Myelin Oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG
1Department of Neurology, University of Münster, 2Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF), Münster, 3Institute of Physiology – Neuropathophysiology, University of Münster

Published 4/15/2014
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Immunology and Infection
 

Summary

प्रायोगिक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) एकाधिक काठिन्य के एक स्थापित पशु मॉडल है. C57BL 6 / चूहों केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में autoreactive प्रतिरक्षा कोशिकाओं की वजह से एक आरोही झूलता हुआ पक्षाघात में जिसके परिणामस्वरूप, माइलिन oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG) पेप्टाइड 35-55 (MOG 35-55) के साथ प्रतिरक्षित कर रहे हैं. रोग प्रेरण और निगरानी के लिए प्रोटोकॉल पर चर्चा की जाएगी.

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Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (86), e51275, doi:10.3791/51275 (2014).

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Abstract

एकाधिक काठिन्य एक मजबूत neurodegenerative घटक के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की एक पुरानी neuroinflammatory demyelinating विकार है. रोग की सटीक एटियलजि अभी तक स्पष्ट नहीं है, autoreactive टी लिम्फोसाइट अपने pathophysiology में एक केंद्रीय भूमिका निभाने के लिए लगा रहे हैं. एमएस चिकित्सा अब तक केवल आंशिक रूप से प्रभावी है और अनुसंधान के प्रयासों की बीमारी के pathophysiology पर हमारे ज्ञान का विस्तार करने और उपन्यास उपचार रणनीति विकसित करने के लिए जारी है. प्रायोगिक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) एमएस कई नैदानिक ​​और pathophysiological सुविधाओं को साझा करने के लिए सबसे आम पशु मॉडल है. मानव एमएस के अलग, नैदानिक ​​प्रतिरक्षाविज्ञानी और ऊतकीय पहलुओं को प्रतिबिंबित जो EAE मॉडल की एक व्यापक विविधता है. चूहों में सक्रिय रूप से प्रेरित EAE मजबूत और replicable परिणामों के साथ सबसे आसान inducible मॉडल है. यह विशेष रूप से autoimmune neuroi द्वारा चुनौती ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके दवाओं की या विशेष जीन के प्रभाव की जांच के लिए अनुकूल हैnflammation. इसलिए, चूहों सीएनएस homogenates या माइलिन प्रोटीन के पेप्टाइड्स के साथ प्रतिरक्षित कर रहे हैं. कारण इन पेप्टाइड्स के कम immunogenic क्षमता को मजबूत, adjuvants उपयोग किया जाता है. EAE संवेदनशीलता और phenotype चुना प्रतिजन और कृंतक तनाव पर निर्भर करता है. C57BL 6 / चूहों ट्रांसजेनिक माउस निर्माण के लिए आमतौर पर इस्तेमाल तनाव हैं और माइलिन oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG) के लिए दूसरों के बीच में जवाब. immunogenic मिलान MOG 35-55 दो दिन बाद टीकाकरण के दिन पर लागू है और पूरा Freund के सहायक (सीएफए) से पहले टीकाकरण और काली खांसी विष में निलंबित कर दिया है. चूहे टीकाकरण के बाद 9-14 दिनों के भीतर झूलता हुआ पक्षाघात आरोही साथ एक "क्लासिक" आत्म सीमित monophasic EAE विकास. चूहे 25-50 दिनों के लिए एक नैदानिक ​​स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग दैनिक मूल्यांकन कर रहे हैं. देखभाल EAE के साथ जानवरों के रूप में लेने के साथ ही इस मॉडल के संभावित अनुप्रयोगों और सीमाओं के लिए विशेष ध्यान चर्चा कर रहे हैं.

Introduction

मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की एक पुरानी demyelinating सूजन की बीमारी है जिसमें heterogenic और जमते नैदानिक ​​लक्षणों में oligodendrocytes और न्यूरॉन्स के परिणाम के विनाश. एमएस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के एक prototypic autoimmune विकार के रूप में माना जाता है और पशु मॉडल इसकी जटिल रोगजनन पर प्रकाश डाला करने के लिए विकसित किया गया है. इसके अलावा, मौजूदा चिकित्सा केवल आंशिक रूप से प्रभावी हैं और neurodegenerative घटक शायद भविष्य चिकित्सकीय के लिए बड़ी चुनौती है, जबकि मुख्य रूप से रोग के भड़काऊ चरण को लक्ष्य 1,2 दृष्टिकोण.

रोग की सटीक एटियलजि अभी तक स्पष्ट नहीं है, सीएनएस में axons की माइलिन आवरण पर epitopes के खिलाफ एक autoimmune प्रतिक्रिया रोग की शुरुआत को भड़काने के लिए माना जाता है. प्रतिरक्षा प्रणाली, आनुवंशिक भेद्यता और पर्यावरणीय कारकों (जैसे संक्रमण, विटामिन डी) की dysregulation माना जाता हैएमएस के pathophysiological तंत्र के प्रभाव केंद्रीय पहलुओं.

पशु मॉडल की तीन अलग अलग प्रकार वर्तमान में एमएस की वैकृत पैटर्न की खोज के लिए स्थापित कर रहे हैं: Theiler के murine इंसेफैलोमाईलिटिस वायरस (TMEV) जैसे वायरल मॉडल, cuprizone तरह विषाक्त एजेंटों द्वारा प्रेरित मॉडल, और प्रयोगात्मक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) 3 के अंत में अलग वेरिएंट, 4. वे सभी एमएस की विशेषताओं की नकल है, वे अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की भागीदारी जैसे अंतर्निहित रोग सुविधाओं में काफी मतभेद है. यह neuroinflammatory रास्ते की जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी है और अक्सर उपन्यास उपचार रणनीति 5,6 की प्रभावकारिता के लिए एक "सबूत के सिद्धांत" मॉडल के रूप में कार्य करता है के रूप में EAE सबसे आम पशु मॉडल है. EAE कई विभिन्न जानवरों (जैसे चूहे, चूहे, miniswine, गिनी सूअर, मुर्गी, या प्राइमेट) में प्रेरित किया जा सकता है. हालांकि, चूहों में कम से कम आंशिक रूप से कारण है जो सबसे अधिक व्यापक रूप से उपयोग प्रजातियों बन गए हैंपरिष्कृत ट्रांसजेनिक या पीटा चूहों 7 के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार करने के लिए.

EAE के pathophysiology मस्तिष्क के विशिष्ट एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया पर आधारित है. यह प्रतिक्रिया तुलनीय तंत्रिका विज्ञान और रोग सुविधाओं में जिसके परिणामस्वरूप, प्रतिजन ले जाने संरचनाओं की सूजन और विनाश को प्रेरित करता है जो एमएस रोगियों में मनाया उन. तीन अलग अलग दृष्टिकोण प्रतिष्ठित किया जा सकता है: सक्रिय प्रेरित EAE (aEAE; सक्रिय प्रतिरक्षण); autoimmune के अध्ययन की अनुमति है, जो और अधिक हाल ही में सहज EAE माउस मॉडल (sEAE) निष्क्रिय EAE तबादला, (एक प्रतिरक्षित पशु से मस्तिष्कशोथ उत्पन्न करने वाला कोशिकाओं के हस्तांतरण pEAE) एक्सोजेनस हेरफेर के बिना तंत्र. सबसे आसान inducible मॉडल तेजी से और मजबूत परिणामों में उपज चूहों में aEAE है. इस मॉडल क्षेत्र 8 में कई शोधकर्ताओं द्वारा neuroimmunological पशु मॉडल की "सोने के मानक 'के रूप में माना जाता है.

AEAE शामिल होने के लिए, पशुचुना प्रतिजन से मिलकर एक पायस की एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ प्रतिरक्षित और टीकाकरण के दिन और दो दिन बाद पर काली खांसी विष की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ Freund के adjuvans (सीएफए) पूरा हो गया है. नतीजतन, माइलिन विशेष टी लिम्फोसाइट परिधि में सक्रिय है और रक्त मस्तिष्क बाधा पार सीएनएस में प्रवास कर रहे हैं. सीएनएस में प्रवेश पर, टी कोशिकाओं monocytes या मैक्रोफेज और अंततः demyelination और axonal कोशिका मृत्यु 9 में जैसे अन्य कोशिकाओं के बाद भड़काऊ Cascades, भागीदारी में जिसके परिणामस्वरूप स्थानीय और घुसपैठ प्रतिजन कोशिकाओं पेश द्वारा पुन: सक्रिय कर रहे हैं. प्रतिरक्षण प्रोटोकॉल और माउस तनाव के संयोजन पर निर्भर करता है (जैसे C57BL / 6, SJL / जम्मू, Biozzi) और प्रतिजन (जैसे माइलिन oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG), माइलिन बुनियादी प्रोटीन (MBP), माइलिन proteolipid प्रोटीन (पीएलपी)), रोग बेशक एक तीव्र, पुरानी प्रगतिशील या relapsing प्रेषक रोग पाठ्यक्रम ले जा सकते हैं.

35-55 पेप्टाइड 10 के साथ C57BL 6 / चूहों के टीकाकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन अगले 10-20 दिनों में खत्म. अकेले MOG 35-55 पेप्टाइड की immunogenic संभावित रोग को उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त नहीं है, ऐसे सीएफए के रूप में adjuvants जरूरी हैं. यह सीएफए के घटकों इन अणुओं की phagocytosis और साइटोकिन्स के स्राव उत्प्रेरण मोनोन्यूक्लियर फ़ैगोसाइट को सक्रिय करता है, माना जाता है. इस एंटीजन की उपस्थिति और लसीका प्रणाली के लिए इनमें से एक अधिक कुशल परिवहन की मोहलत में यह परिणाम है. EAE प्रेरण दूसरों के बीच में मिलाना करने का सुझाव दिया गया है जो काली खांसी विष (पीटी) के आवेदन से मदद की हैरक्त मस्तिष्क बाधा और प्रतिरक्षा जवाबदेही ही 11. रोग प्रेरण के बाद, विशेष देखभाल की बीमारी के लक्षणों के लिए चूहों की दैनिक मूल्यांकन के लिए लिया जाना चाहिए.

Protocol

माउस प्रयोगों के लिए 1. जनरल टिप्पणियां

  1. चूहों का उपयोग सभी प्रयोगों संबंधित संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए.
  2. रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में चूहों रखें और भोजन और पानी यथेच्छ के लिए उपयोग कर सकें. नोट: बीमारी के लिए संवेदनशीलता उम्र और लिंग के साथ भिन्न हो सकते हैं क्योंकि यह प्रयोगात्मक समूहों में उम्र और सेक्स से मिलान चूहों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  3. MOG 35-55 पेप्टाइड प्रतिजन या एक nonencephalitogenic पेप्टाइड के बिना या तो पीबीएस की जगह है, जहां चुना प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करता है, एक दिखावा प्रतिरक्षित नियंत्रण समूह माना जा सकता है.
  4. (भी नीचे देखें) से पहले प्रारंभिक प्रयोगों को methodological पहलुओं पर विचार करें. हम EAE स्कोरिंग के लिए एक या दो अंधे पर्यवेक्षकों को शामिल करने की सलाह देते हैं.

MOG 35-55 पायस की 2. तैयारी

  1. एमओ की एक 1:1 के अनुपात के 200 μlजी 35-55 पेप्टाइड समाधान और सीएफए प्रत्येक माउस को इंजेक्ट किया जाना चाहिए. तैयारी और इंजेक्शन लगाने जबकि चिपचिपा पायस की कोई क्षति होती है. इसलिए, आवश्यक राशि का 1.5-2x तैयार करते हैं. MOG 35-55 पेप्टाइड समाधान और सीएफए दोनों की जरूरत मात्रा के लिए 2 से पायस और विभाजन की कुल मात्रा की गणना.
  2. 2 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता DDH 2 हे में lyophilized MOG 35-55 पतला. हम आम तौर पर 200 ग्राम MOG माउस प्रति 35-55 पेप्टाइड का उपयोग करें. यह राशि शेयर समाधान के 100 μl में निहित है. पेप्टाइड समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए
  3. एक मोर्टार में desiccated माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग H37RA (100 मिलीग्राम) की एक शीशी की सामग्री रखें.
    1. एक पतली पाउडर प्राप्त करने के लिए मोर्टार और मूसल के साथ मैदान.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है, जो एक 10 मिलीग्राम / एमएल सीएफए शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए अधूरा Freund के adjuvants की 10 मिलीलीटर जोड़ें
    3. पिछले टीकाकरण करने, सीएफए शेयर समाधान बुद्धि पतला2 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता घंटे आइएफए. सामग्री कण resuspend और प्रयोगात्मक तैयारी के दौरान चिपचिपा समाधान की कुछ मात्रा घटाने पर विचार करने के लिए प्रत्येक उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं.
    4. 1 मिलीग्राम के अंतिम एकाग्रता / मिलीलीटर तक पहुँच जाता है MOG 35-55 पेप्टाइड समाधान के साथ 1:1 मिश्रण.
      चेतावनी: हीट मारे माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ावा. साँस लेना, घूस और त्वचा और आंखों के साथ संपर्क से बचें.
  4. बर्फ पर समाधान Precool.
    1. दो 2 मिलीलीटर सीरिंज में 1 2 मिलीग्राम / एमएल सीएफए के मिलीग्राम और 1 मिलीलीटर 2 की मिलीग्राम / एमएल MOG 35-55 समाधान ड्रा. प्रतिरक्षित पशुओं की संख्या के हिसाब से आवश्यक सीरिंज की संख्या की गणना.
      चेतावनी: इसे सख्ती से granulomas कारण या autoimmune प्रतिक्रियाओं उत्पन्न हो सकता है के रूप में सहायक की तैयारी के दौरान सिलाई से बचें.
    2. MOG 35-55 समाधान और सीएफए के लिए एक 20 जी प्रवेशनी के लिए एक 27 जी प्रवेशनी प्रयोग करें. हवाई बुलबुले से बचने और कम से साथ दोनों सीरिंज कनेक्टhree तरह वाल्व.
    3. दूसरे के लिए एक सिरिंज से पायस भेजें और एक अच्छा emulsification एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में कम से कम 10 मिनट के लिए मिश्रण अच्छी तरह से. Emulsification समर्थन करने के लिए तीन तरह वाल्व के पास बंद हुआ. समाधान, सफेद कठोर और चरणों का कोई जुदाई के साथ चिपचिपा होना चाहिए.
    4. पायस पूर्व टीकाकरण के लिए कई दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता है. वे स्थिर रहे हैं कि क्या निरीक्षण करने के लिए emulsions तैयार करने के बाद कम से कम 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें. पिछले प्रतिरक्षण के लिए, दो सीरिंज से एक में समाधान ड्रा और एक 27 जी प्रवेशनी कनेक्ट.

पर्टुसिस विष की 3. तैयारी

  1. काली खांसी विष के विभिन्न मात्रा में भी प्रशासन का मार्ग (जैसे नसों या intraperitoneally) पर निर्भर करता है जो साहित्य में पाया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला intraperitoneally टीकाकरण के दिन पर पीबीएस के 200 μl में काली खांसी विष के 400 एनजी का उपयोग करता है और दो दिन बाद. चेतावनी: पर्टुसिस विष कई जैविक असर पड़ता है. साँस लेना, घूस, और त्वचा और आंखों के साथ संपर्क से बचें.
  2. एक 100 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान के लिए 500 μl DDH 2 हे में काली खांसी विष की 50 ग्राम Reconstitute. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  3. पीबीएस के साथ 01:50 पतला. 200 μl अब पीबीएस के 400 एनजी होते हैं. सीरिंज के लिए आवश्यक राशि को तैयार है और प्रत्येक सुई हब के लिए ~ 100 μl की एक अतिरिक्त अतिरिक्त मात्रा पर विचार करें.

4. पशु टीकाकरण

  1. आवश्यक अल्पकालिक इच्छामृत्यु के लिए विशेष मानदंडों के लिए संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति को देखें. ऐसे ketamine / xylazine इंजेक्शन या halothan के रूप में अन्य प्रोटोकॉल भी संभव हो सकता है, जबकि हमारी प्रयोगशाला isoflurane के साथ संक्षिप्त बेहोशी का उपयोग करता है. संज्ञाहरण के लिए प्रतीक्षा करें और संज्ञाहरण के स्तर का आकलन करने के लिए एक सामने पैर पैर के अंगूठे चुटकी का उपयोग करें.
  2. प्रतिरक्षण जानवरों के लिए तनाव को कम करने के लिए और इष्टतम टीकाकरण सुनिश्चित करने के लिए एक अनुभवी व्यक्ति द्वारा किया जाता है कि सुनिश्चित करें.
  3. विरोधी के 100 μl इंजेक्षनप्रत्येक हिंद दिशा में दो अलग अलग साइटों में जनरल / सीएफए पायस subcutaneously. त्वचा के नीचे एक बल्बनुमा जन रूपों प्रयोग भर जारी रहती चाहिए जो यह सुनिश्चित करें कि.
  4. Intraperitonelly काली खांसी विष के 200 μl इंजेक्षन.
  5. व्यक्तिगत चूहों आसानी से पूंछ आधार पर रंग चिह्नों द्वारा जैसे, दैनिक मूल्यांकन के लिए पहचाना जा सकता है यह सुनिश्चित.
  6. टीकाकरण के बाद दो दिन पर काली खांसी विष की दूसरी खुराक प्रशासन.

5. EAE निगरानी

  1. वजन और नैदानिक ​​स्कोर दैनिक मूल्यांकन किया जाना चाहिए. EAE की शुरुआत आम तौर पर रोग गतिविधि का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो वजन घटाने के साथ संबद्ध है. संस्थागत पशु की देखभाल करने का उल्लेख है और व्यक्तिगत चूहों प्रयोगों से बाहर रखा जा सकता है जब मापदंड पूर्व वर्णन करने के लिए समिति का प्रयोग करें. वजन घटाने 20 प्रारंभिक शरीर के वजन का% या जब गंभीर नैदानिक ​​लक्षण (EAE 7 या बुरा अंक) होते हैं अधिक है जब यह माना जाना चाहिए. फिर से करने के लिए देखेंस्वीकृत अधिकतम स्कोर के लिए संबंधित संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति की spective दिशा निर्देशों.
  2. चूहों EAE के नैदानिक ​​लक्षण है, यह पानी की बोतल अभी भी पहुंचा जा सकता है और खाना है कि पिंजरे फर्श पर रखा गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  3. विभिन्न स्कोरिंग लक्षण इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला में एक 0-10 पैमाने स्थापित है.
ग्रेड नैदानिक ​​संकेत टिप्पणी
0 कोई नैदानिक ​​लक्षण माउस पूंछ के आधार पर आयोजित किया जाता है, तो सामान्य चाल, पूंछ चलता रहता है और उठाया जा सकता है, पूंछ एक गोल वस्तु के आसपास wraps
1 आंशिक रूप से लंगड़ा पूंछ सामान्य चाल, पूंछ की नोक droops
2 रुक पूंछ सामान्य चाल, पूंछ droops
3 पिछले अंग केवल पेशियों का पक्षाघात, बेबुनियाद आंदोलन बेबुनियाद चाल, पूंछ limps, हिंद अंग pinching का जवाब
4 रुक एक पिछले अंग एक पिछले अंग खींचने के साथ बेबुनियाद चाल, पूंछ limps, एक पिछले अंग चुटकी का जवाब नहीं है
5 दोनों पिछले पैर लकवा मार खींचकर दोनों हिंद अंग के साथ बेबुनियाद चाल, पूंछ limps, दोनों हिंद अंग चुटकी का जवाब नहीं
6 हिंद अंग रुक, forelimbs में कमजोरी Forelimbs साथ बेबुनियाद चाल बन्द रखो के बाद शरीर, forelimbs पलटा खींचने के लिए संघर्ष, पूंछ limps
7 हिंद अंग एक forelimb रुक रुक माउस को स्थानांतरित नहीं किया जा सकता, एक forelimb के लिए पैर के अंगूठे चुटकी, पूंछ limps प्रतिक्रिया करता है
8 हिंद अंग दोनों forelimbs रुक रुक माउस दोनों forelimbs पैर के अंगूठे चुटकी का जवाब नहीं है, हिल नहीं सकता, पूंछ limps
9 मरणासन्न कोई आंदोलन, बदल सांस लेने
10 मौत

तालिका 1. क्लीनिकल स्कोरिंग प्रणाली.

Representative Results

टीकाकरण के बाद चूहों के वजन और नैदानिक ​​लक्षणों में परिवर्तन के लिए दैनिक मूल्यांकन किया जाना है. बीमारी की शुरुआत आम तौर पर EAE लक्षण दिखाई दे रहे हैं 1-2 दिन पहले शुरू हो सकता है जो वजन की कमी के साथ जोड़ा जाता है. EAE के नैदानिक ​​लक्षण आमतौर पर सुबह 9 और 14 के बाद टीकाकरण के बीच शुरू करते हैं. घावों मुख्य रूप से C57BL 6 / चूहों में MOG-EAE में रीढ़ की हड्डी के लिए स्थानीयकृत रहे हैं, वे आम तौर पर व्याख्यान चबूतरे वाला पैटर्न के लिए एक दुम में मुख्य रूप से motoric लक्षण विकसित. EAE लक्षणों के साथ एक प्रतिरक्षित माउस की एक अनुकरणीय चित्र (6 अंक) चित्रा 1 ए में दिखाया गया है. कुछ असामान्य EAE लक्षण भी ऐसे अक्षीय रोटरी तरीके से रोलिंग के रूप में हो सकता है, शास्त्रीय EAE भीतर नहीं परिलक्षित होते हैं जो hunched उपस्थिति या अतिसंवेदनशीलता तालिका 1 में दर्शाया स्कोर. मोटर लक्षण इस मॉडल में मुख्य विशेषता हैं, इस स्कोर हमें देता है बीमारी की गंभीरता का एक अच्छा संकेत है. अलग निगरानी प्रणालियों (जैसे 0 स्कोर -विभिन्न घाटे का आकलन 5 या 0-6) और अधिक जटिल समग्र स्कोर भी प्रकाशित किया गया है. गंभीर लक्षण संबंधित संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अनुसार प्रयोग से बाहर रखा जा सकता है के साथ चूहों कि कृपया ध्यान दें. चूहे अगले 10-20 दिनों से अधिक लक्षण आम तौर पर आंशिक वसूली दिखा. एक प्रतिनिधि रोग पाठ्यक्रम चित्रा 1 बी में दिखाया गया है. परिणाम मापदंडों का आकलन करने के लिए ब्याज की हैं जो EAE दौरान विभिन्न समय अंक हैं. अक्सर पाया जा सकता है जो कुछ विशिष्ट assays बहुत संक्षेप में वर्णन किया गया हैं. रोग अधिकतम पर, चूहे इन विट्रो में MOG 35-55 पेप्टाइड (MOG याद परख) के साथ अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के restimulation बाद cytokine उत्पादन या प्रसार के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है. इम्यून कोशिकाओं को भी EAE लक्षणों के साथ मस्तिष्क और चूहों से रीढ़ की हड्डी डोरियों से अलग किया और आगे की कार्रवाई की, फ्लो द्वारा जैसे कर सकते हैं. रीढ़ की हड्डी वर्गों के histological विश्लेषण रोग मीटर की ऊंचाई पर किया जा सकता हैघाव लोड और demyelination के लिए aximum, बाद में समय पर neurodegeneration और neuronal सेल मौत के लिए मार्कर अंक जबकि ब्याज की हो सकती है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रतिनिधि EAE परिणाम. 30 दिनों में टीकाकरण के बाद EAE लक्षणों के साथ एक प्रतिरक्षित C57BL 6 / माउस के प्रतिनिधि चित्र (EAE 6 अंक). बी प्रतिनिधि रोग कोर्स. डाटा मतलब है और मतलब की मानक त्रुटि के रूप में दिखाए जाते हैं (एन = 5). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

सक्रिय प्रतिरक्षण प्रोटोकॉल के साथ अलग EAE मॉडल की एक भीड़ ने पिछले दशकों में वर्णित किया गया है. चूहे मॉडल व्यापक रूप से हाल ही में जब तक इस्तेमाल किया गया है, चूहों अब EAE अनुसंधान के लिए सबसे लोकप्रिय मॉडल जीव हैं. इस विकास के कारण उपलब्ध ट्रांसजेनिक चूहों के व्यापक और बढ़ती प्रदर्शनों की सूची के लिए दूसरों के बीच में है. MOG 35-55 पेप्टाइड साथ C57BL 6 / चूहों का टीकाकरण सबसे व्यापक रूप से वितरित EAE मॉडलों में से एक है और एक विश्वसनीय, replicable और अच्छी तरह से उपयोग पशु मॉडल के रूप में माना जा सकता है. अन्य EAE मॉडल अधिक विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि कई neuroimmunological प्रयोगशालाओं में, MOG 35-55 प्रेरित EAE पसंद के मॉडल के रूप में स्थापित है.

विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु EAE प्रयोगों methodologically सही प्रदर्शन कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगात्मक सेटिंग्स की योजना बना रही है. आंतरिक वैधता के लिए, रोग के लक्षणों का अंधा स्कोरिंग अत्यधिक की सिफारिश की है. अनुभवimental समूहों होना चाहिए उम्र, वजन, और सेक्स से मिलान और चूहों बेतरतीब ढंग से उपचार समूहों को आवंटित किया जाना चाहिए. प्रयोगों को हमेशा पशु कल्याण के नियमों के अनुपालन में किया जाना चाहिए. EAE अध्ययन अक्सर underpowered हैं और खाते में सांख्यिकीय प्रकार द्वितीय त्रुटियाँ नहीं लेते. इसलिए, पिछले प्रयोगों के लिए, नमूना आकार गणना प्रदर्शन किया जाना चाहिए. आवश्यक समूह आकार अपेक्षित प्रभाव आकार पर निर्भर करते हैं. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक विशेषज्ञ के परामर्श EAE प्रयोगों शुरू करने से पहले विचार किया जा सकता है.

प्रोटोकॉल के कुछ सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए. सबसे महत्वपूर्ण बात, aEAE डेटा की व्याख्या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर दोनों अतिरिक्त प्रभाव है जो सहायक, काली खांसी और विष के प्रयोग के साथ टीकाकरण के मोड से समझौता किया है. यह भी MOG 35-55 EAE मॉडल मुख्य रूप से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित एक सीडी 4 + टी सेल से पता चलता है कि विचार किया जाना चाहिए. सीडी 8 + टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं खेलनाइन प्रकार की कोशिकाओं को संबोधित जब एक कम प्रमुख भूमिका और वैकल्पिक प्रोटोकॉल पर विचार किया जाना चाहिए. उम्मीद रोग कोर्स, तीव्र monophasic और आत्म - सीमित है. वैकल्पिक रूप से, एक relapsing-remitting रोग कोर्स भी वैकल्पिक EAE मॉडल में प्राप्त किया जा सकता है. प्रोटोकॉल की एक और महत्वपूर्ण सीमा एमएस pathophysiology के प्रतिरक्षात्मक घटक की दिशा में एक निश्चित पूर्वाग्रह है. पिछले वर्षों के दौरान, यह एमएस एक मजबूत neurodegenerative घटक है कि तेजी से स्पष्ट हो गया है. स्नायविक घाटे के एक प्रगतिशील संचय में oligodendrocytes और न्यूरॉन्स के परिणाम की मौत. यह EAE मॉडल पूरी तरह autoimmune सूजन की neurodegenerative तंत्र के विषय में प्रयोग सवालों का पता करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए. सीएनएस विकृति पर ध्यान देने के साथ वैकल्पिक पशु मॉडल पर विचार किया जा सकता है - परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली की भागीदारी के बिना विषाक्त demyelination समझौता जो cuprizone मॉडल उदा.

वर्णित प्रोटोकॉल एक बुनियादी neuroimmunological प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में माना जा सकता है और अन्य अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया जा सकता है. ऊपर वर्णित प्रायोगिक प्रक्रिया को आसानी से अलग चूहों उपभेदों द्वारा अन्य EAE प्रोटोकॉल को लागू किया जा सकता है या प्रकार और प्रोटीन की मात्रा (जैसे चिकित्सकीय आकलन करने के लिए विशेष रूप से अनुकूल है जो एक relapsing-remitting EAE रोग कोर्स के लिए पीएलपी 139-151 पेप्टाइड और SJL चूहों का उपयोग relapses पर प्रभाव). वर्णित प्रोटोकॉल भी दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों (निष्क्रिय EAE) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मॉडल में, C57BL 6 / चूहों MOG 35-55 पेप्टाइड और ऊपर वर्णित के रूप में सीएफए के साथ प्रतिरक्षित कर रहे हैं. इसके विपरीत, काली खांसी विष की आवश्यकता नहीं है. 7-15 दिन, spleens या लिम्फ नोड्स अलग कर रहे हैं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं C57BL/6se चूहों के एक नए समूह में स्थानांतरित करने से पहले MOG 35-55 पेप्टाइड और विभिन्न साइटोकिन्स के साथ इन विट्रो में restimulated कर रहे हैं. ये प्राप्तकर्ता चूहों कि कुछ दिन पहले clas पर से EAE विकसितसिकल प्रतिरक्षण. इन विट्रो स्थितियों विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रश्नों के लिए (टी एच 1 या टी एच 17 कक्षों में जैसे ध्रुवीकरण) अलग किया जा सकता है.

कभी कभी, कम रोग की घटना या कमजोर लक्षण एक प्रयोगात्मक चुनौती हो सकती है. समस्या निवारण के लिए कुछ सिफारिशें की हैं:

- रोग की गंभीरता पेप्टाइड / माउस के विभिन्न मात्रा के साथ अलग किया जा सकता है.

- इष्टतम सीएफए एकाग्रता 1-5 मिलीग्राम / मिलीलीटर से भिन्न हो सकते हैं. प्रयोगों की स्थापना जब सीएफए की एक अनुमापन पर विचार करें. के रूप में कई नियमों 2 मिलीग्राम / एमएल से अधिक सीएफए सांद्रता मना अनुमति दी सीएफए सांद्रता के लिए संबंधित संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के संबंधित दिशा निर्देशों को देखें.

- विभिन्न तरीकों पायस की तैयारी के लिए वर्णित हैं. गरीब emulsification possib के रूप में माना जाता है कि अगर इस तरह 1 घंटा या sonication के लिए vortexing के रूप में वैकल्पिक तरीकों पर विचार किया जा सकता हैLe त्रुटि स्रोत.

- आयु, लिंग, वर्ष और जानवरों की सुविधा के भीतर पर्यावरण की स्थिति का मौसम EAE संवेदनशीलता को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण कारक हैं. यह स्थितियां स्वतंत्र प्रयोगों के बीच तुलना कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए.

ऊपर वर्णित है, का उल्लेख प्रोटोकॉल दत्तक EAE प्रयोगों के लिए बात शुरू के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मॉडल विशेष रूप से (wildtype प्राप्तकर्ता चूहों में मस्तिष्कशोथ उत्पन्न करने वाला पीटकर कोशिकाओं में परिवर्तित करने से उदा) एक आनुवंशिक phenotype के परिधीय और सीएनएस प्रभाव को अलग करने के लिए और हस्तांतरित कोशिकाओं के phenotype अच्छी तरह होती जा सकता है के रूप में विशिष्ट प्रतिरक्षा सवालों के लिए अनुकूल है. पिछले वर्षों के दौरान EAE अनुसंधान के क्षेत्र में नवीनतम विकास टी सेल रिसेप्टर ट्रांसजेनिक चूहों हैं. इन चूहों को बाहरी प्रभाव सहायक टीका की समस्या को धोखा देने के बिना अनायास EAE लक्षण विकसित. हालांकि, इस मॉडल breedi के लिए जानवरों की बड़ी मात्रा की आवश्यकतापर्याप्त समूह आकार सुनिश्चित करने के लिए एनजी. पीटा चूहों का मूल्यांकन पिछले aEAE के विपरीत EAE प्रयोगों को crossbreeding की आवश्यकता है. प्रत्येक माउस एक अलग दिन पर रोग के लक्षण के रूप में विकसित, उपन्यास पदार्थों का मूल्यांकन नहीं बल्कि जटिल हो सकता है. इसलिए, neuroimmunological के लिए शास्त्रीय aEAE के मूल्य चुनौती बनी हुई है.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgements

इस काम क्लीनिकल रिसर्च के लिए अंतःविषय केंद्र (IZKF) मुंस्टर (बीज 12/3, एसबी) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight e.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) e.g. Pepceuticals Ltd Store at -20 °C
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Sigma-Aldrich Co. F5506 Store at 4 °C
Syringes, 1 ml with 26 G 3/8 in needle  e.g. Becton Dickinson & Co. 309625
Syringes, 2 ml e.g. B. Braun 7389
Needles, 25 G 5/8 in and 30 G 1/2 in  e.g. Becton Dickinson & Co., 305122, 305106
Three way valve e.g. B. Braun 16494 C
Pertussis toxin, lyophilized in buffer Enzo Life Sciences Inc. BML-G100 Store at 4 °C
M. tuberculosis H37 RA BD Difco 231141 Store at 4 °C

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References

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Comments

5 Comments

  1. Dear Authors - you describe various conditions that contribute to a less than adequate disease response. But, do you have experience with conditions that create an exaggerated response in C57/Blk6 Jax, that result in animals dieing due to severe neurologic signs, rather than stabilizing and recovering as your discussion describes? For the past year, we have been struggling with a model that "used to work" at Harvard, but since moving to the National Cancer Institute, the model fails in that the previously resistant Tbet-/- (Tbx21) mice now develop EAE and both they and the Blk6 proceed to death. We have ruled out/excluded pathogens/commensals (segmented filamentous bacteria, Helicobacter, and norovirus), we have tried to emulate the same husbandry conditions as Harvard (using sterile micro-isolator caging, acidified water, even switching to a different diet)- but to no avail. Do you have any suggestions?

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 24, 2016 - 12:32 PM
  2. Dear Melody,
    these are rather strange experiences and my guess would be that there is a General Problem which renders your mice so over-succeptible to EAE. These changes are not so uncommon and can be rather tricky to solve. My advice would be to:
    - Try a delivery of your mice to another animal Provider (in europe we would for example choose Harlan or Janvier instead)
    - Try another animal housing facility at your University if available - the specific Environment can result in tremendous differences (even if there are no pathogens), People Report that regularly. The microbiome is suspected to be responsible for that while there are no specific tests for that.
    - Of course reduce amount of MOG (100 µg or lower)
    Hope that helps and good luck!
    Best, Stefan

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 25, 2016 - 9:16 AM
  3. Stefan- Thank you for your response. The investigator was using 100ug MOG and dropped it to 50ug, but this has not changed the profiles. We have done replicate studies in different facilities - same problem. Yesterday I found the following intriguing comments on the commercial Hooke EAE CRO site - they stated that you must titrate the pertussis dose for each lab, and if EAE is too severe, lower the dose (see below). Have you ever heard of this before? Does this sound reasonable? If you could give me your email, I can send you some of our mean clinical score graphs and you will see our problem. Here is their web site.
    http://www.hookelabs.com/protocols/eaeAI_C57BL6.html
    "Titration for optimal dosage of pertussis toxin. We strongly recommend that new customers establish the optimal PTX dose by inducing EAE in 10 mice in their own lab. The optimal PTX dose needed to obtain good EAE is typically 100 to 250 ng/mouse for each of the two PTX administrations. Larger doses of PTX are needed if mice experience higher levels of stress. The dose required decreases with mouse age. Even with identical mice and reagents, the PTX dose required varies from lab to lab. Finally, PTX potency varies from lot to lot; this affects the required dose. Hooke tests each lot of PTX in mice; the dilutions recommended in this protocol are the result of our testing.
    To determine the best PTX dose for the lab conditions, adjust PTX concentration to 4 µg/mL; this gives 400 ng PTX in each 0.1 mL dose (6000/1.5*0.1). Immunize 10 mice. Score mice daily starting 7 days after immunization, continuing until 28 days after immunization. (See Appendix A - EAE scoring guide.)

    If EAE is too severe, reduce PTX concentration to ~2.8 – 3.4 µg/mL (280 to 340 ng PTX/dose).
    If EAE is too mild, a higher dose of PTX is required;

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 25, 2016 - 12:03 PM
  4. My email is stefan.bittner@unimedizin-Mainz.de, you can reply directly there.
    I know Hooke kits and to our experience there is no obvious Change compared to self-made Solutions (for some People they work a bit better, for others not) - the main reason why we are not working with them routinously are Price + no flexibility in MOG/CFA composition.
    Pertussis: We never had Problems there and are not doing the testing (perhaps we are just lucky that our ptx is quite stable from Batch to Batch), but i know that other labs are doing the Titration as described by you and it might be a good Point for Trouble-Shooting!

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 27, 2016 - 6:20 AM
  5. Dear Stefan,

    I am trying to induce EAE in a B6/129 mixed background strain of mice. I wonder would the same protocol work?
    Thanks,

    Donghai

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 1, 2016 - 6:41 PM

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