בהדמית vivo של יושרה סיבי עצב הראייה על ידי contrast-enhanced MRI בעכברים

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

סרטון זה מדגים שיטה, באמצעות סורק T קליני 3, לMR הדמיה משופר לעומת זאת, של ההשלכה החזותית העכבר הנאיבית ובמחקרי vivo חוזר על עצמו ואורך של ניוון עצב ראייה קשור עם פציעה למחוץ עצב ראייה חריפה וניוון עצב ראייה כרוני ב עכברים עקום החוצה (p50 KO).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fischer, S., Engelmann, C., Herrmann, K. H., Reichenbach, J. R., Witte, O. W., Weih, F., Kretz, A., Haenold, R. In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51274, doi:10.3791/51274 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מערכת הראייה של המכרסמים כוללת תאי רשתית גנגליון והאקסונים שלהם היוצרים את עצב הראייה להיכנס למרכזי thalamic והמוח התיכונים, ותחזיות postsynaptic לקליפת המוח הראייתית. בהתבסס על המבנה שלה שונה אנטומיים ונגישות נוחה, זה הפך את המבנה המועדף ללימודים על הישרדות עצבית, התחדשות אקסון ופלסטיות הסינפטית. הפיתוחים אחרונים בתחום ההדמיה MR אפשרו להדמיה vivo של חלק retino-tectal של היטל זה באמצעות שיפור מנגן בתיווך ניגוד (ממר"י). כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממר"י להמחשה של ההשלכה החזותית בעכברים, שבו החלטות (200 מיקרומטר) 3 יכולות להיות מושגות באמצעות 3 סורקי טסלה משותפים. אנו מדגימים כיצד הזרקת זגוגית של מינון יחיד של 15 nmol MnCl 2 מובילה לשיפור רווי של ההקרנה ללא פגע בתוך 24 שעות. עם יוצא מן הכלל של הרשתית, שינויים בעוצמת אות הם באופן עצמאישקע של גירוי חזותי בקנה אחד או הזדקנות פיזיולוגית. בנוסף, אנו ליישם את טכניקה לאורכים לפקח ניוון אקסון בתגובה לפציעת עצב ראייה חריפה, הפרדיגמה שבי Mn 2 + תחבורת מעצרים לחלוטין באתר הנגע. לעומת זאת, תחבורה + פעילה Mn 2 היא כמותית יחסי לקיומה, המספר, ופעילות חשמלית של סיבי האקסון. לניתוח מסוג זה, אנו מדגימים Mn 2 + קינטיקה תחבורה בדרך החזותית במודל של עכברים הטרנסגניים (p50 NF-κB KO) בו מוצגות ניוון ספונטני של חושי, כולל חזותיות, תחזיות. בעכברים אלו, ממר"י מציין מופחת אך לא עיכב Mn 2 + הובלה בהשוואה לעכברי סוג בר, ובכך חושפים את הסימנים של ליקויים מבניים ו / או תפקודיים על ידי מוטציות NF-κB.

לסיכום, ממר"י מגשר בנוחות במבחני vivo ולפרסם היסטולוגיה מורטם לcharacterizatiעל יושרה סיבי עצב והפעילות. זה שימושי מאוד עבור מחקרים ארוכי טווח על ניוון אקסון והתחדשות, וחקירות של עכברים שעברו מוטציה לפנוטיפים אמיתיים או מושרה.

Introduction

בהתבסס על מבנה נוירו אנטומיים החיובי שלה מערכת הראייה המכרסם מציעה אפשרויות ייחודיות כדי להעריך תרכובות תרופתי ויכולתם לתווך neuroprotection 1 או השפעות פרו משובי 2,3. יתר על כן, היא מאפשרת מחקרים על המאפיינים הפונקציונליים ונוירו האנטומי של מוטנטים עכבר, כפי שהודגם לאחרונה לעכברים חסרים את חלבון פיגומי presynaptic 4 בסון. יתר על כן, מגוון רחב של כלים משלימים מקנה נוסף שמציעה של תאים ברשתית גנגליון (RGC) ומספרי האקסון RGC, כמו גם פעילות RGC, למשל, על ידי electroretinography ובדיקות התנהגותיות, והנחישות של שחלופים בקליפת המוח על ידי הדמיה אופטית של אותות פנימיים. ההתפתחויות טכניות האחרונות במיקרוסקופ לייזר תאפשר בהדמיה באתרו של התחדשות RGC ידי דימות פלואורסצנטי רקמות העמוקה בדגימות הר שלמות של עצב ראייה (ON) ומוח. בhistolog זהגישת iCal, סליקת רקמת tetrahydrofuran מבוססת בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון האור מאפשרת רזולוציה של סיבים יחיד שמחדש להיכנס לON deafferented והדרכים אופטיות 5. בעוד טכניקות כזה עשויות להיות מעולה ברזולוציה וקביעת דפוסי צמיחה, הם לא יאפשר לניתוחים חוזרים ואורכים של אירועי צמיחה בודדים, שבעיקר הם רצויים להעריך את התהליך של התחדשות לטווח ארוך.

MRI ניגודיות משופרת כבר מועסק להדמיה פולשנית המינימלית של הקרנת retino-tectal בעכברים ובחולדות 6,7. זו יכולה להיות מושגת על ידי משלוח תוך עיני ישיר של יוני פאראמגנטיים (למשל, Mn 2 +) לתאי רשתית. כאנלוגי סידן, Mn 2 + הוא שולב somata RGC דרך ערוצי סידן תלוי מתח ומועברים באופן פעיל לאורך שלד תא אקסון של ON שלם ומערכת ראייה. בזמן שהוא מצטבר בגרעין המוחשל ההשלכה החזותית, כלומר הגרעין לרוחב הברכיתיים (LGN) וcolliculus מעולה (SC), התפשטות transsynaptic לקליפת הראייה העיקרית מופיעה זניחה 8,9, למרות שהיא עשויה להתרחש 10,11. תחת רצף MR, פאראמגנטיים Mn 2 + מרחיב ניגוד MR בעיקר על ידי קיצור T ספין סריג זמן רגיעה 1 12. כגון Mn 2 + משופר MRI (ממר"י) כבר מיושם בהצלחה במחקרים שונים נוירו אנטומיות ותפקודיים של חולדות, כוללים ההערכה של התחדשות אקסון והתנוונות לאחר פציעת ON 13,14, המיפוי האנטומי המדויק של 15 הקרנת retino-tectal , כמו גם קביעת מאפייני תחבורת אקסון לאחר טיפול תרופתי 16. החידודים אחרונים במינון, רעיל, וקינטיקה של פרוטוקולי MRI עצביים Mn 2 ספיגות והובלה +, כמו גם שיפור בהרחיבו את היישום שלה ללימודים במהונדסיםעכברים 9 באמצעות 3 סורקי טסלה בשימוש נפוץ בפרקטיקה קלינית 17.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממר"י מתאים לאורכים בתחום ההדמיה vivo של הקרנת retino-tectal העכבר ומדגימים את תחולתה על ידי הערכת Mn 2 + שיפור אות תלוי בתנאי ניוון מוחיים נאיביים ושונים. הפרוטוקול שלנו שם דגש ספציפי על רכישת נתונים MR בשדה מתון 3 T מגנטי שהוא בדרך כלל נגיש יותר מסורקי חיה ייעודיים. בעכברים נאיביים, אנו ממחישים כיצד עוצמת אות בדרכי ספציפיות יכולה להיות משמעותי וreproducibly להיות מוגבר לאחר הזגוגית (ivit) Mn 2 + יישום. כמותית, Mn 2 + התפשטות לאורך ההקרנה החזותית מתרחשת באופן עצמאי של התהליך הנורמלי ההזדקנות (נמדד בין עכברים בן 3 ו26 חודש) וההגדלה היא עקשן לגירוי ויזואלי והסתגלות לחשכה. לעומת זאת, Mn 18 כמו גם בעכברים עקום החוצה nfkb1 (p50 KO) הסובל ממות RGC אפופטוטיים ספונטני ועל ניוון 19. כך, בהרחבה לניתוח היסטולוגית קונבנציונלי, ניתוח ממר"י אורך של בעלי חיים בודדים מאפשר אפיון של קינטיקה הייחודית של תהליכי ניוון עצבי. זה צריך להיות שימושי עבור מחקרים על neuroprotection והתחדשות אקסון קשורים התערבויות תרופתיים או גנטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההתערבויות בבעלי החיים בוצעו בהתאם לאמנה האירופית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בחי מעבדה והצהרת ארוו לשימוש בבעלים חיים ברפואת עיניים וחזון מחקר. כל הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. ההליך של פגיעה בעכברים מתואר במקומות אחרים 9.

