연속 흐름 Microspotter을 사용하여 수정 된 표면에 세포의 침수 인쇄

Bioengineering

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Davidoff, S. N., Miles, A. R., Romanov, V., Gale, B. K., Eckman, J. W., Brooks, B. D. The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter. J. Vis. Exp. (86), e51273, doi:10.3791/51273 (2014).

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Abstract

Introduction

제약 산업의 최근 발전은 약물 검사 및 cytotoxicological 분석 1,2,3의 약물 발견 과정에서 세포 마이크로 어레이를 사용하여 증가 된 관심을 이끌고있다. 세포의 마이크로 어레이를 사용하여 시험 관내 높은 처리량 분석 및 스크리닝 방법의 개발이 신속하고 비용 효과적인 약물 후보의 개발뿐만 아니라, 미리 셀 1,4의 기본적인 이해를 용이하게한다. 세포 검사에 대한 전통적인 접근 방식은 기존의 잘 플레이트 플랫폼을 사용한다; 그러나이 접근법으로 인해 높은 비용, 제한된 처리량 및 세포 기능에 대한 정량적 정보 1,5 제한적 기능으로 제한된다. 때문에 이러한 제한, 세포 마이크로 어레이 기술의 연구는 분자 생물학적 특성, 조직 공학, 약물 검사의 1,6에 급성장하고 있습니다. 셀룰러 마이크로 어레이의 장점은 더 작은 샘플 사용, 최소한의 영향을 포함세포의 표현형의 이질성 정보를 마스킹, 그리고 더 높은 처리량 응용 프로그램 -1,7,8,8에 대한 분석을 자동화하는 가장 중요한 기능입니다.

제약 산업은 현재 마이크로 웰 플레이트 9 약물 검사에 대한 2 차원 세포 단층 배양과 높은 처리량 세포 기반 스크리닝 분석을 이용한다. 마이크로 플레이트의 우물에서 다중 세포는 독특한 실험 옵션을 더 높은 처리량에 대한 가능성을 제공합니다. 또한, 세포 마이크로 어레이에 대한 현재의 기술은 세포가 극적으로 생체 내에서 10, 11에서 세포의 표현형을 변경할 수있는 건조 할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, MFCA는 설계하고도 1에 도시된다. MFCA 차원 유체의 디자인이 욕에 하강과 시일을 형성하는 표면에 대해 압축하는도 1의 프린트 헤드 칩을 가능하게한다. 프린트 헤드의 부드러운 실리콘 팁처럼 동작가스켓 가역 씰을 형성한다. MFCA 기술은 고유 세포 배양 및 조직 슬라이스 시스템 모두에 필요한 잠긴 표면과의 인터페이스에 적합하고, 대부분의 다른 접근 방식을 가진 어렵거나 불가능하다. 핀 또는 잉크젯 인쇄가 작동하지 않습니다, 그리고 2 차원 마이크로 유체 장치는 증착 또는 개별 관광 명소의 큰 배열과 인터페이스에 적합하지 않습니다. 또한, 실험 소형화 및 지역화로 - 세포 마이크로 어레이 - MFCA는 높은 처리량 세포 기반 스크리닝 분석과 관련된 주요 문제를 극복한다.

CFM은 표면 (12, 13)에 미세한 반점 위치에 사이클 작은 양의 유체 샘플에 3D 채널 네트워크를 사용합니다. 흐름과 함께 인쇄함으로써, 생체 분자, 세포 및 다른 시약은 현재 셀의 인쇄 기술을 방해하는 공기에의 노출없이 민감한 생체 분자와 세포의 인쇄를 가능하게 프린팅 프로세스에 걸쳐 액체 환경에서 유지된다. 이 어레이 표면에 캡처 메커니즘이 이러한 하이 브리 도마 또는 제공 상청액 같은 조질 물질로부터 직접 인쇄하는 것도 가능하다. 이 원고의 목적은 표면에 상세히 두 세포 유형의 잠긴 인쇄를 설명하는 것이다.

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Protocol

1. 문화 제조 예 셀로

  1. 사용 준비가 될 때까지 액체 질소에 NIH/3T3 세포 주식을 저장합니다.
  2. 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신을 10 % 소 태아 혈청, 10 mM의 HEPES 완충액, 50 단위 / ㎖ 페니실린 및 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 사용 NIH/3T3 세포에 대한 완전한 미디어를 준비한다.
  3. 37 ℃에서 진탕 수조에서 2 ~ 3 분 동안 세포를 해동
  4. 3 분 1,500 XG에 완전한 미디어와 원심 분리기 5 ㎖의 세포를 Resuspend.
  5. 세포 펠렛을 방해하지 않고 세포의 상층 액을 제거합니다.
  6. 미디어 5ml에 세포를 재현 탁하고 혈구 세포를 사용하여 계산.
    1. 0.5 ML의 microcentrifuge 관에 세포 현탁액과 장소의 10 μl를 제거합니다.
    2. 세포 현탁액에 트리 판 블루의 10 μl를 추가하고 피펫의 끝으로 저어.
    3. 피펫 혈구 실에 염색 된 세포의 10 μL.
    4. 배에서 혈구 세포를 계산확대.
      1. 9 큰 사각형의 4의 살아있는 세포 (작은 흰색 공)을 계산합니다. 만 트리 판 블루 염색에서 진한 파란색을 표시하지 않는 살아있는 세포를 계산합니다.
      2. 세포 본래 세포 현탁액 × 104 세포 / ml의 수의 결과, 대형 사각형 당 세포의 평균 수를 계산한다.
      3. 1 배 각각 T25 플라스크에 5 ㎖의 총 5 개의 세포 / ml의 밀도로 시드 세포.
    5. 시작 실험 전에 70 %와 80 %의 포화 상태 사이에 문화의 세포. 필요에 따라 2-3 일마다 미디어를 새로 고치거나.

2. 인쇄 표면 처리

  1. 마크 조직 문화 처리 된 폴리스티렌 (TCTPS) 12 웰 플레이트의 하단에 마커로 사각형 프린트 헤드 (x 19mm 7mm)의 크기.
  2. 피펫 (50) 사각형 영역에 소 태아 혈청의 μL 및 팁 전체 영역에 그것을 확산.
  3. 페트리 접시를 남겨살균 바이오 안전성 후드 O / N의 혈청 자리가 완전히 건조 할 수 있도록합니다. 이 접시는 사용하기 더 이상 2 일 이상 전에 준비를해야합니다.

3. 머지 인쇄

  1. 증류수로 프린트 헤드를 씻어.
    1. 증류수로 60mm 페트리 접시를 채우고 표면에 프린트 헤드를 고정.
    2. 공기 펌프를 사용하여 150 μL / 분에서 2 분 동안 각 라인을 통해 증류수 흐름.
    3. 페트리 접시에서 물을 버리고 깨끗한 물을 채운다.
    4. 물에서 아래로 3 회를 프린트 헤드를 이동합니다.
  2. 사전 준비를 12 웰 플레이트에서 혈청 코팅 자리에 프린트 헤드 중심을 도킹합니다.
  3. 프라임 사전 예열 완료 미디어, 채널 당 300 μL와 프린트 헤드.
  4. 인쇄 표면에 50,000 세포 / ml의 농도와 60 μL / 분, 채널 당 100 μL에서 세포를 중단.
  5. 에 도킹 왼쪽 프린트 헤드를 올려 놓고표면 및 세포 배양 인큐베이터에서 매니 폴드는 2 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C로 설정합니다.
  6. 2 시간 배양 한 후, 프린트 헤드를 제거하고 배양 접시에 뚜껑을 놓습니다. 프린트 헤드를 제거하는 시간은 0 시간 시점으로 간주됩니다.

4. 표준 세포 배양

  1. 2 단계에서 제조 된 혈청 발견 TCTPS 12 - 웰 플레이트 중 하나에 미리 예열 미디어 1 ML을 추가합니다.
  2. 12 잘 TCTPS 판의 하나의 우물에 2 단계 피펫에 남아있는 세포 현탁액 1 ㎖를 가져 가라. 이 접시에 50,000 세포를 포함하는 문화를 생성합니다.
  3. 2 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 세포 배양 접시를 놓습니다.
  4. 2 시간 배양 타이밍을 시작하면; 인쇄 및 시드 샘플 사이의 일관성을 위해이는 0 시간 시점으로 간주됩니다.

5. 문화의 시각화

  1. 0, 2, 24, 두 가지 방법에서 각각 48 시간 걸릴 세포 D 후표준 거꾸로 현미경을 사용하여 위 및 이미지 escribed.
    1. 요오드화 프로피 듐 만 사균의 핵으로 혼입되어 적색 형광 염색을 이용하여 세포를 염색.
      1. 부드럽게 칼슘과 이물질을 제거하기 위해 마그네슘 (PBS + +)와 인산염 완충 생리 식염수 1 ㎖로 세포를 3 회 헹군다.
      2. 각 배양 용기에 미리 예열 PBS + +의 1 ML을 추가합니다.
      3. 각 배양 용기에 프로피 디움 요오드 원액 (1 ㎎ / ㎖) 1 μl를 추가합니다.
      4. 10 분 동안 37 ° C에서의 propidium 요오드화 염색 세포를 품어.
    2. 이미지 반전에서 10X 및 40X 현미경 배율을 이용하여 세포.
  2. 적절한 생물 학적 용기에 세포를 폐기하십시오.

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Representative Results

섬유 아세포 세포주 NIH/3T3 세포 잠긴 표면에 인쇄하거나 시딩 하였다. 세포는 밀리리터 당 5 X 104 세포의 밀도로 성장시켰다. 세포는 기존의 세포 배양 기술을 이용하여 접종 하였다. 세포를 대형, 채널 단백질 및 기타 생체 분자에 사용 CFM보다 (~ 500 μm의) 큰 열두 플로우 셀 프린트 헤드를 사용하여 인쇄 하였다. 세포를 혈청 코팅 표면 상에 인쇄되거나 시딩 하였다. 인쇄 공정은도 1에 도시된다.

인쇄 및 시딩 후, 균체 중요한 시점 (0, 2, 24, 48 시간)에서 밀도 및 형태를 평가하기 위해 시각화 하였다. 이러한 시점에서 세포 밀도와 세포의 형태가 10X 및 40X 현미경의 배율을 사용하여 평가 하였다. 이미지는 세포가 각각의 시점에서 각 배율 그림 2에서와 거의 동일 표현형을 가지고 있음을 보여줍니다.이 그림의 효과를 바탕으로인쇄를 최소화하기로 결정했습니다.

세포 생존율은 PI의 얼룩을 사용하여 평가 하였다. 도 3에 도시 된 바와 같이, 인쇄 된 셀에 대한 세포 생존율은 각 시점에 대한 시딩 된 세포보다 현저하게 다르지 않았다. 표면에 세포를 부착하는 두 가지 방법의 주요 차이점은 인쇄 된 세포의 밀도이다. 세포 밀도는 시드 및 인쇄 세포 모두에서 50 % 이상 2 시간 시점에서 감소한다. 또한 연구 결과는이 감소의 원인을 확인하기 위해 보증합니다; 그러나, 전체적인 인쇄 밀도 비는 시드에 비해 상당히 높은 남아있다. flowcell있는 인쇄 셀 밀도를 고려하여 세포를 시딩와 동일한 밀도로 프린트 된 시딩 된 세포와 같은 각각의 시간 시점에서 약 10 배의 고밀도 이었지만, 작은 영역 (플로우 셀 0.6 cm 2 지역, 7.6 cm 2 24 웰 플레이트의 우물에 대한). 최종 시점에서 세포 w 동일한 밀도로 아르HICH 인해 세포 운동성 및 자원 소비 제한 가능성이있다.

그림 1
CFM의 그림 1. (A) 그림. (B) 흐름 셀의 개략도. (C) 개별 flowcells를 표시하는 헤드의 SEM 이미지. (D) 조직 문화 호환 표면에 프린트 헤드 부두가. 침수 인쇄의 개략도 를 클릭하세요 여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 2
인쇄 세포 대 시드의 형태를 비교 그림 2. 이미지. (A) 3T3 세포에서microfluidically BSA에 인쇄 및 0, 2, 24, 및 48 시간에 평가 하였다. (B)에서 3T3 세포는 씨앗을 품고 대신에 인쇄되었다. 세포 형태가 동일하지 않은 경우와 유사하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
0, 2, 24, 48 시간 등, 다양한 시점에서 세포 인자 및 세포 시딩 간의 세포 밀도 및 생존도 3. 비교. (A)에서 mm 2 당 세포의 세포 밀도를 평가 하였다. (B) 세포의 생존이 결정되었다에서. 이 figu의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오재.

그림 4
그림 4. NIH/3T3 세포를 통해 유입 된의 셀 마이크로 어레이 연속 흐름 microspotter의 네 가지 흐름 세포의 10 배 배율의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 설명 된 3D 미세 인쇄 기술은 잘 채워진 액체로 세포 microfluidically 프린팅 배열 고유 능력 잠긴 표면 즉. 잠긴 표면에 인쇄에 의해, 세포 마이크로 어레이에서는 세포의 생리 학적으로 관련된 세포 표현형뿐만 아니라 단일 웰도 4의 하단에 세포를 다중화 할 수있는 능력을 유지하는 것을 제조 할 수있다. microfluidically 세포 결과를 인쇄하는 본 연구 쇼의 결과 유사한 세포 형태 및 생존 능력을 가진 세포 부착; 그러나 인쇄 된 세포가 더 조밀하게 짧은 전체 연구 시간의 결과로 정의 된 위치에 부착 할 수 있습니다. 짧은 학습 시간은 14 선별 처리량이 약에 대한 비용을 크게 절감 될 수 있습니다.

마이크로 유체 이전 셀룰러 마이크로 어레이 및 높은 처리량 약물 스크리닝을 위해 사용되었다. 연구 수십 흐름 분석을 기반으로하는 방법을 자세히 설명했다정적 흐름 문제를 제거; 19 - 불행하게도, 이러한 연구는 밀도, 다중화, 그리고 고도의 병렬 분석 15 현미경 통합을 제한 차원 미세 유체를 (2D 및 3D 조직 문화와 혼동하지 말 것), 사용합니다. 디지털 마이크로 유체와 액적 기반의 미세 유체는 이러한 유형의 애플리케이션에 대해 제안되어있다 및 높은 병렬 다중화 15,17,18 구성에서 동작 할 수 있지만, 이들은 단일 또는 소세포 개에 한정 모두 잃게되는 3-D 멀티 샘플 준비 동안 셀 타입 조직 구조. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 빠른 세포 검사에 활용되고 있습니다; 그러나, 세포 계측법, 생체 내에서 세포 외 기질 (20)에 닿는하는 자기편 세포 라인을 심사에 적합하지 않은, 서스펜션에 남아있는 세포를 필요로 흐른다. 공동 문화도 마찬가지 조직의 표현 (19)의 부족으로 고통 받고 있습니다. 반면, 3D MFCA 기술은 완전히 자동화 드있게생체 분자와 조밀하게 배열의 세포 반점이나 손상 조직 조각에 시약의 배송 위치. 제안 된 시스템은 배열을 생성 할 수있을 것뿐만 아니라, 이러한 배열에 대한 전단 응력, 다른 화합물의 전달 및 성장 조건의 연구를 허용하고 더 예측 생체 외 약물로 이어질 것 "흐르는"환경에서 그렇게 할 것 도구를 선별. 응용 프로그램의 다양한 혁신이 무한정 계속 할 수 있도록 구상 할 수있다. 이러한 도구는 암, 당뇨병, 염증, 감염, 심장 혈관 질환과 같은 중요한 연구 분야의 다수의 새로운 휴대 약물 발견 및 cytotoxicological 분석을 가능하게합니다.

MFCA는 물속에 잠긴 표면에 세포를 전달하기 위해 사용되는 방법이지만, 문제는 특히 비 부착 세포 라인을 위해, 표면에 세포를 부착 남아 있습니다. 이 기술에 대한 미래의 방향에 대한 세포 부착하는 방법에 초점을 맞출 것이다면. 인공 표면에 세포 패터닝 기술은 현재 존재하고 있습니다 : 잉크젯 인쇄, microextrusion 또는 필라멘트 음모를 꾸미고, DNA 하이브리드, 레이저 앞으로 이동 21. 이러한 기술, DNA 혼성화 기술을 사용하여 세포의 부착은 여러 가지 독특하고 중요한 기능을 가지고있다. 먼저, 세포 부착의 방법은 양쪽 모두의 접착 및 비 접착 성 세포는이 방법 (22)을 이용하여 패터닝 될 수있는 개별 세포가 가지는 수용체에 의존하지 않는다. 다음에, DNA 셀룰러 패터닝 방법은 여러 표면 - 결합 DNA 서열 (23)의 사용을 통해 여러 종류의 세포를 포함하는 복잡한 세포 배열의 생성을 허용한다. 미래의 응용 프로그램이나 방향은 세포 부착 19,24위한 DNA 하이브리드 기술을 사용하는 방법에 초점을 맞출 것이다

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Disclosures

저자는 시약 및 / 또는이 원고에 사용되는 악기를 생산하고 사치 미세 유체의 직원 및 주주입니다.

Acknowledgments

저자는 기술 지원을 크리스 모로을 인정하고 싶습니다. 자금 조달은 NIH SBIR (R43)에 의해 제공되었다 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803을 부여합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous flow microspotter Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 cells ATCC CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium Invitrogen 11965-092 Base media for cells
HEPES buffer Invitrogen 15630-080 Cell media additive (control pH)
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070 Cell media additive
Penicillin-streptomycin  Invitrogen Cell media additive
Trypan blue Invitrogen 15250-061 Stain cell sfor counting
Hemocytometer Fisher 267110 Cell chamber to count cells
Nikon Eclipse TS100 Nikon Used to check on cells
Nikon Eclipse TE2000-U Nikon Used for collecting images
Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) Invitrogen 14040-133 Rinsing cells before passaging and before staining with PI
TrypLE Express  Invitrogen A12177-01 Used to remove cells from surface

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References

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