Isolasjon og kultur av Dental Epiteliale stamceller fra voksne musen Fortann

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Den stadig voksende mus fortann gir en modell for å studere fornyelse av tannvev fra dental epitel stamceller (DESCs). Et robust system for konsekvent og pålitelig måte å skaffe disse cellene fra fortann og utvide dem in vitro er rapportert her.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chavez, M. G., Hu, J., Seidel, K., Li, C., Jheon, A., Naveau, A., Horst, O., Klein, O. D. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. J. Vis. Exp. (87), e51266, doi:10.3791/51266 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Forstå de cellulære og molekylære mekanismer som ligger til grunn tann gjenfødelse og fornyelse har blitt et tema av stor interesse 1-4, og musen fortann gir en modell for disse prosessene. Denne bemerkelsesverdige organ vokser kontinuerlig gjennom hele dyrets levetid og genererer alle nødvendige celletyper fra aktive bassenger av voksne stamceller plassert i labial (mot leppe) og språklige (mot tungen) livmorhals sløyfe (CL) regioner. Bare de dentale stamceller fra den labiale CL gi opphav til ameloblaster som genererer emalje, den ytre tildekning av tenner, på den labiale overflate. Denne asymmetriske emalje dannelse gjør slitasje på fortann spissen, og stamfedre og stamceller i den proksimale fortann sikre at tannvev er stadig etterfylles. Evnen til å isolere og dyrke disse progenitor-eller stamceller in vitro tillater deres utvidelse og åpner dørene til en rekke eksperimenter ikke oppnåelige in vivo, som for eksempel tigh gjennomstrømming testing av potensielle stamcelle regulatoriske forhold. Her beskriver vi og demonstrere en pålitelig og konsistent metode for å dyrke celler fra labial CL av musen fortann.

Introduction

En av de unike egenskapene til virveldyr er utviklingen av tennene. Tannen har blitt en viktig modell for mange forskningsområder, som de molekylære stier og morfologiske spesialiseringer er relevante for dette organet er blitt undersøkt fra flere perspektiver, blant annet ved utviklings-og evolusjonsbiologer fem. Mer nylig har innen regenerativ medisin begynt å få verdifull innsikt ved hjelp av tannen som modell. Spesielt har oppdagelsen av tann epitelial stamceller vært et viktig fremskritt 6-13.

Alle gnagere har kontinuerlig voksende fortenner som veksten er drevet av stamceller, noe som gjør disse tennene et tilgjengelig modellsystem for å studere voksen stamcelle regulering. Merking eksperimenter i 1970 10,11, etterfulgt av genetisk avstamning tracing eksperimenter 8,9,12,14, har vist at DESCs bor i proksimale regionen av fortann. Stammencelleavkom i det epiteliale rom i labial side bevegelse ut av det putative nisje, kjent som den labiale cervical sløyfe (CL), og bidrar til en populasjon av celler som kalles transitt-amplifisering (TA)-celler (figur 1). Spesielt DESCs bor i ytre emalje epitel (OEE) og stel retikulum (SR) 8,9,14, og den indre emalje epitel (IEE) gir opphav til TA celler som fremgang gjennom et begrenset antall cellesykluser og deretter flytte distalt langs lengden av fortann (figur 1). De forskjellige ameloblaster i muse fortann fortsette å bevege seg distalt langs fortann på en bemerkelsesverdig rate på ca 350 mikrometer i en enkelt dag 15,16. Som de beveger seg, cellene differensieres til modne ameloblaster og stratum overgangsledder (SI) celler. Etter deponeringen av den fulle tykkelse av emaljen matrise, er mange av ameloblaster gjennomgår apoptose, og de gjenværende celler krympe i størrelse og regulere emalje modning <sup> 17. Avstamning av de andre celletyper i labial CL, slik som SR, er mindre klart, og data om stamceller i mesenchyme 18 og i den språklige CL er bare begynner å dukke opp.

Ved hjelp av musen fortann modell, har en rekke grupper jobbet med å belyse de genetiske trasé og cellebiologiske prosesser involvert i naturlig stamcellebaserte organ fornyelse. Imidlertid inneholder den labial CL et relativt lite antall celler, anslått til å være ca 5000 per mus fortann, som gjør arbeidet med primære celler utfordrende. Derfor har det vært gjort for å kultur og ekspandere disse cellene in vitro 6,16,19,20 for å åpne nye dører til eksperimentelle tilnærminger som ikke er oppnåelige in vivo. Den siste studien har vist at disse cellene kan både selv fornye og differensiere i amelogenin uttrykke celler når kultivert 13. Her beskriver vi og demonstrere en metode for the pålitelig og konsistent kultur av celler fra muse labial CL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Dissekere Lavere Hemi-kjever fra Adult Mouse

  1. Før du utfører denne protokollen, innhente nødvendig institusjonell godkjenning og sørg for å overholde alle retningslinjer dyr omsorg. Avlive dyret ved hjelp av standard IACUC godkjente prosedyrer. For dette arbeidet CO 2 kvelning ble anvendt fulgt av cervical dislokasjon.
    1. EKSTRA: Separat hodet fra resten av kroppen ved hjelp av et barberblad.
  2. Fjern skinnet fra underleppen til halsen.
  3. Ved hjelp av en skalpell, gjør et snitt mellom de to nederste fortennene, som er løst koblet. Ved å bruke press, vil kjeven bli delt i to halvdeler.
  4. Kile skalpell mellom knokkelen i kjeven og det timelige kjeveledd og kutt langs kjevemuskelen å løsne kjeven.
  5. Fjern alle muskler, sener, og leddbånd til bare beinrester.

2. Isoler Fortann

  1. Ved hjelp av en # 15 skalpell, Omhyggelig barbering av benet i en 45 ° vinkel fra den distale ende til den proksimale ende av den membran-regionen. Bruk tuppen av skalpell til å plukke bort eventuelle gjenværende bein inkludert beinrester på kanten. Sakte begynner å plukke bort på språklige cortical plate av kjeven, som starter rett under 3. molar.
  2. Fortsett til fortann er ren, arbeider forsiktig mot det området som inneholder CL.
  3. Fjern mindreverdig alveolar nerve bunten.
  4. Gjør et rent kutt å først fjerne bein og vev proksimale til CL.
  5. Lag en andre kutt distalt med skalpell, omtrent under 2. molar. Den proksimale fortann region blir deretter dissekert ut ved innsetting av skalpellen mellom benet og den mediale overflate av den proksimale fortann. Dette må være nøye utført, slik at det ikke rives i vevet. Snittet bevegelse er proksimale-distal.
    ALTERNATIV STEP:
    Fjern så mye bein som mulig langs området over incisor. Når området er ryddet, fjern forsiktig hele fortann ved hjelp av en størrelse 5 pinsett til å håndtere emaljen delen nærmest CL-regionen.
  6. Plasser dissekert vev (enten isolert CL som i figur 3E, eller hele fortann som i alternative trinn 2.5) i 2% kollagenase i 1X PBS i 3-4 timer ved 4 ° C i en lav tilslutning plate. For 1-10 fortenner, bruke 100 mL per brønn i en 12-brønns plate. For mer enn 10 fortenner, bruke 500 mL per brønn i en 6-brønns frafall plate.

Tre. Microdissect den Labial Livmorhals Loop

  1. Fjern CL regionen fra collagenase og legg i kaldt DMEM/F12 media.
  2. Trekk forsiktig ved den nedre ende av CL ved hjelp av enten størrelse 5 tang eller en insulinsprøyte (1 cc, 28 G ½); den mesenchyme vil falle fra hverandre mens epitelet forblir intakt. Den CL og den tilstøtende epitel som strekker seg sideveis som en "vinge-lignende" struktur vil være synlig.
  3. Fjernden apikale bud fra tilstøtende epitel ved at et V-formet innsnitt på hver side, og straks sette i kaldt DMEM/F12 på is.
  4. Gjenta for alle CLS, samle inn 1,5 ml mikro tube.
  5. Spinn ned mikrosentrifugerør med prøver, fjerne media, erstatte med 100 mL celle avløsning løsning.
  6. Inkuber vev i cellen løsgjøring løsning i 30 min ved 37 ° C.
  7. Dissosiere vev for å produsere en enkel cellesuspensjon ved forsiktig pipettering opp og ned ved hjelp av en 1000 mL med lav adhesjon pipettespissen. Celler kan også bli plassert gjennom en steril celle sil for å oppnå dissosiasjon.
  8. Tell cellene med hemocytometer, platen på vevskultur plast eller annet ønskelig materiale.

4. Primær Culture of DESCs

  1. Plate-celler i en 6-brønns plate ved 1-6 x 10 4 celler / ml i DESC medier, som består av DMEM/F12 supplert med mus EGF rekombinant protein ved en konsentrasjon på 20 ng / ml, rekombinant FGF protein med en konsentrasjon på 25 ng / ml, 1X B27 supplement, og 1% antibiotisk-løsning (penicillin, 100 U / ml streptomycin, 50 ug / ml).
  2. Dyrk celler sådd ut på en 6-brønners plate ved 37 ° C i 5% CO2 i 1 ml DESC media. Ikke forstyrr innledende kulturer for fem dager etter plating å tillate celle adhesjon og kolonidannelse.
  3. For det første mediaendring, erstatte halvparten av volumet (500 ul) av gamle mediet med det halve volum (500 ul) av nye medier. Sjekk kolonier i henhold mikroskop ved skifte media.
  4. Etter den første medieendringer, fortsetter å endre medie (1-2 ml) hver 2. dag. Sjekk kolonier i henhold mikroskop ved skifte media.

5. Passage DESCs

  1. Sug media og vaske cellene 3x med forvarmet PBS.
  2. Legg forvarmet 0,25% Trypsin-EDTA i saltoppløsning og inkuberes ved 37 ° C i 10-15 min for å DESCs frakobling.
  3. Legg DESC media å nøytralisere trypsin, forsiktig pipette sammen vevkulturplate å samle cellene, og plasser i en 15 ml konisk tube.
  4. Spinn ned celler på 800 xg for 2 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Musen hemi-kjeven består av en stadig voksende fortann og tre forankret jekslene (Figur 1a). Alle tennene består av dentin og emalje, de to mineralisert komponentene i tannkronen (figurene 1A og 1 A '). De fortann huser to stamcelle nisjer kalt labial CL og språklige CL, og emalje er dannet utelukkende på labial side (Figur 1A '). DESCs er ansvarlig for fortann emalje dannelse og er plassert i den labial CL, spesielt OEE og SR (Figur 1A'') 8,9. Den labiale CL inneholder også IEE, TA-celler, og SI (figur 1 A''). Vår teknikk er fokusert på disseksjon og isolering av DESCs av labial CL (Figur 1A''). Krt14-Actin GFP markerer alle epitel-avledet celler av hemi-kjeven (Figur 1B), og labial CL kan tydelig ses through kjeven (Figur 1B, hvit pil). Det bør bemerkes at alle celletyper kan identifiseres under høyere forstørrelse (sammenlign figurene 1A '' og b'').

Fremgangsmåten for isolering av DESCs fra den labiale CL er oppsummert i figur 2.. Kort angitt hemi-kjeven først fjernet fra dyret, er kjevebenet fjernet for å eksponere den labiale CL, og deretter den labiale CL er behandlet med collagenase til skille epitel fra omkringliggende mesenchyme. Den CL er microdissected, behandlet med celledissosieringsmedium buffer, og belagt i vevskulturplater. Separasjon av de labiale CL fra den underliggende kjevebeinet (figur 3), og tilsetning av passende volum av mediet er vesentlig for isolering og vekst av koloniene, respektivt. Små, trange epiteliale kolonier dannet ved hjelp av denne teknikken er synlige etter 7 dager (Figur 4A),og disse vokser til store kolonier i løpet av 2-3 uker (figur 4B).

Figur 1
Figur 1. Illustrasjoner av den voksne mus fortann. (A) Den voksne mus hemi-kjeven viser de mineraliserte komponenter, emalje og dentin, og de ​​to typene av tenner, jeksler og fortenner. Den proksimale fortann regionen hvor DESCs er plassert er uthevet i A '. (A') sagittal visning av proksimale fortann som viser de to stamcelle nisjer, leppe og språklige cervical loop (lacl og LiCl), ameloblaster som genererer emalje, og de odontoblaster som danner dentin. Lacl, som utelukkende genererer ameloblast stamfedre celler og til slutt danne fortann emalje er uthevet i A''. (A'') lacl viser den ytre emalje epitel (OEE), stel retikulum (SR), indre emalje epitel (IEE), transitt-forsterkende (TA) region, og stratum intermedium (SI). SR er representert i blå og mørk rosa å reflektere subpopulasjoner med ulike tettheter. (B) Visualisering av livmorhals løkke ved hjelp av et fluorescerende reporter mus, KRT14-EGFP/Actb. Bone er relativt autofluorescent, og fjerning av bein utsetter cervical loop (B ') og resten av epitel, som deretter kan lett fjernet. (B'') Alle strukturer av livmorhals sløyfe inkludert OEE, IEE, TA og SI kan lett visualisert med reporter-genet. Scale barer B ', B "= 2 mm, B" = 50 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

es/ftp_upload/51266/51266fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Oversikt over disseksjon og isolering av CL muse fortann. Skjematisk representasjon av fremgangsmåten. Den CL er plassert på den proksimale ende av kjeve fortann. Det første trinnet er å fjerne rundt kjevebeinet for å eksponere fortann med CL intakt. Deretter blir tannen organ isoleres og plasseres i 2% kollagenase til separate epitel fra mesenchyme. Etter 4 timers inkubering CL manuelt fjernet, dissosiert til enkeltceller, og dyrket på toppen av standard-vevskulturplater.

Figur 3
Fig. 3. Bone fjerning av muse kjeven for å eksponere det underliggende CL-regionen. Visuelle kontrollpunkter for benet fjerning av disseksjon prosessen er vist. (A) viser den hemi-kjeven enfter Trinn 1.5, når muskler, sener og ligament fjernes fra benet. (B) indikerer området for å begynne fjerning av ben, fra like under 3. Molforholdet, beveger seg proksimalt mot området inneholdende CL. Deretter blir alle bein proksimalt til CL fjernet (C), som nevnt i trinn 2.4. Den neste innsnitt for å fjerne resten av benet som angitt i trinn 2.5 er vist i (D). Endelig er CL fjernes fra den gjenværende ben som angitt i trinn 2.6 (E), forstørrede bilde (innfelt).

Figur 4
Figur 4 Representative resultater for vellykket koloni dannelse in vitro.. A. fasekontrastmikroskopi av DESCs, etter plating i kultur i 7 dager. Tight koloni formasjon indikerer vellykket epithelial isolasjon kon uten mesenchymale forurensning. Skala bar = 400 pm. B. Etter 10 dagers inkubering ble koloniene er større i størrelse og celler har en typisk epitelial brostein morfologi. Scale bar = 100 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epitelceller var første hell kultivert over 40 år siden 21-24, og mer nylig, har vellykket isolering av epiteliale stamceller 25-27 utvidet vår kunnskap om epithelial biologi. Vi rapporterer en protokoll for å isolere DESCs av den voksne mus fortann, et relativt lite studert populasjon av stamceller som har potensial til å gi viktig innsikt i tann biologi og emalje formasjon. Denne protokollen ble opprinnelig basert på tidligere rapporter om epitel stamcelle isolasjon fra hårsekken 28. Mens mange protokoller bruker mater lag og serum for å opprettholde epiteliale stamceller, vår metode er en mater fri, serumfritt system. Men, gjør vår vekstmedier krever bruk av en cocktail av EGF, FGF2 og B27 supplement. EGF har lenge vært brukt for å opprettholde udifferensierte celler 29. En cocktail av EGF og FGF2 sammen med B27 ble tidligere brukt til kultur hårsekken stamceller 27, og B27 er mye brukt for å opprettholde neural stamceller i kultur 30,31. Vi har også tidligere målt levedyktighet og vekst frekvenskarakteristikker av DESCs oppå vev kultur plast og på en rekke ECM underlag, og ingen forskjeller ble oppdaget i satsene for spredning 19. Celler kan opprettholdes i inntil 10 serie passasjer 19.

Vi bruker de nedre fortenner for denne fremgangsmåte på grunn av den enkle fjerning i forhold til de øvre fortenner. De viktigste trinnene i vår protokoll under isolasjon er fullstendig fjerning av CL området fra kjevebenet før du legger i collagenase og en ren microdissection av CL. Fordi den proksimale fortann er veldig delikat, er det viktig ikke å skade den under disseksjon, noe som kan resultere i tap av labial CL. Ufullstendig fjerning vil føre til restene av labialCL og en lavere yield på DESCs. I tillegg er det viktig å unngå forurensning med ikke-CL epitelceller. Således, etter at epitelet er blitt separert fra mesenchyme, en ren V-formet innsnitt bør gjøres for å fjerne den labiale CL fra nabo epitel. Endelig er det viktig å plate disse cellene ved en konsentrasjon på over 1 x 10 4 celler pr ml og la halvparten av det kondisjonerte mediet til den første mediaendring.

Den store fordelen med denne protokollen til dental forskning er at det tillater effektiv produksjon og manipulasjon av DESCs in vitro. Selv om musen fortann er etablert som en in vivo modell 7-9,12,32-34, utvikling av en in vitro system fremmer dental forskningsfelt ved å åpne dørene til eksperimenter som er vanskelige å utføre in vivo. Fordeler med dette systemet inkluderer muligheten til å lett manipulere celler i ulike oppdrettsbetingelser, enkel målretting av ett eller enda flere signalveier, og hemming eller aktivering av TArgeted molekyler ved hjelp av siRNA eller vekstfaktorer. Nedstrøms anvendelser av denne in vitro-system omfatter bruk av de ovenfor angitte teknikker, så vel som andre skjæreende teknikker for å utføre funksjonelle og / eller mekanistiske undersøkelser, spesielt ved enkeltcellenivå.

Overall, informasjon hentet fra DESC in vitro kultur kan bidra til å løse de vanskelighetene med stamcellebaserte fornyelse tann.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Xiu-Ping Wang for innledende hjelp med DESC kulturer. Forfatterne er finansiert delvis av stipend og tilskudd fra National Institutes of Health (K99-DE022059 til AHJ, K12-GM081266 til MGC, K08-DE022377-02 til OH, og R01-DE021420 til ODK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps, size 5 Fine Science Tools 11251-30 FST by Dumont, Dumoxel
Forceps straight, fine, 3.5 Roboz RS5070
Razorblades Electron Microscopy Services #71960
Scalpel Handle No. 3 VWR
Feather Blade No. 15 Electron Microscopy Services #72044-15 Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered Worthington Biochemical Corporation #4214
Insulin syringe BD #329424
Accumax EMD Millipore #SCR006
DMEM/F12 Gibco 11320-033
EGF R&D 2028-EG-200
FGF2 R&D 233-FB-025
B27 Supplement Gibco 10889-038

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharpe, P. T., Young, C. S. Test-tube teeth. Sci Am. 293, 34-41 (2005).
  2. D'Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
  3. Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
  4. Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
  5. Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
  6. Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
  7. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
  8. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
  10. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
  11. Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
  12. Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
  13. Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
  14. Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
  15. Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
  16. Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
  17. Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
  18. Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
  19. Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
  20. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  21. Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
  22. Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
  23. Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
  24. Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
  25. Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
  26. Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
  27. Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
  28. Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
  29. Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
  30. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  31. Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
  32. Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
  33. Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
  34. Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics