展现着多药耐药

Immunology and Infection

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Summary

扩增微阵列结合的不对称PCR扩增和微阵列杂交到一个单一的腔室,其显著简化了微阵列的工作流程最终用户。简化工作流程芯片是一个用于创建可在低资源环境中经常使用的芯片为基础的诊断是必要的第一步。

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Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Qu, P., Knickerbocker, C., Cooney, C. G., Chandler, D. P. Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray. J. Vis. Exp. (86), e51256, doi:10.3791/51256 (2014).

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Abstract

简化工作流程芯片是一个用于创建可在低资源环境中经常使用的MDR-TB芯片为基础的诊断是必要的第一步。扩增基因芯片结合了不对称PCR扩增,目标尺寸选择,目标标签和芯片杂交在一个单一的解决方案,并成一个单一的微流体室。批次处理方法表现出了9复杂不对称的预混和低密度凝胶元素的微阵列基因分型耐多药结核分枝杆菌 (MDR-TB)。这里描述的协议可在6小时内完成,并提供正确的基因分型与基因组DNA的至少1000细胞当量。结合片上的洗涤步骤是可行的,这将导致在一个完全封闭的扩增子的方法和系统。复用的扩增微阵列的程度最终是由引物对的,能够被组合成一个单一的主米的数量受限九,并且仍然获得期望的灵敏度和特异性的性能度量,而不​​是被固定在阵列上的探针的数目。同样地,总分析时间可以缩短或加长取决于特定的预期用途,研究问题,并且检测期望的限制。然而,一般的方法显著简化了微阵列的工作流程,通过减少手动密集和费时的加工步骤的数量,最终用户,并且提供了一个简化的生物化学和微流体通道用于翻译的微阵列为基础的诊断成常规的临床实践。

Introduction

早期发现和快速处理被认为是最有效的控制策略,以降低结核分枝杆菌 (MTB)传输1,和现在有在结核病的社区,一个点的护理(POC)或接近POC测试,同时诊断结核病的广泛共识和耐药性(DR)是必要的。技术,如Cepheid公司的的GeneXpert和其他核酸扩增试验的时间减少到诊断为许多结核病患者,并提供快速的读出指示的耐利福平或所选突变赋予对其他第一或第二线药物2。虽然实时性和等温核酸扩增试验的目的是确定药物的耐药突变,导致耐多药结核病,他们发现突变的频谱往往不足,设计对应于患者的耐药性分布的个体化药物治疗方案,及相关技术的限制光学串扰或扩增和报告的化学复杂性5月3日至7日限制位点或检测到的突变的数量。因此,检测技术具有较高的复用能力需要解决的差距称为耐多药结核病的POC诊断。

微阵列和世界卫生组织认可的海恩线性探针检测可以解决“多基因,多基因突变”诊断耐多药结核病8-29的挑战。不幸的是,这些杂交为基础的,复用检测平台使用多步骤,复杂的,需要显著培训和熟练掌握分子生物学技术的开放式扩增子协议。扩增芯片30的目的是要解决一些芯片的工作流程和运营的担忧。该简化的流体原则是扩增,杂交和单微流体腔室中检测靶核酸。用户引入了核酸扩增和马斯之三混合成流体室用吸管,并开始热循环程序。对于此处所示的批量处理方法,微阵列,其后洗涤散装溶液,干燥,并成像。这项研究表明,使用MDR-TB芯片测试的rpoB(30突变),katG的 (2突变) 的inhA(4突变) 的rpsL(2突变),embB(1突变),IS1245,IS6110扩增芯片的功能和一个内部的扩增和杂交的控制。至少有一个匹配的一对基因芯片的探针(野生型(WT)和单核苷酸突变(MU))被列入为每个感兴趣的突变。从耐多药M.纯化核酸结核病是由结核台湾存托凭证应变银行31。凝胶元素微阵列在玻璃基板上通过共聚如其他地方32描述制造基本上,除了我们用4%的单体和0.05毫每个探头在polymeriz通报BULLETIN混合物。阵列被包围在50ml的垫圈在使用之前。后的热循环,杂交和洗涤步骤,扩增微阵列上成像的Akonni便携式分析。背景校正,集成信号强度从原料取得,使用一个固定的圆的算法TIF图像。噪音对每个凝​​胶元素的计算公式为当地现货背景的三倍标准偏差。靶基因通常被认为是检测到的信号噪声比(SNR)值≥3。为了确定在每个基因的密码子或特定突变的存在或不存在下,生成的判别比是从SNR值作为(WT-MU)/(WT + MU)计算。判别比值<0顷指示耐药突变的位点的,而比值> 0是指示性的野生型序列中。

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Protocol

对于遵循通用的PCR预防措施实验室,在运作上更有效率,包括几个放大芯片和基板每垫圈和在散装容器同时清洗所有放大芯片,如下所述。耗材格式可用于执行在一个完全密封的,封闭的扩增试验扩增后芯片的洗涤步骤,因为在别处30,33报。

1。设置

  1. 提取并在适当的生物安全条件,选择的方法纯化核酸从样品。的要求是,核酸具有足够的纯度为不对称的,多重PCR扩增。
  2. 擦拭表面和设备净化解决方案做准备的工作区。
  3. 将扩增试剂在冰或冷水块。
  4. 标注无菌1.5毫升microfuge管扩增预混,并标记无菌0.2毫升离心TU对于每个样品。
  5. 后的试剂被解冻,简要地涡旋,并收集内容到管的底部用脉冲自旋在微型离心机。不要旋涡振荡Taq聚合酶。轻轻一抖管混合,并按照与脉冲自旋在微型离心机。
  6. 使用表1中所示的每个样品的反应体积制备的扩增母液。为了考虑可能的移液误差,准备至少一个以上的反应体积比被处理的样本的总数。请注意,主混合物包含额外的Taq聚合酶,通过与以上所提供的muliplex PCR缓冲液。只有放大/抑制控件添加到主混音的所有其他试剂结合后,股市试剂管返回到存储。
试剂 每个样品体积(μl) <STRONG>决赛[]
Mulitplex PCR缓冲液与HotStar加Taq酶 25 1X
牛血清白蛋白(BSA) 0.55 0.6毫克/毫升
甲酰胺 3.8 7.6%
额外的Taq聚合酶 0.8 单位/μL(4台总)
耐多药结核病的引物组合 15.75 -
无RNA酶H 2 O 2.1 -
放大/抑制控制 1 5.0 FG /μL
49

表1。耐多药结核病的放大芯片预混成分。

  1. 涡流的主混合物,并收集内容到管的一个脉冲自旋在微型离心机的底部。
  2. 结合49μl反应混合液和1μlM杆菌 DNA的每个步骤1.4,上述样品管。对于外部,无模板对照(NTC),使用1微升的分子生物学级水代替M肺结核 DNA样本。涡流和脉冲旋转时完成管(S)。

2,载入扩增微阵列

  1. 加入48微升每个主混音/样品到各自的微阵列的中心,小心不要触摸芯片本身。
  2. 广场上的芯片垫片和密封件的顶部盖玻片,注意不要捕获任何气泡在微阵列室。气泡可以扩增效率产生负面影响并可能造成假象或在随后的微阵列图像噪声。

3,热循环

  1. 一旦所有的芯片都装有样品,放置在基板的平坦块热循环仪。确保加热盖选项是打开“关闭”。从Akonni生物系统获得的装备就已经通过资格预审的使用。否则,它是非常重要的,以验证该平坦块热循环仪(次),得到(S)均匀的,一致的加热在所有微阵列基板。
  2. 打开热循环仪软件,选择相应的程序,输入“50微升”的反应体积,并开始运行。这里所描述的热循环程序包括:
    热循环步骤
    1 88°C 5分钟
    2 88°C 30秒
    3 55°C 1分钟
    4 65°C 30秒
    5 重复步骤(2-4)50次
    6 65°C 3分钟
    7 55°C 3小时
  3. 热循环的总数和55℃扩增后的保持时间为独立变量,用户可以修改,根据需要或适合于特定的实验。因为MDR-TB的主混合物产生不对称(主要是单链的)扩增子,它通常是有用的,以包括更多的热循环比否则可能被用于常规的,指数的PCR扩增方案。
  4. 当热循环和杂交程序完成,结束程序,取出放大芯片,关闭该软件,并关闭热循环仪(S)。

4,清洗和干燥

  1. 对于同时清洗多达24个基板,准备至少250毫升的1X SSPE - 0.1%的Triton X-100洗涤缓冲液,和两个容器至少250毫升去离子或Milli-Q系统级水各。洗涤缓冲液可以提前准备。
  2. 小心取出盖玻片和垫圈使用平头镊子每个扩增微阵列腔, 这一步是在哪个点有物理损坏凝胶元素的数组的最大风险。使用合适的PCR污染管制,以防止扩增核酸的蔓延内的工作环境。
  3. 将微阵列基板的组织学幻灯片夹,并将所有滑入含有洗涤缓冲液洗仓。覆盖容器用盖。
  4. 为10分钟,在室温下轻轻搅动洗涤微阵列。
  5. 浸微阵列在去离子的两个连续洗涤各三次或Milli-Q系统级的水,和空气干燥。

5。成像

不对称的耐多药结核病的引物组合产生Cy3标记的扩增子。凝胶元素微阵列可以成像与任何标准的微阵列成像仪成像能力的Cy3的。下面的成像过程是具体的耐多药结核病预混,Dx2100现场便携式成像仪,并自动分析软件由Akonni提供。

  1. 确保从成像器将以太网电缆连接到计算机。
  2. 打开成像器。电源开关位于仪器的后面板上。当成像仪电源打开热像仪的前面的蓝色LED指示灯会亮起。
  3. 开启计算机。
  4. 在计算机桌面上,双击软件图标启动自动图像分析软件。
  5. 等待建立与成像相机连接的软件。一旦连接建立,分析按钮变为可用,而出现“连接成功”将出现在屏幕的左下角。
  6. 将干燥的扩增微阵列与微阵列面向远离用户,并且物镜。如果芯片被不正确地定向相对于所述透镜和照相机,自动分析软件将不能放置一个网格中的荧光图像上。
  7. 关闭检修门。预览图像将可在计算机屏幕上。
  8. 从下拉菜单中选择耐多药结核病的分析脚本,并输入所需的曝光时间(以毫秒为单位)。一个典型的起点凝胶元素放大芯片是100-500毫秒。
  9. 在红色的饱和像素将被显示在预览图像。调节曝光时间以个别斑点内的饱和像素的数量最小化。
  10. 单击分析以获取和分析的荧光图像。该软件会自动将一个耐多药结核病检测特定的网格上的图像,提取积分强度和背景值,并报告耐药性及基因分型结果。自动分析通常需要几秒钟。对于包含刮痕,灰尘,荧光文物,或微阵列功能的物理损坏挑战性的图像,该软件可能需要长达1分钟即可完成分析。
  11. 一旦分析完成后,点击保存,文件名中选择目标文件夹,类型,然后单击确定。底层芯片数据被保存为。xls文件,并可以导出用于离线分析,如果需要的话。
  12. 一旦分析完成后,从成像器取出放大芯片,并单击新建以启动下一个分析。
  13. 当收集完数据后,关闭软件,关闭计算机,并关闭相机。

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Representative Results

定性图像分析可以提供洞察实验噪音或变化的挑战是识别通过自动图像分析软件生成的数据表的来源。因此,它可以是有用的在视觉上确定:1)所有的凝胶元素都完好无损,2)全球背景是不受任何可能影响个人的信噪比(SNR)值荧光文物,3)没有证据气泡的形成或不均匀的放大/杂交在阵列中,和4),该软件可准确识别的微阵列图像上的所有点。例如MDR-TB的扩增微阵列图像示于图1,示出了高品质的阵列和可能出现由于热循环过程中的物理损坏或气泡的工件。标准芯片图像分析软件通常是能够放置一个网格,并提取积分强度和背景数据,甚至低质量的图像如sh自己在图1B中,所以它是在研究者现任建立的质量控制标准和度量,用于接受或从进一步分析拒绝的微阵列的图像。探头冗余可以帮助改善这些问题。但是,一个完全自动化,诊断耐多药结核病的放大芯片算法的报告,否则从申报图1B测试为“无效”。

对系列稀释的野生型杆菌H37Ra基因组DNA扩增的微阵列的SNR值示于表2中 。在每个反应6.25皮克输入基因组DNA或约1.25×10 3细胞当量,所有的野生型探针可以容易地检测到。对于每个内部放大和抑制控制的SNR值范围从98.48( 杆菌rpoB)到967.24(Akonni提供的内部阳性对照),这表明在非对称多重扩增反应的所有靶基因被扩增和检测。无模板对照为阴性(SNR <3),用于在所述放大的微阵列的所有探针。在6.25 PG输入的DNA基因分型比从0.18-1.00不等所有WT / MU探针对,这表明野生型和MU探头和相应的基因分型的正确行为。

代表性的基因分型数据的已知基因型的世界卫生组织参考菌株一个面板示于表3,如果一个单核苷酸多态性(SNP)是表示在凝胶微阵列元素,那么扩增微阵列测试准确地检测在对MDR的相应突变结核病基因组。某些扩增的微阵列探针也以未明确阵列作为一个独特的探针上表示近邻突变敏感。例如,隔离TDR-0129包含一个S531E突变的rpoB基因,但是没有一个特异性探针上的扩增基因芯片为S531E。然而,其他五个SNP探针targetin克531位密码子表明,突变出现在密码子531 - 放大芯片,因此正确地指出,这种分离是利福平耐药。类似的敏感性, 杆菌rpoB S513W突变是显而易见的,孤立的TDR-0148。另一方面,一些SNP探针是不近邻突变敏感,如图所示由分离TDR-0148和rpoB基因 S512G突变,并隔离TDR-0011和katG的 S315R突变。我们怀疑这种类型的探测行为是二级和三级结构中的单链扩增子和/或探针34的结果,并且,不是可预测的先验 。然而,探测器的灵敏度近邻的突变,类似于利用松懈的分子信标检测多重耐药性突变与一组的实时PCR探针35,36最小的,并且可以是有利的诊断提供的测试不会产生误报RELAtive到表型药物敏感性。

图1
100 PG野生型图1(A)例扩增基因芯片图像结核 H37Ra株的基因组DNA和一个100毫秒的曝光时间。Cy3的信标(用于自动化网格化和分割软件)上的图像的外围。扩增微阵列表示的荧光晕工件从热循环过程中形成气泡造成的(B)的图像,和损坏的凝胶元素/杂物。自动图像分析软件仍然能够放置一个网格,并提取数据从这个形象。 请点击此处查看该图的放大版本。

<TR>
公司目录号
Akonni生物系统查询
Qiagen公司 #206143
Qiagen公司 #201207
Qiagen公司 #206143
赛默飞世尔科技公司 #BP227-500
Sigma-Aldrich公司 #3B6917
Akonni生物系统查询
Akonni生物系统查询
赛默飞世尔科技公司 #BP1328-4
赛默飞世尔科技公司 #BP151-500
目前的技术公司 #BRSPRAY128
解构实验室公司 #8416
公司目录号
Akonni生物系统 100-20011
100-10021
ArrayIt HTW
赛默飞世尔科技公司 #10-300
VWR #3365040
VWR #93000-196
中央气动 #95630

表2。所需的材料和设备。

69“> 329.09 <TD类=“xl69”> 109.90 号码:无“> 816.64
密码子探测器
ID
野生型探针SNR值 500皮克 100皮克 50皮克 25皮克 12.5皮克 6.25皮克
杆菌rpoB 507 1 900.22 644.46 523.17 431.08 364.49 287.47
3 1016.37 699.38 600.16 525.07 446.51 361.64
511 5 867.67 611.97 529.90 451.73 403.76 307.68
512 8 810.69 544.04 488.85 436.89 391.62 257.46 开发>
513 11 824.36 547.04 496.00 472.01 408.96 242.25
515 15 715.48 536.59 416.96 335.81 267.48 189.10
516 17 723.83 496.44 402.95 270.10 201.98
522 27 674.37 413.33 360.40 316.75 236.19 153.40
524 29 269​​.46 153.69 117.71 118.02 110.13 51.22
526 31 136.37 82.63 76.76 53.61 37.76
531 44 219.92 136.31 109.16 96.18 80.58 26.44
533 51 130.54 83.60 76.03 63.47 61.35 41.54
的rpsL =“xl71”> 43 54 10.41 12.75 53.30 767.18 5.39 362.42
88 56 655.54 542.79 527.43 690.34 403.86 456.05
katG的 315 58 1037.03 873.46 974.83 811.79 876.47
embB 306 66 940.81 781.13 788.75 837.65 787.05 696.69
的inhA 8 82 1069.43 934.38 862.58 936.88 809.85 682 .56
15 85 1111.66 931.88 918.22 957.87 795.72 723.16
17 87 1114.49 926.03 920.60 970.70 854.15 744.41

表3信号。为野生型探针和稀释系列M的信噪比结核 H37Ra株的基因组DNA。SNR值>3顷考虑检测。

ntent“FO:保持together.within页=”总是“> 表4
表4。从MDR-TB代表的基因分型数据分离的已知基因型的每扩增微阵列反应25页。星号标识并非由凝胶上的元件芯片独特的探针所表示的突变。 WT =野生型核酸序列。负值(粗体和阴影)是指示的突变,因此表型耐药性的。 请点击这里查看这个数字的放大版本。

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Discussion

复用的扩增微阵列的程度最终是由多重不对称PCR的效率,而不是在微阵列所决定的。在我们的经验,10-12独特的引物对能够容易地复用在一个扩增微阵列格式。因此,常规的引物和探针的设计准则适用于新的测定法,不同之处在于1也需​​要考虑溶液相的核酸和固定化微阵列的探针,该热循环仪的热效率,并且在PCR缓冲液探针杂交行为之间可能的相互作用也含有PCR引物和低分子量的扩增假象。高度复用扩增的方法,如全基因组扩增,不利于单室型扩增微阵列协议的一些技术上的原因,其中包括随机六聚体和固定化的探针之间的干扰,并且长的,双链的扩增子的杂交效率不高。那里还发现,个人用户需要设计定制分析或使用此处描述的MDR-TB测试时需要考虑的易于使用的,总的分析时间,和限制之间的相互关系。例如,减少的扩增循环的数目,甚至消除扩增后的杂交步骤将显著降低总分析时间,但在试验的灵敏度为代价的。另一方面,实现了可重复的10基因拷贝检出限可能需要更多的扩增循环或杂交时间,从而延长了总的分析时间超出单个工作班次。

的基因,突变,成像仪,分析软件,并报告在这里所描述的算法是说明性的放大的微阵列的方法和系统,而不是对它们的分析性能和临床应用的报告。例如,起始样品可以是痰,净化沉淀物,固体或液体培养物 - 的要求用于扩增基因芯片很简单,所提取的核酸扩增用不对称的,多路PCR。一些研究人员或医生可能会发现几乎在检测的rpsL或embB基因突变赋予对链霉素和乙胺丁醇没有临床价值,分别只对利福平和异烟肼耐药性定义的MDR-TB。因此,这些PCR引物和微阵列探针可以被替换为与靶基因和突变赋予对其他第一或第二线抗生素引物和探针。它可以写一个报告的算法来向用户提供关于在一个给定的样品中检测到的特定突变的详细信息,而不是简单的“检测的电阻”或“未检测到电阻”的结果。对于有兴趣使用这个特定的实验来分析M.那些研究人员结核病菌株,它也可以提供基因分型数据,即使IS6110元件不detecteD在试样。

无论可能的分析和报告排列,放大芯片和这里描述的协议旨在通过结合多个分子生物学步入一个单一的生化反应和微流体室显著简化了芯片的工作流程。的有代表性的数据展示方法通过扩增9 MDR-TB的基因组区域,并检测这些不对称的扩增子与低密度凝胶元件芯片的功效。这里所描述的协议使用,要求用户以物理方式从洗涤前扩增芯片移除垫圈和盖片的堆积洗涤过程,因此更适合于研究使用仅应用,而不是临床诊断。如其他地方所述,但是,它当然是可能的,其中包含使用横流流体33片的清洗步骤,因此保留一个完全封闭的扩增子的耗材,包括UDING 1,可以很容易地结合到样品中的回答出诊断系统,该系统适合于点关心的应用程序。

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Disclosures

作者宣称没有竞争的财务权益。

Acknowledgments

这项工作是由美国国立卫生研究院(NIH)根据授予RC3 AI089106支持。

耐多药结核病核酸是由联合国儿童基金/联合国开发计划署/世界银行/世界卫生组织特别规划热带病(TDR),日内瓦,瑞士提供的研究和培训。

我们感谢美国疾病控制和预防的汤姆Shinnick博士对特定基因的突变和指导在原型试验,以包括。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips Akonni Biosystems Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus Qiagen #206143
Taq polymerase Qiagen #201207
RNAse-free water Qiagen #206143 
Formamide Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix Akonni Biosystems Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control Akonni Biosystems Inquire
20X SSPE Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP151-500
Disinfecting Spray  Current Technologies, Inc. #BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol Decon Labs, Inc. #8416
Microarray imager, with automated image and data analysis software Akonni Biosystems 100-20011
Thermal cycler with flat block insert Akonni Biosystems 100-10021
High-throughput wash station and slide holder ArrayIt HTW
Dissecting forceps Thermo Fisher Scientific, Inc. #10-300
Mini Vortexer VWR #3365040
Mini-centrifuge VWR #93000-196
Airbrush Compressor Kit Central Pneumatic #95630

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References

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