المايلين دبقية قليلة التغصن جلايكوبروتين (MOG

Immunology and Infection
 

Summary

التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية (EAE) هو نموذج حيواني أنشئت من التصلب المتعدد. يتم تطعيم C57BL / 6 الفئران مع المايلين دبقية قليلة التغصن بروتين سكري (موج) الببتيد 35-55 (MOG 35-55)، مما أدى إلى الشلل الرخو الصعود الناجم عن الخلايا المناعية autoreactive في الجهاز العصبي المركزي. وسوف تناقش البروتوكولات لتحريض المرض والرصد.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (86), e51275, doi:10.3791/51275 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التصلب المتعدد هو اضطراب مزمن في neuroinflammatory المزيل الجهاز العصبي المركزي مع عنصر الاعصاب قوية. في حين أن المسببات الدقيق لهذا المرض حتى الآن غير واضحة، ويعتقد أن الخلايا الليمفاوية T autoreactive للعب دور مركزي في الفيزيولوجيا المرضية لها. العلاج MS فعالة جزئيا فقط حتى الآن، ومواصلة الجهود البحثية لتوسيع معرفتنا على الفيزيولوجيا المرضية للمرض ووضع استراتيجيات العلاج الرواية. التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية (EAE) هو نموذج حيواني الأكثر شيوعا لمرض التصلب العصبي المتعدد تبادل العديد من المظاهر السريرية والمرضية في جسم المريض. هناك تنوع واسع من النماذج EAE التي تعكس مختلف الجوانب السريرية، والمناعية والنسيجية من MS الإنسان. EAE التي يسببها بنشاط في الفئران هو أسهل نموذج محرض مع نتائج قوية وقابلة للتكرار. هي مناسبة خاصة للتحقيق في ذلك آثار المخدرات أو جينات معينة باستخدام الفئران المعدلة وراثيا طعن من قبل neuroi المناعة الذاتيةnflammation. لذلك، يتم تحصين الفئران مع الخليط CNS أو الببتيدات من البروتينات المايلين. نظرا لإمكانات مناعة منخفضة من هذه الببتيدات، يتم استخدام المواد المساعدة قوية. EAE قابلية والنمط الظاهري يعتمد على المستضد واختار سلالة القوارض. C57BL / 6 الفئران هي سلالة تستخدم عادة لبناء الماوس المعدلة وراثيا والرد بين أمور أخرى إلى المايلين دبقية قليلة التغصن بروتين سكري (موج). وعلقت حاتمة MOG مناعة 35-55 في مساند فرويند الكامل (CFA) قبل التحصين والسعال الديكي السم يتم تطبيق يوم التحصين وبعد ذلك بيومين. الفئران وضع "الكلاسيكية" EAE الطور ذاتي محدود مع الصعود الشلل الرخو داخل 9-14 أيام بعد التطعيم. يتم تقييم الفئران يوميا باستخدام نظام التهديف السريرية ل25-50 يوما. وتناقش اعتبارات خاصة لرعاية الحيوانات مع EAE فضلا عن التطبيقات والقيود المحتملة لهذا النموذج.

Introduction

التصلب المتعدد (MS) هو المزيل للمرض التهابي مزمن في الجهاز العصبي المركزي حيث تدمير قليلة التغصن والنتائج الخلايا العصبية في الأعراض السريرية غيروي المنشأ والتراكم. يعتبر مرض التصلب العصبي المتعدد واضطراب المناعة الذاتية prototypic من الجهاز العصبي المركزي (CNS) ولقد تم تطوير نماذج حيوانية لتسليط الضوء على المرضية المعقدة. وعلاوة على ذلك، والعلاجات الحالية فعالة جزئيا فقط، وتستهدف أساسا المرحلة الالتهابية للمرض في حين أن عنصر الاعصاب وربما كان تحديا كبيرا لمستقبل النهج العلاجي 1،2.

في حين أن المسببات الدقيق لهذا المرض حتى الآن غير واضحة، ويفترض رد فعل المناعة الذاتية ضد الحواتم على غمد النخاعين من محاور عصبية في الجهاز العصبي المركزي لاستفزاز بداية المرض. ويعتقد أن التقلبات في الجهاز المناعي، والضعف الوراثية والعوامل البيئية (مثل الالتهابات، وفيتامين D) لالجوانب المركزية تأثير الآليات المرضية في جسم المريض من مرض التصلب العصبي المتعدد.