הזרקת 1. מנגן הזגוגית

  1. בצע HR Mn 2 + הזרקת 24 לפני MR לסרוק בעזרת עוזרו. להרדים את בעלי החיים על ידי זריקת intraperitoneal של פתרון 5% זקוקים לסם (420-450 מ"ג / קילוגרם משקל גוף בסטרילי PBS). להרדמה מקומית נוספת, להחיל טיפה אחת של conjuncain הנוזלי (0.4% hydrochloride oxybuprocaine) לקרנית לפני ניקור עיניים. להזריק 15 nmol Mn 2 + לכל עין להכין פתרון 2 מ"מ MnCl 7.5, למשל, על ידי דילול 1 ליטר של 1 פתרון 2 מניות M MnCl ב132 LH 2 </ Sub> O. טען 5 μl של הפתרון הסופי לתוך מזרק 5 μl המילטון מחובר למחט 34 G רכזת קטנה נשלפת (מחט RN).
  2. כאשר מתחיל עם עין ימין, מקם את העכבר צדדי עזב תחת מיקרוסקופ משקפת ועדינות פתוחה ולתקן את עין ימין בין האגודל והאצבע של יד שמאל. להרים את המזרק עם יד הימין שלך ולאחוז במחט הקרובה לקצה. ללנקב atraumatic של הנורה העין, הכנס בזהירות את המחט לתוך הגוף הזגוגי בהיקף infero-זמני כ 1 מ"מ דיסטלי לימבוס, ובכך חוסכים כלי scleral.
  3. בשלב בא, העוזר חל לאט הנפח הכולל של 2 μl תוך שליטה על הסולם של מזרק המילטון. במהלך הליך זה, לעקוב אחר מיקום מחט אופטימלי מתחת למיקרוסקופ ולמנוע ניקור של העדשה או שפיכה של הנוזל. שמור את המחט באופן סטטי מוכנסת ל30 שניות נוספות, ואז למשוך את זה לאט כדי למזער את הנוזלדליפה מאתר ההזרקה.
  4. לאורך כל ההליך, יש לנקוט באמצעי זהירות מיוחדת כדי למנוע לחץ בעין. כמו כן, להימנע מניסיונות קשים או רבים כדי לנקב את הנורה העין. מאז Mn 2 ספיגים לRGCs והובלה לאורך ON + כבר רווי ב15 nmol MnCl 2, זה ממזער וריאציות אות על ידי כרכי הזרקה מעט לא מדויקים. להגברת אות דו צדדית של ההשלכה החזותית, לחזור על הליך ההזרקה לעין השמאל.
  5. החל המכיל ofloxacin (3 מ"ג / מיליליטר) טיפות עיניים ומשחה המכיל פנטנול פעם אחת לאחר ההליך כדי למנוע זיהומים וייבוש של העין עיניות. להחזיר את העכברים לכלובים שלהם בתנאי דיור רגילים עד לתחילת סריקת MR.

2. הכנת בעלי החיים לבדיקת MRI

  1. להרדים את העכבר על ידי ממשל של תערובת גז isoflurane / חמצן 2% / 98%. הר את העכבר על בעל עכבר בעמדה כמעט אופקית, untwisted. InsERT אותו לסליל MR, אשר לאחר מכן מותאם בתוך סורק MRI. לפקח על נשימה וקצב לב על ידי מערכות מתאימות. לפרטים טכניים, ראה הרמן ואח' 20.
  2. במהלך בדיקת MRI, הרדמה אספקה ​​על ידי ניפוח מתמשך של תחילה 1.5% / 98.5% תערובת גז isoflurane / חמצן באמצעות מאייד מחובר למחזיק ראש העכבר על ידי צינור משולב. במהלך הסריקה, להתאים את העומק של הרדמה על פי הפרמטרים החיוניים שנרשמו (כלומר לכוון לקצב נשימה יציב של כ -40 נשימות לדקה). שימוש במכשיר חימום לשמור על טמפרטורת פני השטח הגוף היציבה בין 35 ו37 מעלות צלזיוס, כפי שהיא נמדדת על ידי חיישן תרמי מוצב באתר הבטן של העכבר. לפרטים טכניים, ראה הרמן ואח' 17.
  3. לאחר הסריקה, לשחרר את העכבר מהבעל ולספק לך חמצן טהור כדי להאיץ את ההתאוששות מן ההרדמה. בנוסף, לשמור על טמפרטורת הגוף יציב על ידי שימושמקור חימום אור אדום.

3. MRI פרוטוקול

  1. פרוטוקול תוקף לסורק טסלה 3 מצוידים בסליל ייעודי, יחס אות לרעש יעיל, קטן בבעלי חיים (סליל יץ מקוטב ליניארי) בתחום יעיל מבט של 35 מ"מ × 38 קוטר מ"מ. להפעיל את הסליל במצב שידור-מקבל.
  2. עם בעלי החיים במצב הסופי שלו, להתאים את המנגינה והתאמה של הסליל בעזרת מנתח תדר. באופן ידני להתאים את מתח ייחוס משדר וזרמי הפחית כדי לייעל את ההומוגניות תמונה ואיכות.
  3. רכישת T 1 תמונות 2D TSE משוקללות עם רזולוציה של 0.5 מ"מ × 0.5 מ"מ × 2 מ"מ בתצוגת sagittal ורוחבי לתכנון. שימוש בסריקות MR מתכננת, לרכוש את תמונות MEMR בכיוון מדידת העטרה, לסובב כדי להיות מקביל לראש של החיה עם קידוד שלב לאורך הכיוון של השמאל וימין. כדי למזער את זמן רכישה, להשתמש בשדה מלבני של תצוגה מותאמת לממדי ראש בפועל. מעסיק רצף מפונק FLASH 3D (VIBE 3D) באמצעות הפרמטרים הבאים: מטריצת בסיס 256, שדה הראייה 54 מ"מ × 50.65 מ"מ × 14.08 מ"מ, באמצעות 93.8% שדה מלבני של נוף בכיוון לקודד שלב, ו128 פרוסות 0.11 מ"מ עובי פרוס עם רזולוציה הפרוסה מוגדר 61%.
  4. הפעל את אינטרפולציה במטוס כדי ליצור תמונות סופיות עם 512 × 480 × 128, מתן ברזולוציה אפקטיבית של 0.21 מ"מ × 0.21 מ"מ × 0.18 מ"מ (0.1 מ"מ × 0.1 מ"מ × 0.09 מ"מ אינטרפולציה), זמן הד T E = 6.51 אלפיות שנייה, R T זמן החזרה = 16 אלפיות = זווית, רוחב פס 160 הרץ / px, להעיף = 22 °. תחול שני ממוצעים ושלוש חזרות כדי להשיג זמן רכישה כולל (T) של כ 30 דקות.

4. MRI ניתוח נתונים

  1. לנתח את הנתונים באמצעות fastView syngo תוכנה. להגברת אות כמותיים, בחר אזורים מוגדרים oעניין F בהקלטות MRI מישוריים 2D ולקבוע עוצמות אות (SI) של המבנה המשופר (SI ממר"י), רקע רקמה (backgr SI), וסטיית התקן של הרעש (N-SD). במידת צורך, השתמש באטלס מוח עכבר כדי להקל על התמצאות נוירו אנטומי לLGN ומבני SC. לחשב את יחס ניגודיות לרעש (CNR) באמצעות הנוסחה:
  2. CNR = (SI ממר"י - backgr SI) / SD N
  3. לכמת שלוש תמונות רצופות לחישוב CNR ממוצע עבור כל דגימה. בחיות שהוחדרו בילטרלי, לנתח כל חצי הכדור באופן עצמאי.
  4. לתיאור של תמונות אופקיים, העטרה ועל sagittal, לחשב שחזורי multiplanar מערכת נתוני 3D MRI המקורית. עיבוד תמונות אלה אינן מומלצים לניתוח כמוני. כדי ליצור שחזורי אנימציה 3D (תחזיות בעוצמה מקסימלית, MIPS) של retino-Tectal הקרנה, להשתמש במודול תוכנה שלאחר עיבוד אנגיוגרפיה.

5. Mn 2 + Autometallography (TIMM מכתים)

  1. עבור מכתים TIMM של 2 מבנים במוח + לייחס Mn הבא ממר"י, להזריק מינון של 15-150 nmol Mn 2 + ivit 24 שעות לפני הדמיה.
  2. לאחר MR סריקה, ינקב חיות עם 30 מיליליטר 0.325% קרים כקרח S Na 2 ב PBS (pH 7.4). לנתח רשתיות ודגימות הקפאה בסעיף קפוא.
  3. לחתוך קטעים רציפים, קו המשווה של 15 עובי מיקרומטר על cryotome.
  4. לבצע מכתים TIMM 21 בהעדר מקבע וcryoprotection פי Angenstein et 22 אל.

6. ניתוח סטטיסטי

ביצוע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות מבחן t של הסטודנט להשוואות אחד, ואחריו post hoc ANOVA. הנתונים מוצגים כשגיאה ממוצעת ± סטנדרטי. מספרי N בודדיםניתנו בנפרד לכל ניסוי. תוצאות להגיע P ≤ 0.05 נחשבות משמעותיות מבחינה סטטיסטית (P ≤ 0.05, *, P ≤ 0.01, **, P ≤ 0.001, ***).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

היכולת של טכניקת הדמיה זה להעריך את החיוניות ואת הפונקציונליות של ההשלכה החזותית מדויק מסתמכת על יישום מדויק של Mn 2 + במינון רעיל לגוף הזגוגי וספיגתו על ידי RGCs. הנחה גדולה זה נבדק בתרשים 1, שבו Mn 2 + ספיגה ספציפית שכבה מודגמת על ידי autometallography (מכתים TIMM) 21. סעיפי רשתית נותחו ב24 שעות לאחר יישום ivit של או 15 nmol או 150 nmol Mn 2 +, או PBS כבקרה. בנקודה זו בזמן, Mn 2 רשתיות + הזריקו להראות שיפור אות מרבי בT 1 משוקלל MRI (N = 3; קווים מקווקווים), ואילו PBS הוזרק רשתית אינה משופרת באות (N = 3; קו מקווקו) (איור 1 , עזב את הפנל). שים לב לשיפור אות hyperintensive בעיניים הזריקו 150 nmol. לעומת זאת, אזורי nonenhanced המוח (כוכביות) מראים עוצמות אות רקע דומות לכל שיתוףעליות 2 + יישום nditions (צבע ירוק). Ivit Mn מכתים TIMM כולל במיוחד בשכבת RGC ושכבת סיבי עצב (NFL) (איור 1, ריבועי מוגדלים בפנל באמצע), אשר אושר על ידי חקירה של somata RGC הפרט הבא H & E שיתוף תיוג (פנל מימין).

עבור in vivo הדמיה של הקרנת retino-tectal העכבר, זה קריטי כדי לבחור פרוטוקול ממר"י מיוחד עכבר שבו הפרמטרים התפעוליים יחד עם הציוד, כפי שמודגמים באיור 2, מותאמים לנתח עכברים בשדה 3 T. החלת התקנה כגון סורק, העבודה הקודמת שלנו גילתה כי לרזולוציית תמונה במערכת העצבים המרכזית סליל ראש העכברוש עדיף על סליל ייעודי עכבר כל גוף 17. כדי לתקן את הראש העכברי ולהתאים את מיקומו בתוך סליל העכברוש כמו שצריך, אנחנו משתמשים בעריסה וצינור חרוטי עם בר ביס עשוי מפלסטיק, אשר שניהם downscaled לפגוש את ממדי הגוףשל עכברים (2A דמויות, ב '). כאשר תמונות נרכשות על מטריצה ​​משוקללת שוכל T 1 יישום רצפי הד שיפוע 3D, ניתן לצפות בדור של תמונות ברזולוציה גבוהה של (200 מיקרומטר) 3 בתוך 35 דקות של זמן רכישה. אנו ממליצים בחום הניטור המתמיד של תפקידים חיוניים במהלך הסריקה. התאמה של הרדמה יחד עם חמצון postimaging ובקרת טמפרטורת גוף מאיצה באופן משמעותי את זמן החלמה ומבטיחה שיעורי הישרדות של% על 100. אמצעי זהירות טכני כאלה הם חיוניים כדי להבטיח כי כל הדור יהיה לקיים MRI אורכי וחוזר על עצמו.

בכל מחקר, רק Mn 2 + במינון רעיל של 15 nmol אמור לשמש ליישום ivit 9, וזה מספיק כדי לשפר באופן בולט CNRS ברשתית, ON, ודרכים אופטיות עד LGN תוך המוחי presynaptic וSC. ערכי CNR מחושבים הטוב ביותר משוכל עבה 200 מיקרומטרפרוסות המתקבלות מערכות נתונים MRI מקוריות על ידי reslicing המקורי איזוטרופיים 3D הנפח. איור 3 א מציג דוגמא לנחישות CNR המדויקת לLGN המשופר, שבו שלושה אזורים של עניין נבחרו בכל תמונה ל( 1) אזור משופר אותות (SI ממר"י ), (2) רקמה הלא affine המוח (backgr SI), וכן (3) רעש רקע (N-SD). שיפור האות מרחבית expectable לכמת לאורך מכלול השלכה חזותית בודדת מוצג באיור 3. הערה העלייה החזקה ההדרגתית של שיפור אות בסעיפי רשתית לאורך מטוס dorsoventral, אשר פסגות בראש עצב הראייה. בנוסף, שים לב לחוסר Mn 2 + התפשטות transsynaptic רלוונטית לשכבות בקליפת המוח בתנאים יושמו הניסיוניים (ירידת אות בקליפת המוח הראייתית). MIPS הוא המחשה מאוד לדמיין את מיצוב 3D של הקרנת retino-tectal בטוטו (סרט 1).ccumulation של Mn 2 + לאורך ההקרנה החזותית נקבע על ידי קינטיקה של ספיגה תאית לRGCs באמצעות מתח תלוי Ca 2 ערוצים + והתחבורה אקסון המהיר שלה, כמו גם על ידי הפינוי הנמוך יחסית מרקמת מטרת 13. על פי המחקרים הקינטית הקודמים שלנו, Mn 2 + שיפור אות תלוי ניתן לאתר מוקדם ככל 6 שעות לאחר הזרקה. זה פסגות נוספות ב24 שעות ויורד חזרה לרמות בסיס בתוך 120 שעות שלאחר הזרקה 9. לכן, על מנת להשיג תוצאות אופטימליות, ממר"י צריך להתבצע 24 שעות לאחר הזרקה, המייצג מחצית מהזמן הדרוש לשיפור חולדות 13.

לאחר שהתווה את העיקרון להגברת הניגודיות של ההשלכה החזותית על ידי ממר"י, אנחנו עוד לתקשר את ההשפעות של שני פרמטרים - גיל מצב וחית אור - שעשוי להשפיע על מדידות כמותיות:

(1) כדי לבדוק fאו הצטברות גירוי תלוי של Mn 2 + במרכזי המוח התיכון, עכברים נשמרו גם בתנאי גירוי אור שהושגו על ידי חשיפת פנס של תדירות מוגדרת (הרץ 5) ועוצמת אור (LED 3 W) או בחושך מוחלט לפני הסריקה ובמהלך 24 שעות של Mn 2 + חשיפה. ניתוח כמותי של שעה CNR 24 לאחר ivit Mn 2 + יישום חושף עלייה משמעותית בעוצמת האות של רשתיות כהות מותאם בהשוואה לתנאי מגורה אור (66.29 ± 3.07 לעומת 54.56 ± 3.08, P ≤ 0.05, N = 7 / 8; איור 3 ג). בהתחשב בשיפוע בשיפור אות בין הרשתית ההיקפית וראש עצב הראייה (ראה איור 3 ב), אנו סמוכים ובטוחים תמיד לנתח מקבילים סעיפי רשתית בתוך כל קבוצות הניסוי. ניתוח תמונה במישור ventrodorsal מתגלה, כצפוי, כי ערכי CNR מוחלטים יורדים בשני התנאים. חשוב לציין, relהבדל אות ative בין רשתיות מותאמות חושך והאור נשאר עיקש (מידע לא מוצג). עם זאת, שיפור אות באזורי ההשלכה של LGN (26.97 ± 1.78 לעומת 26.58 ± 1.05, P = 0.9, N = 7-2) וSC (25.09 ± 1.24 לעומת 26.81 ± 1.55, P = 0.4, N = 7 / 8) הוא שאין להבחין בין סביבות אור וחושך אוויר (איור 3 ג). assay זה מוכיח כי ספיגה של Mn 2 + לשכבות רשתית היא רגישה לחשיפה לאור, ואילו התפשטותה לאורך הקרנת retino-tectal והצטברות באזורי היעד אינה מושפעת על ידי גירוי חזותי החופף. לחלופין, רגישות האות של סורק 3 T עשויה להיות מתחת לסף הגילוי לוריאצית אות בLGN או SC.

(2) כדי לחקור את ההשלכות של הגיל של בעל החיים על שיפור אות ממר"י בנושא של ההקרנה החזותית, נתחנו עכברים בין 3 ל 26 חודשים oגיל ו. ערכי CNR בLGN של עכברים בן 3 חודשים (23.49 ± 1.36, N = 12) אינו שונה מעוצמת האות שנמדדה בעכברים בגיל 7 חודשים (23.90 ± 0.81, P = 0.79, N = 16), 13 חודשים (23.35 ± 1.29, P = 0.94, N = 10) או 26 חודשים (25.10 ± 2.29, P = 0.53, N = 6; איור 3D). כמו כן, את עוצמת האות בSC היא ללא שינוי בין 3 חודשים (19.01 ± 1.20) ו26 חודשים של גיל (16.92 ± 2.18, P = 0.37; איור 3D). למרות עלייה קלה באו לידי ביטוי בערכי CNR של רשתיות ישנות 26 חודש (38.49 ± 3.25), עלייה זו אינה מובהקת בהשוואה בכל הקבוצות (P> 0.05). ניסויים אלה מצביעים על כך ששיפור אות באזורי יעד במוח של ההשלכה החזותית אינו מושפע על ידי גירוי חזותי והזדקנות פיזיולוגית.

בשלב הבא, אנחנו מדגימים את הרגישות של ממר"י כדי לזהות שינויים מבניים of ההקרנה החזותית הנגרמת על ידי axonopathy האקוטי וכרוני. כדי לחקור את זה, מודל של ניוון Wallerian הנגרם על ידי טראומטי על פציעה 18 כמו גם מודל חיה בו מוצגות ניוון מוקדמים, ספונטני של תחזיות חושיות כוללים המסלול החזותי 19 הועסקו:

(1) axonopathy טראומטי הנגרם על ידי פגיעה דלוק על גורם לשבירה של axona fascicles. כתוצאה מכך, תחבורת retino-tectal של Mn 2 + לאורך שלד תא אקסון תהיה חסומה לחלוטין ובר קיימא, כפי שדמיינו ידי הפסד של 2 + אות משופרת Mn מלא בLGN וSC ניתח יום אחד (לא מוצג), שבוע אחד (איור 4 א , קווים מקווקווים), ו -4 שבועות (לא מוצג) לאחר פציעה. כדי להדגים באופן ברור את תכונות MR neuroanatomical והרצופות של פציעה ובלנתח אותם מהמדינה התמימה, הנגע נגרם רק באופן חד צדדי. התוצאה היא Mn 2 + הובלה ללא שינוי על tהוא שולט בצד בניגוד להפרעה נותב בצד של ההתערבות. ניתוח של ערכי CNR באזורי deafferented מאשר את היעדר שיפור אות (לא מוצג) המלא. ניסוי זה ממחיש עוד יותר שממר"י הוא רגיש מאוד באיתור המיקום והחומרה של אתר נגע ידי הערכת אורך של עוצמת האות לאורך ההקרנה לפני ואחרי פציעה (איור 4). בעוד עוצמת האות לאורך ON לפני פציעה נשארת כל הזמן מעל לאות הרקע, יש ירידת temporo מרחבים בעוצמת אות ליום ברמת רקע אחד לאחר פציעת ON.

(2) העבודה הקודמת שלנו הראתה כי Mn 2 + שיפור אות תלוי בLGN מצטמצם ב10 חודשי עכברים ישנים חסרי p50 למקטע NF-κB כאשר נמדדו 24 שעות לאחר הזרקת 9. גילוי זה עם עקביות גבוהה, הנחנו לירידת ערך הכולל בretino-tectal Mn 2 + טרנסנמל, שנגרם ככל הנראה על ידי מספרים מופחתים של RGCs וקשור על נוירופתיה בp50 הזדקנות עכברי KO 19. לחלופין, שיפור האות המופחת עשוי להיות קשור עם ספיגה מושהה עצבית והתפשטות של Mn 2 + מהגוף הזגוגי ולאורך הקרנת פתולוגי. האפשרות האחרונה יכולה להיחקר על ידי ביצוע סריקות MR חוזר על עצמו לאחר יישום יחיד של 15 nmol Mn 2 + ולומד קינטיקה של שיפור אות ברשתית וLGN במוקדם (8 ו24hr) ומאוחר (48 ו72 hr) זמן נקודות. בעכברי KO סוג p50 ופראי, פסגות שיפור אות רשתית בשעה 8 בשיעורים כמעט זהים שיפור (43.52 ± 3.24 ו40.72 ± 2.79, P = 0.6, N = 3-6; איור 4C, משמאל). בעוד שיפור אות נותר גבוה בסוגים פראיים ב24 הודעה שעה הזרקה, זה יורד בעכברי KO p50 (43.38 ± 2.18 לעומת 32.89 ± 1.54, P ≤ 0.01, N = 5-8). במהלך השלבים מאוחרים (48 ו72 שעה), שיפור אות יורד בשני הקבוצות (עם ערכים נמוכים יותר באופן עקבי CNR בעכברים עקום החוצה), ובכך לא כולל Mn עיכב רשתית 2 + ספיגה והתפשטות בעכברי KO p50. תוצאות מקבילים בLGN של עכברי KO p50 לאשר את הרעיון הזה. למרות CNR הוא נמוך באופן משמעותי בין 8 ל 48 לאחר הזרקת שעה (P ≤ 0.05, N = 5-9), קינטיקה של הנחתה אות בעכברי KO p50 מתאימה לזה בעכברי סוג בר (איור 4C, מימין). לפיכך, שיפור אות temporo מרחבים המופחת של היטל retino-tectal נובע מספרי האקסון מופחתים שמקורם אוכלוסיית RGC מוגבלת ולא קינטיקה תחבורה לקויה. אנו מציעים ממר"י להיות כלי רב ערך למסך מוטנטים עכבר גנטיים לליקויי projectional במערכת העצבים המרכזית.

תוכן "עבור: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 1
איור 1. מכתים TIMM של Mn 2 + ספיג בRGCs. תמונות חום המפה מייצגות של T 1 משוקלל MRI (MRI T 1) מראה שיפור אות של העדשה ואת כל היקף הרשתית (קו מקווקו) 24 שעות לאחר יישום ivit של 15 nmol, ושיפור אות Hyper-אינטנסיבי אחרי היישום של 150 nmol Mn 2 + (משמאל). צבעים חמים מייצגים ערכי אות גבוהים יותר מצבעים קרים. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. אמצע / ימין: Mn 2 + ספיגה ידי RGCs לאחר הזרקת ivit של MnCl 2 כפי שזוהה על ידי משקעים כסף באמצעות מכתים TIMM (צבע שחור). סעיפי רשתית ביקורת שטופלו-PBS להפגין מכתים די חלש ובידול מפוזר של שכבת RGC (RGC) (למעלה; N = 3). בהגדלה גבוהה אינה מאפשרת ד. יישום 2 iscrimination של תאים בודדים (ריבועי מוגדלים) Ivit MnCl דיפרנציאלי מגביר צביעת כסף כוללת פני שכבות רשתית, עם ממטרים כסף בולטים במיוחד בשכבת סיבי עצב (NFL), שכבת RGC, ושכבת גרעין פנימית (INL; אמצעי ותחתון , ריבועי מוגדלים; N = 3). Colabeling של TIMM עם H & E מכתימה מאשר עוד שכבה כגון Mn 2 + צבירה ספציפית (פנל מימין). סרגל קנה מידה, סקירה: 50 מיקרומטר, הגדלה: 25 מיקרומטר. IPL, שכבה פנימית plexiform; OPL, שכבת plexiform חיצונית; ONL, שכבה חיצונית גרעינית; הרשתית, אפיתל הפיגמנט ברשתית.

איור 2
איור 2. תצלומים מראים ציוד MRI במיוחד עבור רכישת תמונת MEMR עכבר על סורק 3T קליני. א) מראה את עריסת עכבר מחוייט עם bקיבעון ITE ראש הבר והחיישן לניטור נשימה (כרית לבנה, צינור כחול). ב ') מציג את העכבר בעמדה וקבוע בעריסה. הצינורות לאספקה ​​השמאלית גז ההרדמה. C) מדגים את המיקום של ראש העכבר והעריסה בתוך סליל יץ המקוטב ליניארי הפועל בשידור וקליטת מצב. ד ') מציג את פלטפורמת הסליל מול צינור המיגון ו3 הקליניים T סורק. הצינור המצופה נחושת מספק מיגון נוסף מרעש וחוסם את אות ה-MRI ממזרן המים החמים המבוסס חימום (עטיפה שחורה סביב הצינור). E) מדמיין את ההגדרה של סליל החיה בתוך הנקבובית של סורק 3 T המלאה רק לפני מיצוב הראש של בעלי החיים דווקא בisocenter בתוך הסורק.

איור 3
איור 3. ממר"י של הקרנת retino-tectal הנאיבית בתנאי אור וגיל שונים.) איור של האזור של עניין מיפוי (ROI) בLGN המשופר ורקמת רקע על MRI שוכל הקלטה (משמאל). שיפור אות ספציפי LGN בא לידי ביטוי במצגת מפת החום (מימין). 1 ו 1 ', משמאל ומימין LGN; 2 ו 2 ', רקמת רקע; 3, רעש; P, אחורי; R, נכון. בר סולם:. 100 מיקרומטר ב ') מיפוי מרחבי של שיפור אות לאורך הקרנת retino-tectal יחידה כפי שתקבע מפרוסות תמונת MR החותך שנרכשו במקור על ידי ממר"י. ריבועים מלאים, Mn 2 + שיפור אות תלוי; משולשים פתוחים, אות רקע. R, רשתית; ON, עצב ראייה; OT, בדרכי אופטיות; LGN, גרעין הברכיתיים לרוחב; SC, colliculus מעולה; VC, קליפת מוח הראייתית. עובי פרוס, 200 מיקרומטר. C) גירוי אור מפחית באופן משמעותי שיפור אות ברשתית. Enhancement בLGN וSC אינו תלוי בגירוי ויזואלי. עיגולים מלאים, כהה הסתגלות; חוגים פתוחים, הסתגלות קלה. ד) שיפור אות הוא עצמאי של עלייה בגיל שבין 3 ו26 חודשים.

איור 4
איור 4. ממר"י של הקרנת retino-tectal בתנאים ניווניות. א) ממר"י של עכברים מוזרקים בילטרלי ivit ביצע שבוע לאחר פציעה למחוץ חד צדדי של צד הימין. שחזורי Multiplanar דעות אופקיים, העטרה, ורוחב מתארים היעדר שיפור אות מלא בLGN וSC לאונה נפצעה (קווים מקווקווים). ג, אונה הנגדית; אני, בחצי הכדור ipsilateral. בר סולם:. 1 מ"מ ב ') תמונות MIP וניתוח MRI אורך של שיפור האות המרחבית לאורך ON לפני ויום אחד לאחר פציעה. R, רשתית; ON, עצב ראייה; חץ, אתר נגע. בר סולם:.. ספיגת קינטיקס 0.5 מ"מ C) של שיפור אות תחת ניוון מוחיים הכרוני של ההשלכה החזותית בעכברי KO p50 קדומה (8 שעות) של Mn 2 + לתאי רשתית אינה מושפעת, אבל כבר צמצמה בLGN של p50 עכברי KO. הדמיה חוזרת MR ב24, 48, ו( רק לרשתית) בשעה 72 מראה ירידת אות מתמשכת, אבל קינטיקה דומה של Mn 2 ותחבורה + הצטברות ברשתית וLGN של עכברי KO p50.

סרט 1: אנימציה, מצגת חום מפת 3D של בהקרנת retino-tectal משופר לעומת זאת, באתר MR הדמיה בוצעה 24 שעות לאחר הזרקת ivit דו צדדי של 15 nmol MnCl 2.. הנתונים מוצגים במצב MIP. עובי פרוס, 200 מיקרומטר. <target = "_blank" href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4"> לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ממר"י של מערכת הראייה משתרע טכניקות הנוירוביולוגי קונבנציונליות להערכה פונקציונליות בתנאים נאיביים ופתולוגיים. מלבד לספק תובנה ייחודית על היושרה של מערכת סיבים של מערכת העצבים המרכזית מבודדת, ממר"י ניתן להשלים בקלות עם בדיקות התנהגותיות, למשל, אופטומטריה ומשימות על בסיס מים מבחינה ויזואלית, כדי לחקור את ההשלכות מיידיות של הפרדיגמה נתונה לתפיסה חזותית. זה גם קישורי אלקטרו וחקירות היסטולוגית עם אפיון חזותי פונקציונלי in vivo. הטכניקה היא אמינה לשחזור עם סטיות interindividual קטין בתוך קבוצות זהות מאוד (ראה ברים שגיאה באיורים 3, 4). מסקרן, במינון של 15 nmol, Mn 2 + ספיג והובלת אקסון רוויות תהליכים, כך ששיפור האות מגיע לרמה שלא ניתן להיות מורמת על ידי נוספת Mn 2 + אספקה ​​9. מבחינה מעשיתלהציג, ממזער כגון תגובת מינון אופייני, לפחות במידה מסוימת, תנודות הקשורות להזרקה בשיפור אות. יצוין, כי הנתונים שהוצגו במינון וקינטיקה של Mn 2 + שיפור אות הם ספציפיים לעכברים ושונים מאלה בחולדות, הדורשות כ 10-20x גבוה יותר 2 ומינון + Mn השהיה מוגבר (36 hr) כדי להשיג שיפור לעומת אופטימלי 13,23. בנוסף, השיפור לאורך ההקרנה החזותית נשאר עקבי בין גיל חיה של 3 ו26 חודשים. ממצא זה עולה בקנה אחד עם בדיקות חזותיות המבוצעות על עכברים מזדקנים והעובדה שעכברי C57/B6 לשמור עד 2 שנים של גיל 24 פעילות חזותית נורמלית. למרות שאנחנו לא נתחנו עכברים בודדים אורכים במחקר ההזדקנות, תוצאות קודמות הראו בבירור את הבטיחות של Mn 2 + מינונים מנוהלים שוב ושוב של 15 nmol לחזותי תחזוקה 9, אשר עשוי להיות רצויה במחקרי הזדקנות אורך.

בהתאם לרעיון שMn 2 + הוא שולב RGCs, אנו מראים Mn 2 + ספיג לsomata על ידי צביעת TIMM אשר מסתמכת על משקעים כסף של יונים חופשי מתכת, כפי שמיושם על ידי Angenstein et al. לMn 2 + זיהוי תוך מוחי הבאים היישום המערכתי שלה 22. בעבר, Mn 2 + הפצה תוך מוחית זוהתה על ידי autoradiography 54 Mn 2 + איזוטופ להתוות מעגלים עצביים של העכברים CNS 25, אבל לא ברמה התאית. הנה, מכתים TIMM מאפשר הייחוס של Mn 2 + ספיג לאוכלוסיות שונות של תאים בתוך הרשתית חשופה, שבו אנו מוצאים ממטרים כסף בולטים בRGC ושכבות סיבי עצב. יש לציין כי הפרוטוקול מיושם תוכניות גילוי השתפר ידי מכתים TIMM לאחר היישום של מינון של 150 nmol לעומת 15 nmol Mn 2 +. למרות Mn 2 + ספיג וטרנס אקסוןנמל כבר רווי ב15 nmol, ובכך, המקנה אין עליית CNR נוספת לאורך הקרנת retino-tectal במינונים גבוהים יותר, תוספת מוגזמת עלולה להגדיל את הזמינות של חינם, חלבון מאוגד Mn 2 + ובכך להפוך אותו לנגיש לממטרי כסף. חידודי עתיד ברגישות מכתים יאפשר המתאם של ערכי CNR מבוססי ממר"י של תחזיות CNS ספציפיות עם המיקום הסלולרי של Mn 2 + העשרה בתוך אזור מוגדר היסטולוגית. כגון יכולת יכולה להיות שימושית גם לאפיון והכימות של Mn 2 + הפצה באזורים אחרים מחוץ למערכת העצבים המרכזית ההשלכה החזותית. כמו כן, Mn + 2 כבר מועסק במודל רעילות kainate לדמיין התנוונות והתחדשות של סיבי אזובי היפוקמפוס 26.

Mn 2 + הוא נלקח על ידי תעלות סידן תלוי מתח ומופץ intracellularly בתחבורה אקסון פעיל, אשר can להיות חסום על ידי הטיפול בקולכיצין 25,27. ניסויי גירוי חזותיים על חולדות שקבלו מינון intraperitoneal של MnCl 2 חשפו שיפור אות מוגבר ברשתית הפנימית, ובמיוחד, החיצונית 28. ובכך, הסתגלות כהה עוד יותר מעלה עוצמות אות בשכבות רשתית החיצוניות בהשוואה לחולדות שנחשפו לתנאי חדר אור היחיד, ובכך מצביעה על רגישות של Mn רשתית 2 + ספיג לגירוי ויזואלי 28. בדומה לכך, אנו מוצאים את עוצמת אות משופרת ברשתית של עכברים כהים מותאמים בהשוואה לעכברים שנחשפו לגירוי ויזואלי לאחר ivit Mn 2 + יישום. זה עשוי להיות קשור למאפייני אלקטרו הספציפיים של הרשתית ואת הדור של זרם חושך מתמשך בתאי קולטי אור. מאז Ca 2 + זרם למקטעים חיצוניים של קולטני אור תורם באופן משמעותי לחוקה של הזרם האפל, הדור שלהם עלול להיות מלווהעל ידי שיתוף משופר ספיגה של Mn 2 + לשכבת תאי קולטי אור בחושך. לעומת זאת, גירוי אור מפחית את הזרם האפל וגורם hyperpolarization של תאי קולטי אור 29. וכך, באופן כללי Mn 2 + הספיגה עלולה להצטמצם בתנאי אור.

לשימוש אמין של ממר"י, חשוב לברר אם Mn בולט יותר 2 + ספיג לתוך הרשתית הכהה מותאם משנה שיפור אות לאורך חלקים אחרים של ההשלכה החזותית או אפילו כולו להארכתו. שינויי גירוי תלוי בעוצמת אות ממר"י של רשתות מוחיות הוכחו למערכת אקוסטית לאחר Mn 2 + יישום intraperitoneal 30. במחקר זה על ידי יו et al., חולדות נחשפו לתדרי רעש משתנים לפני סריקות MR וT 1 שיפור אות משוקלל של colliculi הנחותים נחקרו לאחר מכן. גירוי אקוסטי נמצא משמעותיתtly להגדיל את עוצמות אות ממר"י בייצוג tonotopic, ובכך ממחיש את האופי כמו fMRI של פעילות תלויה Mn 2 + הצטברות 30. לעומת זאת, בניסוי שלנו להגדיר את Mn 2 + בהצטברות LGN וSC מופיע עצמאי של גירוי ויזואלי. עם זאת, כגון הבדלים בניסיונות מיפוי המוח חושיים עלולים להתעורר מהשדה המגנטי הנמוכה והסף מוגבל של גילוי שלנו סורק 3 T בהשוואה לסורק T הגבוה שדה 7 בשימוש על ידי יו et 30 אל.

עד כה, לא ידוע למה הפרמטרים biophysical מידה ישפיעו תחבורת אנטרוגדית אקסון של Mn 2 + ואיך ממר"י עשוי לשמש כאינדיקטור לפעילות חשמלית. עם זאת, נראה כי Mn 2 + שידור על ידי RGCs מתרחש, לפחות בחלקו, באופן עצמאי מגירוי האור ספציפי וקלט חשמלי המתקבל מהתאים דו קוטביים. לחלופין, ההשפעה נטו של חשמלctivity בתוך ההקרנה retino-tectal עשוי להיות תוצאה של גירוי חשמלי של כהה מגיב "OFF-RGCs 'והאור מגיב" ON-RGCs'. פירוש כזה נתמך על ידי הממצא שMn 2 + הובלה לאורך הקרנת retino-tectal אינה פגומה בזני עכבר עם ראייה ירודה, כמו עכברי CBA שנושאים את המוטציה RD1 של גן Pde6b גורם ניוון רשתית 11. במחקר שנערך על עכברים הקינטית רואי וCBA סוג בר, שיעורי תחבורה דומים נצפו במהלך השלב הראשוני הזרם (ב2.5 לאחר הזרקת hr) ועבור השיפור הסופי אות (ב24hr) בLGN ו11 SC.

יחדיו, תצפיות אלו תומכות ברעיון כי ממר"י, לדוגמא, של מערכת הראייה כפי שהודגם כאן, מייצג צעד חשוב לשלמות מבנית ויציבות מטבולית ולא לפעילות חשמלית. באופן מעשי, של לכאורהעצמאות שולחן של שיפור אות בLGN וSC מוחין מהחשיפה לאור מאפשרת לטיפול ודיור של בעלי חיים חזקים ללא טיפול מיוחד בעניין התאורה. מצד השני, ללימודי ממר"י, המתמקדים בשיפור אות ברשתית, יש צורך לשמור על בעלי חיים בתנאי אור פיקוח הדוק לפני הסריקה.

בין הפרמטרים הפיסיולוגיים המשפיעים Mn 2 + שיעורי תחבורה אקסון ושיפור אות ממר"י שלאחר מכן, יציבות טמפרטורת גוף עשויה להיות בעלת חשיבות מיוחדת. כך עולה ממחקרים על אפי Mn 2 + להגברה של מטרות הקרנת הרחה ראשוניות במוח, שם העשרה נמצאה להצטמצם באופן משמעותי בהפחתה זמנית של טמפרטורת גוף ל30 מעלות צלזיוס לעומת לאותת שיפור בטמפרטורת גוף נורמלי 27. לכן, טמפרטורת גוף צריכה להיות במעקב ומותאם לפני ובמהלך MR סורק לא רק לעמrotect בריאותם של בעלי החיים, אלא גם כדי לנרמל את הפרמטרים פיסיולוגיים של Mn 2 + התפשטות.

מאז שינויי pathophysiological וליקויים מטבוליים משפיעים על יעילות תחבורת אקסון של Mn 2 +, שיפור אות במרכזי הקרנה, לדוגמא, LGN וSC, יכולים לשמש כאמצעי לשלמות המבנית ופעילות תפקודית של מסלול זה. כאן, אנו מציגים שני תנאים שונים של ניוון ON ולהמחיש כי Mn 2 וריבוי + העשרה במרכזי thalamic והמוח התיכונים משתנים כפונקציה של שלמות עצב. תוצאות פגיעה חריפה על אובדן מוחלט אות מייד לאחר פציעה, שאינו מחלים תוך 4 שבועות בשל חוסר התחדשות אקסון רלוונטי, תוך ניוון אקסון איטי במוטצית KO p50 מתבטאת בערכי CNR מופחתים בLGN. בהתחשב באפשרות של הדמיה אורך, יישום זה של ממר"י עשוי להיות f היקראו ניטור תגובות צמיחת postlesional של ON ולאפשר החקירה של התערבויות גנטיות או תרופתיים proregenerative לRGCs.

בנוסף, אנו מציגים ממר"י כשיטה רגישה ביותר לאיתור ליקויים הדרגתיים בשיפור אות הקשורים לתהליכי ניוון אקסון כרוניים. גורם השעתוק NF-κB מעורב בתחזוקה עצבית ועכברים עם מחיקה של מקטע p50 של אובדן NF-κB תצוגה תלוי גיל עצבי תא וניוון אקסון בתוך מערכת הראייה 19. בנוסף להיסטולוגית ואלקטרון מיקרוסקופי ניתוחים, ממר"י של הקרנת retino-tectal הוא מסוגל לזהות שינויי פנוטיפי בעכברים אלו. על ידי רכישה של T הסידורי 1 תמונות משוקללות MR הבאים ivit Mn 2 + יישום, אנו נבדלים כולל הופחתו מ 2 + תחבורת Mn פשוט מתעכבת לאורך המסלול החזותי בp50 אלהעכברי KO. ובכך, נתוני רכישה חוזרת על ידי ממר"י לאחר Mn 2 + יישום יחיד מאפשרת ההגדרה של קינטיקה תחבורת אקסון ושינויים נוירופיזיולוגיות בבריכה לא יסולא בפז של עכברים מהונדסים גנטי זמינים. נכון לעכשיו, מספר שינויים של ממר"י נמצאים תחת החקירה במטרה להפוך טכניקה זו בטוחה ליישומי אבחון בבני אדם. גישה מבטיחה של הרלוונטיות קלינית גבוהה, המהווה חלופה לivit הזרקה, היא המשלוח של Mn 2 + כטיפי עיניים. ובכך, ממשל מקומי של 1 M MnCl 2 הניב שיפור אות משמעותי ב -20% בSC כאשר תמונות נרכשו על סורק בעלי חיים T 4.7 יום 31. השיטה הייתה מסוגלת לזהות נרחב על ניוון רשתית בעקבות איסכמיה ביום 31, והריכוז מיושם הוכיח בטוח כשהיא מיושמת שוב ושוב במרווחים של חודש 32. לאור גבוה יחסית רעילות העצבית של Mn 2 + למשל, לאבחון של טרשת נפוצה ונוירופתיה אחרת.

לסיכום, המחקר שלנו מוכיח כי ממר"י הוא גישה ניסויית רבת עוצמה כדי לחקור circuitries retino-tectal בעכברים, ובכך להאריך משימות אופטומטרי להערכה הפונקציונליות של מערכת הראייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

AK נתמך על ידי קרן אופנהיים וRH נתמך על ידי קרן Velux. אנו מודים אני Krumbein לBuder טכני וק לתמיכה היסטולוגית, וג' גולדשמידט (לייבניץ מכון לנוירוביולוגיה, מגדבורג, גרמניה) עבור ייעוץ טכני על מכתים TIMM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M1787 MEMRI contrast reagent
Conjuncain Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 7617666 0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 3820927 3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol Jenapharm, Jena, Germany PZN 3524531
Chloral hydrate  Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany C8383 420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe  Hamilton Company, Reno, NV, USA 7634-01 SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN) Hamilton Company, Reno, NV, USA 207434/00 removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000 Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 6502 tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O) Merck, Darmstadt, Germany 106346 for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O) Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany 208043
Gum arabic Roth, Arlesheim, Switzerland 4159 for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2) Roth, Arlesheim, Switzerland 3586
Citric acid (C6H8O7) Roth, Arlesheim, Switzerland 6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O) Merck, Darmstadt, Germany 106448
Silver nitrate (AgNO3) Roth, Arlesheim, Switzerland 7908

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kretz, A., et al. Simvastatin promotes heat shock protein 27 expression and Akt activation in the rat retina and protects axotomized retinal ganglion cells in vivo. Neurobiol Dis. 21, 421-430 (2006).
  2. Lima, S., et al. Combinatorial therapy stimulates long-distance regeneration, target reinnervation, and partial recovery of vision after optic nerve injury in mice. Int Rev Neurobiol. 106, 153-172 (2012).
  3. Lima, S., et al. Full-length axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9149-9154 (2012).
  4. Goetze, B., et al. Vision and visual cortical maps in mice with a photoreceptor synaptopathy: reduced but robust visual capabilities in the absence of synaptic ribbons. Neuroimage. 49, 1622-1631 (2010).
  5. Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
  6. Pautler, R. G., et al. In vivo neuronal tract tracing using manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Magn Reson Med. 40, 740-748 (1998).
  7. Watanabe, T., et al. Mapping of retinal projections in the living rat using high-resolution 3D gradient-echo MRI with Mn2+-induced contrast. Magn Reson Med. 46, 424-429 (2001).
  8. Pautler, R. G. In vivo, trans-synaptic tract-tracing utilizing manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI). NMR biomed. 17, 595-601 (2004).
  9. Haenold, R., et al. Magnetic resonance imaging of the mouse visual pathway for in vivo studies of degeneration and regeneration in the CNS. Neuroimage. 59, 363-376 (2012).
  10. Lindsey, J. D., et al. Magnetic resonance imaging of the visual system in vivo: transsynaptic illumination of V1 and V2 visual cortex. Neuroimage. 34, 1619-1626 (2007).
  11. Bearer, E. L., et al. Role of neuronal activity and kinesin on tract tracing by manganese-enhanced MRI (MEMRI). Neuroimage. 37, Suppl 1. S37-S46 (2007).
  12. Mendonca-Dias, M. H., et al. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Semin Nucl Med. 13, 364-376 (1983).
  13. Thuen, M., et al. Manganese-enhanced MRI of the optic visual pathway and optic nerve injury in adult rats. J Magn Reson Imaging. 22, 492-500 (2005).
  14. Sandvig, I., et al. In vivo MRI of olfactory ensheathing cell grafts and regenerating axons in transplant mediated repair of the adult rat optic nerve. NMR biomed. 25, 620-631 (2012).
  15. Chan, K. C., et al. In vivo retinotopic mapping of superior colliculus using manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Neuroimage. 54, 389-395 (2011).
  16. Chan, K. C., et al. In vivo chromium-enhanced MRI of the retina. Magn Reson Med. 68, 1202-1210 (2012).
  17. Herrmann, K. H., et al. Possibilities and limitations for high resolution small animal MRI on a clinical whole-body 3T scanner. Magma. 25, 233-244 (2012).
  18. Villegas-Perez, M. P., et al. Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats. J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).
  19. Takahashi, Y., et al. Development of spontaneous optic neuropathy in NF-κΒ50-deficient mice: requirement for NF-κΒp50 in ganglion cell survival. Neuropathol Appl Neurobiol. 33, 692-705 (2007).
  20. Herrmann, K. H. P., et al. MRI compatible small animal monitoring and triggering system for whole body scanners. Z Med Phys. 24, 55-64 (2013).
  21. Danscher, G., Zimmer, J. An improved Timm sulphide silver method for light and electron microscopic localization of heavy metals in biological tissues. Histochemistry. 55, 27-40 (1978).
  22. Angenstein, F., et al. Manganese-enhanced MRI reveals structural and functional changes in the cortex of Bassoon mutant mice. Cereb cortex. 17, 28-36 (2007).
  23. Thuen, M., et al. Manganese-enhanced MRI of the rat visual pathway: acute neural toxicity, contrast enhancement, axon resolution, axonal transport, and clearance of Mn(2). J Magn Reson Imaging. 28, 855-865 (2008).
  24. Lehmann, K., et al. Vision and visual plasticity in ageing mice. Restor Neurol Neurosci. 30, 161-178 (2012).
  25. Takeda, A., et al. Manganese transport in the neural circuit of rat CNS. Brain Res Bull. 45, 149-152 (1998).
  26. Nairismagi, J., et al. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging of mossy fiber plasticity in vivo. Neuroimage. 30, 130-135 (2006).
  27. Smith, K. D., et al. In vivo axonal transport rates decrease in a mouse model of Alzheimer's disease. Neuroimage. 35, 1401-1408 (2007).
  28. Berkowitz, B. A., et al. Noninvasive and simultaneous imaging of layer-specific retinal functional adaptation by manganese-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2668-2674 (2006).
  29. Schnapf, J. L. B. D. A. How photoreceptor cells respond to light. Sci. Am. 256, (8), (1987).
  30. Yu, X., et al. In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI. Nat Neurosci. 8, 961-968 (2005).
  31. Sun, S. W., et al. Noninvasive topical loading for manganese-enhanced MRI of the mouse visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 3914-3920 (2011).
  32. Sun, S. W., et al. Impact of repeated topical-loaded manganese-enhanced MRI on the mouse visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 4699-4709 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics