連続フローMicrospotterを使用して変更表面に細胞のサブマージ印刷

Bioengineering

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Davidoff, S. N., Miles, A. R., Romanov, V., Gale, B. K., Eckman, J. W., Brooks, B. D. The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter. J. Vis. Exp. (86), e51273, doi:10.3791/51273 (2014).

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Abstract

Introduction

製薬業界における最近の進歩は、薬物スクリーニングおよび分析cytotoxicological 1,2,3ための創薬プロセスにおける細胞マイクロアレイを使用して関心の高まりをもたらした。細胞マイクロアレイ用いたin vitroハイスループットアッセイおよびスクリーニング方法の開発は、迅速かつ費用対効果の高い薬剤候補の開発、ならびに、予めセル1,4の基本的な理解を容易にするであろう。細胞を用いたスクリーニングに伝統的なアプローチは、従来のウェルプレートのプラットフォームを使用しています。しかしながら、このアプローチは、高いコスト、限定されたスループット、および細胞機能に関する定量1,5については限られた能力に制限される。原因これらの制限があるため、携帯マイクロアレイ技術の研究は、分子生物学的特性評価、組織工学、および薬剤スクリーニング1,6のために急成長されている。携帯マイクロアレイの利点は、より小さなサンプルを使用、最小限の影響を含む細胞表現型情報をマスキング異質性、そして最も重要なことには、より高いスループットアプリケーション1,7,8するためのアッセイを自動化する能力。

製薬業界は、現在、マイクロタイターウェルプレート9における薬物スクリーニングのための2D細胞単層培養物とのハイスループット細胞ベースのスクリーニングアッセイを利用する。マイクロタイタープレートのウェル中の多重化セルはユニークな実験のオプションでより高いスループットの可能性を提供しています。さらに、細胞のマイクロアレイのための現在の技術は飛躍的に生体内で 10,11 から細胞の表現型を変える可能性がある細胞を乾燥させる。これらの問題を克服するために、MFCAは、操作された、 図1に示されている。MFCA 3次元流体工学の設計は、浴中に降下し、シールを形成する表面に対して圧縮されるように、図1のプリントヘッドチップを可能にする。プリントヘッドの柔らかいシリコーンチップは、同じように動作しガスケットと可逆的シールを形成する。 MFCA技術は、細胞培養物及び組織切片システムの両方に必要とされる浸漬表面とのインタフェースを一意に適しており、他のほとんどのアプローチでは困難又は不可能である。ピンやインクジェット印刷は機能しません、と2Dマイクロ流体デバイスは、蒸着やディスクリートスポットの大きな配列とのインタフェースに適していない。さらに、実験の小型化とローカル化することで - 携帯マイクロアレイを - MFCAは、ハイスループットの細胞ベースのスクリーニングアッセイに関連する主要な問題を克服する。

CFMは、表面12,13上の微小スポットの場所を介してサイクル少量流体サンプルに3Dチャンネルのネットワークを使用しています。流れに印刷することによって、生体分子、細胞、および他の試薬は、現在のセルの印刷技術を妨げる空気に曝すことなく敏感な生体分子および細胞の印刷を可能にする、印刷プロセス全体を通して液体環境に維持される。アレイ表面上の捕獲メカニズムが設けられ、このようなハイブリドーマまたは上清として粗物質から直接印刷することも可能である。本稿の目的は、表面上に詳細に2つの細胞型の浸漬印刷を説明することである。

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Protocol

1。細胞培養の準備

  1. 使用するまで液体窒素中でNIH/3T3細胞株を保管してください。
  2. 10%ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いてNIH/3T3細胞について完全培地を調製し、10mMのHEPES緩衝液、50単位/ mlペニシリン、および50μg/ mlのストレプトマイシン。
  3. 37℃にて振とう水浴中で2〜3分間、細胞を解凍
  4. 3分間1500×gで完全なメディアや遠心分離機の5ミリリットル中の細胞を再懸濁。
  5. 細胞ペレットを乱すことなく細胞上清を取り除きます。
  6. メディア5mlに細胞を再懸濁し、血球計数器を用いて細胞を数える。
    1. 0.5ミリリットルのマイクロチューブに細胞懸濁液と場所を10μlを削除します。
    2. 細胞懸濁液にトリパンブルー10μlのを追加し、ピペットのチップでかき混ぜる。
    3. 血球計数器室への染色された細胞のピペットを10μl。
    4. 10倍で血球計数器で細胞を数える倍率。
      1. 9大正方形の4のために生きている細胞(小さな白いボールを)カウントします。トリパンブルー染色から濃い青色に表示されない、生きた細胞のみをカウントします。
      2. 細胞は元の細胞懸濁液中の×10 4細胞/ mlの数を生じ、大きい正方形当たりの細胞の平均数を計算する。
      3. 1×10各T25フラスコ中の5mlを合計5細胞/ mlの密度で種子細胞。
    5. 70%〜80%の集密度に培養細胞の実験を開始する前に。必要に応じて2〜3日ごとにメディアを更新するか。

2。印刷面の準備

  1. マーク·組織培養処理ポリスチレン(TCTPS)12ウェルプレートの底面にあるマーカーを持つ矩形のプリントヘッド(X 19ミリメートル7ミリメートル)の大きさ。
  2. ピペット50の矩形領域にウシ胎児血清のμLとチップとの全域に広げる。
  3. ペトリ皿を残す無菌バイオセーフティーフードのO / Nにおいて血清スポットが完全に乾燥することができます。これらのプレートは、使用前にこれ以上の2日以上を準備する必要があります。

3。サブマージ印刷

  1. 蒸留水でプリントヘッドをすすぐ。
    1. 蒸留水で60ミリメートルペトリ皿を記入し、表面にプリントヘッドをドッキング。
    2. 空気ポンプを用いて150μlの/分で2分間線のそれぞれを介して蒸留水を流す。
    3. ペトリ皿から水を捨て、きれいな水でそれを埋める。
    4. 水中で上下に3回プリントヘッドを移動します。
  2. 事前準備12ウェルプレート中の血清でコーティングされたスポット上でプリントヘッドの中心をドッキング。
  3. プライム予め温め完全なメディア、チャネルあたり300μlのプリントヘッド。
  4. 印刷面に50,000細胞/ mlの濃度で細胞を懸濁し、60μL/分、チャンネルあたり100μL。
  5. プリントヘッドを置き、反対ドッキング左表面、および2時間、5%CO 2、37℃に設定し、細胞培養インキュベーター中でマニホールド。
  6. 2時間インキュベートした後、プリントヘッドを取り外して、培養皿にふたをする。プリントヘッドが除去される時間は、0時間の時点と考えられる。

4。標準的な細胞培養

  1. ステップ2で調製した血清を点着TCTPS 12ウェルプレートの1に予め温めメディアの1ミリリットルを追加します。
  2. 12ウェルTCTPSプレートの単一ウェルにステップ2とピペットから残りの細胞懸濁液の1ミリリットルを取る。これは皿に50,000細胞を含む培養が生成されます。
  3. 2時間37℃のインキュベーター内で細胞培養プレートを置きます。
  4. 2時間インキュベートした後のタイミングを始める。印刷され、播種サンプル間の一貫性のために、これを0時間の時点と考えられている。

5。文化の可視化

  1. 0,2、24、及び二つの方法の各々からの48時間のテイク細胞日後標準の倒立顕微鏡を用いて上記画像傍接した。
    1. ヨウ化プロピジウムのみ死細胞の核内に組み込まれる赤色蛍光染色を用いて細胞を染色する。
      1. 穏やかに任意の破片を除去するために、カルシウムおよびマグネシウムを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS + +)1mlで細胞を3回すすぐ。
      2. 各培養容器に予め温めPBS + +の1ミリリットルを追加します。
      3. 各培養容器にヨウ化プロピジウム原液(1 mg / ml)をの1を添加する。
      4. 10分間37℃で、ヨウ化プロピジウムで染色した細胞をインキュベートする。
    2. イメージ細胞を10倍と40倍の倍率で倒立顕微鏡を使用。
  2. 適切なバイオハザード容器にセルを廃棄。

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Representative Results

線維芽細胞株NIH/3T3細胞を沈め表面に印刷又は播種した。細胞を、1ml当たり5×10 4細胞の密度まで増殖させた。細胞は、伝統的な細胞培養技術を用いて播種した。細胞は、大判、チャネルは、タンパク質および他の生体分子のために使用CFM以上(〜500μm)を大きい十二フローセルプリントヘッドを用いて印刷した。細胞は、血清コーティングされた表面に印刷または播種した。印刷処理は、図1に示されている。

印刷および播種後、細胞を関連する時間点(0、2、24、及び48時間)での密度および形態学を評価するために可視化した。これらの時点での細胞の細胞密度および形態を顕微鏡10Xおよび40Xの倍率を用いて評価した。画像は、細胞が各時点で各倍率図2においてほぼ同一の表現型を有することを示している。これらの図の効果に基づいて印刷は最小限であると決定された。

細胞生存率は、PI染色を用いて評価した。 図3に示すように、印刷された細胞についての細胞生存率は、各時点で播種された細胞よりも有意に異ならなかった。表面に細胞を付着させる2つの方法の主な違いは、印刷された細胞の密度である。細胞密度を播種し、印刷された細胞の両方において50%以上が2時間の時点で減少する。さらなる研究は、この減少の原因を判断するために保証されている。播種さと比較した場合しかし、全体的な印刷濃度比は、有意に高いままである。フローセル内の印刷された細胞密度は考慮した細胞は播種と同じ濃度で印刷した播種された細胞などの各時点での約10倍緻密であったが、より小さな面積(フローセル0.6 cm 2の面積は3.8 cm 2単位24ウェルプレートのウェルのために)。最終時点で、細胞を同じ密度ワットであるHICHは、細胞の運動性とリソース消費の制限に起因する可能性が高い。

図1
CFMの図1(A)写真(B)フローセルの概略。(C)は 、個々のフローセルを示すプリントヘッドのSEM像。(D)組織培養互換性の表面にプリントヘッドドック。水没印刷の模式図をクリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。

図2
図2画像が印刷細胞に対する播種の形態を比較する。(A)3T3細胞中microfluidically BSA上に印刷され、0,2、24、及び48時間後に評価した。 (B)において、3T3細胞を播種し、代わりに印刷した。細胞形態が同一でない場合にも、同様である。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3
図3セル印刷および0を含む様々な時点での細胞播種、2,24、および48時間の間の細胞密度および生存率の比較(A)において、1mm 2あたりの細胞における細胞密度を評価した。 (B)の細胞の生存率を測定した。 このふぃぎゅの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。再。

図4
図4。NIH/3T3細胞を貫流された細胞マイクロアレイ連続フローmicrospotterの4フローセルの10倍倍率画像。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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Discussion

ここで説明した3Dマイクロ流体印刷技術は、よく充填された液体への細胞のmicrofluidically印刷アレイの一意ができる水没面、すなわち 。水没面に印刷することによって、細胞マイクロアレイは、細胞の生理学的に関連する細胞表現型ならびに単一ウェル、図4の底部に細胞を多重化する能力を維持するように製造することができる。microfluidically中の細胞の結果を印刷するこの研究の結果比較可能な細胞形態および生存率、細胞の付着;しかしながら、印刷された細胞は、より密に短い全体的な研究時間が得られる定義された場所に取り付けることができる。短い調査時間は、ハイスループット薬剤スクリーニング用の14大幅なコスト削減をもたらす可能性がある。

マイクロフルイディクスは、以前に細胞のマイクロアレイおよびハイスループット薬剤スクリーニングのために使用されている。研究の数十のアッセイを基にどのように流れるかを詳述しています静的フローの問題を解消する。 19 -残念ながら、これらの研究は、15を解析するための高度な並列密度、多重化、及び顕微鏡の統合を制限する2次元マイクロ流体工学を(2Dおよび3D組織培養物と混同されるべきではない)を使用する。デジタルマイクロ流体工学と液滴ベースのマイクロ流体工学は、これらのタイプの用途のために提案されている、高度に並列に動作することができ、多重化された構成15,17,18が、それらは、単一または小細胞群に限定されるもので、全ての3-Dを失っている、マルチサンプル調製時の細胞型組織構造。ハイスループットフローサイトメトリーは、迅速な細胞スクリーニングのために利用されている;しかし、フローサイトメトリーは、 生体内で 、細胞外マトリックス20につながている、接着細胞株をスクリーニングするための理想的なされていない、細胞が懸濁状態を維持する必要があります。共培養には、真の組織表現19の不足に苦しんでいます。対照的に、3D MFCA技術は、完全に自動化を可能にするデ生体分子と密に充填された配列内の細胞スポットまたは無傷組織切片への試薬の納入の位置。本システムは、アレイを生成することができるであろうだけでなく、これらのアレイ上のせん断応力、異なる化合物の送達、および増殖条件の研究を可能にし、複数の予測インビトロ薬物につながる「流れる」環境で行うであろうツールのスクリーニング。様々なアプリケーションは、イノベーションは、無期限に継続させることを想定することができる。そのようなツールは、癌、糖尿病、炎症、感染症、および心血管疾患などの重要な研究分野の多くにおける新規な細胞の創薬およびcytotoxicologicalアッセイを可能にします。

MFCAは、水没面に細胞を送達する好ましい方法であるが、課題は、特に非接着細胞株について、表面に細胞を付着させるのままである。この技術の将来の方向性はのための細胞接着のための方法に焦点を当てる表面。人工表面上での細胞のパターニングのための技術は現在存在し挙げられる:インクジェット印刷、microextrusionまたはフィラメントプロット、DNAハイブリダイゼーション、レーザフォワード転写21。これらの技術の中で、DNAハイブリダイゼーション技術を用いて細胞の付着は、いくつかの独特で重要な機能を有する。まず、細胞付着の方法は、そのように両方の接着性および非接着細胞は、この方法22を用いてパターニングされることが可能である個々の細胞が有する受容体に依存しない。次に、DNAの細胞パターニング方法は、複数の表面に結合したDNA配列23の使用を介して多くの細胞型を含む複雑な細胞アレイの生成を可能にする。将来のアプリケーションまたは方向は、細胞付着19,24のためのDNAハイブリダイゼーション技術の使用に焦点を当てる

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Disclosures

著者らは、この原稿に使用される試薬および/または楽器を生産ワサッチマイクロ流体工学の従業員と株主である。

Acknowledgments

著者は、技術支援のためのクリス·モローを承認したいと思います。資金は、NIH SBIR(R43)助成1R43GM101859-01(MPI)GRANT10940803によって提供された。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous flow microspotter Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 cells ATCC CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium Invitrogen 11965-092 Base media for cells
HEPES buffer Invitrogen 15630-080 Cell media additive (control pH)
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070 Cell media additive
Penicillin-streptomycin  Invitrogen Cell media additive
Trypan blue Invitrogen 15250-061 Stain cell sfor counting
Hemocytometer Fisher 267110 Cell chamber to count cells
Nikon Eclipse TS100 Nikon Used to check on cells
Nikon Eclipse TE2000-U Nikon Used for collecting images
Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) Invitrogen 14040-133 Rinsing cells before passaging and before staining with PI
TrypLE Express  Invitrogen A12177-01 Used to remove cells from surface

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References

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