وضعت ثلاثة أنواع مختلفة من النماذج الحيوانية حاليا لاستكشاف أنماط مرضية من مرض التصلب العصبي المتعدد: نماذج الفيروسية مثل فيروس التهاب الدماغ والنخاع الفئران تايلر (TMEV)، ونماذج الناجمة عن المواد السامة مثل cuprizone، وأخيرا أنواع مختلفة من تجريبية التهاب الدماغ و النخاع المناعة الذاتية (EAE) 3، 4. على الرغم من أنهم جميعا تحاكي ملامح MS، فإنها تختلف بشكل كبير في ملامح المرضية الكامنة مثل إشراك الجهاز المناعي على التكيف. EAE هو نموذج حيواني الأكثر شيوعا كما هو مفيدة بشكل خاص للتحقيق في مسارات neuroinflammatory وغالبا ما تخدم كنموذج "إثبات صحة المبدأ" لفعالية استراتيجيات العلاج الرواية 5،6. EAE يمكن أن يتسبب في العديد من الحيوانات المختلفة (مثل الفئران والجرذان، miniswine والخنازير الغينية والدجاج، أو قرود). ومع ذلك، أصبحت الفئران أكثر على نطاق واسع استخدام الأنواع التي يرجع جزئيا على الأقللتوسيع مرجع المعدلة وراثيا متطورة أو الفئران خروج المغلوب 7.

ويستند الفيزيولوجيا المرضية من EAE على رد فعل جهاز المناعة ضد المستضدات الدماغ محددة. هذا التفاعل يؤدي الى التهاب وتدمير الهياكل الدفترية مستضد، مما أدى في ملامح العصبية والمرضية للمقارنة التي تلك التي لوحظت في مرضى التصلب المتعدد. ثلاثة مناهج مختلفة يمكن تمييزها: يسببها بنشاط-EAE (مجلة؛ التحصين النشط)، ونقل بشكل سلبي EAE (pEAE؛ نقل خلايا دماغي المنشأ من حيوان تحصين)، ونماذج EAE الماوس عفوية في الآونة الأخيرة (SEAE) التي تسمح للدراسة الذاتية آليات دون التلاعب الخارجية. أسهل نموذج محرض هو مجلة في الفئران ذات العوائد في نتائج سريعة وقوية. ويعتبر هذا النموذج باعتباره "المعيار الذهبي" من النماذج الحيوانية neuroimmunological من قبل العديد من الباحثين في مجال 8.

لمجلة الاستقراء، الحيوان يتم تحصين مع الحقن تحت الجلد من مستحلب تتكون من المستضد اختيار واستكمال adjuvans فرويند (CFA) يرافقه حقنة داخل الصفاق من السعال الديكي السم في يوم التحصين وبعد ذلك بيومين. وبالتالي، يتم تنشيط الخلايا اللمفية تي المايلين محددة في محيط وتهاجر إلى الجهاز العصبي المركزي في الدماغ عبر حاجز الدم-. عند الدخول إلى الجهاز العصبي المركزي، ويتم تنشيط خلايا T من الخلايا العارضة للمستضد المحلية والتسلل مما أدى إلى شلالات التهابات لاحقة، وإشراك خلايا أخرى مثل وحيدات أو الضامة وإزالة الميالين في نهاية المطاف ومحور عصبي موت الخلية 9. تبعا للبروتوكول التحصين ومزيج من سلالة الماوس (على سبيل المثال C57BL / 6، SJL / J، Biozzi) ومستضد (مثل بروتين سكري المايلين دبقية قليلة التغصن (موج)، البروتين الأساسي المايلين (ب ب)، المايلين البروتين شحم بروتيني (حزب العمال التقدمي))، وهذا المرض بالطبع يمكن أن تأخذ، مسار المرض المزمن تحويل تقدمية أو الانتكاس الحاد.

= "jove_content"> أصبحت C57BL / 6 الفئران من سلالة الأكثر استخداما لبناء الفئران المعدلة وراثيا وعدد كبير متزايد من خروج المغلوب أو الفئران المعدلة وراثيا هو متاح. نحن هنا وصف بروتوكول للتحصين C57BL / 6 الفئران مع MOG 35-55 الببتيد 10 والذي ينتج في EAE الطور الأول مع الأعراض بعد 9-14 أيام، والحد الأقصى المرض بعد حوالي 3-5 أيام ظهور المرض وبطيئة وجزئية الانتعاش أعراض خلال الأيام 10-20 القادمة. كما القدرة المناعية للموج 35-55 الببتيد وحدها ليست كافية لإحداث المرض، والمواد المساعدة مثل CFA ضرورية. فمن المفترض، أن مكونات CFA تفعيل البالعات وحيدات النوى يحفز البلعمة من هذه الجزيئات وإفراز السيتوكينات. هذه النتائج في إطالة أمد وجود مستضدات ونقل أكثر كفاءة من هؤلاء إلى الجهاز اللمفاوي. ومما يسهل EAE الاستقراء من خلال تطبيق السم السعال الديكي (PT) والذي من بين أمور أخرى اقترحت لتعديلحاجز الدم في الدماغ والاستجابة المناعية نفسها 11. بعد تحريض المرض، لا بد من إيلاء عناية خاصة لتقييم يوميا من الفئران لأعراض المرض.

Protocol

1. تعليقات عامة لتجارب ماوس

  1. جميع التجارب باستخدام الفئران يجب أن يتم تنفيذ وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام كل منها.
  2. الحفاظ على الفئران تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض وتمكينهم من الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. ملاحظة: من المهم لاستخدام الفئران المتطابقة الجنس في سن والمجموعات التجريبية وذلك لأن التعرض للمرض يمكن أن تختلف مع تقدم العمر والجنس.
  3. اعتمادا على الظروف التجريبية المختار، ويمكن اعتبار مجموعة مراقبة المحصنين صورية حيث يتم استبدال MOG 35-55 الببتيد من قبل أي برنامج تلفزيوني دون مستضد أو الببتيد nonencephalitogenic.
  4. يرجى النظر في الجوانب المنهجية قبل انطلاق التجارب (انظر أيضا أدناه). نوصي لإشراك واحد أو اثنين من المراقبين أعمى لEAE التهديف.

2. إعداد MOG 35-55 مستحلب

  1. 200 ميكرولتر من نسبة 1:1 من MOينبغي حقن G 35-55 حل الببتيد وCFA إلى كل فأر. هناك بعض الخسائر من مستحلب لزج في حين تستعد وحقن. وبالتالي، تعد 1.5-2X من المبلغ المطلوب. حساب الحجم الكلي للمستحلب والقسمة على 2 للحصول على المبالغ اللازمة من كلا MOG 35-55 حل الببتيد وCFA.
  2. تمييع MOG مجفف بالتجميد 35-55 في DDH 2 O إلى تركيز النهائي من 2 ملغ / مل. ونحن عادة استخدام 200 ميكروغرام MOG 35-55 الببتيد في الماوس. ويرد هذا المبلغ في 100 ميكرولتر من محلول المخزون. يجب أن يتم تخزين الحل الببتيد في -20 درجة مئوية.
  3. وضع محتوى القارورة من 1 المجفف H37RA المتفطرة السلية (100 ملغ) في الهاون.
    1. الأرض مع هاون ومدقة للحصول على مسحوق رقيقة.
    2. إضافة 10 مل من المواد المساعدة فرويند غير كاملة للحصول على محلول المخزون 10 ملغ / مل CFA التي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية.
    3. قبل التحصين، وتمييع الحل الأسهم CFA الطرافةح IFA إلى تركيز النهائي من 2 ملغ / مل. تخلط جيدا قبل كل استخدام ل resuspend المواد الجسيمية والنظر في بعض الخسارة حجم الحل لزج خلال الاستعدادات التجريبية.
    4. خلط مع MOG 35-55 01:01 حل الببتيد حتى / يتم الوصول إلى تركيز النهائي من 1 ملغ مل.
      تنبيه: قتلت الحرارة المتفطرة السلية يحفز الاستجابة المناعية الفطرية. تجنب استنشاق، الابتلاع وملامسة الجلد والعينين.
  4. Precool الحلول على الجليد.
    1. وضع 1 مل من 2 ملغ / مل CFA و 1 مل من 2 ملغ / مل 35-55 MOG الحل إلى قسمين 2 مل المحاقن. حساب عدد الحقن اللازمة وفقا لعدد من الحيوانات تحصين.
      تنبيه: تجنب بدقة خياطة خلال إعداد المواد المساعدة لأنها قد تسبب أورام حبيبية أو حث ردود فعل المناعة الذاتية.
    2. استخدام 27 G قنية للموج 35-55 الحل و20 G قنية لCFA. تجنب فقاعات الهواء وربط كل من المحاقن مع فيhree في اتجاه وصمام.
    3. إرسال مستحلب من حقنة واحدة إلى أخرى، وتخلط جيدا لمدة 10 دقيقة على الأقل باعتباره استحلاب جيدة هو خطوة حاسمة. شبه إغلاق ثلاثي صمام لدعم استحلاب. وينبغي أن يكون الحل بيضاء، وقاسية ولزج مع عدم وجود فصل مراحل.
    4. ويمكن تخزين مستحلب لعدة أيام قبل التطعيم. الانتظار على الأقل 30 دقيقة بعد إعداد المستحلبات لمراقبة ما إذا كانت مستقرة. قبل التطعيم، ورسم الحل في واحدة من اثنين من المحاقن وتوصيل 27 G قنية.

