细胞的浸入式印刷到改性表面采用连续流动Microspotter

Bioengineering

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Davidoff, S. N., Miles, A. R., Romanov, V., Gale, B. K., Eckman, J. W., Brooks, B. D. The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter. J. Vis. Exp. (86), e51273, doi:10.3791/51273 (2014).

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Abstract

Introduction

在医药工业中的最新进展已导致使用移动芯片在药物发现过程用于药物筛选和cytotoxicological分析1,2,3兴趣增加。利用细胞微阵列体外高通量检测和筛选方法的发展将有利于候选药物的快速和具有成本效益的发展,以及提前1,4单元的基本认识。传统的方法来筛查细胞采用常规孔板平台;然而,这种方法由于成本高,产量有限,以及对细胞功能1,5定量信息有限,能力有限。由于这些限制,研究在细胞微阵列技术是新兴的分子生物学特性,组织工程和药物筛选1,6。细胞微阵列的优点包括更小的样品使用,影响最小细胞表型异质性掩蔽的信息,最重要的自动化测定法更高通量应用1,7,8的能力。

制药行业目前采用高通量细胞系筛选测定与2D细胞单层培养物在微量滴定孔板9的药物筛选。复细胞在微量滴定板的孔中提供了独特的实验方案更高的吞吐量的潜力。另外,在目前的技 ​​术用于蜂窝芯片使细胞干这可能显着地从改变细胞的表型在体内 10,11。为了克服这些问题,MFCA被设计并且被示于图1。的MFCA三维流体的设计使打印头前端在图1中被降低到一个浴和压靠在一个表面上以形成一个密封。打印头的软硅胶尖的行​​为就像一个垫片,形成了一个可逆的密封。该MFCA技术是唯一适合用潜面,这都需要细胞培养和组织切片系统的接口,并且是很难或不可能与大多数其他方法。销或喷墨印刷将无法正常工作,和2D的微流体装置不适合于沉积或离散点的大型阵列接口。另外,通过小型化和定位的实验 - 细胞微阵列 - 的MFCA克服了与高通量细胞系筛选测定法相关的主要问题。

该CFM采用3D频道网络周期小体积流体样品在表面上的微观12,13点的位置。通过用流量进行打印时,生物分子,细胞和其它试剂均保持在一个液体环境中在整个印刷过程中,使敏感的生物分子和细胞的印刷不暴露于空气中,这妨碍了当前小区的印刷技术。另外,也可以直接从粗物质,如杂交瘤或提供上清液有该阵列表面上的捕获机构进行打印。该原稿的目的是详细浸没印刷两种细胞类型的解释在表面上。

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Protocol

1细胞培养制备

  1. 存储NIH/3T3细胞的股票在液氮中,直到准备使用。
  2. 准备完整的媒体使用Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM),补充有10%胎牛血清,10mM的HEPES缓冲液,50单位/ ml青霉素和50μg/ ml的链霉素NIH/3T3细胞。
  3. 在37°C解冻细胞2-3分钟的水浴摇床
  4. 将细胞再悬浮于5ml完全培养基和离心机在1500×g离心3分钟。
  5. 除去细胞上清液而不干扰细胞沉淀。
  6. 重悬细胞于5ml介质,并使用血细胞计数器计数细胞。
    1. 在0.5 ml离心管中取出10微升的细胞悬液和地点。
    2. 加10微升台盼蓝的细胞悬浮液,并搅拌用移液管的尖端。
    3. 移液管加入10μl染色细胞成血细胞计数室。
    4. 计数细胞,血球在10倍放大倍率。
      1. 计数活细胞(白色小球)为4的9大广场。只计算,不会出现从台盼蓝染色深蓝色的活细胞。
      2. 计算每个大正方形单元的平均数目,从而导致细胞的原始细胞悬液×10 4个细胞/ ml的数量。
      3. 种子细胞以1×10 5个细胞/毫升,总的5毫升在每个T25烧瓶的密度。
    5. 培养的细胞在开始实验前70%至80%汇合之间。刷新媒体每2-3天或根据需要。

2,印刷表面处理

  1. 马克在组织培养处理的聚苯乙烯(TCTPS)12孔板的底部,标记一个矩形的打印头(7毫米x 19毫米)的大小。
  2. 移液管加入50μl胎牛血清成的矩形区域,并铺在其整个区域的小费。
  3. 离开培养皿在无菌生物安全罩O / N,使血清斑点完全干燥。这些板块应使用不超过2天前编制。

3,浸入式印刷

  1. 清洗打印头用蒸馏水。
    1. 填60毫米培养皿中,用蒸馏水和停靠打印头在表面上。
    2. 使用气动泵以150微升/分钟,通过每行的流动蒸馏水2分钟。
    3. 从培养皿倒掉水,并用干净的水填满它。
    4. 移动打印头向上和向下在水中的3倍。
  2. 停靠在打印头中心多年来在预先制备的12孔板中的血清涂覆点。
  3. 总理打印头与预热的完全培养基,每通道300微升。
  4. 以50000个细胞/ ml的浓度在表面上和60微升/分钟,每通道100微升打印悬浮细胞。
  5. 将打印头,离开了停靠反对表面上,并且在细胞培养孵化器歧管设置为5%的CO 2和37℃下进行2小时。
  6. 在2小时培养后,取出打印头,然后将盖子上的培养皿。在该打印头上取下的时候被认为是0小时的时间点。

4,标准的细胞培养

  1. 加入1 ml预热的媒介,在步骤2中制备的血清斑TCTPS 12孔板中的一个。
  2. 取1ml所剩余的细胞悬浮液的步骤2和吸管成12孔TCTPS板的单个孔。这会产生含50,000个细胞在培养皿的文化。
  3. 将细胞培养板在培养箱中在37℃下搅拌2小时。
  4. 经过2小时培养开始计时;用于印刷和播种样品之间的一致性,这被认为是0小时时间点。

五,文化可视化

  1. 0,2,24,和48小时取单元从所述两个方法d时旁切上面和图像使用标准的倒置显微镜。
    1. 使用碘化丙啶,红色荧光染色,是只掺入死细胞的细胞核染色的细胞。
      1. 轻轻冲洗细胞3次,用1ml磷酸盐缓冲盐水中钙和镁(PBS + +),以除去任何碎片。
      2. 加入1 ml预热的PBS + +的每个培养容器。
      3. 加入1μl的碘化丙啶溶液(1毫克/毫升),以每个培养容器。
      4. 孵育染色用碘化丙啶,在37℃下进行10分钟的细胞。
    2. 图片使用在10倍倒置显微镜和40倍的放大倍率的细胞。
  2. 丢弃在适当的生物危害容器中的细胞。

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Representative Results

的成纤维细胞系NIH/3T3细胞被印刷或接种到水下表面。使细胞生长至每毫升5×10 4个细胞的密度。细胞被用传统的细胞培养技术接种。细胞使用大幅面,12 - 流动池的打印头,其中的信道是较大的(〜500微米)比用于蛋白质和其他生物分子的CFM打印。将细胞印刷或接种在血清涂覆的表面。印刷过程示于图1。

印刷及接种后,将细胞可视化,以评估密度和形貌相关的时间点(0,2,24,和48小时)。在这些时间点的细胞密度和细胞的形态使用10X和40X的放大倍率用显微镜进行了评估。的图像显示,该细胞具有几乎相同的表型在每个时间点,并在每个放大图2,基于这些图中,效果印刷被确定为最小。

用PI染色的细胞存活率进行了评估。 如图3所示 ,细胞存活率为印刷单元是不高于接种的细胞在每个时间点显著不同。将所述细胞表面的两种方法之间的主要区别是印刷的细胞密度。在50%以上均去籽,印刷单元的2小时时间点细胞密度降低。进一步的研究是必要的,以确定这种下降的原因;然而,整体的印刷密度比值相比,种子仍然显著较高。在流通池的印刷细胞密度为致密约10倍于各时间点作为考虑细胞被打印在相同的密度播种的种子细胞,但在较小的面积(0.9 平方厘米面积的流通池,3.8 cm 2的对于一个24孔板的一个孔)。在最后的时间点的细胞是在同一密度瓦特HICH可能是由于细胞的运动性和资源消耗的限制。

图1
图1(A)图片的CFM的(B)的流动池的原理图。(C)打印头显示个别测量管(四)淹没打印头的地方到码头组织培养相容的表面。示意图SEM图像。 请点击此处查看这个数字的放大版本。

图2
比较接种与印刷细胞形态图2。影像,(A)3T3细胞被microfluidically印刷到BSA和在0,2,24,和48小时进行评估。在(B)的 3T3细胞接种而不是打印。细胞形态相似,如果不相同。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3
在不同时间点,包括0,2,24,和48小时的细胞的印刷和细胞接种之间的细胞密度和存活率的图3的比较,(A)中每平方毫米的细胞的细胞密度进行了评估。在(B)中细胞的活力而厘定。 请点击此处查看此FIGU的放大版本重。

图4
图4,细胞芯片连续流动microspotter在NIH/3T3细胞流经四个流动池的10倍放大率的图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

这里所描述的3D微流体印刷技术是唯一能够细胞microfluidically印刷阵列放入盛好液体, 一个水下表面。通过印刷在潜面,细胞微阵列可以制造维持细胞的生理相关的细胞表型,以及多路复用单元中的单个孔图4底部的能力。本研究的结果表明,microfluidically印刷细胞的结果在细胞附着与细胞相媲美的形态和活力;然而,印刷单元可被更密集地附着在导致较短的总研究时间定义的位置。更短的学习时间,可能会导致显著的成本节约用于高通量药物筛选14。

微流体先前已被用于蜂窝芯片和高通量药物筛选。大量研究已经详细介绍了如何基于流量的测定消除静电流问题;不幸的是,这些研究使用二维微流体(不要与二维和三维组织培养相混淆),这限制了密度,复用和显微镜集成为高度并行分析15 - 19。数字微流体和微滴的基于微流体已经提出了用于这些类型的应用程序,并且可以在高度并行的,复用的配置15,17,18进行操作,但它们仅限于单个或小细胞群,并失去了所有的3-D的多样品制备过程中细胞类型的组织结构。高通量流式细胞仪已被用于细胞快速筛选;然而,流式细胞术,需要细胞保持在悬浮液中,这是不理想的用于筛选是, 在活体内 ,被束缚于细胞外基质20粘附细胞系。共同的文化也从缺乏真正的组织代表19受苦。与此相反,在三维MFCA技术使完全自动化德生物分子和交付试剂细胞斑点或完整的组织切片在密密麻麻排列的位置。建议的系统将不仅能够生成数组,但会在“流动”的环境,允许剪应力,交付不同的化合物,以及生长条件对这些阵列研究,并会导致更多的预测体外药物这么做筛选工具。各种应用程序可以设想允许创新无限期地持续下去。这样的工具使得新的细胞的药物发现和cytotoxicological测定在众多重要的研究领域,如癌症,糖尿病,炎症,感染和心血管疾病。

而MFCA是优选的方法,以提供细胞的水下表面,挑战仍然与细胞附着在表面,特别是对非贴壁细胞系。这项技术的未来发展方向将集中于细胞附着的方法的表面上。对于人工细胞表面图案化技术目前存在的,其中包括:喷墨印刷,microextrusion或长丝绘图,DNA杂交和激光正向转 ​​移21。这些技术中,用DNA杂交技术细胞附着具有几个独特的重要特征。首先,细胞附着的方法是不依赖于受体的单个细胞所具有这样既粘附和非粘附细胞能够使用这种方法22被图案化。接着,该DNA蜂窝图案形成方法允许通过使用多种表面结合的DNA序列23包括许多细胞类型的复杂细胞阵列的产生。未来的应用或方向将侧重于利用DNA杂交技术进行细胞附着19,24

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Disclosures

作者是瓦萨奇微流体的员工和股东产生试剂和/或本手稿中使用的仪器。

Acknowledgments

作者要感谢克里斯·莫罗的技术援助。经费是由美国国立卫生研究院SBIR(R43)提供给予1R43GM101859-01(MPI)GRANT10940803。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous flow microspotter Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 cells ATCC CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium Invitrogen 11965-092 Base media for cells
HEPES buffer Invitrogen 15630-080 Cell media additive (control pH)
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070 Cell media additive
Penicillin-streptomycin  Invitrogen Cell media additive
Trypan blue Invitrogen 15250-061 Stain cell sfor counting
Hemocytometer Fisher 267110 Cell chamber to count cells
Nikon Eclipse TS100 Nikon Used to check on cells
Nikon Eclipse TE2000-U Nikon Used for collecting images
Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) Invitrogen 14040-133 Rinsing cells before passaging and before staining with PI
TrypLE Express  Invitrogen A12177-01 Used to remove cells from surface

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References

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