवेयर के लिए प्रतीक्षा करें. कनेक्शन स्थापित हो जाने के बाद, विश्लेषण बटन उपलब्ध हो जाता है, औरसंदेश "सफल कनेक्शन" स्क्रीन के निचले बाएँ कोने में दिखाई देगा.
  6. माइक्रोएरे दूर उपयोगकर्ता से सामना करना पड़ रहा है, और उद्देश्य लेंस की ओर से सूखे प्रवर्धन माइक्रोएरे डालें. माइक्रोएरे अनुचित तरीके से लेंस और कैमरे के लिए सम्मान के साथ उन्मुख है, तो स्वचालित विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रतिदीप्ति छवि पर एक ग्रिड जगह असफल हो जायेगी.
  7. उपयोग दरवाजा बंद कर दें. एक पूर्वावलोकन छवि कंप्यूटर स्क्रीन पर उपलब्ध हो जाएगा.
  8. ड्रॉप डाउन मेनू से एमडीआर टीबी विश्लेषण स्क्रिप्ट का चयन करें और (मिलीसेकेंड में) वांछित एक्सपोजर समय दर्ज करें. जेल तत्व प्रवर्धन प्रोटीन के लिए एक विशिष्ट प्रारंभिक बिंदु 100-500 मिसे है.
  9. संतृप्त पिक्सल लाल रंग में पूर्वावलोकन छवि पर प्रदर्शित किया जाएगा. व्यक्तिगत स्पॉट भीतर संतृप्त पिक्सल की संख्या कम करने के लिए जोखिम समय समायोजित करें.
  10. प्रतिदीप्ति छवि हासिल करने और विश्लेषण करने के लिए विश्लेषण क्लिक करें. सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से एक जगह होगीछवि पर एमडीआर टीबी परख विशेष ग्रिड, एकीकृत तीव्रता और पृष्ठभूमि मूल्यों को निकालने, और दवा प्रतिरोध और जीनोटाइपिंग परिणाम की रिपोर्ट. स्वचालित विश्लेषण आमतौर पर एक कुछ सेकंड ले जाएगा. खरोंच, धूल, फ्लोरोसेंट कलाकृतियों, या माइक्रोएरे सुविधाओं को शारीरिक क्षति होते हैं कि चुनौतीपूर्ण छवियों के लिए, सॉफ्टवेयर विश्लेषण पूरा करने के लिए 1 मिनट के लिए ऊपर पड़ सकता है.
  11. विश्लेषण पूरा हो जाने पर, सहेजें पर क्लिक करें एक फ़ाइल नाम में गंतव्य फ़ोल्डर, प्रकार का चयन करें, और ठीक क्लिक करें. अगर वांछित अंतर्निहित माइक्रोएरे डेटा एक. Xls फ़ाइल के रूप में सहेज कर रहे हैं और बंद लाइन के लिए निर्यात किया जा सकता है, का विश्लेषण करती है.
  12. विश्लेषण पूरा हो जाए, इमेजर से प्रवर्धन माइक्रोएरे हटाने, और अगले विश्लेषण आरंभ करने के लिए नई पर क्लिक करें.
  13. डाटा एकत्रित समाप्त होने पर, सॉफ्टवेयर बंद कंप्यूटर बंद, और इमेजर बंद कर देते हैं.

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Representative Results

गुणात्मक विश्लेषण छवि स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न डेटा तालिकाओं में पहचान करने के लिए चुनौती दे रहे हैं कि प्रयोगात्मक शोर या परिवर्तनशीलता के स्रोतों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. इस प्रकार, यह 1) सब जेल तत्व बरकरार और undamaged हैं, 2) वैश्विक पृष्ठभूमि शोर अनुपात (SNR) मूल्यों को व्यक्तिगत संकेत प्रभावित हो सकता है कि फ्लोरोसेंट कलाकृतियों से मुक्त है कि पता लगाने के नेत्रहीन के लिए उपयोगी हो सकता है, 3) के लिए कोई सबूत नहीं है बुलबुला गठन या असमान प्रवर्धन / संकरण सरणी पार, और 4) सॉफ्टवेयर सही माइक्रोएरे छवि पर सभी स्थानों की पहचान की है. उदाहरण एमडीआर टीबी प्रवर्धन माइक्रोएरे छवियों को एक उच्च गुणवत्ता वाले सरणी और कारण थर्मल साइकिल चालन के दौरान शारीरिक क्षति या बुलबुले पैदा हो सकता है कि कलाकृतियों illustrating, चित्र 1 में दिखाया गया है. स्टैंडर्ड माइक्रोएरे छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर आमतौर पर एक ग्रिड जगह है और यहां तक ​​कि ऐसे श के रूप में गरीब गुणवत्ता छवियों से अभिन्न तीव्रता और पृष्ठभूमि डेटा निकालने में सक्षम हैखुद चित्रा 1 बी में, यह स्वीकार करने या आगे के विश्लेषण से माइक्रोएरे छवियों खारिज करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण मापदंड और मेट्रिक्स की स्थापना के लिए शोधकर्ता पर निर्भर है इसलिए. जांच अतिरेक इन मुद्दों को सुधारने में मदद कर सकता है. हालांकि, एक पूरी तरह से स्वचालित, निदान एमडीआर टीबी प्रवर्धन माइक्रोएरे रिपोर्टिंग एल्गोरिथ्म अन्यथा "अवैध" के रूप में चित्रा 1 बी से परीक्षण की घोषणा करेंगे.

Wildtype H37Ra जीनोमिक डीएनए के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए प्रवर्धन माइक्रोएरे SNR मूल्यों तालिका 2 में दिखाया गया. प्रतिक्रिया प्रति 6.25 पीजी इनपुट जीनोमिक डीएनए या लगभग 1.25 x 10 3 सेल समकक्ष में, सभी wildtype जांच आसानी से पता चला रहे हैं. आंतरिक प्रवर्धन और निषेध नियंत्रण के प्रत्येक के लिए SNR मूल्यों असममित मल्टीप्लेक्स प्रवर्धन प्रतिक्रिया में सभी जीन लक्ष्य परिलक्षित और detectable हैं कि यह दर्शाता है, (आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण Akonni की आपूर्ति) 98.48 (rpoB) से 967.24 तक बताया गया. नहींटेम्पलेट नियंत्रण (SNR <3) नकारात्मक थे प्रवर्धन माइक्रोएरे में सारे जांच के लिए. 6.25 पीजी इनपुट डीएनए पर जीनोटाइपिंग अनुपात WT और म्यू जांच और उचित जीनोटाइपिंग की सही व्यवहार को दर्शाता है जो सभी wt / एमयू जांच जोड़े, के लिए 0.18-1.00 बताया गया.

ज्ञात जीनोटाइप के विश्व स्वास्थ्य संगठन के संदर्भ आइसोलेट्स के एक पैनल के लिए प्रतिनिधि जीनोटाइपिंग डेटा 3 तालिका में दिखाया गया. एक एकल nucleotide बहुरूपता (SNP) जेल तत्व माइक्रोएरे पर प्रतिनिधित्व किया है, तो प्रवर्धन माइक्रोएरे परीक्षण सही एमडीआर में इसी उत्परिवर्तन का पता लगाता है टीबी जीनोम. प्रवर्धन माइक्रोएरे जांच से कुछ भी स्पष्ट रूप से एक अद्वितीय जांच के रूप में सरणी पर प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं कि निकट पड़ोसी म्यूटेशन के प्रति संवेदनशील हैं. उदाहरण के लिए, टीडीआर-0129 rpoB जीन में एक S531E उत्परिवर्तन होता है अलग है, लेकिन एक विशिष्ट जांच S531E के लिए प्रवर्धन माइक्रोएरे पर वहाँ नहीं है. फिर भी, पांच अन्य SNP जांच targetinजी कोडोन 531 एक उत्परिवर्तन कोडोन 531 पर उपस्थित संकेत मिलता है कि - प्रवर्धन माइक्रोएरे इसलिए यह सही ढंग से अलग rifampin प्रतिरोधी है कि इंगित करता है. RpoB S513W उत्परिवर्तन के लिए इसी तरह की संवेदनशीलता को अलग टीडीआर-0148 के लिए स्पष्ट है. दूसरी ओर, कुछ SNP जांच को अलग टीडीआर-0148 और rpoB S512G उत्परिवर्तन द्वारा सचित्र रूप में, निकट पड़ोसी म्यूटेशन के प्रति संवेदनशील नहीं हैं, और टीडीआर-0011 और katG S315R उत्परिवर्तन को अलग. हम जांच के इस प्रकार के व्यवहार एकल असहाय amplicon और / या जांच 34 में माध्यमिक और तृतीयक संरचना का एक परिणाम है, और एक प्राथमिकताओं भविष्यवाणी की जा सकती है कि कुछ नहीं है कि संदेह है. फिर भी, निकट पड़ोसी परिवर्तन करने के लिए जांच संवेदनशीलता पीसीआर 35,36 जांच वास्तविक समय की एक न्यूनतम सेट के साथ कई दवा प्रतिरोध म्यूटेशनों पता लगाने के लिए मैला आणविक बीकन के उपयोग के अनुरूप है, और परीक्षण झूठी सकारात्मक उत्पन्न नहीं करता है प्रदान की लक्षणपूर्वक फायदेमंद हो सकता है असलीप्ररूपी दवा संवेदनशीलता को सक्रिय.

चित्रा 1
100 पीजी wildtype एम. चित्रा 1. (एक) उदाहरण प्रवर्धन माइक्रोएरे छवि तपेदिक H37Ra जीनोमिक डीएनए और एक 100 मिसे समय जोखिम. Cy3 बीकन (स्वचालित gridding और विभाजन सॉफ्टवेयर के लिए) छवि की परिधि पर हैं. दौरान थर्मल साइकिल बुलबुला गठन से उत्पन्न एक फ्लोरोसेंट हेलो विरूपण साक्ष्य दिखा एक प्रवर्धन माइक्रोएरे (बी) छवि, और जेल तत्वों / मलबे क्षतिग्रस्त. स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर अभी भी इस छवि से एक ग्रिड और डेटा निकालने जगह करने में सक्षम है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

<टीआर>
कंपनी सूची संख्या
Akonni Biosystems जाँच
क्विएज़न # 206,143
क्विएज़न # 201,207
क्विएज़न # 206,143
थर्मो फिशर साइंटिफिक, Inc # BP227-500
सिग्मा Aldrich # 3B6917
Akonni Biosystems जाँच
Akonni Biosystems जाँच
थर्मो फिशर साइंटिफिक, Inc # BP1328-4
थर्मो फिशर साइंटिफिक, Inc # BP151-500
वर्तमान टेक्नोलॉजीज, Inc # BRSPRAY128
Decon लैब्स, Inc # 8416
कंपनी सूची संख्या
Akonni Biosystems 100-20011
100-10021
Arrayit HTW
थर्मो फिशर साइंटिफिक, Inc # 10-300
VWR # 3365040
VWR # 93000-196
सेंट्रल वायवीय # 95630

तालिका 2. आवश्यक सामग्री और उपकरण.

69 "> 329.09 <> 109.90 टीडी वर्ग = "xl69" पी: कोई नहीं "> 816.64
Codon जांच
आईडी
गुम्मट जांच SNR मान 500 पीजी 100 पीजी 50 पीजी 25 पीजी 12.5 पीजी 6.25 पीजी
rpoB 507 1 900.22 644.46 523.17 431.08 364.49 287.47
3 1,016.37 699.38 600.16 525.07 446.51 361.64
511 5 867.67 611.97 529.90 451.73 403.76 307.68
512 8 810.69 544.04 488.85 436.89 391.62 257.46 डी>
513 11 824.36 547.04 496.00 472.01 408.96 242.25
515 15 715.48 536.59 416.96 335.81 267.48 189.10
516 17 723.83 496.44 402.95 270.10 201.98
522 27 674.37 413.33 360.40 316.75 236.19 153.40
524 29 269.46 153.69 117.71 118.02 110.13 51.22
526 31 136.37 82.63 76.76 53.61 37.76
531 44 219.92 136.31 109.16 96.18 80.58 26.44
533 51 130.54 83.60 76.03 63.47 61.35 41.54
rpsL = "Xl71"> 43 54 10.41 12.75 53.30 767.18 5.39 362.42
88 56 655.54 542.79 527.43 690.34 403.86 456.05
katG 315 58 1,037.03 873.46 974.83 811.79 876.47
embB 306 66 940.81 781.13 788.75 837.65 787.05 696.69
Inha 8 82 1,069.43 934.38 862.58 936.88 809.85 682 .56
15 85 1,111.66 931.88 918.22 957.87 795.72 723.16
17 87 1,114.49 926.03 920.60 970.70 854.15 744.41

तालिका 3. सिग्नल wildtype जांच और एम. के कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए शोर अनुपात करने के लिए तपेदिक H37Ra जीनोमिक डीएनए. SNR मूल्यों> 3 detectable माना जाता है.

ntent "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> तालिका 4
तालिका 4. एमडीआर टीबी से प्रतिनिधि जीनोटाइपिंग डेटा प्रवर्धन माइक्रोएरे प्रतिक्रिया प्रति 25 पीजी के नाम से जाना जीनोटाइप के आइसोलेट्स. सितारे जेल तत्व माइक्रोएरे पर एक अद्वितीय जांच से प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं कि उत्परिवर्तन की पहचान. गुम्मट = wildtype न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम. नकारात्मक मूल्यों (बोल्ड और छायांकित) एक उत्परिवर्तन, इसलिए प्ररूपी दवा प्रतिरोध का संकेत कर रहे हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

एक प्रवर्धन माइक्रोएरे साथ बहुसंकेतन की हद अंततः मल्टीप्लेक्स असममित पीसीआर की दक्षता, नहीं माइक्रोएरे से निर्धारित होता है. हमारे अनुभव में, 10-12 अद्वितीय प्राइमर जोड़े आसानी से एक प्रवर्धन माइक्रोएरे प्रारूप में मल्टिप्लेक्स किया जा सकता है. परम्परागत प्राइमर और जांच डिजाइन मानदंडों इसलिए कि एक भी समाधान चरण न्यूक्लिक एसिड और immobilized माइक्रोएरे जांच, एक पीसीआर बफर में थर्मल थर्मल cycler की क्षमता है, और जांच संकरण व्यवहार के बीच संभावित बातचीत पर विचार करने की जरूरत है, को छोड़कर नए assays पर लागू होने वाली भी पीसीआर प्राइमरों और कम आणविक भार प्रवर्धन कलाकृतियों में शामिल है. इस तरह पूरे जीनोम प्रवर्धन के रूप में अत्यधिक मल्टिप्लेक्स प्रवर्धन दृष्टिकोण यादृच्छिक hexamers और immobilized जांच के बीच हस्तक्षेप, और लंबे, डबल असहाय amplicons की अक्षम संकरण सहित तकनीकी कारणों के एक नंबर के लिए एक एकल कक्ष प्रवर्धन माइक्रोएरे प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल नहीं हैं. वहाँयह भी व्यक्तिगत उपयोगकर्ताओं को कस्टम assays डिजाइनिंग या यहाँ वर्णित एमडीआर टीबी परीक्षण का उपयोग करते समय विचार करना होगा कि पता लगाने में आसानी से उपयोग, कुल विश्लेषण समय, और सीमा के बीच एक अंतर - संबंध है. उदाहरण के लिए, प्रवर्धन चक्रों की संख्या को कम करने और यहां तक ​​कि बाद प्रवर्धन संकरण कदम को नष्ट करने में काफी कुल विश्लेषण समय कम है, लेकिन परीक्षण संवेदनशीलता की कीमत पर होगा. दूसरी ओर, एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य 10 जीन की नकल सीमा का पता लगाने को प्राप्त करने, इस प्रकार एक ही काम पारी परे कुल विश्लेषण समय का विस्तार, अधिक प्रवर्धन चक्र या संकरण समय की आवश्यकता हो सकती है.

जीन उत्परिवर्तन, इमेजर, विश्लेषण सॉफ्टवेयर, और यहाँ वर्णित एल्गोरिथ्म रिपोर्टिंग बल्कि अपनी विश्लेषणात्मक प्रदर्शन और नैदानिक ​​उपयोगिता पर एक रिपोर्ट से, प्रवर्धन माइक्रोएरे विधि और प्रणाली के उदाहरण हैं. आवश्यकता है - उदाहरण के लिए, शुरू कर नमूना थूक, decontaminated तलछट, ठोस या तरल संस्कृतियों हो सकता हैप्रवर्धन माइक्रोएरे के लिए निकाले न्यूक्लिक एसिड असममित, मल्टिप्लेक्स पीसीआर द्वारा amplifiable हैं कि बस है. कुछ शोधकर्ताओं या चिकित्सकों rpsL या स्ट्रेप्टोमाइसिन और एथेमब्युटोल के लिए प्रतिरोध प्रदान कि embB परिवर्तन का पता लगाने में कोई नैदानिक ​​मूल्य के लिए थोड़ा मिल सकता है, क्रमशः, rifampin और Isoniazid को केवल प्रतिरोध एमडीआर टीबी परिभाषित. इस प्रकार, इन पीसीआर प्राइमरों और माइक्रोएरे जांच जीन और अन्य पहली या दूसरी पंक्ति एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोध प्रदान म्यूटेशनों कि लक्ष्य प्राइमरों और जांच के साथ बदला जा सकता है. बल्कि यह एक सरल "का पता चला प्रतिरोध" या "प्रतिरोध का पता नहीं" परिणाम से दिए गए नमूने में पाया जाता है कि विशिष्ट परिवर्तन पर विस्तृत जानकारी, साथ उपयोगकर्ता प्रदान करने के लिए एक रिपोर्टिंग एल्गोरिथ्म लिखने के लिए संभव है. एम. विश्लेषण करने के लिए इस विशिष्ट परख का उपयोग करने में रुचि रखने वालों के शोधकर्ताओं के लिए तपेदिक यह IS6110 तत्व detecte नहीं है, भले ही जीनोटाइपिंग डेटा उपलब्ध कराने के लिए भी संभव है, आइसोलेट्सनमूना में डी.

भले ही संभव परख और रिपोर्टिंग क्रमपरिवर्तन की, यहाँ वर्णित प्रवर्धन माइक्रोएरे और प्रोटोकॉल काफी एक भी जैव रासायनिक प्रतिक्रिया और microfluidic चेंबर में कई आणविक जीव विज्ञान कदम के संयोजन से माइक्रोएरे कार्यप्रवाह सरल बनाया गया है. प्रतिनिधि डेटा नौ एमडीआर टीबी जीनोमिक क्षेत्रों amplifying और एक कम घनत्व जेल तत्व माइक्रोएरे साथ उन असममित amplicons पता लगाने के द्वारा दृष्टिकोण की प्रभावकारिता प्रदर्शित करता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल शारीरिक रूप से धोने से पहले प्रवर्धन माइक्रोएरे से गैस्केट और कवर पर्ची निकालने के लिए उपयोगकर्ता की आवश्यकता है कि एक थोक कपड़े धोने की प्रक्रिया का उपयोग करता है, और इसलिए बल्कि नैदानिक ​​निदान से अनुसंधान उपयोग केवल अनुप्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त है. कहीं वर्णित है, हालांकि, यह पार्श्व प्रवाह fluidics 33 का उपयोग कर चिप पर एक कपड़े धोने कदम को शामिल करने और इसलिए एक पूरी तरह से बंद amplicon उपभोज्य, भंडार बनाए रखने के लिए निश्चित रूप से संभव हैआसानी से बिंदु का ध्यान अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है कि एक जवाब बाहर नमूना में नैदानिक ​​प्रणाली में शामिल किया जा सकता है कि एक uding.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

इस काम अनुदान RC3 AI089106 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) द्वारा समर्थित किया गया.

एमडीआर टीबी न्यूक्लिक एसिड उष्णकटिबंधीय रोगों (टीडीआर), जिनेवा, स्विट्जरलैंड में अनुसंधान एवं प्रशिक्षण के लिए संयुक्त राष्ट्र बाल कोष / संयुक्त राष्ट्र विकास कार्यक्रम / विश्व बैंक / विश्व स्वास्थ्य संगठन का विशेष कार्यक्रम द्वारा प्रदान किया गया.

हम प्रोटोटाइप परख में शामिल करने के लिए विशिष्ट जीन और परिवर्तन पर मार्गदर्शन के लिए रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए अमेरिकी केंद्र के डॉ. टॉम Shinnick धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips Akonni Biosystems Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus Qiagen #206143
Taq polymerase Qiagen #201207
RNAse-free water Qiagen #206143 
Formamide Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix Akonni Biosystems Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control Akonni Biosystems Inquire
20X SSPE Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP151-500
Disinfecting Spray  Current Technologies, Inc. #BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol Decon Labs, Inc. #8416
Microarray imager, with automated image and data analysis software Akonni Biosystems 100-20011
Thermal cycler with flat block insert Akonni Biosystems 100-10021
High-throughput wash station and slide holder ArrayIt HTW
Dissecting forceps Thermo Fisher Scientific, Inc. #10-300
Mini Vortexer VWR #3365040
Mini-centrifuge VWR #93000-196
Airbrush Compressor Kit Central Pneumatic #95630

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References

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