3. إعداد السعال الديكي السمية

  1. كميات مختلفة من السعال الديكي السم يمكن العثور عليها في الأدب الذي يعتمد أيضا على مسار الإدارة (على سبيل المثال عن طريق الوريد أو الغشاء البريتونى). مختبرنا يستخدم 400 نانوغرام من السعال الديكي السم في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الغشاء البريتونى في يوم من التحصين وبعد ذلك بيومين. تنبيه: السعال الديكي السم له العديد من الآثار البيولوجية. تجنب استنشاق، الابتلاع، وملامسة الجلد والعينين.
  2. إعادة 50 ميكروغرام من السعال الديكي السم في 500 ميكرولتر DDH 2 O لمحلول المخزون 100 ميكروغرام / مل. تخزين عند 4 درجات مئوية.
  3. تمييع 01:50 مع برنامج تلفزيوني. تحتوي على 200 ميكرولتر الآن 400 نانوغرام من برنامج تلفزيوني. إعداد المبلغ اللازم من المحاقن والنظر في حجم الفائض إضافية من ~ 100 ميكرولتر لكل محور الإبرة.

4. تحصين الحيوان

  1. يرجى الرجوع إلى لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية لمعايير محددة ليطلب القتل الرحيم على المدى القصير. يستخدم مختبرنا التخدر قصيرة مع isoflurane وبينما البروتوكولات الأخرى مثل حقن الكيتامين / زيلازين أو halothan قد يكون من الممكن أيضا. الانتظار للتخدير واستخدام إصبع القدم جبهة قرصة لتقييم مستوى التخدير.
  2. تأكد من أن التحصين يتم تنفيذها بواسطة شخص من ذوي الخبرة لتقليل الإجهاد للحيوانات وضمان التحصين الأمثل.
  3. ضخ 100 ميكرولتر من مكافحةالجنرال / CFA مستحلب تحت الجلد في موقعين مختلفين على كل الجناح الخلفيتين. ضمان أن أشكال كتلة منتفخة تحت الجلد والتي ينبغي أن تستمر في كافة مراحل التجربة.
  4. ضخ 200 ميكرولتر من السعال الديكي السم intraperitonelly.
  5. ضمان أن الفئران الفردية يمكن بسهولة تحديدها لتقييم اليومية، على سبيل المثال عن طريق علامات اللون على قاعدة الذيل.
  6. إدارة جرعة ثانية من السعال الديكي السم في اليوم الثاني بعد التحصين.

5. مراقبة EAE

  1. وينبغي تقييم الوزن والنتيجة السريرية اليومية. بداية EAE يرتبط عادة مع فقدان الوزن، والتي يمكن استخدامها كمؤشر على نشاط المرض. يرجى الرجوع إلى رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لتحديد مسبق المعايير عندما يكون الفئران الفردية التي يجب اتخاذها للخروج من التجارب. وينبغي النظر في هذا عندما يتجاوز وزن خسارة 20٪ من وزن الجسم الأولي أو عند حدوث علامات سريرية شديدة (EAE يسجل 7 أو أسوأ). يرجى الرجوع إلى إعادةالمبادئ التوجيهية spective لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام كل منها لأقصى الدرجات المسموح بها.
  2. عندما يكون الفئران أعراض سريرية لEAE، فمن المهم التأكد من أن زجاجة المياه لا يزال من الممكن التوصل إليها والتي يتم وضع الطعام على الأرض القفص.
  3. ويمكن استخدام التهديف أعراض مختلفة. في المختبر لدينا يتم تأسيس مقياس 0-10.
درجة علامات سريرية تعليق
0 أي علامات سريرية مشية عادية، يتحرك الذيل ويمكن أن تثار، وذيل يلتف حول كائن الجولة إذا تم عقد الماوس عند قاعدة الذيل
1 الذيل يعرج جزئيا مشية عادية، طرف الذيل يتدلى
2 الذيل بالشلل مشية عادية، يتدلى الذيل
3 هند أطرافهم شلل جزئي، والحركة غير منسقة مشية غير منسقة، يعرج الذيل، أطرافه الخلفية الرد على معسر
4 أحد أطرافهم هند بالشلل مشية غير منسقة مع أحد أطرافهم الخلفيتين سحب، يعرج الذيل، لا يستجيب أحد أطرافهم هند لقرصة
5 كل من أطرافه الخلفية بالشلل مشية غير منسقة مع كل الأطراف الخلفية السحب، يعرج الذيل، سواء أطرافه الخلفية لا تستجيب لقرصة
6 أطرافه الخلفية بالشلل، وضعف في الأطراف الأمامية مشية غير منسقة مع النضال الأمامية لسحب الجسم، الأمامية العاكسة بعد معسر، يعرج الذيل
7 شلت أطرافه الخلفية، forelimb احد بالشلل الفأر لا يمكن أن تتحرك، forelimb احد يستجيب لقرصة أخمص قدميه، يعرج الذيل
8 شلت أطرافه الخلفية، على حد سواء الأمامية بالشلل الفأر لا يمكن أن تتحرك، على حد سواء الأمامية لا تستجيب لقرصة أخمص قدميه، يعرج الذيل
9 محتضر عدم الحركة، والتنفس تتغير
10 الموت

الجدول 1. نظام التهديف السريرية.

Representative Results

بعد التحصين، والفئران يجب أن يتم تقييمها اليومي لإجراء تغييرات في الوزن والأعراض السريرية. عادة ما يرتبط ظهور المرض مع تخفيض الوزن والتي قد تبدأ قبل 1-2 أيام الأعراض EAE مرئية. علامات سريرية للEAE عادة ما يبدأ بين يوم 9 و 14 آخر التحصين. كما يتم ترجمة الآفات في الغالب إلى الحبل الشوكي في MOG-EAE في C57BL / 6 الفئران، فإنها عادة ما تتطور لديهم أعراض في الغالب حركية في الذيلية لنمط منقاري. صورة نموذجية لتحصين الماوس مع أعراض EAE (6 نقاط) وصفت في الشكل 1A. قد تحدث بعض الأعراض EAE شاذة أيضا مثل المتداول بطريقة محوري الدوارة، والمظهر منحنية أو فرط الحساسية التي لا تنعكس داخل EAE الكلاسيكية درجة تقييم مبين في الجدول رقم 1. والأعراض الحركية هي السمة الرئيسية في هذا النموذج، وهذا لا يعطينا النتيجة مؤشرا جيدا من شدة المرض. نظم الرصد المختلفة (على سبيل المثال تصبح النتيجة 0 -كما تم نشر 5 أو 0-6) وأكثر عشرات مركب معقد تقييم العجز مختلفة. يرجى ملاحظة أن الفئران مع أعراض حادة يتعين اتخاذها للخروج من التجربة وفقا للجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام كل منها. تظهر الفئران الانتعاش الجزئي عموما من الأعراض على مدى أيام 10-20 المقبل. ويصور دورة المرض ممثل في الشكل 1B. هناك نقاط زمنية مختلفة خلال EAE التي تهم لتقييم المعلمات النتيجة. يتم وصف بعض المقايسات النمطية التي كثيرا ما يمكن العثور فترة وجيزة جدا. في أقصى المرض والفئران يمكن تقييمها لإنتاج السيتوكينات أو الانتشار بعد restimulation من الخلايا المناعية معزولة مع MOG 35-55 الببتيد في المختبر (أذكر MOG مقايسة). ويمكن أيضا أن الخلايا المناعية تكون معزولة من الدماغ والنخاع الشوكي من الفئران مع أعراض EAE ومواصلة تجهيزها، مثلا عن طريق التدفق الخلوي. لا يمكن أن يؤديها التحليل النسيجي من أقسام النخاع الشوكي في مرض مaximum لتحميل وإزالة الميالين الآفة، بينما في وقت لاحق يشير علامات لتنكس عصبي وموت الخلايا العصبية قد تكون ذات فائدة.

الشكل 1
الشكل 1. نتائج الممثل EAE. A. صورة الممثل من تحصين C57BL / 6 الماوس مع أعراض EAE (EAE يسجل 6). مسار المرض B. الممثل بعد التحصين أكثر من 30 يوما. وتظهر البيانات كما يعني والخطأ المعياري للمتوسط ​​(ن = 5). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Discussion

وقد وصفت وهناك العديد من نماذج مختلفة مع بروتوكولات EAE التحصين نشاطا على مدى العقود الماضية. في حين نماذج الفئران وقد استخدمت على نطاق واسع حتى وقت قريب، والفئران هي الآن كائن النموذج الأكثر شعبية للبحث EAE. هذا التطور هو من بين آخرين، نظرا للذخيرة واسعة ومتزايدة من الفئران المعدلة وراثيا المتوفرة. تحصين C57BL / 6 الفئران مع MOG 35-55 الببتيد هي واحدة من أكثر وزعت على نطاق واسع نماذج EAE ويمكن اعتباره نموذجا يمكن الاعتماد عليها، قابلة للتكرار والحيوان جيدا للاستخدام. في العديد من المختبرات neuroimmunological، يتم تأسيس MOG 35-55 EAE التي يسببها كنموذج للاختيار بينما تستخدم نماذج أخرى لEAE الأسئلة التجريبية أكثر تحديدا.

وهناك نقطة حاسمة للنظر هو التخطيط للإعدادات التجريبية لضمان أن يتم تنفيذ التجارب EAE الصحيح منهجيا. للصحة الداخلية، ينصح بشدة التهديف أعمى من أعراض المرض. EXPERوينبغي أن تكون مجموعات imental العمر والوزن، وينبغي تخصيص مطابقة الجنس والفئران عشوائيا إلى مجموعات العلاج. وينبغي دائما أن يؤديها التجارب في الامتثال للوائح الرفق بالحيوان. دراسات EAE غالبا ما تكون أضعفت ولا تأخذ في الاعتبار الإحصائية أخطاء من النوع الثاني. لذلك، قبل التجارب، ينبغي إجراء حسابات حجم العينة. أحجام مجموعة اللازمة تعتمد على حجم التأثير المتوقع. قد يعتبر التشاور خبير للتحليل الإحصائي قبل بدء التجارب EAE.

تحتاج الى بعض القيود المفروضة على بروتوكول لأن يوضع في الاعتبار. الأهم من ذلك، هو خطر تفسير البيانات من قبل مجلة طريقة التحصين مع استخدام المواد المساعدة والسعال الديكي السم التي لها تأثير على حد سواء إضافية على رد فعل مناعي. وينبغي أيضا اعتبار أن نموذج MOG 35-55 EAE يظهر أساسا خلايا CD4 + T مدفوعة استجابة مناعية. خلايا CD8 + T والخلايا B تلعبوينبغي النظر في دورا أقل بروزا والبروتوكولات البديلة عند معالجة هذه أنواع الخلايا. مسار المرض المتوقع الحاد، والطور ذاتي محدود. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن يتحقق مسار المرض منتكس تحويل في النماذج EAE البديلة. قيود إضافية هامة من البروتوكول هو وجود تحيز معينة تجاه المكون المناعية من الفيزيولوجيا المرضية MS. خلال السنوات الأخيرة، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن MS ديه عنصر الاعصاب قوية. وفاة قليلة التغصن والنتائج الخلايا العصبية في تراكم التدريجي للعجز عصبي. يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن النموذج EAE قد لا تكون مناسبة تماما لمعالجة المسائل المتعلقة التجربة آليات الاعصاب التهاب المناعة الذاتية. النماذج الحيوانية البديلة مع التركيز على الجهاز العصبي المركزي علم الأمراض يمكن النظر - على سبيل المثال نموذج cuprizone الذي يهدد إزالة الميالين السامة دون تدخل من الجهاز المناعي الطرفية.

يعتبر بروتوكول صفها بأنها نموذج تجريبي neuroimmunological الأساسية، ويمكن تعديله لتطبيقات أخرى. إجراء التجارب المذكورة أعلاه يمكن تطبيقها بسهولة على غيرها من البروتوكولات EAE من خلال تغيير سلالات الفئران أو نوع وكمية البروتين (مثل استخدام حزب العمال التقدمي 139-151 الببتيد والفئران SJL لEAE مسار المرض منتكس تحويل والتي هي مناسبة خاصة لتقييم العلاجية الآثار على الانتكاس). ويمكن أيضا وصف البروتوكول استخدامها لتجارب نقل بالتبني (المنفعلة EAE). في هذا النموذج، يتم تطعيم C57BL / 6 الفئران مع MOG 35-55 الببتيد وCFA كما هو موضح أعلاه. في المقابل، ليس مطلوبا السعال الديكي السم. بعد 7-15 أيام، الطحال أو الغدد الليمفاوية يتم عزل وrestimulated الخلايا المناعية في المختبر مع MOG 35-55 الببتيد ومختلف السيتوكينات قبل نقلها إلى مجموعة جديدة من الفئران C57BL/6se. هذه الفئران المتلقية تطوير EAE قبل بضعة أيام من عند كلاسالتحصين SICAL. يمكن أن تختلف الظروف في المختبر لطرح الأسئلة المناعية محددة (على سبيل المثال في الاستقطاب T H 1 أو T H 17 خلايا).

في بعض الأحيان، حدوث المرض منخفضة أو أعراض ضعيفة قد يكون تحديا التجريبية. بعض التوصيات لاستكشاف هي:

- مرض شدة يمكن أن تختلف مع كميات مختلفة من الببتيد / الماوس.

- تركيز الأمثل CFA قد تختلف 1-5 ملغ / مل. النظر في المعايرة من CFA عند وضع التجارب. يرجى الرجوع إلى المبادئ التوجيهية كل من لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام كل منها لتركيزات CFA المسموح بها العديد من اللوائح تمنع تركيزات CFA تتجاوز 2 ملغ / مل.

- يتم وصف طرق مختلفة لإعداد مستحلب. يمكن اعتبار أساليب بديلة مثل vortexing لمدة 1 ساعة أو صوتنة إذا يعتبر الفقراء استحلاب وقت possibمصدر الخطأ جنيه.

- العمر والجنس والموسم من السنة، والظروف البيئية داخل المنشأة الحيوانية من العوامل الهامة التي تؤثر على قابلية EAE. وينبغي التأكد من أن الشروط قابلة للمقارنة بين تجارب مستقلة.

كما هو موضح أعلاه، فإن البروتوكول المذكور يمكن أن تستخدم كنقطة انطلاق لتجارب EAE بالتبني. يناسب هذا النموذج وخاصة لفصل الآثار الطرفية والجهاز العصبي المركزي من النمط الظاهري الوراثية (على سبيل المثال عن طريق نقل الخلايا خروج المغلوب دماغي المنشأ في الفئران المتلقية wildtype) وعن أسئلة محددة المناعية كما يمكن وصف النمط الظاهري للخلايا نقل بدقة. آخر التطورات في مجال البحوث EAE خلال السنوات الأخيرة هي تي مستقبلات الخلية الفئران المعدلة وراثيا. هذه الفئران أعراض EAE عفويا دون تأثير خارجي التحايل على المشكلة من مساعد التلقيح. ومع ذلك، يتطلب هذا النموذج كميات كبيرة من الحيوانات لbreediنانوغرام لضمان أحجام مجموعة كافية. تقييم الفئران خروج المغلوب يتطلب التهجين قبل التجارب EAE على النقيض من مجلة. حيث أن كل تطور أعراض المرض الماوس في يوم آخر، يمكن تقييم المواد رواية تكون معقدة نوعا ما. لذا، فإن قيمة مجلة الكلاسيكية لneuroimmunological يبقى دون منازع.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المركز المتعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) مونستر (SEED 12/3، SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight e.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) e.g. Pepceuticals Ltd Store at -20 °C
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Sigma-Aldrich Co. F5506 Store at 4 °C
Syringes, 1 ml with 26 G 3/8 in needle  e.g. Becton Dickinson & Co. 309625
Syringes, 2 ml e.g. B. Braun 7389
Needles, 25 G 5/8 in and 30 G 1/2 in  e.g. Becton Dickinson & Co., 305122, 305106
Three way valve e.g. B. Braun 16494 C
Pertussis toxin, lyophilized in buffer Enzo Life Sciences Inc. BML-G100 Store at 4 °C
M. tuberculosis H37 RA BD Difco 231141 Store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Wiendl, H. Neuroinflammation: the world is not enough. Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).
  3. vander Star, B. J., et al. In vitro and in vivo models of multiple sclerosis. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).
  4. Pachner, A. R. Experimental models of multiple sclerosis. Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).
  5. Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).
  6. Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis. Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).
  7. Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. EAE: an immunologist's magic eye. Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).
  8. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).
  9. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).
  10. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).
  11. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J. Immunol. 169, 117-125 (2002).

Comments

5 Comments

  1. Dear Authors - you describe various conditions that contribute to a less than adequate disease response. But, do you have experience with conditions that create an exaggerated response in C57/Blk6 Jax, that result in animals dieing due to severe neurologic signs, rather than stabilizing and recovering as your discussion describes? For the past year, we have been struggling with a model that "used to work" at Harvard, but since moving to the National Cancer Institute, the model fails in that the previously resistant Tbet-/- (Tbx21) mice now develop EAE and both they and the Blk6 proceed to death. We have ruled out/excluded pathogens/commensals (segmented filamentous bacteria, Helicobacter, and norovirus), we have tried to emulate the same husbandry conditions as Harvard (using sterile micro-isolator caging, acidified water, even switching to a different diet)- but to no avail. Do you have any suggestions?

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 24, 2016 - 12:32 PM
  2. Dear Melody,
    these are rather strange experiences and my guess would be that there is a General Problem which renders your mice so over-succeptible to EAE. These changes are not so uncommon and can be rather tricky to solve. My advice would be to:
    - Try a delivery of your mice to another animal Provider (in europe we would for example choose Harlan or Janvier instead)
    - Try another animal housing facility at your University if available - the specific Environment can result in tremendous differences (even if there are no pathogens), People Report that regularly. The microbiome is suspected to be responsible for that while there are no specific tests for that.
    - Of course reduce amount of MOG (100 µg or lower)
    Hope that helps and good luck!
    Best, Stefan

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 25, 2016 - 9:16 AM
  3. Stefan- Thank you for your response. The investigator was using 100ug MOG and dropped it to 50ug, but this has not changed the profiles. We have done replicate studies in different facilities - same problem. Yesterday I found the following intriguing comments on the commercial Hooke EAE CRO site - they stated that you must titrate the pertussis dose for each lab, and if EAE is too severe, lower the dose (see below). Have you ever heard of this before? Does this sound reasonable? If you could give me your email, I can send you some of our mean clinical score graphs and you will see our problem. Here is their web site.
    http://www.hookelabs.com/protocols/eaeAI_C57BL6.html
    "Titration for optimal dosage of pertussis toxin. We strongly recommend that new customers establish the optimal PTX dose by inducing EAE in 10 mice in their own lab. The optimal PTX dose needed to obtain good EAE is typically 100 to 250 ng/mouse for each of the two PTX administrations. Larger doses of PTX are needed if mice experience higher levels of stress. The dose required decreases with mouse age. Even with identical mice and reagents, the PTX dose required varies from lab to lab. Finally, PTX potency varies from lot to lot; this affects the required dose. Hooke tests each lot of PTX in mice; the dilutions recommended in this protocol are the result of our testing.
    To determine the best PTX dose for the lab conditions, adjust PTX concentration to 4 µg/mL; this gives 400 ng PTX in each 0.1 mL dose (6000/1.5*0.1). Immunize 10 mice. Score mice daily starting 7 days after immunization, continuing until 28 days after immunization. (See Appendix A - EAE scoring guide.)

    If EAE is too severe, reduce PTX concentration to ~2.8 – 3.4 µg/mL (280 to 340 ng PTX/dose).
    If EAE is too mild, a higher dose of PTX is required;

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 25, 2016 - 12:03 PM
  4. My email is stefan.bittner@unimedizin-Mainz.de, you can reply directly there.
    I know Hooke kits and to our experience there is no obvious Change compared to self-made Solutions (for some People they work a bit better, for others not) - the main reason why we are not working with them routinously are Price + no flexibility in MOG/CFA composition.
    Pertussis: We never had Problems there and are not doing the testing (perhaps we are just lucky that our ptx is quite stable from Batch to Batch), but i know that other labs are doing the Titration as described by you and it might be a good Point for Trouble-Shooting!

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 27, 2016 - 6:20 AM
  5. Dear Stefan,

    I am trying to induce EAE in a B6/129 mixed background strain of mice. I wonder would the same protocol work?
    Thanks,

    Donghai

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 1, 2016 - 6:41 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics