Myelin oligodendrocyt Glycoprotein (MOG

Immunology and Infection
 

Summary

Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en etableret dyremodel for multipel sklerose. C57BL / 6 mus immuniseres med myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG)-peptid 35-55 (MOG 35-55), hvilket resulterer i en stigende paralyse forårsaget af autoreaktive immunceller i det centrale nervesystem. Protokoller for sygdom induktion og overvågning vil blive diskuteret.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (86), e51275, doi:10.3791/51275 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Multipel sklerose er en kronisk Neuroinflammatoriske demyeliniserende sygdom i centralnervesystemet med en stærk neurodegenerativ komponent. Mens den nøjagtige ætiologi af sygdommen er endnu uklar, er autoreaktive T-lymfocytter menes at spille en central rolle i patofysiologien. MS terapi er kun delvist effektive hidtil og forskningsindsats fortsætte med at udvide vores viden om sygdommens patofysiologi og at udvikle nye behandlingsstrategier. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er den mest almindelige dyremodel for MS deler mange kliniske og patofysiologiske funktioner. Der er en bred mangfoldighed af EAE modeller, der afspejler forskellige kliniske, immunologiske og histologiske aspekter af menneskelige MS. Aktivt induceret EAE i mus er den nemmeste inducerbare model med robuste og reproducerbare resultater. Den er specielt velegnet til at undersøge virkningerne af narkotika eller bestemte gener ved hjælp af transgene mus udfordret af autoimmun neuroinflammation. Derfor immuniseres mus med CNS homogenater eller peptider af myelin proteiner. Grundet den lave immunogene potentiale af disse peptider, er stærke adjuvanser anvendes. EAE modtagelighed og fænotype afhænger af den valgte antigen og gnaver stamme. C57BL / 6 mus er det almindeligt anvendte belastning for transgene mus konstruktion og svare blandt andre til myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG). Det immunogene epitop MOG 35-55 suspenderes i komplet Freunds adjuvans (CFA) forud for immunisering og pertussistoksin anvendes på dagen for immunisering og to dage senere. Mus udvikle en "klassisk" selvbegrænsende monofasisk EAE med stigende lammelse indenfor 9-14 dage efter immunisering. Mus bedømmes dagligt ved hjælp af en klinisk Pointsystemet for 25-50 dage. Særlige overvejelser til pleje udtagning af dyr med EAE samt potentielle anvendelser og begrænsninger i denne model diskuteres.

Introduction

Multipel sklerose (MS) er en kronisk demyeliniserende inflammatorisk sygdom i centralnervesystemet, hvor ødelæggelsen af ​​oligodendrocytter og neuroner resulterer i heterogene og akkumulere kliniske symptomer. MS betragtes som en prototypisk autoimmun sygdom i centralnervesystemet (CNS) og dyremodeller er blevet udviklet til at kaste lys på dens komplekse patogenese. Endvidere nuværende behandlinger er kun delvis effektive og målrette hovedsagelig inflammatorisk fase af sygdommen, mens den neurodegenerative komponent er sandsynligvis den store udfordring for fremtidig terapeutisk nærmer 1,2.

Mens den nøjagtige ætiologi af sygdommen er endnu uklar, er en autoimmun reaktion mod epitoper på myelinskeden af ​​axoner i centralnervesystemet antages at provokere sygdommens opståen. Dysregulering af immunsystemet, genetiske sårbarhed og miljømæssige faktorer (f.eks infektioner, vitamin D) menes atpåvirke centrale aspekter af patofysiologiske mekanismer i MS.

Tre forskellige typer af dyremodeller er i øjeblikket etableret for udforskning af patologiske mønstre af MS: Virale modeller som Theilers murine encephalomyelitis virus (TMEV), modeller, induceret af giftige stoffer som cuprizone, og endelig forskellige varianter af eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) 3, 4.. Selv om de alle efterligne funktioner i MS, de adskiller sig voldsomt i de underliggende patologiske funktioner som inddragelse af det adaptive immunsystem. EAE er den mest almindelige dyremodel, som det er især nyttig til at undersøge neuroinflammatoriske veje og fungerer ofte som en "proof-of-principle" model for effekten af nye behandlingsstrategier 5,6. EAE kan induceres i mange forskellige dyr (fx mus, rotter, miniswine, marsvin, høns eller primater). Imidlertid har mus blevet den mest udbredte brug art, som i det mindste delvis skyldestil at udvide repertoire af sofistikeret transgene eller knockout mus 7.

Patofysiologien af ​​EAE er baseret på reaktionen af ​​immunsystemet mod hjerne-specifikke antigener. Denne reaktion inducerer inflammation og destruktion af antigen regnskabsmæssige strukturer, hvilket resulterer i neurologiske og patologiske træk sammenlignelige som dem, der observeres i MS-patienter. Der kan skelnes mellem tre forskellige tilgange: Aktivt induceret EAE (aEAE, aktiv immunisering), passivt overført EAE (pEAE, overførsel af encephalitogene celler fra et immuniseret dyr), og for nylig spontane EAE musemodeller (sEAE), der giver studiet af autoimmune mekanismer uden exogen manipulation. Den nemmeste inducerbare model er aEAE i mus der giver i hurtige og robuste resultater. Denne model betragtes som "gold standard" for neuroimmunologiske dyremodeller af mange forskere på området 8.

For aEAE induktion dyretimmuniseres med en subkutan injektion af en emulsion bestående af det valgte antigen og komplet Freunds adjuvans (CFA), ledsaget af en intraperitoneal injektion af pertussistoksin på dagen for immunisering og to dage senere. Derfor er myelin-specifikke T-lymfocytter aktiveres i periferien og migrere ind i CNS gennem blod-hjerne-barrieren. Ved indrejse i CNS, er T-celler reaktiveres ved lokale og infiltrerer antigenpræsenterende celler resulterer i efterfølgende inflammatoriske kaskader, inddragelse af andre celler som monocytter eller makrofager og til sidst i demyelinisering og aksonal celledød 9. Afhængig immuniseringsprotokollen og kombination af musestamme (f.eks C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) og antigen (f.eks myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG), myelin basic protein (MBP), myelin proteolipidprotein (PLP)) sygdommen Selvfølgelig kan tage en akut, kronisk progressiv eller attakvis sygdomsforløbet.

35-55 peptid 10, hvilket resulterer i en monofasisk EAE med første symptomer efter 9-14 dage, maksimum sygdom ca 3-5 dage efter sygdomsdebut og langsom og delvis symptom opsving over de næste 10-20 dage. Som det immunogene potentiale MOG 35-55 peptid alene ikke er tilstrækkelig til at fremkalde sygdom, adjuvanser, såsom CFA er nødvendige. Det antages, at komponenterne i CFA aktivere mononukleære fagocytter inducerer fagocytose af disse molekyler og sekretion af cytokiner. Dette resulterer i en forlængelse af tilstedeværelsen af ​​antigener og en mere effektiv transport af disse til lymfesystemet. EAE induktion lettes ved anvendelse af pertussistoksin (PT), der blandt andet blevet foreslået at modulereblod-hjerne-barrieren og immunologiske funktion selv 11. Efter sygdom induktion, skal der tages særlig pleje til daglig evaluering af mus til sygdomssymptomer.

Protocol

1.. Generelle bemærkninger til museforsøg

  1. Alle forsøg med mus bør udføres i overensstemmelse med retningslinjerne i den respektive institutionelle dyrepleje og brug udvalg.
  2. Hold musene under patogenfrie forhold og sætte dem i stand til at få adgang til mad og vand ad libitum. Bemærk: Det er vigtigt at bruge alders-og køn-matchede mus i eksperimentelle grupper, fordi modtagelighed for sygdommen kan variere med alder og køn.
  3. Afhængig af den valgte eksperimentelle betingelser, kan en farce-immuniserede kontrolgruppe overvejes hvor MOG 35-55 peptid erstattes af enten PBS uden antigen eller en nonencephalitogenic peptid.
  4. Overvej venligst metodologiske aspekter før start eksperimenter (se også nedenfor). Vi anbefaler, at inddrage en eller to blindede observatører til EAE scoring.

2. Fremstilling af MOG 35-55 Emulsion

  1. 200 pi af et 1:1 forhold af MOG 35-55 peptid-opløsning og CFA bør injiceres i hver mus. Der er et vist tab af tyktflydende emulsion, mens forbereder og injektion. Derfor forberede 1,5 2x af den nødvendige mængde. Beregn det samlede volumen af emulsionen og dividere med 2 for de nødvendige mængder af både MOG 35-55 peptid-løsning, og CFA.
  2. Fortyndet lyofiliseret MOG 35-55 i ddH2O til en slutkoncentration på 2 mg / ml. Vi plejer at bruge 200 ug MOG 35-55 peptid per mus. Dette beløb er indeholdt i 100 pi af stamopløsningen. Peptidet skal opbevares ved -20 ° C.
  3. Placer indholdet af 1 hætteglas med udtørret Mycobacterium tuberculosis H37Ra (100 mg) i en morter.
    1. Ground med morter og støder for at opnå en tynd pulver.
    2. Der tilsættes 10 ml ufuldstændig Freunds adjuvanser for at opnå en 10 mg / ml CFA stamopløsning, som kan opbevares ved 4 ° C.
    3. Forud for immunisering, fortynde CFA stamopløsning with IFA til en slutkoncentration på 2 mg / ml. Bland grundigt før hver brug for at opblande partikulært materiale og overveje nogle volumen tab af tyktflydende løsning under de eksperimentelle præparater.
    4. Bland 1:1 med MOG 35-55 peptid-opløsning, indtil den endelige koncentration på 1 mg / ml er nået.
      ADVARSEL: Varmedræbte Mycobacterium tuberculosis stimulerer medfødt immunrespons. Undgå indånding, indtagelse og kontakt med hud og øjne.
  4. Forkøling løsninger på is.
    1. Udarbejde 1 ml 2 mg / ml CFA og 1 ml 2 mg / ml MOG 35-55 løsning i to 2 ml sprøjter. Beregne antallet af sprøjter, der er nødvendige i forhold til antallet af immuniserede dyr.
      ADVARSEL: Strengt undgå syning under forberedelsen af ​​adjuvans da det kan forårsage granulomer eller inducere autoimmune reaktioner.
    2. Brug en 27 G kanyle til MOG 35-55 løsning og en 20 G kanyle til CFA. Undgå luftbobler og forbinde de to sprøjter med påhree-vejs-ventil.
    3. Send emulsionen fra den ene sprøjte til den anden og blandes i mindst 10 min som en god emulgering er et kritisk trin. Nær-lukke trevejs-ventil til at understøtte emulgering. Opløsningen skal være hvid, stiv og tyktflydende med ingen adskillelse af faser.
    4. Emulsion kan opbevares i flere dage forud for immunisering. Vent mindst 30 minutter efter at forberede emulsionernes at observere, om de er stabile. Forud for immunisering, tegne løsningen i en af ​​to sprøjter og tilslut en 27 G kanyle.

3.. Fremstilling af pertussistoksin

  1. Forskellige mængder af pertussistoksin kan findes i litteraturen, som også afhænger af administrationsvejen (fx intravenøst ​​eller intraperitonealt). Vores laboratorieformål 400 ng pertussis-toksin i 200 pi PBS intraperitonealt på dagen for immunisering og to dage senere. ADVARSEL: Pertussistoksin har mange biologiske effekter. Undgå indånding, indtagelse og kontakt med hud og øjne.
  2. Opløs 50 ug pertussistoxin i 500 ul ddH2O for en 100 mg / ml stamopløsning. Opbevares ved 4 ° C.
  3. Fortynd 1:50 med PBS. 200 pi indeholder nu 400 ng PBS. Forbered den nødvendige mængde af sprøjter og overveje en ekstra overskud volumen på ~ 100 pi for hver nål hub.

4.. Animal Vaccination

  1. Der henvises til den institutionelle dyrepleje og brug udvalg for specifikke kriterier for påkrævede kortfristede dødshjælp. Vores laboratorieformål kort narcotization med isofluran mens andre protokoller såsom ketamin / xylazin injektion eller halothan også kan være muligt. Vent til anæstesi og bruge en forreste fod tå knibe for at vurdere niveauet af anæstesi.
  2. Sørg for, at immunisering udføres af en erfaren person til at minimere stress for dyrene og for at sikre optimal immunisering.
  3. Indsprøjtes 100 pi antigen / CFA emulsion subkutant i to forskellige steder på hver hind flanke. Sørg for, at et løgformet masse formularer under huden, som skulle vare ved gennem hele eksperimentet.
  4. Injicer 200 pi pertussistoksin intraperitonelly.
  5. Sørg for, at nemt kan identificeres individuelle mus til daglig evaluering, fx ved farvemarkering på halen base.
  6. Administrere en anden dosis af pertussistoxin på dag to efter immunisering.

5.. EAE Overvågning

  1. Vægt og klinisk score skal vurderes dagligt. Starten af ​​EAE typisk korrelerer med vægttab, som kan anvendes som en indikator for sygdomsaktivitet. Der henvises til den institutionelle dyrepleje og bruge udvalg til at forhåndsdefinere kriterier, når de enkelte mus har at blive taget ud af forsøgene. Dette bør overvejes, når vægttab over 20% af den oprindelige kropsvægt, eller når alvorlige kliniske tegn (EAE score 7 eller værre) forekomme. Der henvises til respektive retningslinjer for respektive institutionelle dyrepleje og brug udvalg for de maksimalt tilladte scoringer.
  2. Når mus har kliniske symptomer på EAE, er det vigtigt at sikre, at vandet flasken stadig kan nås, og at fødevaren er placeret på buret gulvet.
  3. Forskellige scoring symptomer kan anvendes. I vores laboratorium er etableret en skala fra 0-10.
Grade Klinisk tegn Kommentar
0 Ingen kliniske tegn Normal gangart, hale bevæger sig og kan hæves, hale ombrydes omkring en rund genstand, hvis musen holdes ved haleroden
1 Delvist slap hale Normal gangart, halespids droops
2 Lammet hale Normal gangart, hale droops
3 Bagben parese, ukoordineret bevægelse Ukoordineret gangart, hale limps, bagben reagere på klemme
4. Et bagben lammet Ukoordineret gangart med et bagben trække, hale limps, man bagben ikke reagere på klemme
5. Begge bagbenene lammet Ukoordineret gangart med begge bagben trække, hale limps, gøre begge bagben ikke reagere på klemme
6 Bagbenene lammet, svaghed i forelimbs Ukoordineret gangart med forelimbs kæmper for at trække kroppen, forelimbs refleks efter klemme, hale limps
7 Bagbenene lammet ene forben lammet Mus kan ikke bevæge sig, den ene forben reagerer på tå knibe, hale limps
8. Bagbenene lammet begge forelimbs lammet Mus kan ikke flytte begge forelimbs ikke reagerer på tå knibe, hale limps
9 Døende Ingen bevægelse, ændret vejrtrækning
10 Død

Tabel 1. Klinisk pointsystem.

Representative Results

Efter immunisering har mus evalueres dagligt for ændringer i vægt og kliniske symptomer. Sygdomsudbruddet er typisk korreleret med en reduktion af vægten, der kan begynde 1-2 dage før EAE symptomer er synlige. Kliniske tegn på EAE begynder normalt mellem dag 9 og 14 efter immunisering. Læsioner overvejende er lokaliseret til rygmarven i MOG-EAE hos C57BL / 6 mus, udvikler typisk de overvejende motoriske symptomer i en caudale til rostralt mønster. En eksemplarisk billede af et immuniseret mus med EAE symptomer (score 6) er afbildet i figur 1A. Nogle atypiske EAE symptomer kan også forekomme, såsom rullende i aksial-roterende måde, scor foroverbøjet udseende eller overfølsomhed, som ikke er afspejlet i den klassiske EAE afbildet i tabel 1. Som motoriske symptomer er den vigtigste egenskab i denne model, er denne score giver os en god indikation af sygdommens sværhedsgrad. Forskellige overvågningssystemer (f.eks 0 -5 eller 0-6), og mere komplekse sammensatte scoringer vurderer forskellige underskud er også blevet offentliggjort. Bemærk venligst, at mus med svære symptomer skal tages ud af forsøget i henhold til den respektive institutionelle dyrepleje og brug udvalg. Mus viser generelt delvis tilbagebetaling af symptomer i løbet af de næste 10-20 dage. En repræsentativ sygdomsforløb er afbildet i figur 1B. Der er forskellige tidspunkter i løbet af EAE, der er af interesse for at vurdere outcome parametre. Nogle typiske analyser som ofte kan findes, er beskrevet meget kort. Ved maksimal sygdom, kan mus evalueres for cytokinproduktion eller proliferation efter restimulering af isolerede immunceller med MOG 35-55 peptid in vitro (MOG tilbagekaldelse assay). Immunceller kan også isoleres fra hjerne og rygmarv fra mus med EAE symptomer og behandles yderligere, fx ved flowcytometri. Histologisk analyse af rygmarv sektioner kan udføres ved sygdom mMAKSIMALGRÆNSEVÆRDIER for læsionsbyrden og demyelinisation mens på senere tidspunkter markører for neurodegeneration og neuronal celledød kunne være af interesse.

Figur 1
Figur 1. Repræsentant EAE resultater. A. repræsentativt billede af et immuniseret C57BL / 6 mus med EAE symptomer (EAE score 6). B. Repræsentant sygdomsforløbet efter immunisering i løbet af 30 dage. Data er vist som middelværdi og standardafvigelse på middelværdien (n = 5). Klik her for at se større billede .

Discussion

Et væld af forskellige EAE-modeller med aktive immuniseringsprotokoller er blevet beskrevet i de seneste årtier. Mens rottemodeller er ofte blevet brugt indtil for nylig, er mus nu den mest populære model organisme til EAE forskning. Denne udvikling er blandt andet på grund af den brede og stadigt voksende repertoire af tilgængelige transgene mus. Immunisering af C57BL / 6 mus med MOG 35-55 peptid er en af de mest udbredte EAE-modeller og kan betragtes som en pålidelig, reproducerbare og godt at bruge dyremodel. I mange neuroimmunologiske laboratorier er MOG 35-55 induceret EAE etableret som den model af valg, mens andre EAE modeller bruges til mere specifikke eksperimentelle spørgsmål.

Et kritisk punkt at overveje, er planlægningen af ​​de eksperimentelle indstillinger for at sikre, at EAE eksperimenter udføres metodisk korrekt. For intern validitet er blindet scoring af sygdomssymptomer stærkt anbefales. Experimental grupper skal være alderssvarende, vægt-og køn-matchede og mus bør der tilfældigt allokeret til behandlingsgrupper. Forsøgene bør altid udføres i overensstemmelse med regler for dyrevelfærd. EAE undersøgelser er ofte underdimensioneret og ikke tager højde for statistiske type II fejl. Derfor, forud for eksperimenter beregninger prøvestørrelses skal udføres. Nødvendige gruppe størrelser afhænger af den forventede effekt størrelse. Høring af en ekspert til statistisk analyse kunne overvejes, før du starter EAE eksperimenter.

Nogle begrænsninger af protokollen skal holdes for øje. Vigtigst er fortolkningen af ​​aEAE data kompromitteret af den tilstand af immunisering med anvendelse af adjuvans og pertussistoksin der begge har yderligere indflydelse på den immunologiske reaktion. Det bør også overvejes at MOG 35-55 EAE model viser primært CD4 + T-celle drevet immunologisk respons. CD8 + T-celler og B-celler spilleren mindre fremtrædende rolle og alternative protokoller bør overvejes, når man behandler disse celletyper. Den forventede sygdomsforløb er akut, monofasiske og selvbegrænsende. Alternativt kan en anfaldsformen naturligvis også opnås i alternative EAE-modeller. En yderligere vigtig begrænsning af protokollen er en vis skævhed i retning af den immunologiske komponent MS patofysiologi. I de seneste år er det blevet stadig mere klart, at MS har en stærk neurodegenerativ komponent. Død af oligodendrocytter og neuroner resulterer i en progressiv akkumulering af neurologiske underskud. Det skal tages i betragtning, at EAE modellen ikke kan fuldt ud egnet til at løse eksperiment spørgsmål vedrørende neurodegenerative mekanismer autoimmun inflammation. Alternative dyremodeller med fokus på CNS-patologi kan betragtes - f.eks cuprizone model, som kompromitterer giftig demyelination uden involvering af perifere immunsystem.

Den beskrevne protokol kan betragtes som en grundlæggende neuroimmunologiske eksperimentel model og kan ændres til andre anvendelser. Den eksperimentelle procedure beskrevet ovenfor, kan nemt anvendes på andre EAE-protokoller ved varierende mus stammer eller typen og mængden af protein (fx bruge PLP 139-151 peptid og SJL-mus til en recidiverende-remitterende EAE sygdom kursus, som er specielt velegnet til at vurdere terapeutisk virkninger på tilbagefald). Den beskrevne protokol kan også anvendes til adoptiv-transfer eksperimenter (passiv EAE). I denne model er C57BL / 6 mus immuniseret med MOG 35-55 peptid og CFA som beskrevet ovenfor. I modsætning hertil er pertussistoksin ikke påkrævet. Efter 7-15 dage, milt eller lymfeknuder isoleres og immune celler restimuleret in vitro med MOG 35-55 peptid og forskellige cytokiner før overførsel til en ny gruppe af C57BL/6se mus. Disse recipientmus udvikler EAE et par dage tidligere end ved klassisk immunisering. In vitro-betingelser kan varieres til specifikke immunologiske spørgsmål (fx polarisering i T H 1 eller T H 17 celler).

Nogle gange kan lave forekomst sygdom eller svage symptomer være en eksperimentel udfordring. Nogle anbefalinger til fejlsøgning er:

- Sygdom sværhedsgraden kan varieres med forskellige mængder af peptid / mus.

- Optimal CFA koncentration kan variere fra 1-5, mg / ml. Overvej en titrering af CFA, når oprettelse af forsøgene. Der henvises til de respektive retningslinjer for respektive institutionelle dyrepleje og brug udvalg for tilladte CFA koncentrationer så mange regler forbyde CFA koncentrationer over 2 mg / ml.

- Forskellige metoder er beskrevet for udarbejdelse af emulsionen. Alternative metoder såsom vortex i 1 time eller lydbehandling kan overvejes, hvis dårlig emulgering betragtes som possible fejlkilde.

- Alder, køn, årstid og miljøforholdene inden dyret facilitet er vigtige faktorer, der påvirker EAE modtagelighed. Det bør sikres, at vilkårene er sammenlignelige mellem uafhængige forsøg.

Som beskrevet ovenfor kan nævnte protokol anvendes som udgangspunkt for adoptiv EAE forsøg. Denne model er specielt velegnet til adskillelse randområder og CNS-virkninger af en genetisk fænotype (fx ved at overføre encephalitogene knockout celler i vildtypemus recipientmus) og for specifikke immunologiske spørgsmål som fænotypen af de overførte celler kan karakteriseres grundigt. Den seneste udvikling i EAE forskning i løbet af de seneste år er T-celle receptor transgene mus. Disse mus udvikler EAE symptomer spontant uden ydre påvirkning omgå problemet med adjuverende podning. Denne model kræver imidlertid store mængder dyr til breeding at sikre tilstrækkelige gruppe størrelser. Evaluering af knockout-mus kræver krydsning før EAE forsøg i modsætning til aEAE. Da hver mus udvikler sygdomssymptomer på en anden dag, kan vurderingen af ​​nye stoffer være temmelig kompliceret. Derfor er værdien af ​​klassisk aEAE for neuroimmunologiske forbliver uændret.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Interdisciplinært Center for Klinisk Forskning (IZKF) Münster (SEED 12/3, SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight e.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) e.g. Pepceuticals Ltd Store at -20 °C
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Sigma-Aldrich Co. F5506 Store at 4 °C
Syringes, 1 ml with 26 G 3/8 in needle  e.g. Becton Dickinson & Co. 309625
Syringes, 2 ml e.g. B. Braun 7389
Needles, 25 G 5/8 in and 30 G 1/2 in  e.g. Becton Dickinson & Co., 305122, 305106
Three way valve e.g. B. Braun 16494 C
Pertussis toxin, lyophilized in buffer Enzo Life Sciences Inc. BML-G100 Store at 4 °C
M. tuberculosis H37 RA BD Difco 231141 Store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Wiendl, H. Neuroinflammation: the world is not enough. Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).
  3. vander Star, B. J., et al. In vitro and in vivo models of multiple sclerosis. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).
  4. Pachner, A. R. Experimental models of multiple sclerosis. Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).
  5. Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).
  6. Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis. Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).
  7. Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. EAE: an immunologist's magic eye. Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).
  8. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).
  9. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).
  10. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).
  11. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J. Immunol. 169, 117-125 (2002).

Comments

5 Comments

  1. Dear Authors - you describe various conditions that contribute to a less than adequate disease response. But, do you have experience with conditions that create an exaggerated response in C57/Blk6 Jax, that result in animals dieing due to severe neurologic signs, rather than stabilizing and recovering as your discussion describes? For the past year, we have been struggling with a model that "used to work" at Harvard, but since moving to the National Cancer Institute, the model fails in that the previously resistant Tbet-/- (Tbx21) mice now develop EAE and both they and the Blk6 proceed to death. We have ruled out/excluded pathogens/commensals (segmented filamentous bacteria, Helicobacter, and norovirus), we have tried to emulate the same husbandry conditions as Harvard (using sterile micro-isolator caging, acidified water, even switching to a different diet)- but to no avail. Do you have any suggestions?

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 24, 2016 - 12:32 PM
  2. Dear Melody,
    these are rather strange experiences and my guess would be that there is a General Problem which renders your mice so over-succeptible to EAE. These changes are not so uncommon and can be rather tricky to solve. My advice would be to:
    - Try a delivery of your mice to another animal Provider (in europe we would for example choose Harlan or Janvier instead)
    - Try another animal housing facility at your University if available - the specific Environment can result in tremendous differences (even if there are no pathogens), People Report that regularly. The microbiome is suspected to be responsible for that while there are no specific tests for that.
    - Of course reduce amount of MOG (100 µg or lower)
    Hope that helps and good luck!
    Best, Stefan

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 25, 2016 - 9:16 AM
  3. Stefan- Thank you for your response. The investigator was using 100ug MOG and dropped it to 50ug, but this has not changed the profiles. We have done replicate studies in different facilities - same problem. Yesterday I found the following intriguing comments on the commercial Hooke EAE CRO site - they stated that you must titrate the pertussis dose for each lab, and if EAE is too severe, lower the dose (see below). Have you ever heard of this before? Does this sound reasonable? If you could give me your email, I can send you some of our mean clinical score graphs and you will see our problem. Here is their web site.
    http://www.hookelabs.com/protocols/eaeAI_C57BL6.html
    "Titration for optimal dosage of pertussis toxin. We strongly recommend that new customers establish the optimal PTX dose by inducing EAE in 10 mice in their own lab. The optimal PTX dose needed to obtain good EAE is typically 100 to 250 ng/mouse for each of the two PTX administrations. Larger doses of PTX are needed if mice experience higher levels of stress. The dose required decreases with mouse age. Even with identical mice and reagents, the PTX dose required varies from lab to lab. Finally, PTX potency varies from lot to lot; this affects the required dose. Hooke tests each lot of PTX in mice; the dilutions recommended in this protocol are the result of our testing.
    To determine the best PTX dose for the lab conditions, adjust PTX concentration to 4 µg/mL; this gives 400 ng PTX in each 0.1 mL dose (6000/1.5*0.1). Immunize 10 mice. Score mice daily starting 7 days after immunization, continuing until 28 days after immunization. (See Appendix A - EAE scoring guide.)

    If EAE is too severe, reduce PTX concentration to ~2.8 – 3.4 µg/mL (280 to 340 ng PTX/dose).
    If EAE is too mild, a higher dose of PTX is required;

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 25, 2016 - 12:03 PM
  4. My email is stefan.bittner@unimedizin-Mainz.de, you can reply directly there.
    I know Hooke kits and to our experience there is no obvious Change compared to self-made Solutions (for some People they work a bit better, for others not) - the main reason why we are not working with them routinously are Price + no flexibility in MOG/CFA composition.
    Pertussis: We never had Problems there and are not doing the testing (perhaps we are just lucky that our ptx is quite stable from Batch to Batch), but i know that other labs are doing the Titration as described by you and it might be a good Point for Trouble-Shooting!

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 27, 2016 - 6:20 AM
  5. Dear Stefan,

    I am trying to induce EAE in a B6/129 mixed background strain of mice. I wonder would the same protocol work?
    Thanks,

    Donghai

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 1, 2016 - 6:41 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics