चूहे में विपरीत बढ़ाकर एमआरआई द्वारा ऑप्टिक तंत्रिका फाइबर वफ़ादारी के vivo इमेजिंग में

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Neuroscience

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Summary

इस वीडियो भोले माउस दृश्य प्रक्षेपण के विपरीत बढ़ाकर एमआर इमेजिंग के लिए और तीव्र ऑप्टिक तंत्रिका कुचलने चोट और जीर्ण ऑप्टिक तंत्रिका अध: पतन के साथ जुड़े ऑप्टिक तंत्रिका अध: पतन का दोहराव और अनुदैर्ध्य अध्ययन में vivo के लिए, एक नैदानिक ​​3 टी स्कैनर का उपयोग कर, एक विधि दिखाता है नाक आउट चूहों (P50 को).

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Fischer, S., Engelmann, C., Herrmann, K. H., Reichenbach, J. R., Witte, O. W., Weih, F., Kretz, A., Haenold, R. In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51274, doi:10.3791/51274 (2014).

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Abstract

कृंतक दृश्य प्रणाली दृश्य प्रांतस्था को thalamic और मध्यमस्तिष्क केन्द्रों, और postsynaptic अनुमानों में प्रवेश के लिए ऑप्टिक तंत्रिका कि फार्म रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और उनके axons शामिल हैं. अपनी विशिष्ट शारीरिक संरचना और सुविधाजनक पहुँच के आधार पर यह neuronal अस्तित्व, axonal उत्थान, और synaptic plasticity पर पढ़ाई के लिए इष्ट संरचना बन गया है. एमआर इमेजिंग में हाल की प्रगति में मैंगनीज मध्यस्थता विपरीत वृद्धि (MEMRI) का उपयोग करते हुए इस प्रक्षेपण के retino-tectal भाग के vivo दृश्य के लिए सक्षम है. यहाँ, हम (200 माइक्रोन) 3 के संकल्प के आम 3 टेस्ला स्कैनर का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है जिसके द्वारा चूहों में दृश्य प्रक्षेपण के चित्रण के लिए एक MEMRI प्रोटोकॉल उपस्थित थे. हम 15 nmol 2 MnCl की एक भी खुराक की intravitreal इंजेक्शन 24 घंटे के भीतर बरकरार प्रक्षेपण के एक संतृप्त वृद्धि की ओर जाता है कैसे प्रदर्शित करता है. रेटिना के अपवाद के साथ, संकेत तीव्रता में परिवर्तन निर्दलीय कर रहे हैंसंयोग दृश्य उत्तेजना या शारीरिक उम्र बढ़ने की सेंध. हम आगे तीव्र ऑप्टिक तंत्रिका चोट के जवाब में axonal अध: पतन की निगरानी longitudinally इस तकनीक को लागू, एक प्रतिमान घाव स्थल पर जो Mn 2 + परिवहन पूरी तरह से गिरफ्तारी से. इसके विपरीत, सक्रिय करोड़ 2 + परिवहन व्यवहार्यता, संख्या, और अक्षतंतु फाइबर की विद्युतीय गतिविधि को मात्रात्मक आनुपातिक है. इस तरह के एक विश्लेषण के लिए, हम दृश्य, अनुमानों सहित संवेदी का सहज शोष, प्रदर्शित करने के लिए एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल (NF-κB P50 को) में दृश्य मार्ग के किनारे करोड़ 2 + परिवहन कैनेटीक्स उदाहरण देना. इन चूहों में, MEMRI कम लेकिन इस प्रकार NF-κB परिवर्तन की संरचनात्मक और / या कार्यात्मक विकलांगता के लक्षण खुलासा, जंगली प्रकार चूहों की तुलना में करोड़ 2 + परिवहन देरी नहीं इंगित करता है.

संक्षेप में, MEMRI सुविधा विवो assays में पुलों और characterizati के लिए पोस्टमार्टम ऊतक विज्ञान पोस्टतंत्रिका फाइबर अखंडता और गतिविधि की पर. यह axonal अध: पतन और उत्थान, और वास्तविक या inducible phenotypes के लिए उत्परिवर्ती चूहों की जांच पर अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अत्यधिक उपयोगी है.

Introduction

अपने अनुकूल न्यूरो शारीरिक संरचना के आधार पर कृंतक दृश्य प्रणाली neuroprotection 1 या समर्थक पुनर्योजी प्रभाव 2,3 मध्यस्थता औषधीय यौगिकों और उनकी क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए अद्वितीय संभावनाएं प्रदान करता है. इसके अलावा, यह हाल ही में presynaptic मचान प्रोटीन Bassoon 4 कमी चूहों के लिए उदाहरण के रूप में, माउस म्यूटेंट के कार्यात्मक और न्यूरो संरचनात्मक विशेषताओं पर अध्ययन की अनुमति देता है. इसके अलावा, पूरक उपकरणों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम electroretinography और व्यवहार परीक्षण, और आंतरिक संकेतों के ऑप्टिकल इमेजिंग द्वारा कोर्टिकल rearrangements के दृढ़ संकल्प से, जैसे रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल (RGC) और RGC अक्षतंतु संख्या के साथ ही RGC गतिविधि की विशेषता अतिरिक्त परमिट. लेजर माइक्रोस्कोपी में नवीनतम तकनीकी विकास ऑप्टिक तंत्रिका (पर) और मस्तिष्क के पूरे माउंट नमूनों में गहरी ऊतक प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा RGC उत्थान के सीटू दृश्य में सक्षम. इस histolog मेंराजनैतिक दृष्टिकोण, प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में tetrahydrofuran आधारित ऊतक समाशोधन deafferented पर और ऑप्टिक पथ 5 में फिर से दर्ज है कि एकल फाइबर का संकल्प परमिट. इस तरह की तकनीक संकल्प और विकास पैटर्न के निर्धारण में बेहतर हो सकता है, वे विशेष रूप से लंबी अवधि के उत्थान की प्रक्रिया का आकलन करने के लिए वांछित हैं जो व्यक्ति के विकास की घटनाओं के दोहराव और अनुदैर्ध्य विश्लेषण सक्षम नहीं है.

इसके विपरीत बढ़ाकर एमआरआई चूहों और चूहों 6,7 में retino-tectal प्रक्षेपण की न्यूनतम इनवेसिव दृश्य के लिए नियोजित किया गया है. यह रेटिना की कोशिकाओं को समचुंबक आयनों (जैसे, MN 2 +) के प्रत्यक्ष intraocular वितरण के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. एक कैल्शियम एनालॉग के रूप में, MN 2 + वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल के जरिए RGC somata में शामिल किया है और सक्रिय रूप से बरकरार पर और ऑप्टिक पथ की axonal cytoskeleton साथ पहुँचाया. यह मस्तिष्क नाभिक में जम जाता है, जबकियह 10,11 को हो सकती है, हालांकि दृश्य प्रक्षेपण के पार्श्व जानुवत नाभिक (LGN) और बेहतर colliculus (एससी) यानी, प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था में transsynaptic प्रचार, 8,9 नगण्य दिखाई देता है. एमआर अनुक्रमण के तहत, समचुंबक करोड़ 2 + मुख्य रूप से टी 1 स्पिन जाली विश्राम का समय 12 को छोटा करके एमआर विपरीत augments. इस तरह करोड़ 2 + एमआरआई (MEMRI) सफलतापूर्वक पर चोट 13,14 के बाद axonal उत्थान और पतन का मूल्यांकन सहित चूहों के विभिन्न न्यूरो संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन, में लागू किया गया है बढ़ाया, retino-tectal प्रक्षेपण 15 की सटीक संरचनात्मक मानचित्रण , के रूप में अच्छी तरह से औषधीय उपचार 16 के बाद axonal परिवहन विशेषताओं का दृढ़ संकल्प के रूप में. करोड़ 2 + तेज और परिवहन neuronal, साथ ही सुधार एमआरआई प्रोटोकॉल की खुराक, विषाक्तता, और कैनेटीक्स में हाल के शोधन ट्रांसजेनिक पर अध्ययन करने के लिए अपने आवेदन बढ़ाया हैआमतौर पर नैदानिक ​​अभ्यास 17 में इस्तेमाल किया 3 टेस्ला स्कैनर का उपयोग चूहों 9.

यहाँ, हम माउस retino-tectal प्रक्षेपण के vivo इमेजिंग में अनुदैर्ध्य के लिए उपयुक्त एक MEMRI प्रोटोकॉल उपस्थित थे और भोले और विभिन्न neurodegeneration परिस्थितियों में करोड़ 2 + निर्भर संकेत वृद्धि का आकलन करने से इसके लागू उदाहरण देना. हमारे प्रोटोकॉल आम तौर पर समर्पित पशु स्कैनर से अधिक सुलभ है कि एक उदारवादी 3 टी चुंबकीय क्षेत्र में एमआर डाटा अधिग्रहण पर विशेष जोर देता है. भोले चूहों में, हम पथ विशिष्ट संकेत तीव्रता काफी और reproducibly intravitreal (ivit) करोड़ 2 + आवेदन में वृद्धि के बाद बन जाते हैं हो सकता है वर्णन कैसे. मात्रात्मक, दृश्य प्रक्षेपण के साथ करोड़ 2 + प्रसार (3 और 26 महीने पुराने चूहों के बीच मापा) सामान्य उम्र बढ़ने की प्रक्रिया की स्वतंत्र रूप से होता है और वृद्धि करने के लिए अंधेरे दृश्य उत्तेजना और अनुकूलन के लिए आग रोक है. इसके विपरीत, MN 18 तीव्र के साथ ही nfkb1 नाक आउट चूहों में सहज apoptotic RGC मौत से और अध: पतन 19 पीड़ित (P50 को) निम्नलिखित कम है. इस प्रकार, पारंपरिक histological विश्लेषण करने के लिए विस्तार में, व्यक्ति पशुओं के अनुदैर्ध्य MEMRI विश्लेषण neurodegenerative प्रक्रियाओं का अनूठा कैनेटीक्स की रूपरेखा बनाते हैं. यह औषधीय या आनुवंशिक उपायों के साथ जुड़े neuroprotection और axonal उत्थान पर अध्ययन के लिए उपयोगी साबित करना चाहिए.

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Protocol

सभी पशु हस्तक्षेप प्रयोगशाला पशु का पशु की देखभाल और उपयोग के लिए यूरोपीय कन्वेंशन और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए ARVO विवरण के अनुसार प्रदर्शन कर रहे हैं. सभी प्रयोगों स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं. चूहों में चोट की प्रक्रिया कहीं और 9 में वर्णित है.

1. Intravitreal मैंगनीज इंजेक्शन

  1. पिछले एमआर एक सहायक की मदद से स्कैन करने के लिए करोड़ 2 + इंजेक्शन 24 घंटे कार्य करें. (बाँझ पीबीएस में 420-450 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) एक 5% क्लोरल हाइड्रेट समाधान की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा पशुओं anesthetize. अतिरिक्त सामयिक संज्ञाहरण के लिए, पिछले आंख पंचर कॉर्निया को तरल conjuncain की एक बूंद (0.4% oxybuprocaine हाइड्रोक्लोराइड) लागू होते हैं. 15 nmol करोड़ इंजेक्षन करने के लिए 2 + आई प्रति उदाहरण के लिए, 132 एलएच 2 <1 एम 2 MnCl शेयर समाधान के 1 एल गिराए, एक 7.5 मिमी 2 MnCl समाधान तैयार/ उप> ओ एक 34 जी छोटी हब हटाने योग्य सुई (आर एन सुई) से जुड़े एक 5 μl हैमिल्टन सिरिंज में अंतिम समाधान के लोड 5 μl.
  2. दाहिनी आंख के साथ शुरू करते हैं, एक दूरबीन खुर्दबीन के नीचे और धीरे खुला बाईं तरफा माउस की स्थिति और अपने बाएँ हाथ के अंगूठे और तर्जनी के बीच सही आँख को ठीक. अपने दाहिने हाथ के साथ सिरिंज उठाओ और टिप के करीब सुई को पकड़ लेते हैं. आंख बल्ब की atraumatic पंचर के लिए, ध्यान से जिससे scleral वाहिकाओं बख्शते, किनारी के लिए लगभग 1 मिमी बाहर का infero अस्थायी परिधि में कांच का शरीर में सुई डालने.
  3. हैमिल्टन सिरिंज के पैमाने नियंत्रित करते हुए अगला, सहायक धीरे धीरे 2 μl की कुल मात्रा पर लागू होता है. इस प्रक्रिया के दौरान, खुर्दबीन के नीचे इष्टतम सुई प्लेसमेंट पर नजर रखने और तरल की लेंस या spilling के पंचर से बचें. स्थिर रुप से एक अतिरिक्त 30 सेकंड के लिए डाला सुई रखें, तो तरल को कम करने के लिए धीरे धीरे इसे वापस लेनेइंजेक्शन साइट से रिसाव.
  4. प्रक्रिया के दौरान, विशेष देखभाल की आंख को दबाव से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. इसी तरह, आंख बल्ब पंचर कठोर या कई प्रयास से बचें. करोड़ 2 + RGCs और पर साथ परिवहन में तेज पहले से ही 15 nmol 2 MnCl पर संतृप्त है के बाद से, यह थोड़ा imprecise इंजेक्शन वॉल्यूम्स संकेत विविधताओं को कम करता है. दृश्य प्रक्षेपण के द्विपक्षीय बढ़ाने के संकेत के लिए, बाईं आंख के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया को दोहराने.
  5. लागू ऑफ़्लॉक्सासिन युक्त (3 मिलीग्राम / एमएल) आई ड्रॉप और प्रक्रिया नेत्र संक्रमण और आंख के सूखने से रोकने के लिए एक बार के बाद Panthenol युक्त मरहम. एमआर स्कैन की शुरुआत तक सामान्य आवास की स्थिति के तहत उनके पिंजरों में चूहों लौटें.

एमआरआई के लिए 2. पशु तैयारी

  1. एक 2% / 98% isoflurane / ऑक्सीजन गैस के मिश्रण के प्रशासन द्वारा माउस anesthetize. लगभग एक क्षैतिज, untwisted स्थिति में एक माउस धारक पर माउस माउंट. इन्सफिर एमआर स्कैनर के अंदर निकाला जाता है जो एमआर कुंडल, में ईआरटी यह. उचित सिस्टम द्वारा श्वसन और हृदय की दर को मॉनिटर. तकनीकी जानकारी के लिए, हरमैन एट अल 20 देखें.
  2. दौरान एमआरआई, एक एकीकृत ट्यूब द्वारा माउस सिर धारक से जुड़ा एक बाष्पीकरण के माध्यम से एक शुरू में 1.5% / 98.5% isoflurane / ऑक्सीजन गैस के मिश्रण की निरंतर साँस द्वारा आपूर्ति संज्ञाहरण. स्कैन के दौरान दर्ज की गई महत्वपूर्ण पैरामीटर (यानी प्रति मिनट लगभग 40 साँस के एक स्थिर श्वसन दर के लिए लक्ष्य) के अनुसार संज्ञाहरण की गहराई को समायोजित. एक हीटिंग डिवाइस का उपयोग कर माउस के पेट स्थल पर तैनात एक थर्मल सेंसर द्वारा मापा, 35 और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच स्थिर शरीर की सतह के तापमान रखना. तकनीकी जानकारी के लिए, हरमैन एट अल 17 देखें.
  3. स्कैन करने के बाद, धारक से माउस को आजाद कराने और संज्ञाहरण से वसूली में तेजी लाने के लिए शुद्ध ऑक्सीजन के साथ की आपूर्ति. साथ ही, का उपयोग करके स्थिर शरीर के तापमान रखनाएक लाल बत्ती हीटिंग स्रोत.

3. एमआरआई प्रोटोकॉल

  1. प्रोटोकॉल 35 मिमी × 38 मिमी व्यास की दृष्टि से एक प्रभावी क्षेत्र के साथ एक समर्पित, SNR कुशल, छोटे जानवर का तार (रैखिक ध्रुवीकरण Litz तार) के साथ सुसज्जित एक 3 टेस्ला स्कैनर के लिए मान्य है. संचारित-प्राप्त मोड में कुंडल कार्य करते हैं.
  2. इसकी अंतिम स्थिति में पशुओं के साथ, एक आवृत्ति विश्लेषक की सहायता से तार की धुन और मैच को समायोजित. मैन्युअल छवि एकरूपता और गुणवत्ता का अनुकूलन करने के लिए ट्रांसमीटर संदर्भ वोल्टेज और शिम धाराओं को समायोजित.
  3. टी योजना बनाने के लिए बाण के समान और आड़ा देखने में 0.5 मिमी × 2 मिमी × 0.5 मिमी का एक संकल्प के साथ 1 भारित 2D त्से छवियों मोल. योजना बना एमआर स्कैन का उपयोग, राज्याभिषेक माप दिशा में MEMR छवियों के अधिग्रहण, बाएँ सही दिशा के साथ चरण एन्कोडिंग के साथ पशु के सिर के समांतर घुमाया. अधिग्रहण के समय को कम करने के लिए, को समायोजित देखने का एक आयताकार क्षेत्र का उपयोगवास्तविक सिर आयाम. चरण सांकेतिक शब्दों दिशा में देखने के 93.8% आयताकार क्षेत्र का उपयोग, आधार मैट्रिक्स 256, देखने के क्षेत्र 14.08 मिमी × 50.65 मिमी × 54 मिमी, और 0.11 एमएम की 128 स्लाइस: निम्नलिखित मानकों का उपयोग कर एक खराब 3 डी फ़्लैश अनुक्रम (खिंचाव 3 डी) रोजगार टुकड़ा संकल्प के साथ टुकड़ा मोटाई 61% करने के लिए सेट.
  4. 0.18 मिमी × 0.21 मिमी × 0.21 मिमी की एक प्रभावी संकल्प (0.1 मिमी × 0.1 मिमी × 0.09 मिमी interpolated), इको समय टी = 6.51 मिसे उपलब्ध कराने, 512 × 480 × 128 के साथ अंतिम चित्र बनाने के लिए में विमान प्रक्षेप सक्रिय, पुनरावृत्ति समय टी आर = 16 मिसे, बैंडविड्थ = 160 हर्ट्ज / px, फ्लिप कोण = 22 °. लगभग 30 मिनट की कुल अधिग्रहण के समय (टी ए) प्राप्त करने के लिए दो मूविंग और तीन repetitions लागू करें.

4. एमआरआई डेटा विश्लेषण

  1. सॉफ्टवेयर syngo fastView का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण. मात्रात्मक बढ़ाने के संकेत के लिए, हे परिभाषित क्षेत्रों का चयनएफ 2 डी तलीय एमआरआई रिकॉर्डिंग में ब्याज और बढ़ाया संरचना (एसआई MEMRI), ऊतक पृष्ठभूमि (एसआई backgr), और शोर (एसडी एन) के मानक विचलन का संकेत तीव्रता (एसआई) निर्धारित करते हैं. जहां आवश्यक हो, LGN और अनुसूचित जाति संरचनाओं के लिए न्यूरो संरचनात्मक उन्मुखीकरण की सुविधा के लिए एक माउस ब्रेन एटलस का उपयोग करें. : सूत्र का उपयोग इसके विपरीत करने के लिए शोर अनुपात (सीएनआर) की गणना
  2. सीएनआर = (एसआई MEMRI - एसआई backgr) / एसडी एन
  3. प्रत्येक नमूने के लिए मतलब सीएनआर गणना के लिए लगातार तीन छवियों यों. द्विपक्षीय इंजेक्शन पशुओं में, स्वतंत्र रूप से एक गोलार्द्ध का विश्लेषण.
  4. , क्षैतिज राज्याभिषेक और बाण के समान छवियों के चित्रण के लिए, मूल 3D एमआरआई डेटा सेट से multiplanar पुनर्निर्माण की गणना. ये संसाधित छवियों मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सिफारिश नहीं कर रहे. Retino की 3 डी एनिमेटेड पुनर्निर्माण (अधिकतम तीव्रता के अनुमानों, एमआईपी) बनाने के लिए-Tectal प्रक्षेपण, एक एंजियोग्राफी के बाद प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर मॉड्यूल का उपयोग करें.

5. करोड़ 2 + Autometallography (Timm धुंधला)

  1. MEMRI निम्नलिखित करोड़ 2 + पता लगाया मस्तिष्क संरचना की Timm धुंधला के लिए, 15-150 nmol करोड़ 2 + ivit 24 घंटा इमेजिंग के लिए पहले की एक खुराक इंजेक्षन.
  2. एमआर स्कैन के बाद, पीबीएस में 30 मिलीलीटर ठंडा 0.325% ना 2 एस (7.4 पीएच) के साथ जानवरों छिड़कना. जमे हुए खंड में retinae और फ्रीज नमूने काटना.
  3. एक cryotome पर 15 माइक्रोन मोटाई की अनुक्रमिक, इक्वेटोरियल वर्गों में कटौती.
  4. Angenstein एट अल 22 के अनुसार लगानेवाला और cryoprotection के अभाव में Timm धुंधला 21 कार्य करें.

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

पद अस्थायी एनोवा द्वारा पीछा एकल तुलना के लिए विद्यार्थी t-परीक्षण का उपयोग कर, सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन. डेटा मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. व्यक्तिगत एन संख्या रहे हैंएक प्रयोग के लिए अलग से दिए गए. (***, 0.001 पी ≤; **, 0.01 पी ≤ *, पी 0.05 ≤) 0.05 ≤ पी पहुँचने के परिणामों के सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता है.

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Representative Results

सही दृश्य प्रक्षेपण की जीवन शक्ति और कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए इस इमेजिंग तकनीक की क्षमता कांच का शरीर और RGCs द्वारा अपने तेज करने के लिए एक nontoxic करोड़ 2 + खुराक की सटीक आवेदन पर निर्भर करता है. इस प्रमुख धारणा परत विशिष्ट करोड़ 2 + तेज autometallography (Timm धुंधला) 21 द्वारा प्रदर्शन किया है जहां चित्रा 1, में परीक्षण किया है. रेटिना वर्गों नियंत्रण के रूप में 15 nmol या 150 nmol या तो करोड़ 2 +, या पीबीएस के ivit आवेदन के बाद 24 घंटे में विश्लेषण किया गया. इस समय बिंदु पर, MN 2 + इंजेक्शन retinae टी 1 में अधिकतम बढ़ाने के संकेत दिखा भारित एमआरआई (= 3 एन, बिंदीदार लाइनों), पीबीएस रेटिना संकेत (= 3 एन, बिंदीदार रेखा) में बढ़ाया नहीं गया है इंजेक्शन जबकि (चित्रा 1 ,) पैनल छोड़ दिया. 150 nmol इंजेक्शन आंख में hyperintensive बढ़ाने के संकेत पर ध्यान दें. इसके विपरीत, nonenhanced मस्तिष्क क्षेत्रों (तारांकनों) सभी के सहयोग के लिए इसी तरह की पृष्ठभूमि संकेत तीव्रता दिखानेविशेष रूप से RGC परत और निम्न व्यक्तिगत RGC somata की जांच से इस बात की पुष्टि कर रहे हैं, जो तंत्रिका फाइबर परत (एनएफएल) (चित्रा 1, मध्यम पैनल में बढ़ाया insets), में nditions (हरा रंग). Ivit करोड़ 2 + अनुप्रयोग बढ़ जाती समग्र Timm धुंधला एच एंड ई सह लेबलिंग (सही पैनल).

माउस retino-tectal प्रक्षेपण के vivo इमेजिंग के लिए, यह एक साथ उपकरणों के साथ संचालन मानकों, चित्रा 2 में सचित्र के रूप में, एक 3 टी क्षेत्र में चूहों का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, जहां एक विशेष माउस MEMRI प्रोटोकॉल का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस तरह के एक स्कैनर सेटअप लागू कर रहा है, हमारे पहले काम सीएनएस छवि संकल्प के लिए एक चूहा सिर का तार एक समर्पित माउस पूरे शरीर का तार 17 से बेहतर है कि पता चला. Murine सिर को ठीक करने के लिए और ठीक से चूहे का तार के भीतर अपनी स्थिति को समायोजित करने के लिए, हम प्लास्टिक से बने काटने पट्टी के साथ एक झूला और एक शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें, जो दोनों के शरीर आयामों को पूरा करने के लिए downscaled रहे हैंचूहों की (आंकड़े 2A, बी). छवियों 3D ढाल गूंज दृश्यों को लागू करने के लिए एक आड़ा 1 टी भारित मैट्रिक्स पर अर्जित कर रहे हैं, तो अधिग्रहण के समय के 35 मिनट के भीतर (200 माइक्रोन) 3 के उच्च संकल्प छवियों की पीढ़ी की उम्मीद की जा सकती है. हम दृढ़ता से स्कैन के दौरान महत्वपूर्ण कार्यों की निरंतर निगरानी की सिफारिश. एक साथ postimaging oxygenation और शरीर का तापमान नियंत्रण के साथ संज्ञाहरण के समायोजन काफी वसूली समय accelerates और के बारे में 100% की जीवित रहने की दरों की गारंटी देता है. ऐसी तकनीकी सावधानियों पूरी पलटन अनुदैर्ध्य और दोहराव एमआरआई बनाए रखा जाएगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं.

किसी भी अध्ययन में, 15 nmol की केवल एक nontoxic करोड़ 2 + खुराक प्रमुखता पर, रेटिना में CNRS बढ़ाने के लिए पर्याप्त है, जो ivit आवेदन 9 के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और presynaptic intracerebral LGN और अनुसूचित जाति के लिए ऊपर ऑप्टिक पथ. सीएनआर मूल्यों सर्वश्रेष्ठ 200 माइक्रोन मोटी आड़ा से गणना कर रहे हैंमूल isotropic 3D मात्रा reslicing द्वारा मूल एमआरआई डेटा सेट से प्राप्त स्लाइस. चित्रा 3A ब्याज के तीन क्षेत्रों (1) संकेत बढ़ाकर क्षेत्र (एसआई MEMRI के लिए प्रत्येक छवि में चुने गए हैं जहां बढ़ाया LGN, के लिए सटीक सीएनआर दृढ़ संकल्प का एक उदाहरण से पता चलता है ), (2) गैर affine मस्तिष्क के ऊतकों (एसआई backgr), और (3) पृष्ठभूमि शोर (एसडी एन). एक भी दृश्य प्रक्षेपण के पूरी तरह से साथ मात्रा निर्धारित expectable स्थानिक बढ़ाने के संकेत चित्रा 3 बी में प्रस्तुत किया है. ऑप्टिक तंत्रिका सिर पर जो चोटियों dorsoventral विमान, साथ रेटिना वर्गों में संकेत वृद्धि की मजबूत क्रमिक वृद्धि पर ध्यान दें. इसके अतिरिक्त, लागू प्रयोगात्मक शर्तों (दृश्य प्रांतस्था में संकेत ड्रॉप) के तहत cortical परतों में एक प्रासंगिक transsynaptic करोड़ 2 + प्रसार की कमी को ध्यान दें. एमआईपी पूर्ण मूवी (1) में retino-tectal प्रक्षेपण की 3 डी स्थिति कल्पना करने के लिए अत्यधिक उदाहरण हैं. एकदृश्य प्रक्षेपण के साथ करोड़ 2 + की ccumulation सीए 2 + चैनलों और अपनी तेजी axonal परिवहन निर्भर है, साथ ही लक्ष्य ऊतक 13 से अपेक्षाकृत कम निकासी से वोल्टेज के माध्यम से RGCs में intracellular तेज की कैनेटीक्स द्वारा निर्धारित किया जाता है. हमारे पिछले गतिज अध्ययन के अनुसार, MN 2 + निर्भर बढ़ाने के संकेत के रूप में जल्दी इंजेक्शन के बाद 6 घंटे के रूप में पता लगाया जा सकता है. यह 24 घंटे में आगे चोटियों और 120 घंटे के बाद इंजेक्शन 9 के भीतर आधारभूत स्तर पर वापस कम हो जाती है. इसलिए, अधिकतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, MEMRI चूहों 13 के लिए आवश्यक वृद्धि समय के आधे का प्रतिनिधित्व करता है, जो इंजेक्शन के बाद 24 घंटे का प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

MEMRI द्वारा दृश्य प्रक्षेपण के विपरीत वृद्धि के लिए सिद्धांत को रेखांकित किया है, हम आगे दो मापदंडों के प्रभाव संवाद - प्रकाश हालत और पशु उम्र - मात्रात्मक माप प्रभावित कर सकता है:

(1) च परीक्षण करने के लिएया मध्यमस्तिष्क केन्द्रों में करोड़ 2 + के प्रोत्साहन पर निर्भर संचय, चूहों या तो टॉर्च एक परिभाषित आवृत्ति का जोखिम (5 हर्ट्ज) और प्रकाश की तीव्रता (3 डब्ल्यू एलईडी) के द्वारा प्राप्त प्रकाश उत्तेजित परिस्थितियों में या पूर्व स्कैन करने के लिए पूरी तरह अंधेरे में रखा गया और एम. एन 2 + जोखिम के 24 घंटे के दौरान. सीएनआर 24 घंटा के मात्रात्मक विश्लेषण ivit बाद करोड़ 2 + अनुप्रयोग प्रकाश उत्तेजित स्थितियां (66.29 ± 3.07 बनाम 54.56 ± 3.08, पी ≤ 0.05, एन = 7 / की तुलना में काले अनुकूलित retinae के संकेत तीव्रता में उल्लेखनीय वृद्धि का पता चलता है 8, चित्रा -3 सी). परिधीय रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका सिर (3B चित्रा देखें) के बीच संकेत वृद्धि में ढाल को देखते हुए, हम हमेशा सभी प्रयोगात्मक समूहों के भीतर रेटिना वर्गों इसी का विश्लेषण करने का आश्वासन दिया. उम्मीद के रूप में ventrodorsal विमान के साथ छवि विश्लेषण पूर्ण सीएनआर मानों दोनों स्थितियों में नीचे जा रहे हैं, का पता चला. महत्वपूर्ण बात, रिलायंस एनर्जीअंधेरे और प्रकाश अनुकूलित retinae के बीच ative संकेत अंतर (डेटा) नहीं दिखाया लगातार बनी हुई है. LGN का प्रक्षेपण क्षेत्रों में हालांकि, संकेत वृद्धि (26.97 ± 1.78 बनाम 26.58 ± 1.05, पी = 0.9, एन = 7-2) और अनुसूचित जाति (25.09 ± 1.24 बनाम 26.81 ± 1.55, पी = 0.4, एन = 7 / 8) प्रकाश और अंधेरे कंडीशनिंग वातावरण (चित्रा -3 सी) के बीच अप्रभेद्य है. यह परख लक्ष्य क्षेत्रों में retino-tectal प्रक्षेपण और संचय के साथ अपने प्रचार संपाती दृश्य उत्तेजना से प्रभावित नहीं है जबकि रेटिना परतों में करोड़ 2 + की तेज, प्रकाश जोखिम के प्रति संवेदनशील है कि दर्शाता है. वैकल्पिक रूप से, 3 टी स्कैनर का संकेत संवेदनशीलता LGN या अनुसूचित जाति में संकेत बदलाव के लिए पता लगाने सीमा से नीचे हो सकता है.

(2) दृश्य प्रक्षेपण के MEMRI संबंधित बढ़ाने के संकेत पर जानवर की उम्र के प्रभाव का पता लगाने के लिए, हम 3 और 26 महीनों ओ के बीच चूहों का विश्लेषणएफ उम्र. (; = एन, पी = 0.79 16 23.90 ± 0.81), 13 महीने (23.35 3 महीने पुराने चूहों की LGN (23.49 ± 1.36, = 12 एन) 7 महीने के आयु वर्ग के चूहों में मापा संकेत तीव्रता से अलग नहीं करना में सीएनआर मूल्यों चित्रा 3 डी), 1.29, पी = 0.94, एन = 10) या 26 महीने (25.10 ± 2.29, पी = 0.53, एन = 6 ±. इसी तरह, अनुसूचित जाति में संकेत तीव्रता (16.92 ± 2.18 पी = 0.37, चित्रा 3 डी) 3 महीने (19.01 ± 1.20) और उम्र के 26 महीनों के बीच अपरिवर्तित है. एक मामूली वृद्धि 26 महीने पुराने retinae (38.49 ± 3.25) की सीएनआर मूल्यों में स्पष्ट है हालांकि सभी समूहों (पी> 0.05) के दौरान की तुलना में, इस वृद्धि के महत्व तक पहुँच नहीं है. इन प्रयोगों दृश्य प्रक्षेपण के मस्तिष्क लक्ष्य क्षेत्रों में बढ़ाने के संकेत दृश्य उत्तेजना और शारीरिक उम्र बढ़ने से अप्रभावित है कि संकेत मिलता है.

अगला, हम ओ संरचनात्मक परिवर्तन का पता लगाने के लिए MEMRI की संवेदनशीलता का प्रदर्शनF दृश्य प्रक्षेपण तीव्र और जीर्ण अक्षतंतुओं का कोई भी रोग की वजह से. इस का पता लगाने, चोट 18 के साथ ही दृश्य मार्ग 19 सहित संवेदी अनुमानों के असामयिक, सहज अध: पतन दिखाने में कोई पशु मॉडल पर दर्दनाक द्वारा प्रेरित Wallerian अध: पतन का एक मॉडल कार्यरत थे:

(1) पर क्रश चोट से प्रेरित घाव अक्षतंतुओं का कोई भी रोग axona fascicles का टूटना का कारण बनता है. LGN में करोड़ 2 + बढ़ाया संकेत का पूरा नुकसान द्वारा कल्पना और अनुसूचित जाति एक सप्ताह (चित्रा -4 ए, एक दिन () नहीं दिखाया विश्लेषण किया नतीजतन, axonal cytoskeleton साथ करोड़ 2 + की retino-tectal परिवहन, पूरी तरह से और sustainably अवरुद्ध हो जाएगा बिंदीदार लाइनों), और 4 सप्ताह () नहीं दिखाया चोट के बाद. स्पष्ट रूप से पर चोट के neuroanatomical और लगातार एमआर सुविधाओं का प्रदर्शन और भोले राज्य से उन्हें काटना, घाव ही एकतरफा प्रवृत्त किया गया था. यह टी पर अनछुए करोड़ 2 + परिवहन में परिणामवह हस्तक्षेप के पक्ष में दरियाफ्त रुकावट के विपरीत पक्ष पर नियंत्रण. Deafferented क्षेत्रों में सीएनआर मूल्यों का विश्लेषण बढ़ाने के संकेत (नहीं दिखाया गया है) के पूर्ण अभाव की पुष्टि करता है. इस प्रयोग को आगे MEMRI (चित्रा 4 बी) से पहले और चोट के बाद प्रक्षेपण के साथ संकेत तीव्रता के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन द्वारा एक घाव साइट का स्थान और गंभीरता का पता लगाने में अत्यधिक संवेदनशील है कि दर्शाता है. चोट से पहले पर साथ संकेत तीव्रता लगातार पृष्ठभूमि संकेत से ऊपर रहता है, वहीं पर चोट के बाद पृष्ठभूमि स्तर एक दिन के लिए संकेत तीव्रता में एक temporo स्थानिक बूंद है.

(2) हमारा काम पहले इंजेक्शन 9 के बाद 24 घंटा मापा जब LGN में करोड़ 2 + निर्भर बढ़ाने के संकेत NF-κB सबयूनिट P50 कमी 10 महीने पुरानी चूहों में कम हो जाता है कि प्रदर्शन किया. एक उच्च सामंजस्य के साथ इस का पता लगाने, हम retino-tectal करोड़ 2 + ट्रांस में एक समग्र हानि ग्रहणबंदरगाह, संभवतः RGCs की कम संख्या के कारण होता है और उम्र बढ़ने P50 को चूहों 19 में न्यूरोपैथी पर संबंधित. वैकल्पिक रूप से, कम बढ़ाने के संकेत कांच का शरीर से एक देरी neuronal तेज और एम. एन 2 के प्रचार के साथ और रोग प्रक्षेपण के साथ संबद्ध किया जा सकता है. उत्तरार्द्ध संभावना पर जल्दी (8 और 24 घंटे) और देर से (48 और 72 घंटे) समय 15 nmol करोड़ 2 + की एक भी आवेदन के बाद दोहराव एमआर स्कैन प्रदर्शन और रेटिना और LGN में संकेत वृद्धि के कैनेटीक्स का अध्ययन करके पता लगाया जा सकता है अंक. जंगली प्रकार और P50 को चूहों में, 8 घंटा में रेटिना बढ़ाने के संकेत चोटियों पर लगभग समान वृद्धि दर (43.52 ± 3.24 और 40.72 ± 2.79, पी = 3-6 0.6, एन, बाईं चित्रा 4C,). संकेत वृद्धि 24 घंटे बाद इंजेक्शन पर जंगली प्रकार में उच्च बनी हुई है, वहीं यह P50 को चूहों में गिरावट आती है (43.38 ± 2.18 बनाम 32.89 ± 1.54, पी ≤ 0.01, एन = 5-8). बाद में चरणों (48 और 72 घंटा) के दौरान बढ़ाने के संकेत इस प्रकार एक देरी रेटिना करोड़ 2 + तेज और P50 को चूहों में प्रचार को छोड़कर, (नॉक आउट चूहों में लगातार कम सीएनआर मूल्यों के साथ) दोनों समूहों में कम हो जाती है. P50 को चूहों के LGN में इसी के परिणाम इस धारणा की पुष्टि करें. सीएनआर 8 और 48 घंटे के बाद इंजेक्शन (पी 0.05 ≤, एन = 5-9) के बीच काफी कम है, P50 को चूहों में संकेत क्षीणन के कैनेटीक्स (सही, चित्रा 4C) जंगली प्रकार चूहों में उस से मेल खाती है. इस प्रकार, retino-tectal प्रक्षेपण की कम temporo स्थानिक बढ़ाने के संकेत एक सीमित RGC जनसंख्या के बजाय बिगड़ा परिवहन कैनेटीक्स से होने वाले कम अक्षतंतु संख्या की वजह से है. हम सीएनएस में projectional impairments के लिए आनुवंशिक माउस म्यूटेंट स्क्रीन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण MEMRI प्रस्ताव.

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करोड़ 2 चित्रा 1. Timm धुंधला + RGCs में तेज. 1 टी के प्रतिनिधि गर्मी का नक्शा छवियों एमआरआई (एमआरआई टी 1) संकेत लेंस की वृद्धि और पूरे रेटिना परिधि (बिंदीदार रेखा) 24 घंटा दिखाने भारित 15 की ivit आवेदन के बाद nmol, और अति गहन बढ़ाने के संकेत 150 nmol के आवेदन के बाद करोड़ 2 + (बाएं). जोशीले रंग ठंड रंगों की तुलना में अधिक संकेत मूल्यों का प्रतिनिधित्व. स्केल पट्टी: 1 मिमी. सही / मध्य: करोड़ 2 + Timm धुंधला (काले रंग) का उपयोग चांदी तेज़ी से पता चला के रूप में 2 MnCl की ivit इंजेक्शन के बाद RGCs द्वारा तेज. पीबीएस का इलाज नियंत्रण रेटिना वर्गों (शीर्ष; n = 3) के बजाय कमजोर धुंधला और RGC परत (RGC) का फैलाना भेदभाव प्रदर्शित करता है. उच्च बढ़ाई डी की अनुमति नहीं है. व्यक्ति की कोशिकाओं (बढ़ाया insets) की iscrimination Ivit 2 MnCl आवेदन विभिन्न विशेष रूप से तंत्रिका फाइबर परत (एनएफएल) RGC परत, और भीतर परमाणु परत (लीग में एक प्रमुख चांदी वर्षा के साथ रेटिना परतों में समग्र चांदी धुंधला बढ़ जाती है, मध्यम और नीचे , बढ़ाया insets, n = 3). एच ई आगे की पुष्टि ऐसी परत विशिष्ट करोड़ 2 + संचय (सही पैनल) धुंधला के साथ Timm की Colabeling. स्केल बार, अवलोकन: 50 माइक्रोन, बढ़ाई: 25 माइक्रोन. आईपीएल, भीतरी उलझन - रूप परत; OPL, बाहरी उलझन - रूप परत; ONL, बाहरी परमाणु परत; RPE, रेटिना वर्णक उपकला.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक नैदानिक ​​3T स्कैनर पर माउस MEMR छवि अधिग्रहण के लिए विशेष रूप से एमआरआई उपकरण दिखा फोटो. ए) बी के साथ कस्टम बनाया माउस पालने से पता चलता हैसांस की निगरानी (सफेद पैड, ब्लू ट्यूब). बी) के लिए ite बार सिर निर्धारण और सेंसर पालने में तैनात है और तय माउस से पता चलता है. संवेदनाहारी गैस. सी) संचारित में सक्रिय रैखिक ध्रुवीकरण Litz तार अंदर माउस सिर और पालने की स्थिति एक मिसाल है और. डी मोड प्राप्त बाईं आपूर्ति) के लिए ट्यूब परिरक्षण ट्यूब के सामने तार मंच से पता चलता है और नैदानिक ​​3 टी स्कैनर. तांबा लेपित ट्यूब गर्म पानी आधारित हीटिंग चटाई (ट्यूब के आसपास काले रैपिंग) से शोर और ब्लॉकों एमआरआई संकेत से अतिरिक्त परिरक्षण प्रदान करता है. ई) 3 टी स्कैनर का ताकना भीतर पशु कुंडली के पूरा सेट अप visualizes बस स्कैनर के अंदर isocenter पर ठीक पशु सिर स्थिति के लिए पहले.

चित्रा 3
एक आड़ा एमआरआई पर बढ़ाया LGN और पृष्ठभूमि के ऊतकों में ब्याज (आरओआई) मैपिंग के क्षेत्र की विभिन्न प्रकाश और उम्र परिस्थितियों में भोले retino-tectal प्रक्षेपण की चित्रा 3. MEMRI. ए) चित्रण (बाएं) रिकॉर्डिंग. LGN विशिष्ट संकेत वृद्धि गर्मी का नक्शा प्रस्तुति (दाएं) से यह साफ है. 1 और 1 ', बाएँ और दाएँ LGN; 2 और 2 ', पृष्ठभूमि ऊतक; 3, शोर; पी, पीछे; आर, सही. स्केल बार:. MEMRI द्वारा मूल रूप से हासिल कर ली आड़ा एमआर छवि स्लाइस से निर्धारित के रूप में एक एकल retino-tectal प्रक्षेपण के साथ बढ़ाने के संकेत के 100 माइक्रोन बी) के स्थानिक मानचित्रण. भरे चौराहों, Mn 2 + निर्भर बढ़ाने के संकेत; खुला त्रिकोण, पृष्ठभूमि संकेत. आर, रेटिना; पर, ऑप्टिक तंत्रिका; ओटी, ऑप्टिक तंत्र; LGN, पार्श्व जानुवत नाभिक; अनुसूचित जाति, बेहतर colliculus; कुलपति, दृश्य प्रांतस्था. टुकड़ा मोटाई, 200 माइक्रोन. सी) प्रकाश उत्तेजना काफी रेटिना बढ़ाने के संकेत कम कर देता है. EnhaLGN और अनुसूचित जाति में ncement दृश्य उत्तेजना से स्वतंत्र है. भरा हलकों, काले अनुकूलन; खुला हलकों, प्रकाश अनुकूलन. डी) बढ़ाने के संकेत 3 और 26 महीने के बीच बढ़ती उम्र से स्वतंत्र है.

चित्रा 4
Neurodegenerative शर्तों के तहत retino-tectal प्रक्षेपण की चित्रा 4. MEMRI. ए) द्विपक्षीय ivit इंजेक्शन चूहों के MEMRI दाईं तरफ के एकतरफा कुचलने की चोट के बाद एक सप्ताह के लिए प्रदर्शन किया. , क्षैतिज राज्याभिषेक, और पार्श्व दृश्य के Multiplanar पुनर्निर्माण घायल गोलार्द्ध (बिंदीदार रेखा) के लिए LGN और अनुसूचित जाति में संकेत वृद्धि के पूर्ण अभाव को दर्शाती है. सी, contralateral गोलार्द्ध; मैं, ipsilateral गोलार्द्ध. स्केल बार:. 1 मिमी बी) एमआईपी छवियों और पर साथ स्थानिक बढ़ाने के संकेत के अनुदैर्ध्य एमआरआई विश्लेषण से पहले औरचोट के बाद एक दिन. आर, रेटिना; पर, ऑप्टिक तंत्रिका; , घाव साइट तीर. स्केल बार:.. रेटिना की कोशिकाओं में करोड़ 2 + की P50 को चूहों में दृश्य प्रक्षेपण की पुरानी neurodegeneration के तहत बढ़ाने के संकेत के 0.5 मिमी सी) काइनेटिक्स जल्दी (8 घंटा) तेज प्रभावित नहीं है, लेकिन पहले से ही P50 के LGN में कम है को चूहों. दोहराए एमआर 24, 48 पर इमेजिंग, और (केवल रेटिना के लिए) 72 घंटे में निरंतर संकेत कमी से पता चलता है, लेकिन करोड़ 2 + परिवहन और P50 को चूहों के रेटिना और LGN में संचय की समान कैनेटीक्स.

मूवी 1: एनिमेटेड, 3 डी गर्मी का नक्शा प्रस्तुति सीटू विपरीत बढ़ाकर retino-tectal प्रक्षेपण में एमआर इमेजिंग 15 nmol 2 MnCl की द्विपक्षीय ivit इंजेक्शन के बाद 24 घंटे का प्रदर्शन किया गया था.. डाटा एमआईपी मोड में प्रस्तुत कर रहे हैं. टुकड़ा मोटाई, 200 माइक्रोन. <एक href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4" लक्ष्य = "_blank"> इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

दृश्य प्रणाली की MEMRI भोले और रोग की स्थिति के तहत कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए पारंपरिक neurobiological तकनीक फैली हुई है. इसके अलावा एक अलग सीएनएस फाइबर पथ की अखंडता में एक अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करने से, MEMRI आसानी दृश्य धारणा के लिए एक दिया प्रतिमान के तत्काल परिणामों की जांच के लिए, व्यवहार जैसे परीक्षण, ओप्टामीटर और नेत्रहीन आधारित पानी कार्यों के साथ पूरक हो सकता है. यह भी electrophysiological और vivo में कार्यात्मक दृश्य लक्षण वर्णन के साथ ऊतकीय जांच जोड़ता है. तकनीक (3 आंकड़े, में त्रुटि सलाखों देख 4) अत्यंत विश्वसनीय और समान समूहों के भीतर नाबालिग interindividual प्रसरण के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. संकेत है कि वृद्धि अतिरिक्त करोड़ 2 + आपूर्ति 9 से ऊंचा नहीं किया जा सकता है, जो एक पठार तक पहुँच जाता है तो दिलचस्प, 15 nmol की एक खुराक पर, MN 2 +, तेज और axonal परिवहन प्रक्रियाओं संतृप्त कर रहे हैं. एक व्यावहारिक बिंदु से सेकम से कम बढ़ाने के संकेत में कुछ डिग्री, इंजेक्शन जुड़े बदलाव के लिए इस तरह के एक खुराक प्रतिक्रिया लक्षण कम से कम, देखें. विशेष रूप से, खुराक और एम. एन 2 + संकेत वृद्धि के कैनेटीक्स पर प्रस्तुत डाटा इष्टतम विपरीत वृद्धि हासिल करने के लिए चूहों के लिए विशिष्ट और एक लगभग 10 20x उच्च करोड़ 2 + खुराक और बढ़ विलंबता (36 घंटे) की आवश्यकता होती है, जो चूहों में उन लोगों से अलग हैं 13,23. इसके अतिरिक्त, दृश्य प्रक्षेपण के साथ वृद्धि एक पशु 3 साल की उम्र और 26 महीने के बीच लगातार बनी हुई है. यह निष्कर्ष दृश्य उम्र बढ़ने चूहों पर किया परीक्षण और C57/B6 चूहों के ऊपर 24 साल की उम्र के 2 साल के लिए सामान्य दृश्य गतिविधि का कहना है कि इस तथ्य के साथ लाइन में है. हम उम्र बढ़ने अध्ययन में अनुलंबीय व्यक्तिगत चूहों का विश्लेषण नहीं किया है, पिछले परिणाम स्पष्ट रूप से अनुदैर्ध्य बुढ़ापे अध्ययन में वांछित हो सकता है जो दृश्य रखरखाव 9, के लिए 15 nmol की repetitively प्रशासित करोड़ 2 + dosages की सुरक्षा का प्रदर्शन.

करोड़ 2 + RGCs में शामिल किया है कि इस धारणा के अनुसार, हम करोड़ 2 + Angenstein एट अल द्वारा लागू के रूप में, नि: शुल्क धातु आयनों की चांदी वर्षा पर निर्भर करता है जो Timm धुंधला द्वारा उनके somata में तेज दिखा. Intracerebral करोड़ 2 + का पता लगाने के लिए निम्नलिखित इसके प्रणालीगत आवेदन 22. इससे पहले, intracerebral करोड़ 2 + वितरण चूहा सीएनएस 25 के neuronal सर्किट को चित्रित करने के लिए 54 करोड़ 2 + आइसोटोप की autoradiography ने पता लगाया है, लेकिन नहीं सेलुलर स्तर पर किया गया था. इधर, Timm धुंधला करोड़ 2 + का रोपण हम RGC और तंत्रिका फाइबर परतों में प्रमुख चांदी वर्षा लगता है जहां उजागर रेटिना के भीतर अलग सेल आबादी, के लिए तेज की अनुमति देता है. यह प्रोटोकॉल 15 nmol करोड़ 2 + की तुलना में 150 nmol की एक खुराक के आवेदन के बाद Timm धुंधला द्वारा शो में सुधार का पता लगाने लागू किया जाना चाहिए. करोड़ 2 + तेज और इसके axonal ट्रांस हालांकिपोर्ट पहले से ही उच्च dosages में retino-tectal प्रक्षेपण के साथ कोई अतिरिक्त सीएनआर वृद्धि प्रदान करने, इस प्रकार, 15 nmol में संतृप्त कर रहे हैं, अत्यधिक पूरकता अनबाउंड इस प्रकार करोड़ 2 + और ​​चांदी वर्षा के लिए सुलभ इसे प्रस्तुत मुक्त, प्रोटीन की उपलब्धता बढ़ सकता है. धुंधला संवेदनशीलता में भविष्य का शोधन एक परिभाषित ऊतकीय क्षेत्र के भीतर करोड़ 2 + संवर्धन के सेलुलर स्थान के साथ विशिष्ट सीएनएस अनुमानों के MEMRI आधारित सीएनआर मूल्यों के संबंध अनुमति देगा. इस तरह की क्षमता भी दृश्य प्रक्षेपण के बाहर अन्य सीएनएस क्षेत्रों में करोड़ 2 + वितरण के लक्षण वर्णन और मात्रा का ठहराव के लिए उपयोगी हो सकता है. इसी तरह, Mn 2 + हिप्पोकैम्पस दलदल का फाइबर 26 के अध: पतन और उत्थान कल्पना करने के लिए एक kainate विषाक्तता मॉडल में नियोजित किया गया है.

Mn 2 + वोल्टेज निर्भर कैल्शियम चैनल द्वारा लिया जाता है और intracellularly सक्रिय axonal परिवहन, द्वारा वितरित किया जाता है, जो सीएn colchicine उपचार 25,27 से अवरुद्ध हो. 2 MnCl की intraperitoneal खुराक प्राप्त चूहों पर दृश्य उत्तेजना प्रयोगों भीतरी और, विशेष रूप से, बाहरी रेटिना 28 में एक वृद्धि बढ़ाने के संकेत से पता चला है. इस प्रकार, तमोनुकूलन आगे इस प्रकार दृश्य उत्तेजना 28 को तेज रेटिना करोड़ 2 + की संवेदनशीलता का संकेत है, केवल कमरे की बत्ती स्थिति से अवगत कराया चूहों की तुलना में बाहरी रेटिना परतों में संकेत तीव्रता उठाती है. इसी तरह, हम ivit करोड़ 2 + आवेदन के बाद दृश्य उत्तेजना के संपर्क में चूहों की तुलना में अंधेरा अनुकूलित चूहों के रेटिना में बढ़ाया संकेत तीव्रता पाते हैं. इस फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में एक सतत अंधेरे वर्तमान की रेटिना और पीढ़ी के विशिष्ट electrophysiological गुणों से संबंधित हो सकता है. Photoreceptors के बाहरी क्षेत्रों में सीए 2 + आमद काफी अंधेरा वर्तमान के संविधान का योगदान करने के बाद से, उनकी पीढ़ी के साथ हो सकता हैद्वारा अंधेरे के तहत फोटोरिसेप्टर सेल परत में करोड़ 2 + सह तेज बढ़ाया. इसके विपरीत, प्रकाश उत्तेजना अंधेरे वर्तमान कम कर देता है और फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं 29 की hyperpolarization का कारण बनता है. इस प्रकार, समग्र करोड़ 2 + तेज प्रकाश परिस्थितियों में कम किया जा सकता है.

MEMRI की विश्वसनीय उपयोग के लिए, यह और अधिक स्पष्ट करोड़ 2 + दृश्य प्रक्षेपण या भी अपने पूरे विस्तार के अन्य भागों के साथ बढ़ाने के संकेत को परिवर्तित कर देता काले अनुकूलित रेटिना में तेज है कि क्या स्पष्ट करना जरूरी है. मस्तिष्क नेटवर्क की MEMRI संकेत तीव्रता में उत्तेजना पर निर्भर परिवर्तन intraperitoneal करोड़ 2 + आवेदन 30 के बाद ध्वनिक प्रणाली के लिए प्रदर्शन किया गया है. द्वारा यू एट अल. इस अध्ययन में चूहों एमआर स्कैन और अवर colliculi के टी 1 भारित बढ़ाने के संकेत बाद में जांच की गई पहले चर शोर आवृत्तियों से अवगत कराया गया. ध्वनिक उत्तेजना significan पाया गयाTLY इस प्रकार गतिविधि पर निर्भर करोड़ 2 + संचय 30 की fMRI तरह चरित्र exemplifying, एक tonotopic प्रतिनिधित्व में MEMRI संकेत तीव्रता में वृद्धि. इसके विपरीत, हमारे प्रयोगात्मक LGN में करोड़ 2 + संचय की स्थापना की और में अनुसूचित जाति दृश्य उत्तेजना की स्वतंत्र प्रकट होता है. हालांकि, संवेदी ब्रेन मैपिंग के प्रयास में इस तरह के मतभेदों यू एट अल 30 से इस्तेमाल किया उच्च क्षेत्र 7 टी स्कैनर की तुलना में कम चुंबकीय क्षेत्र और हमारे 3 टी स्कैनर का पता लगाने के सीमित सीमा से पैदा हो सकता है.

तिथि करने के लिए, यह हद biophysical पैरामीटर अग्रगामी axonal करोड़ 2 + के परिवहन और कैसे MEMRI बिजली की गतिविधि के लिए एक संकेत के रूप में सेवा कर सकता है को प्रभावित करने के लिए क्या ज्ञात नहीं है. फिर भी, यह RGCs द्वारा Mn 2 + प्रसारण स्वतंत्र रूप से द्विध्रुवी कोशिकाओं से प्राप्त प्रकाश विशिष्ट उत्तेजना और बिजली के इनपुट के कम से कम हिस्से में होता है, जो दिखाई देता है. वैकल्पिक रूप से, बिजली एक का शुद्ध प्रभावretino-tectal प्रक्षेपण के भीतर ctivity अंधेरे जिम्मेदार 'बंद RGCs' की बिजली की उत्तेजना और 'पर RGCs' प्रकाश उत्तरदायी का परिणाम हो सकता है. इस तरह की एक व्याख्या retino-tectal प्रक्षेपण के साथ करोड़ 2 + परिवहन ऐसी रेटिना अध: पतन 11 पैदा Pde6b जीन की RD1 उत्परिवर्तन ले कि CBA चूहों के रूप में गरीब दृष्टि के साथ माउस उपभेदों में बिगड़ा नहीं है कि खोजने के द्वारा समर्थित है. जंगली प्रकार से देखे और CBA चूहों पर एक गतिज अध्ययन में, तुलनीय परिवहन दर (2.5 घंटे के बाद इंजेक्शन पर) प्रारंभिक बाढ़ चरण के दौरान और LGN और अनुसूचित जाति के 11 में (24 घंटे में) अंतिम संकेत बढ़ाने के लिए मनाया गया.

साथ में ले ली, इन टिप्पणियों MEMRI, जैसे, दृश्य प्रणाली के यहाँ उदाहरण के रूप में, बल्कि बिजली की गतिविधि के लिए की तुलना में संरचनात्मक अखंडता और चयापचय स्थिरता के लिए एक मूल्यवान उपाय का प्रतिनिधित्व करता है कि इस धारणा का समर्थन है. व्यावहारिक रूप से, मालूम होता हैप्रकाश जोखिम से मस्तिष्क LGN और अनुसूचित जाति में संकेत वृद्धि की तालिका स्वतंत्रता रोशनी के विषय में विशेष देखभाल के बिना मजबूत हैंडलिंग और पशुओं के आवास के लिए अनुमति देता है. दूसरी ओर, रेटिना बढ़ाने के संकेत पर ध्यान केंद्रित है कि MEMRI अध्ययन के लिए, यह पिछले स्कैन करने के लिए कसकर नियंत्रित प्रकाश परिस्थितियों में पशुओं को रखने के लिए आवश्यक है.

करोड़ 2 + axonal परिवहन दरों और बाद MEMRI संकेत वृद्धि को प्रभावित करने वाले शारीरिक मापदंड के अलावा, शरीर के तापमान की स्थिरता विशेष महत्व का हो सकता है. इस संवर्धन काफी 30 डिग्री सेल्सियस के लिए शरीर के तापमान के एक अस्थायी कमी पर कम हो पाया था जहां मस्तिष्क में प्राथमिक घ्राण प्रक्षेपण लक्ष्य की वृद्धि के लिए intranasal करोड़ 2 + पर अध्ययन ने संकेत दिया है सामान्य शरीर के तापमान 27 के तहत वृद्धि संकेत की तुलना में. इसलिए, शरीर के तापमान से पहले और एमआर के दौरान निगरानी और समायोजित किया जाना चाहिए करने के लिए पी न केवल स्कैन करता है'जानवरों के स्वास्थ्य rotect, बल्कि करोड़ 2 + प्रचार के शारीरिक मापदंड सामान्य करने के लिए.

Pathophysiological परिवर्तन और चयापचय impairments करोड़ 2 +, प्रक्षेपण केंद्रों में संकेत वृद्धि की axonal परिवहन प्रभावकारिता को प्रभावित के बाद से, जैसे, LGN और अनुसूचित जाति, संरचनात्मक अखंडता और इस मार्ग के कार्यात्मक गतिविधि के लिए एक उपाय के रूप में सेवा कर सकते हैं. यहाँ, हम पर अध: पतन की दो अलग अलग परिस्थितियों के वर्तमान और thalamic और मध्यमस्तिष्क केन्द्रों में करोड़ 2 + प्रसार और संवर्धन axonal अखंडता के एक समारोह के रूप में बदलता है कि उदाहरण देकर स्पष्ट करना. P50 को उत्परिवर्ती में धीमी axonal अध: पतन, whilst प्रासंगिक axonal उत्थान की कमी की वजह से 4 सप्ताह के भीतर ठीक नहीं है जो तुरंत चोट के बाद एक कुल संकेत हानि, में तीव्र पर चोट के परिणाम LGN में कम सीएनआर मूल्यों से परिलक्षित होता है. अनुदैर्ध्य इमेजिंग की संभावना को देखते हुए MEMRI के इस आवेदन मूल्यवान च हो सकता हैया की postlesional विकास प्रतिक्रियाओं की निगरानी और RGCs को proregenerative आनुवंशिक या औषधीय उपायों की जांच के लिए अनुमति देते हैं.

इसके अतिरिक्त, हम पुरानी axonal अध: पतन की प्रक्रिया के साथ जुड़े रहे हैं बढ़ाने के संकेत में क्रमिक दोष का पता लगाने के लिए एक बेहद संवेदनशील तरीके के रूप में MEMRI प्रस्तुत करते हैं. प्रतिलेखन कारक NF-κB दृश्य प्रणाली 19 भीतर NF-κB प्रदर्शन उम्र पर निर्भर neuronal सेल नुकसान और axonal अध: पतन की P50 सबयूनिट के विलोपन के साथ neuronal रखरखाव और चूहों में शामिल है. ऊतकीय और इलेक्ट्रॉन के अलावा सूक्ष्म retino-tectal प्रक्षेपण के MEMRI इन चूहों में प्ररूपी परिवर्तन की पहचान करने में सक्षम है, का विश्लेषण करती है. Ivit करोड़ 2 + अनुप्रयोग निम्नलिखित धारावाहिक टी 1 भारित एमआर छवियों का अधिग्रहण करके, हम इन P50 में दृश्य मार्ग के किनारे एक बस में देरी करोड़ 2 + परिवहन से कम एक समग्र प्रतिष्ठितको चूहों. इस प्रकार, एक एकल करोड़ 2 + आवेदन के बाद MEMRI द्वारा दोहराए डाटा अधिग्रहण उपलब्ध आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की अमूल्य पूल में axonal परिवहन कैनेटीक्स और neurophysiological परिवर्तन की परिभाषा में सक्षम बनाता है. वर्तमान में, MEMRI के कई संशोधनों मानव में नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए इस तकनीक को सुरक्षित बनाने के लिए लक्ष्य जांच के अधीन हैं. इंजेक्शन ivit के लिए एक विकल्प का गठन किया है, जो उच्च नैदानिक ​​प्रासंगिकता का एक आशाजनक दृष्टिकोण, आई ड्रॉप के रूप करोड़ 2 + का वितरण है. छवियों को एक 4.7 टी जानवर स्कैनर 31 पर हासिल किया गया है जब इस प्रकार, 1 एम 2 MnCl के सामयिक प्रशासन अनुसूचित जाति में 20% की एक महत्वपूर्ण बढ़ाने के संकेत मिले. विधि रेटिना ischemia के 31 निम्नलिखित अध: पतन पर व्यापक पता लगाने में सक्षम था, और repetitively मासिक अंतराल 32 में लागू जब लागू एकाग्रता सुरक्षित साबित कर दिया. करोड़ 2 + के अपेक्षाकृत उच्च neurotoxicity को देखते हुए जैसे, नैदानिक ​​प्रासंगिक MEMRI अनुप्रयोगों का समर्थन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा.

संक्षेप में, हमारे अध्ययन MEMRI इस प्रकार दृश्य प्रणाली की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए ऑटोमेटिक कार्यों को विस्तार देने, चूहों में retino-tectal circuitries अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है कि यह दर्शाता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

एके Velux फाउंडेशन द्वारा समर्थित है Oppenheim फाउंडेशन और आरएच द्वारा समर्थित है. हम ऊतकीय समर्थन के लिए तकनीकी और लालकृष्ण Buder के लिए मैं KRUMBEIN धन्यवाद, और Timm धुंधला पर तकनीकी सलाह के लिए जे गोल्डश्मिट (तंत्रिका जीव विज्ञान, मैगडेबर्ग, जर्मनी के लिए लाइबनिट्स संस्थान).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M1787 MEMRI contrast reagent
Conjuncain Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 7617666 0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 3820927 3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol Jenapharm, Jena, Germany PZN 3524531
Chloral hydrate  Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany C8383 420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe  Hamilton Company, Reno, NV, USA 7634-01 SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN) Hamilton Company, Reno, NV, USA 207434/00 removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000 Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 6502 tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O) Merck, Darmstadt, Germany 106346 for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O) Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany 208043
Gum arabic Roth, Arlesheim, Switzerland 4159 for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2) Roth, Arlesheim, Switzerland 3586
Citric acid (C6H8O7) Roth, Arlesheim, Switzerland 6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O) Merck, Darmstadt, Germany 106448
Silver nitrate (AgNO3) Roth, Arlesheim, Switzerland 7908

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References

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