Der Nachweis eines multiresistenten

Immunology and Infection

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Summary

Ein Verstärkungsmikroarray kombiniert asymmetrischen PCR-Amplifikation und Mikroarray-Hybridisierung in einer einzigen Kammer, die Mikroarray-Arbeitsprozess deutlich vereinfacht für den Endbenutzer. Vereinfachung der Microarray-Workflow ist ein notwendiger erster Schritt für die Erstellung von Microarray-basierte Diagnostik, die routinemäßig in der unteren-Ressource-Umgebungen eingesetzt werden kann.

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Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Qu, P., Knickerbocker, C., Cooney, C. G., Chandler, D. P. Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray. J. Vis. Exp. (86), e51256, doi:10.3791/51256 (2014).

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Abstract

Vereinfachung der Microarray-Workflow ist ein notwendiger erster Schritt für die Erstellung von MDR-TB-Microarray-basierte Diagnostik, die routinemäßig in der unteren-Ressource-Umgebungen eingesetzt werden kann. Ein Verstärkungsmicroarray kombiniert asymmetrische PCR-Amplifikation Zielgrößenauswahl, Zielkennzeichnung, und Microarray-Hybridisierung in einer einzigen Lösung und in einem einzigen mikrofluidischen Kammer. Eine Batch-Verarbeitungsverfahren ist mit einem 9-plex asymmetrische Master-Mix und Low-Density-Gel Element Microarray zur Genotypisierung multiresistenter Mycobacterium-Tuberkulose (MDR-TB) demonstriert. Das hier beschriebene Protokoll kann in 6 Stunden abgeschlossen sein und korrekte Genotypisierung mit mindestens 1000 Zelläquivalente von genomischer DNA. Mit On-Chip Waschschritten durchführbar ist, die in einer völlig geschlossenen Amplikon Verfahren und System führt. Das Ausmaß der mit einer Multiplex-Amplifikation Mikroarray wird schließlich durch die Anzahl der Primerpaare, die in einem einzigen Master-m kombiniert werden können, eingeschränktix und trotzdem die gewünschte Empfindlichkeit und Spezifität Leistungsmetriken, anstatt die Anzahl von Sonden, die auf dem Array immobilisiert sind. Ebenso kann die Gesamtanalysezeit verkürzt oder verlängert werden, je nach dem speziellen Verwendungszweck Fragestellung und gewünschte Nachweisgrenze. Dennoch ist die allgemeine Vorgehensweise deutlich Microarray-Workflow optimiert für den Endanwender, indem die Anzahl der manuell intensive und zeitaufwendige Verarbeitungsschritte und bietet eine vereinfachte biochemischen und Mikrofluidik-Pfad für die Übersetzung von Microarray-basierte Diagnostik in der klinischen Routine.

Introduction

Frühe Erkennung und Fall schnelle Behandlung gelten als die wirksamsten Kontrollstrategien zur Mycobacterium tuberculosis (MTB) Getriebe 1 zu reduzieren, und es gibt jetzt einen breiten Konsens in der TB-Community, die ein Point of Care (POC) oder in der Nähe von POC-Test, um gleichzeitig zu diagnostizieren TB und Arzneimittelresistenz (DR) benötigt. Technologien wie Cepheid Genexpert und andere Nukleinsäure-Amplifikation Tests reduzieren die Zeit bis zur Diagnose für viele TB-Patienten und bieten eine schnelle Auslesen der angibt, Resistenz gegen Rifampicin oder ausgewählte Mutationen eine Resistenz gegen andere erste oder zweite Linie 2 Drogen. Obwohl Echtzeit-und isothermen Nucleinsäureamplifikation Tests sind für die Medikamentenresistenz Mutationen, die zu MDR-TB führen, zu identifizieren, ist das Spektrum der Mutationen erkennen sie oft nicht ausreichend, um eine individuelle medikamentöse Behandlung, die der Arzneimittel-Resistenz-Profil des Patienten zu gestalten, und technische Zwänge im Zusammenhangum optisches Übersprechen oder die Komplexität der chemischen Verstärkung und Berichts Mai 3-7 die Anzahl der Loci oder Mutationen, die erfasst werden, zu begrenzen. So sind Detektionstechnologien mit höherer Kapazität erforderlich, um Multiplexing bekannt Lücken im MDR-TB POC Diagnostik zu adressieren.

Microarrays und die WHO-endorsed Hain Linie Sondentests können die "multiple Gen, mehrere Mutationen" Herausforderung der Diagnose von MDR-TB 8-29 ehen. Leider sind diese Hybridisierung-basierte Multiplex-Detektionsplattformen verwenden mehrstufigen, kompliziert und Open-Amplikon Protokolle, die eine umfassende Ausbildung und Kenntnisse in molekularen Techniken erfordern. Die Verstärkung Microarray-30 wurde entwickelt, um einige dieser Microarray-Work-Flow und Betriebs Anliegen anzusprechen. Die Vereinfachung fluidischen Grundsätze sind zu ergänzen, zu hybridisieren und erkennen Nukleinsäure-Targets in einem einzigen mikrofluidischen Kammer. Der Benutzer stellt die Nukleinsäure-Amplifikation und master mischen in einem fluidischen Kammer mit einer Pipette und startet den Temperaturwechsel-Protokoll. Für die hier gezeigte Stapelverarbeitung Verfahren werden Mikroarrays anschließend in Lösung gewaschen, getrocknet und abgebildet. Diese Studie veranschaulicht die Funktionalität von einem Verstärkungsmikroarray unter Verwendung eines MDR-TB Microarray-Test rpoB (30 Mutationen) katG (2 Mutationen), inhA (4 Mutationen), rpsL (2 Mutationen), embB (1-Mutation), IS1245, IS6110 und eine interne Verstärkung und Hybridisierungskontrolle. Mindestens ein angepaßtes Paar von Mikroarray-Sonden (Wildtyp (WT) und Single-Nukleotid-Mutante (MU)) für jede Mutation von Interesse enthalten. Gereinigte Nukleinsäuren von multiresistenter M. Tuberkulose sind von der TDR-Tuberkulose-Stamm Bank-31. Gel-Element-Microarrays auf Glassubstraten durch Copolymerisation im Wesentlichen hergestellt wie an anderer Stelle 32, mit der Ausnahme, dass wir 4% Monomer und 0,05 mM jede Sonde in der polymerization Mischung. Arrays werden mit einem 50-ml-Dichtung vor der Verwendung umgeben. Nach dem thermischen Zyklus, Hybridisierung und die Waschschritte werden Amplifikation Mikroarrays auf ein tragbares Analyse Akonni abgebildet. Hintergrund-korrigiert, integrierte Signalintensitäten von der rohen erhalten. Tif Bilder mit einem festen Kreis-Algorithmus. Lärm für jedes Gel Element als das Dreifache der Standardabweichung der lokalen Stelle Hintergründe berechnet. Gen-Targets werden in der Regel als nachweisbar Signal-Rausch-Verhältnis (SNR)-Werte ≥ 3. Um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Mutation in jedem Gen oder Codon zu bestimmen, wird eine Diskriminanzanalyse Verhältnis aus den SNR-Werte als (WT-MU) / (WT + MU) berechnet. Diskriminanzanalyse Verhältnisse <0 deuten auf eine Medikamentenresistenz Mutation an der Stelle, während die Verhältnisse> 0 sind bezeichnend für die Wildtyp-Sequenz.

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Protocol

Für Labore, die universelle PCR-Anweisungen nicht befolgen, ist es operativ effizienter, mehrere Verstärkung Microarrays und Dichtungen pro Substrat enthalten und waschen für alle Verstärkungsmicroarrays gleichzeitig in einem Großbehälter, wie hier beschrieben. Verbrauchsmaterialformate sind für die Durchführung nach der Amplifikation Microarray-Waschschritte in einem völlig abgedichtet, geschlossene Amplikon-Test zur Verfügung, wie an anderer Stelle berichtet, 30,33.

1. Setup-

  1. Extrahieren und zu reinigen Nukleinsäuren aus der Probe unter geeigneten Bedingungen die biologische Sicherheit mit einer Methode der Wahl. Voraussetzung ist, dass Nukleinsäuren ausreichender Reinheit für die asymmetrische, Multiplex-PCR-Amplifikation.
  2. Bereiten Arbeitsbereich durch Abwischen Oberflächen und Geräte mit Dekontaminierung Lösungen.
  3. Zeigen Amplifikationsreagenzien auf Eis oder kalten Block.
  4. Beschriften Sie eine sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für die Verstärkung Master-Mix, und kennzeichnen eine sterile 0,2-ml-Mikro tuwerden für jede Probe.
  5. Nach Reagenzien werden aufgetaut, kurz Wirbel und sammeln Inhalt auf den Boden des Röhrchens mit einem puls Spin in einer Minizentrifuge. Vortexen nicht Taq-Polymerase. Flick vorsichtig das Rohr zu mischen und folgen mit einem Impuls-Spin-in Mini-Zentrifuge.
  6. Bereiten Sie eine Verstärkung Master-Mix mit den pro-Probenreaktion in Tabelle 1 dargestellt Bände. Um mögliche Ungenauigkeiten Pipettieren Konto, bereiten mindestens eine weitere Reaktionsvolumen als die Gesamtzahl der Proben verarbeitet werden. Beachten Sie, dass die Master-Mix enthält zusätzliche Taq-Polymerase, die über das, was mit der Muliplex-PCR-Puffer vorgesehen ist. Fügen Sie nur die Verstärkung / Hemmung Steuerung an den Master-Mix, nachdem alle anderen Reagenzien kombiniert werden, und die Aktien Reagenzröhrchen den Speicher zurück.
Reagens Per-Probenvolumen (ul) <strong> Finale []
Mulitplex-PCR-Puffer mit HotStar Taq Plus- 25 1x
Rinderserumalbumin (BSA) 0,55 0,6 mg / ml
Formamid 3.8 7,6%
Zusätzliche Taq-Polymerase 0,8 Einheiten / ul (4 Einheiten insgesamt)
MDR-TB-Primer-Gemisch 15,75 -
RNase-freie H 2 O 2.1 -
Verstärkung / Hemmung Steuer 1 5,0 fg / ul
Gesamt 49

Tabelle 1. MDR-TB Verstärkung Microarray-Master-Mix-Zusammensetzung.

  1. Wirbel die Master-Mix und sammeln Inhalt auf den Boden des Röhrchens mit einem Impuls-Spin in einer Minizentrifuge.
  2. Kombinieren Sie 49 ul des Master-Mix und 1 ul von M. tuberculosis-DNA mit jedem der Probenröhrchen von Schritt 1.4, oben. Für eine externe, nicht-Template-Kontrolle (NTC), verwenden Sie 1 ul der Molekularbiologie Wasser anstelle des M. Tuberkulose DNA-Probe. Vortex-Spin-und Impuls die Röhre (n), wenn Sie fertig.

2. Legen Amplification Microarrays

  1. In 48 ul jeder Master-Mix / Probe auf die Mitte der jeweiligen Mikroarrays, wobei Sie darauf achten, den Microarray selbst nicht berühren.
  2. Legen Sie ein Deckglas auf dem Microarray-Dichtung und Dichtung, man aufpassen, nicht zu stoppen keine Luftblasen in der Microarray-Kammer. Luftblasen können sich negativ auf Verstärkungseffizienzund kann zu Artefakten oder Rauschen in dem nachfolgenden Bild-Mikroarray zu erzeugen.

3. Thermal Cycling

  1. Sobald alle Microarrays sind mit Probe werden Substrate auf der flachen Block Thermocycler geladen. Stellen Sie sicher, dass der beheizte Deckel Option auf "Aus". Ausstattung von Akonni Biosystems wird bereits für die Verwendung präqualifiziert werden. Ansonsten ist es sehr wichtig, um zu überprüfen, dass die flache Block Thermocycler (n) bieten (n) einheitliche, konsistente Heizung in allen Mikroarray-Substraten.
  2. Öffnen Sie den Thermocycler-Software, wählen Sie das entsprechende Programm, geben Sie "50 ul" für das Reaktionsvolumen, und starten Sie die Sicht. Die hier beschriebene Wärmezyklus-Protokoll besteht aus:
    Thermal Cycling Schritte
    1 88 ° C 5 min
    2 88 ° C 30 Sek.
    3 55 ° C 1 min
    4 65 ° C 30 Sek.
    5 Wiederholen Sie die Schritte (2-4) für 50 Zyklen
    6 65 ° C 3 min
    7 55 ° C 3 Stunden
  3. Die Gesamtzahl der thermischen Zyklen und 55 ° C nach der Amplifikation Haltezeit unabhängige Variable sind, dass der Benutzer zu ändern, wie benötigt oder für den spezifischen Experiment geeignet. Da der MDR-TB-Master-Mix schafft asymmetrisch (überwiegend Einzelstrang) Amplikons, ist es meist hilfreich, mehr Wärmezyklen, als es sonst für einen herkömmlichen, exponentielle PCR-Amplifikation-Protokoll verwendet werden, umfassen.
  4. Wenn der Temperaturwechsel und Hybridisierung Programm abgeschlossen ist, beenden Sie das Programm, entfernen Sie die Verstärkung Microarrays, schließen Sie die Software, und schalten Sie den Thermocycler (n).

4. Waschen und Trocknen

  1. Zum Waschen bis zu 24 Substrate gleichzeitig werden mindestens 250 ml 1x SSPE - 0,1% Triton X-100 Waschpuffer, und zwei Behälter mit mindestens 250 ml deionisiertem oder Milli-Q-Wasser jeweils. Der Waschpuffer kann im Voraus erstellt werden.
  2. Das Deckglas und die Dichtung von jedem Verstärkung Microarray Kammer mit Flach-End-Zange vorsichtig entfernen. Dieser Schritt ist der Punkt, an dem es das größte Risiko von schädlichen physikalisch-Gel-Element-Arrays. Verwenden Sie geeignete PCR-Kontaminationskontrollen, um die Ausbreitung zu verhindern amplifizierten Nukleinsäuren in der Arbeitsumgebung.
  3. Zeigen Microarray-Substraten in einer Histologie Objektträger-Halter, und setzen Sie alle Folien in den Waschkorb mit der Waschpuffer. Bedecken Sie den Behälter mit einem Deckel.
  4. Waschen Mikroarrays für 10 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
  5. Tauchen Sie den Microarrays jeweils drei Mal in zwei aufeinanderfolgenden Waschungen VE-oderMilli-Q-Wasser und der Luft trocknen.

5. Imaging

Die asymmetrische MDR-TB-Primer-Gemisch erzeugt Cy3-markierten Amplikons. Gel-Element-Microarrays kann mit jedem Standard-Microarray-Imager in der Lage, Bild Cy3 abgebildet werden. Die folgende Bildverfahren ist spezifisch für die MDR-TB-Master-Mix, Dx2100 Feld tragbare Imager und automatisierte Analyse-Software von Akonni Verfügung gestellt.

  1. Stellen Sie sicher, dass das Ethernet-Kabel vom Scanner an den Computer angeschlossen ist.
  2. Schalten Sie den Scanner. Der Netzschalter befindet sich auf der Rückseite des Gerätes befindet. Blaue LEDs auf der Vorderseite der Abbildungs ​​leuchtet, wenn Imager eingeschaltet ist.
  3. Den Computer einzuschalten.
  4. Auf dem Computer-Desktop, doppelklicken Sie auf das Software-Symbol, um die automatisierte Bildanalyse-Software zu starten.
  5. Warten Sie auf die Software, um eine Verbindung mit dem Imager-Kamera zu etablieren. Sobald die Verbindung hergestellt ist, wird die Schaltfläche Analysieren zur Verfügung, und dieMeldung "Verbindung erfolgreich" wird in der unteren linken Ecke des Bildschirms angezeigt.
  6. Legen Sie die getrockneten Mikroarray-Verstärkung mit der Mikroarray abgewandten den Benutzer und Richtung der Objektivlinse. Wenn das Mikroarray mit nicht gegen der Linse und der Kamera ausgerichtet ist, wird die automatisierte Analyse-Software nicht, um ein Raster auf dem Fluoreszenzbild zu platzieren.
  7. Schließen Sie die Tür. Eine Vorschau Bild wird auf dem Computer-Bildschirm verfügbar sein.
  8. Wählen Sie das MDR-TB-Analyse Skript aus dem Dropdown-Menü und geben Sie die gewünschte Belichtungszeit (in Millisekunden). Ein typischer Ausgangspunkt für Gel-Element Verstärkung Microarrays 100-500 ms.
  9. Gesättigte Pixel auf dem Vorschaubild in rot angezeigt. Einstellen der Belichtungszeit, um die Anzahl von gesättigten Bildelementen innerhalb einzelner Flecken zu minimieren.
  10. Klicken Sie auf Analysieren, um das Fluoreszenzbild zu erwerben und zu analysieren. Die Software wird automatisch vergeben einenMDR-TB-Assay-spezifischen Gitter auf das Bild, zu extrahieren und integrierte Intensität der Hintergrundwerte und berichten Arzneimittelresistenz und Genotypisierung Ergebnisse. Die automatisierte Analyse dauert in der Regel ein paar Sekunden. Für anspruchsvolle Bilder, die Kratzer, Staub, fluoreszierende Artefakte oder physische Schäden an den Microarray-Funktionen enthalten, muss die Software bis zu 1 min, um die Analyse abzuschließen.
  11. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf Speichern, wählen Sie den Zielordner, geben Sie einen Dateinamen ein, und klicken Sie auf OK. Basiswert Microarray-Daten werden als. Xls-Datei gespeichert und können für die Offline-Analysen exportiert werden, wenn gewünscht.
  12. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, entfernen die Verstärkung aus der Microarray-Imager, und klicken Sie auf Neu, um die nächste Analyse einzuleiten.
  13. Beim Sammeln von Daten abgeschlossen ist, schließen Sie die Software, den Computer herunterfahren, und schalten Sie den Bildwandler.

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Representative Results

Qualitative Bildanalyse Einblick in Quellen von Lärm oder experimentelle Variabilität, die herausfordern, um in Datentabellen durch automatisierte Bildanalyse-Software erzeugt identifizieren. So kann es sinnvoll sein, um visuell festzustellen, dass 1) Alle Elemente Gel intakt und unbeschädigt sind, 2) die globalen Grund frei von Artefakten, die einzelnen Fluoreszenzsignal-Rausch-Verhältnis-Werten (SNR) beeinträchtigen könnte, 3) es gibt keine Beweise für Blasenbildung oder ungleichmäßige Amplifikation / Hybridisierung über die Anordnung und 4), dass die Software genau alle Spots auf dem Microarray Bild identifiziert. Beispiel MDR-TB Verstärkung Microarray-Bilder sind in Abbildung 1 dargestellt ist, die eine qualitativ hochwertige Array und Artefakte, die aufgrund der körperlichen Schäden oder Blasen während thermischer Zyklen auftreten können. Standard-Image-Microarray-Analyse-Software ist in der Regel in der Lage, ein Gitter legen und extrahieren integrale Intensität und Hintergrunddaten auch aus Bildern schlechter Qualität wie shSelbst in 1B, so obliegt es dem Forscher Qualitätskriterien Kontrolle und Metriken für die Annahme oder Ablehnung Microarray-Bilder von der weiteren Analyse zu etablieren. Probe-Redundanz kann helfen, diese Probleme zu lindern. Allerdings ist eine vollautomatische, Diagnose MDR-TB Verstärkung Microarray-Berichterstattung Algorithmus sonst den Test von 1B erklären würde als "ungültig".

Microarray-Amplifikation SNR-Werte für eine Verdünnungsreihe von Wildtyp-H37Ra genomischen DNA sind in Tabelle 2 gezeigt. Bei 6,25 pg Eingangs genomische DNA pro Reaktion oder etwa 1,25 x 10 3 Zellen Äquivalente sind alle Wildtypsonden leicht nachgewiesen. SNR-Werte für jeden der internen Verstärkung und Hemmung Kontrollen reichten von 98,48 (rpoB) bis 967,24 (Akonni gelieferten internen Positivkontrolle), die anzeigt, dass alle Gen-Targets in der asymmetrischen Multiplex Amplifikationsreaktion amplifiziert und nachgewiesen werden. NichtTemplate-Kontrollen waren negativ (SNR <3) für alle Sonden in der Microarray-Verstärkung. Genotypisierung Verhältnisse bei 6,25 pg DNA-Eingang reichten von 0,18 bis 1,00 für alle WT / MU Sondenpaare, die das richtige Verhalten von WT-und MU-Sonden und geeignete Genotypisierung zeigt.

Repräsentative Daten für die Genotypisierung eines Panels von der Weltgesundheitsorganisation Referenz Isolate Genotyp sind in Tabelle 3 gezeigt. Wenn ein Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) an der Gel-Mikroarray-Element dargestellt, und die Verstärkung Microarray-Test genau die entsprechenden Mutation im MDR erkennt TB-Genom. Einige der Verstärkungssonden-Mikroarray sind auch empfindlich gegen nahen Nachbar Mutationen, die nicht explizit auf dem Array als eine einzigartige Sonde dargestellt. Zum Beispiel isolieren TDR-0129 enthält einen S531E Mutation in rpoB-Gen, aber es ist nicht eine bestimmte Sonde auf dem Mikroarray für die Amplifikation S531E. Dennoch fünf anderen SNP-Sonden TARGETINCodon 531 g zeigen, dass eine Mutation im Codon 531 vorhanden ist - die Verstärkung Microarray daher korrekt an, dass dieses Isolat ist Rifampicin resistent. Ähnliche Sensibilität für die rpoB S513W Mutation zu isolieren TDR-0148 offensichtlich. Auf der anderen Seite sind einige SNP-Sonden nicht empfindlich auf Nachbar-Mutationen, wie Isolat TDR-0148 und dem rpoB S512G Mutation dargestellt und isolieren TDR-0011 und der katG S315R-Mutation. Wir vermuten, dass diese Art der Sonde Verhalten ist eine Folge der Sekundär-und Tertiärstruktur in der Einzelstrang-Amplikon und / oder Sonde 34 und ist nicht etwas, das von vornherein vorhergesagt werden kann. Dennoch ist Sondenempfindlichkeit nahe Nachbarn Mutationen analog zum Einsatz von Molecular Beacons schlampig, mehrere Resistenzen Mutationen, die mit einem minimalen Satz von Echtzeit-PCR-Sonden 35,36 erkennen und diagnostisch vorteilhaft sein, sofern der Test nicht Fehlalarme erzeugen Beziehungentive auf die phänotypische Medikamentenempfindlichkeit.

Figur 1
Abbildung 1. (A) Bild Beispiel Verstärkung für Microarray-100 pg Wildtyp M. tuberculosis H37Ra genomische DNA und eine 100 ms Belichtungszeit. Cy3 Baken (automatisierte Rasterung und Segmentierung Software) sind an der Peripherie des Bildes. (B) Bild eines Verstärkungsmikroarray, das eine fluoreszierende Halogen Artefakt von Blasenbildung während der Wärmezyklen resultiert, Gel und beschädigte Elemente / Schutt. Automatische Bildanalyse-Software ist noch in der Lage, ein Gitter und Extrahieren von Daten aus diesem Bild zu platzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

<tr>
Firma Katalognummer
Akonni Biosystems Erkundigen
Qiagen # 206143
Qiagen # 201207
Qiagen # 206143
Thermo Fisher Scientific, Inc. # BP227-500
Sigma-Aldrich # 3B6917
Akonni Biosystems Erkundigen
Akonni Biosystems Erkundigen
Thermo Fisher Scientific, Inc. # BP1328-4
Thermo Fisher Scientific, Inc. # BP151-500
Strom Technologies, Inc. # BRSPRAY128
Decon Labs, Inc. # 8416
Firma Katalognummer
Akonni Biosystems 100-20011
100-10021
Arrayit HTW
Thermo Fisher Scientific, Inc. # 10-300
VWR # 3365040
VWR # 93000-196
Zentrale Druckluft # 95630

Tabelle 2. Benötigte Materialien und Geräte.

69 "> 329,09 <td class = "xl69"> 109.90 p: none "> 816,64
Codon Sonde
Identifikation
WT-Sonde SNR Werte 500 pg 100 pg 50 pg 25 pg 12,5 pg 6,25 pg
rpoB 507 1 900,22 644,46 523,17 431,08 364,49 287,47
3 1.016,37 699,38 600,16 525,07 446,51 361,64
511 5 867,67 611,97 529,90 451,73 403,76 307,68
512 8 810,69 544,04 488,85 436,89 391,62 257,46 d>
513 11 824,36 547,04 496,00 472,01 408,96 242,25
515 15 715,48 536,59 416,96 335,81 267,48 189,10
516 17 723,83 496,44 402,95 270,10 201,98
522 27 674,37 413,33 360,40 316,75 236,19 153,40
524 29 269,46 153,69 117,71 118,02 110,13 51,22
526 31 136,37 82.63 76.76 53.61 37,76
531 44 219,92 136,31 109,16 96,18 80,58 26.44
533 51 130,54 83.60 76.03 63.47 61,35 41,54
rpsL = "Xl71"> 43 54 10.41 12.75 53.30 767,18 5,39 362,42
88 56 655,54 542,79 527,43 690,34 403,86 456,05
katG 315 58 1.037,03 873,46 974,83 811,79 876,47
embB 306 66 940,81 781,13 788,75 837,65 787,05 696,69
inhA 8 82 1.069,43 934,38 862,58 936,88 809,85 682 0,56
15 85 1.111,66 931,88 918,22 957,87 795,72 723,16
17 87 1.114,49 926,03 920,60 970,70 854,15 744,41

Tabelle 3. Signal-Rausch-Verhältnis für Wildtyp-Sonden und einer Verdünnungsreihe von M. Tuberkulose H37Ra genomischer DNA. SNR-Werte> 3 werden als nachweisbar.

ntent "fo: keep-together.within-page =" always "> Tabelle 4
Tabelle 4. Genotypisierung Repräsentative Daten von MDR-TB-Isolate von Genotyp bei 25 pg pro Amplifikation Mikroarrayreaktions. Sterne kenn Mutationen, die nicht durch eine eindeutige Sonde auf dem Gelelement Mikroarray dargestellt sind. WT = Wildtyp-Nukleinsäuresequenz. Negative Werte (fett und schattigen) sind Anzeichen für eine Mutation, also phänotypische Medikamentenresistenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Das Ausmaß der mit einer Multiplex-Amplifikation Mikroarray wird letztendlich von der Effizienz der Multiplex-PCR asymmetrisch, nicht das Mikroarray bestimmt wird. Nach unserer Erfahrung können 10-12 einzigartigen Primerpaare leicht zu einer Verstärkung Microarray-Format gemultiplext werden. Herkömmliche Primer-und Sondendesign Kriterien daher, neue Tests, mit Ausnahme, dass man muss auch mögliche Wechselwirkungen zwischen Lösungsphase Nukleinsäuren und Microarray-Sonden immobilisiert, der thermische Wirkungsgrad der Thermocycler und Sondenhybridisierung Verhalten in einer PCR-Puffer berücksichtigen, dass auch enthält PCR-Primer und niedrigem Molekulargewicht Verstärkung Artefakte. Sehr Multiplex-Amplifikation Ansätze wie Amplifikation des gesamten Genoms sind nicht förderlich für ein Ein-Kammer-Verstärkung Microarray-Protokoll für eine Reihe von technischen Gründen, einschließlich Störungen zwischen Zufallshexameren und immobilisierten Sonden und ineffizient Hybridisierung lange, doppelsträngige Amplikons. Daist auch eine Wechselbeziehung zwischen Einfachheit der Nutzung, Gesamtanalysezeit und Nachweisgrenzen, dass die einzelnen Benutzer müssen bei der Gestaltung kundenspezifische Assays oder mit der hier beschriebenen MDR-TB-Test. Zum Beispiel wird die Verringerung der Anzahl von Amplifikationszyklen und auch die Beseitigung der nach der Amplifikation Hybridisierungsschritts wesentlich Gesamtanalysezeit zu verringern, jedoch auf Kosten der Testempfindlichkeit. Auf der anderen Seite, Erzielung einer reproduzierbaren 10 Gen-Kopie Nachweisgrenze kann mehr Amplifizierungszyklen oder Hybridisierungszeit und verlängert so die Gesamtanalysezeit über eine einzelne Arbeitsschicht.

Die Gene, Mutationen Imager Analysesoftware und Berichts hier beschriebenen Algorithmus veranschaulichen die Verstärkung Microarray-Verfahren und das System, anstatt einen Bericht über ihre analytische Leistung und klinischen Nutzen. Die Anforderung - zum Beispiel kann die Ausgangsprobe Sputum, dekontaminierte Sediment, feste oder flüssige Kulturenzur Amplifikation Mikroarray ist einfach, dass die extrahierten Nukleinsäuren amplifiziert werden asymmetrische Multiplex PCR. Einige Forscher oder Kliniker kann wenig bis gar keine klinischen Wert der Aufdeckung rpsL embB oder Mutationen, die eine Resistenz gegen Streptomycin und Ethambutol verleihen zu finden bzw. nur Widerstand gegen Rifampicin und Isoniazid definieren MDR-TB. Somit können diese PCR-Primer und-Sonden-Mikroarray mit Primern und Sonden, die Gene und Mutationen, die Resistenz gegen andere der ersten oder zweiten Ziel-line Antibiotika ersetzt. Es ist möglich, ein Reporting-Algorithmus schreiben, um dem Nutzer detaillierte Informationen über die spezifischen Mutationen, die in einer gegebenen Probe festgestellt werden, anstelle eines einfachen "Widerstand erkannt" oder "Widerstand nicht erkannt" Ergebnis liefern. Für die Forscher, die sich bei der Verwendung dieser spezifischen Assay zu analysieren M. tuberculosis-Isolaten, ist es auch möglich, die Genotypdaten bereitzustellen, selbst wenn das IS6110-Element nicht detected in der Probe.

Unabhängig von den möglichen Test-und Berichts Permutationen wird die Verstärkung Mikroarray und hier beschriebene Protokoll entwickelt, um Mikroarray-Workflow erheblich vereinfachen durch die Kombination mehrerer molekularbiologische Schritte in einem einzigen biochemischen Reaktion und mikrofluidischen Kammer. Die repräsentativen Daten zeigen die Wirksamkeit des Ansatzes durch Verstärkung von neun MDR-TB genomischen Regionen und Erfassen diese asymmetrische Amplikons mit einer Low-Density-Gel-Microarray-Element. Das hier beschriebene Protokoll verwendet einen Großwaschverfahren, die den Benutzer erfordert physisch entfernen Sie die Dichtung und Deckglas aus der Microarray-Verstärkung vor dem Waschen, und ist daher für die Forschung-use-Anwendungen nur anstatt der klinischen Diagnostik geeignet. Wie an anderer Stelle beschrieben, jedoch ist es durchaus möglich, einen Waschschritt auf dem Chip mit Lateral-Flow-Fluidik 33 übernehmen und behalten somit eine völlig geschlossene Amplikon Verbrauchs, inkl.uding eine, die leicht in einer Probe in Antwort out-Diagnosesystem, das für die Point-of-Care-Anwendungen geeignet ist eingearbeitet werden können.

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Disclosures

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health (NIH) unter dem Förder RC3 AI089106 unterstützt.

MDR-TB Nukleinsäuren wurden durch das Kinderhilfswerk der Vereinten Nationen Entwicklungsprogramm Fund / UN / Weltbank / Weltgesundheitsorganisation Sonderprogramm für Forschung und Ausbildung in Tropical Diseases (TDR), Genf, Schweiz zur Verfügung gestellt.

Wir danken Dr. Tom Shinnick der US Centers for Disease Control and Prevention zur Orientierung auf die spezifischen Gene und Mutationen in der Prototypen-Test enthalten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips Akonni Biosystems Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus Qiagen #206143
Taq polymerase Qiagen #201207
RNAse-free water Qiagen #206143 
Formamide Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix Akonni Biosystems Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control Akonni Biosystems Inquire
20X SSPE Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP151-500
Disinfecting Spray  Current Technologies, Inc. #BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol Decon Labs, Inc. #8416
Microarray imager, with automated image and data analysis software Akonni Biosystems 100-20011
Thermal cycler with flat block insert Akonni Biosystems 100-10021
High-throughput wash station and slide holder ArrayIt HTW
Dissecting forceps Thermo Fisher Scientific, Inc. #10-300
Mini Vortexer VWR #3365040
Mini-centrifuge VWR #93000-196
Airbrush Compressor Kit Central Pneumatic #95630

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References

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