Подводная Печать клеток на модифицированной поверхности с помощью непрерывного потока Microspotter

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Davidoff, S. N., Miles, A. R., Romanov, V., Gale, B. K., Eckman, J. W., Brooks, B. D. The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter. J. Vis. Exp. (86), e51273, doi:10.3791/51273 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Последние достижения в области фармацевтической промышленности, привели к увеличению интереса к помощи через сотовую микрочипов в процессе обнаружения наркотиков для скрининга лекарственных средств и cytotoxicological анализа 1,2,3. Развитие в пробирке высокой пропускной анализов и методов скрининга с использованием клеточных микрочипов будет способствовать быстрому и экономически эффективное развитие лекарств-кандидатов, а также продвижение фундаментальное понимание клетки 1,4. Традиционный подход к скрининга с клетками использует обычные платформы хорошо пластины; Однако этот подход ограничен из-за высокой стоимости, ограниченной пропускной способности, и ограниченной способности для количественной информации о функции клеток 1,5. Из-за этих ограничений, исследования в сотовой микрочипов является растущей для молекулярно-биологической характеристике, тканевой инженерии, и наркотики 1,6. Преимущества сотовых микрочипов включают меньшее использование выборки, минимальные эффектысотовой фенотип неоднородности маскировки информации, а главное возможность автоматизировать анализы для более высокой пропускной приложений 1,7,8.

Фармацевтическая промышленность в настоящее время использует высокой пропускной клеток на основе скрининговых исследований с 2D клеточный монослой культур для скрининга лекарственных средств в луночных микротитровальных 9. Мультиплексирования клетки в лунках микротитровальных планшетах предлагает потенциал для более высокой пропускной способности с уникальными вариантов экспериментирования. Кроме того, существующие технологии для сотовых микрочипов позволяют клеткам, чтобы высушить который может резко изменить фенотип клеток в естественных условиях от 10,11. Для того чтобы преодолеть эти проблемы, был разработан MFCA и показан на рисунке 1. Конструкция MFCA 3D струйной позволяет наконечник печатающей головки на рисунке 1, чтобы быть снижены в ванну и сжатый к поверхности, чтобы сформировать уплотнение. Мягкий силиконовый наконечник печатающей головки ведет себя какпрокладка и образует обратимые уплотнение. Технология MFCA однозначно подходит для взаимодействия с подводных поверхностей, где требуется как для клеточных культур и тканей срезов систем, и трудно или невозможно с большинством других подходов. Штыри или струйная печать не будет работать, и 2D микрожидкостных устройств не подходят для осаждения или взаимодействия с большими массивами дискретных пятен. Кроме того, по миниатюризации и локализации эксперимент - сотовый микрочипов - MFCA преодолевает основные проблемы, связанные с высокой пропускной основе клеток скрининга.

CFM использует 3D каналов сети для цикла образцов малого объема жидкости более микроскопических местах пятно на поверхности 12,13. Печатая с потоком, биомолекулы, клетки, и другие реагенты ведутся в жидкой среде на протяжении всего процесса печати, что позволяет печатать чувствительных биомолекул и клеток без воздействия воздуха, что препятствует текущие методов печати клеток. Кроме того, можно печатать непосредственно из сырого материала, такого как гибридомы или супернатантов при наличии механизм захвата на поверхности массива. Цель этой рукописи подробно объяснить погруженную печать двух типов клеток на поверхности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Клеточные культуры Подготовительного

  1. Храните запасы NIH/3T3 клеток в жидком азоте до готовности к использованию.
  2. Подготовка полной среде для клеток с использованием NIH/3T3 Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мМ HEPES буфера, 50 единиц / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина.
  3. Оттепель клетки в течение 2-3 мин в встряхивании на водяной бане при 37 ° С
  4. Ресуспендируют клеток в 5 мл полной среды и центрифуге при 1500 мкг в течение 3 мин.
  5. Удалить супернатант клеток, не нарушая клеточный осадок.
  6. Ресуспендируют клеток в 5 мл СМИ и подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
    1. Удалить 10 мкл суспензии клеток и поместить в 0,5 мл трубки микроцентрифужных.
    2. Добавить 10 мкл трипанового синего к клеточной суспензии и перемешивают с кончиком пипетки.
    3. Пипетка 10 мкл окрашенных клеток в камере гемоцитометра.
    4. Граф клеток в гемоцитометре в 10 разувеличение.
      1. Подсчитайте живые клетки (маленькие, белые шарики) для 4 из 9 больших площадей. Только подсчет живые клетки, которые не появляются темно-синий с трипановым синим пятном.
      2. Вычислить среднее число клеток на большой площади, в результате чего количества клеток × 10 4 клеток / мл в исходной суспензии клеток.
      3. Семенной клетки при плотности 1 x10 5 клеток / мл в общей сложности 5 мл в каждом T25 колбу.
    5. Культуры клеток в диапазоне от 70% и 80% слияния Перед началом экспериментов. Обновить СМИ каждые 2-3 дня или по мере необходимости.

2. Печать Подготовка поверхности

  1. Марк прямоугольник с маркером на дне ткани-культуры обработанных полистирола (TCTPS) 12 хорошо пластины размером печатающей головки (7 мм х 19 мм).
  2. 50 мкл фетальной бычьей сыворотки в прямоугольной области и распространить его по всей области с наконечником.
  3. Оставьте чашку Петрив стерильной биобезопасности капот O / N, чтобы место сыворотки до полного высыхания. Эти пластины должны быть готовы не более 2 дней перед использованием.

3. Подводная Печать

  1. Промыть печатающую головку с дистиллированной водой.
    1. Заполните 60 мм чашки Петри с дистиллированной водой и док печатающую головку на поверхность.
    2. Поток дистиллированную воду через каждой из линий течение 2 мин при 150 мкл / мин с использованием пневматического насоса.
    3. Откажитесь от воды из чашки Петри и заполните его чистой водой.
    4. Перемещение печатающую головку вверх и вниз в воду 3 раза.
  2. Доку печатающей головки центр над тем местом, сыворотки покрытием в предварительно подготовленный 12-луночный планшет.
  3. Премьер печатающей головки с предварительно подогретые полной среды, 300 мкл на канал.
  4. Печать приостановлена ​​клетки в концентрации 50000 клеток / мл на поверхность и 60 мкл / мин, 100 мкл на канале.
  5. Поместите печатающую головку, влево пристыкован противповерхность, а коллектор в инкубаторе для клеточных культур установлен в 5% CO 2 и 37 ° С в течение 2 часов.
  6. После 2 ч инкубации удалить печатающую головку и поместите крышку на блюдо культуры. Время, в которое печатающая головка удалена считается момент времени 0 грн.

4. Стандартный Культура клеток

  1. Добавить 1 мл предварительно нагретого массовой информации к одному из TCTPS 12-луночный планшет в сыворотке пятнами, полученного на стадии 2.
  2. Принимать по 1 мл оставшейся клеточной суспензии со стадии 2 и пипетки в одну лунку 12-луночного TCTPS пластины. Это даст культуру, содержащую 50000 клеток в блюдо.
  3. Поместите культуральный планшет в инкубаторе при 37 ° С в течение 2 часов.
  4. После того, как 2 часа инкубации начала отсчета времени; для согласованности между печатной и высева образцов, это считается момент времени 0 грн.

5. Культура Визуализация

  1. После 0, 2, 24 и 48 ч взять клетки от каждого из двух методов гвневписанной выше и изображений с использованием стандартного инвертированного микроскопа.
    1. Пятно клетки с помощью пропидий йодида, красный флуоресцентный пятно, что только включены в ядре мертвых клеток.
      1. Осторожно промыть клетки 3 раза 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора с кальцием и магнием (PBS + +) для удаления мусора.
      2. Добавьте 1 мл подогретого PBS + + для каждого сосуда для культивирования.
      3. Добавить 1 мкл пропидий йодид исходного раствора (1 мг / мл) в каждую культуральную судна.
      4. Инкубируйте клетки окрашивали иодидом пропидия при 37 ° С в течение 10 мин.
    2. Изображение клетки с помощью инвертированного микроскопа в 10 раз и 40-кратном увеличении.
  2. Откажитесь от клетки в соответствующем контейнер для биологически опасных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В фибробластов линии NIH/3T3 клетки были напечатаны или высевали на затопленной поверхности. Клетки выращивали до плотности 5 × 10 4 клеток на мл. Клетки высевали с использованием традиционных методов культивирования клеток. Клетки были напечатаны с использованием большого формата, печатающая головка двенадцать потока клеток, где каналы крупнее (~ 500 мкм), чем CFM, используемого для белков и других биомолекул. Клетки были напечатаны или высевают на сыворотке покрытием поверхности. Процесс печати показано на рисунке 1.

После печати и посева, клетки были визуализированы оценить плотность и морфологию на соответствующих временных точках (0, 2, 24 и 48 часов). Плотность клеток и морфология клеток в этих временных точек оценивали с помощью 10х и 40х увеличениях под микроскопом. Изображения показывают, что клетки обладают практически идентичные фенотипы в каждый момент времени и при каждом увеличении рисунке 2. Исходя из этих цифр, эффектпечать был полон решимости быть минимальным.

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью PI пятно. Как показано на фиг.3, жизнеспособность клеток на печатной клетки достоверно не отличались от посеянных клеток для каждой временной точке. Основное различие между этими двумя способами присоединения клеток к поверхности плотность клеток печатных. Плотность клеток уменьшается на 2 времени час точки более чем на 50% в обоих сеяных и печатных клеток. Дальнейшее изучение является оправданным, чтобы определить причину этого снижения; Однако, в целом печатные отношения плотности по сравнению с высевают остается значительно выше. Печатная плотность клеток в проточную ячейку был примерно в десять раз плотнее в каждый момент времени, что и сеяных клеток рассматривают клетки печатных при той же плотности, посева, но в меньшей площади (0,6 см 2 площади для ячейки потока, 3,8 см 2 на лунку 24-луночного планшета). В конечной точке времени клетки при той же плотности шHICH, вероятно, из-за ограничений на потребление подвижности клеток и ресурсов.

Рисунок 1
Рисунок 1. (А) Изображение CFM. (В) Схема ячейки потока. (С) СЭМ изображения печатающей головки, показывая отдельные проточные ячейки. (D) Схема погружного печати, где печатающая головка доки в культуре ткани совместимой поверхности. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное рисунке.

Рисунок 2
Рисунок 2. Изображения, сравнивающие морфологию высевают по сравнению с печатными клеток. В (а) 3T3,были microfluidically печатается на БСА и оценены на 0, 2, 24, и 48 час. В (В) 3T3 клетки высевали вместо напечатаны. Морфология клеток похож если не идентичны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Сравнение плотности клеток и жизнеспособность между печати клеток и посева на различных временных точках, включая 0, 2, 24 и 48 часов. В (а) оценивали плотность клеток в клеток на мм 2. В (Б) Жизнеспособность клеток определяли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой FIGUчисло рейнольдса

Рисунок 4
Рисунок 4. 10-кратное увеличение изображения четырех клеток потока сотового микрочипов непрерывного microspotter потока, в котором NIH/3T3 клетки поступали через. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3D микрофлюидных технология печати, описанный здесь, однозначно способны microfluidically печати массивов клеток в жидкости заполнены хорошо, то есть погруженный поверхность. К печати на подводных поверхностей, сотовые микрочипы могут быть получены, что поддержание физиологически соответствующую клеточную фенотип клеток, а также возможность мультиплексирования клетки в нижней части одной скважины рисунке 4. Результаты данного исследования показывают, что microfluidically печать клеток приводит к Прикрепление клеток с сопоставимой морфологии клеток и жизнеспособности; Однако, печатные клетки могут быть более плотно присоединены в определенном месте, в результате чего более коротких общего времени исследования. Более короткое время исследования может привести к значительной экономии средств для высокой пропускной препарата скрининг 14.

Microfluidics ранее использовалось для сотовых микрочипов и высокопроизводительного скрининга наркотиков. Десятки исследований подробно рассказали, как поток на основе анализовустранить проблемы статические потока; к сожалению, эти исследования используют 2D микрофлюидики (не путать с 2D и 3D тканевых культур), что ограничивает плотность, мультиплексирования и интеграции микроскопа для высоко параллельных анализов 15 - 19. Цифровые микрофлюидики и капель на основе микрофлюидики были предложены для этих типов приложений и может работать в высоко-параллельно, мультиплексированных конфигураций 15,17,18, но они ограничены в один или небольших групп клеток и потерять все 3-D, мульти- Структура ткани типа клеток во время подготовки образца. Цитометрии потока Высокая пропускная была использована для быстрого скрининга клеток; Однако, проточной цитометрии требуется клеткам оставаться во взвешенном состоянии, который не идеален для скрининга прилипшие клеточных линий, которые, в естественных условиях, которые привязаны к внеклеточной матрицы 20. Со-культуры также страдают от недостатка истинного представления ткани 19. В противоположность этому, технология 3D MFCA позволяет полностью автоматизирПоложение биомолекул и доставки реагента к клеточных пятен или неповрежденных срезы тканей в плотно упакованной массива. Предлагаемая система будет не только способны генерировать массивы, но будет делать это в "течет" среде, что позволяет для исследования напряжений сдвига, поставка различных соединений и условий выращивания на этих массивов и приведет к более интеллектуального препарата в пробирке скрининг инструменты. Разнообразие приложений можно представить позволяя инновации продолжать до бесконечности. Такой инструмент позволяет роман открытие сотовой наркотиков и cytotoxicological анализов в многочисленных критических областях исследований, таких как рак, диабет, воспаление, инфекции и сердечно-сосудистых заболеваний.

В то время как MFCA является предпочтительным методом для доставки клеток к погруженной поверхности, задача остается приложить ячейку на поверхность, особенно для неадгезивных клеточных линий. Будущие направления этой технологии будут сосредоточены на способах прикрепления клеток дляповерхность. Методы клеточной паттерна на искусственных поверхностях в настоящее время существуют и включают в себя: струйной печати, microextrusion или нити черчения, гибридизации ДНК и лазерный вперед передачу 21. Из этих методов, прикрепление клеток с использованием гибридизации ДНК технологии обладает рядом уникальных и важных особенностей. Во-первых, способ прикрепления клеток не зависит от рецепторов обладают отдельных клеток, так как адгезивные и неадгезивные клетки способны быть с рисунком с помощью этого метода 22. Далее, ДНК методом клеточного паттерна позволяет генерировать сложных клеточных массивов, содержащих множество типов клеток за счет использования нескольких поверхностно-св занный последовательностей ДНК 23. Будущие приложения или направления будут сосредоточены на использовании ДНК-гибридизации технологии для прикрепления клеток 19,24

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы сотрудник и акционеры Уошэтч Microfluidics, который производит реагенты и / или инструменты, используемые в этой рукописи.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить признательность Крис Морроу для оказания технической помощи. Финансирование было предоставлено NIH SBIR (R43) предоставить 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous flow microspotter Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 cells ATCC CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium Invitrogen 11965-092 Base media for cells
HEPES buffer Invitrogen 15630-080 Cell media additive (control pH)
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070 Cell media additive
Penicillin-streptomycin  Invitrogen Cell media additive
Trypan blue Invitrogen 15250-061 Stain cell sfor counting
Hemocytometer Fisher 267110 Cell chamber to count cells
Nikon Eclipse TS100 Nikon Used to check on cells
Nikon Eclipse TE2000-U Nikon Used for collecting images
Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) Invitrogen 14040-133 Rinsing cells before passaging and before staining with PI
TrypLE Express  Invitrogen A12177-01 Used to remove cells from surface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
  2. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
  3. Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
  4. Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
  5. Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
  6. Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
  7. Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
  8. Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
  9. Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. (2013).
  10. Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
  11. Liu, R., Lee, A. P. Integrated Biochips for DNA Analysis. Springer. (2008).
  12. Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
  13. Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
  14. Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Summer 2011. Drug Discovery World Online at: http://www.ddw-online.com/p-149288 (2011).
  15. Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
  16. Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).
  17. Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
  18. Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
  19. Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
  20. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
  21. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
  22. Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
  23. Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics