Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG

Immunology and Infection
 

Summary

Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) is een gevestigde diermodel voor multiple sclerose. C57BL / 6 muizen worden geïmmuniseerd met myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), wat resulteert in een oplopende zwakke verlamming veroorzaakt door autoreactieve immuuncellen in het centrale zenuwstelsel. Protocollen voor de ziekte van inductie en toezicht zal worden besproken.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (86), e51275, doi:10.3791/51275 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Multiple sclerose is een chronische neuro-inflammatoire demyeliniserende aandoening van het centrale zenuwstelsel met een sterke neurodegeneratieve component. Hoewel de exacte etiologie van de ziekte is nog niet duidelijk zijn autoreactieve T-lymfocyten gedacht dat een centrale rol spelen in de pathofysiologie. MS therapie is slechts gedeeltelijk effectief zo ​​ver en onderzoeksinspanningen blijven onze kennis over de pathofysiologie van de ziekte uit te breiden en nieuwe behandelingsstrategieën te ontwikkelen. Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) is de meest voorkomende diermodel voor MS delen vele klinische en pathofysiologische kenmerken. Er is een grote verscheidenheid van EAE modellen die verschillende klinische, histologische en immunologische aspecten van menselijke MS weerspiegelen. Actief-geïnduceerde EAE in muizen is de makkelijkste induceerbare model met robuuste en reproduceerbare resultaten. Het is vooral geschikt voor het onderzoeken van de effecten van drugs of van bepaalde genen met behulp van transgene muizen uitgedaagd door auto neuroinflammation. Daarom worden muizen geïmmuniseerd met homogenaten CZS of peptiden van myeline-eiwitten. Vanwege de lage immunogene potentieel van deze peptiden worden sterke adjuvantia gebruikt. EAE gevoeligheid en fenotype afhankelijk van het gekozen antigeen en knaagdieren stam. C57BL / 6 muizen zijn de meest gebruikte soort voor transgene muis bouw en reageren onder andere op myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG). De immunogene epitoop MOG 35-55 gesuspendeerd in compleet Freund's adjuvans (CFA) vóór immunisatie en pertussis toxine wordt op de dag van immunisering en twee dagen later. Muizen ontwikkelen een "klassieke" self-limiting monofasisch EAE met oplopende slappe verlamming binnen 9-14 dagen na immunisatie. Muizen worden dagelijks geëvalueerd met behulp van een klinisch scoresysteem voor 25-50 dagen. Speciale aandachtspunten voor de zorg onttrekken van dieren met EAE evenals potentiële toepassingen en beperkingen van dit model worden besproken.

Introduction

Multiple sclerose (MS) is een chronische demyeliniserende ontstekingsziekte van het centrale zenuwstelsel waarbij de vernietiging van oligodendrocyten en neuronen resulteert in heterogene en opslaan van klinische symptomen. MS wordt beschouwd als een prototype auto-immuunziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) en dierlijke modellen ontwikkeld om licht te werpen op de complexe pathogenese. Bovendien, de huidige therapieën zijn slechts gedeeltelijk effectief en doel voornamelijk de inflammatoire fase van de ziekte, terwijl de neurodegeneratieve component is waarschijnlijk de grootste uitdaging voor toekomstige therapeutische benaderingen 1,2.

Hoewel de exacte etiologie van de ziekte is nog onduidelijk is een auto-immuunreactie tegen epitopen op de myelineschede van de neuronen van het CZS verondersteld om het begin van de ziekte veroorzaken. Ontregeling van het immuunsysteem, genetische kwetsbaarheid en omgevingsfactoren (zoals infecties, vitamine D) worden verondersteldinvloed centrale aspecten van de pathofysiologische mechanismen van MS.

Drie verschillende types van dierlijke modellen worden momenteel vastgesteld voor de exploratie van pathologische patronen van MS: Virale modellen zoals Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV), modellen veroorzaakt door giftige stoffen zoals cuprizone, en tenslotte verschillende varianten van experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) 3, 4. Hoewel ze allemaal na te bootsen kenmerken van MS, ze verschillen enorm in de onderliggende pathologische functies, zoals de betrokkenheid van het adaptieve immuunsysteem. EAE is de meest voorkomende diermodel als het bijzonder nuttig om neuro wegen onderzoeken en vaak dient als een "proof-of-principle" model voor de effectiviteit van nieuwe behandelingsstrategieën 5,6. EAE geïnduceerd kan worden in vele verschillende dieren (bijv. muizen, ratten, miniswine, cavia's, kippen of primaten). Echter, de meest muizen gebruiken soort die ten minste deels wordenaan de uitbreiding van het repertoire van geavanceerde transgene of knockout muizen 7.

De pathofysiologie van EAE is gebaseerd op de reactie van het immuunsysteem tegen hersen-specifieke antigenen. Deze reactie induceert ontsteking en vernietiging van het antigeen dragende structuren, waardoor neurologische en pathologische kenmerken die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in patiënten met MS. Drie verschillende benaderingen kunnen worden onderscheiden: Actief geïnduceerde EAE (aeae; actieve immunisatie), passief overgedragen EAE (peae, overdracht van encefalitogene cellen van een geïmmuniseerd dier), en meer recent spontane EAE muismodellen (SEAE) die de studie van auto mogelijk mechanismen zonder exogene manipulatie. De makkelijkste induceerbare model is aeae bij muizen waardoor in snelle en robuuste resultaten. Dit model wordt beschouwd als de "gouden standaard" van neuro dierlijke modellen van veel onderzoekers op het gebied 8.

Voor aeae inductie, het diergeïmmuniseerd met een subcutane injectie van een emulsie bestaande uit de gekozen antigeen en compleet Freund's adjuvans (CFA) vergezeld van een intraperitoneale injectie van pertussis toxine op de dag van immunisering en twee dagen later. Bijgevolg worden myeline-specifieke T lymfocyten geactiveerd in de periferie en migreren in het CZS over de bloed-hersen-barrière. Bij binnenkomst in het CZS, worden T-cellen geactiveerd door lokale en infiltreren antigeen-presenterende cellen resulteert in de daaropvolgende inflammatoire cascades, betrokkenheid van andere cellen, zoals monocyten of macrofagen en uiteindelijk in demyelinisatie en axonale celdood 9. Afhankelijk van de immunisatie protocol en verzameling muizenstam (bijv. C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) en antigeen (bijvoorbeeld myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG), myeline basisch eiwit (MBP), proteolipide myeline-eiwit (PLP)), de ziekte Natuurlijk kan een acute, chronische progressieve of relapsing remitting ziekte cursus.

35-55 peptide 10 waardoor een monofasische EAE eerst symptomen na 9-14 dagen, maximaal ziekte ongeveer 3-5 dagen na ziektebegin en traag en gedeeltelijk herstel symptoom in de komende 10-20 dagen. Aangezien het immunogene potentieel van MOG 35-55 peptide alleen is niet voldoende om ziekte te induceren, adjuvantia zoals CFA noodzakelijk. Aangenomen wordt, dat de componenten van CFA activeren mononucleaire fagocyten induceren van de fagocytose van deze moleculen en secretie van cytokinen. Dit resulteert in de verlenging van de aanwezigheid van antigenen en een efficiënter transport daarvan aan het lymfestelsel. EAE inductie wordt vergemakkelijkt door toepassing van pertussis-toxine (PT), die onder meer is heeft voorgesteld om te modulerende bloed-hersenbarrière en de immunologische responsiviteit zelf 11. Na ziekte inductie, moet speciale zorg worden genomen voor de dagelijkse evaluatie van muizen voor ziektesymptomen.

Protocol

1. Algemene opmerkingen voor Muis Experimenten

  1. Alle experimenten met muizen moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de respectieve institutionele Animal Care en gebruik Comite.
  2. Houd de muizen onder-pathogeen-vrije omstandigheden en hen in staat om de toegang tot voedsel en water ad libitum te hebben. Opmerking: Het is belangrijk leeftijd en geslacht overeenkomstige muizen gebruiken experimentele groepen, omdat de gevoeligheid voor ziekte kan variëren met leeftijd en geslacht.
  3. Afhankelijk van de gekozen experimentele omstandigheden, kan een sham geïmmuniseerde controlegroep beschouwd wanneer MOG 35-55 peptide wordt vervangen door PBS zonder antigeen of nonencephalitogenic peptide.
  4. Kunt u overwegen methodologische aspecten voorafgaand aan het starten experimenten (zie ook hieronder). Wij raden aan om een ​​of twee geblindeerde waarnemers voor EAE scoren betrekken.

2. Bereiding van MOG 35-55 Emulsie

  1. 200 ui van een 1:01 verhouding MOG 35-55 peptide oplossing en CFA worden geïnjecteerd om elke muis. Er is een verlies van de viskeuze emulsie tijdens de voorbereiding en het injecteren. Daarom productie van 1.5-2x de benodigde hoeveelheid. Bereken het totale volume van de emulsie en delen door 2 voor de benodigde hoeveelheden van beide MOG 35-55 peptide oplossing en CFA.
  2. Verdun gelyofiliseerd MOG 35-55 in DDH 2 O tot een eindconcentratie van 2 mg / ml. We gebruiken meestal 200 pg MOG 35-55 peptide per muis. Dit bedrag wordt in 100 ul van de voorraadoplossing. De peptide oplossing moet bij -20 ° C worden bewaard
  3. Plaats de inhoud van 1 flacon van verdroogde Mycobacterium tuberculosis H37RA (100 mg) in een vijzel.
    1. Grond met vijzel en stamper om een ​​dunne poeder te verkrijgen.
    2. Voeg 10 ml incomplete Freund's adjuvans een 10 mg / ml CFA voorraadoplossing die bij 4 ° C worden bewaard vinden
    3. Voorafgaand aan de immunisatie, verdunnen CFA stockoplossing with IFA een eindconcentratie van 2 mg / ml. Meng grondig voor elk gebruik aan fijn materiaal opnieuw in suspensie en te overwegen wat volume verlies van de viskeuze oplossing tijdens de experimentele voorbereidingen.
    4. Meng 1:1 met MOG 35-55 peptide oplossing tot de uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml wordt bereikt.
      LET OP: door hitte gedode Mycobacterium tuberculosis stimuleert de aangeboren immuunrespons. Vermijd inademing, inslikken en aanraking met de huid en ogen.
  4. Precool oplossingen op ijs.
    1. Zuig 1 ml 2 mg / ml CFA en 1 ml 2 mg / ml MOG 35-55 oplossing in twee 2 ml spuiten. Bereken het aantal spuiten nodig volgens het aantal geïmmuniseerde dieren.
      LET OP: Strikt vermijden stikken tijdens de bereiding van adjuvante als het granulomen kunnen veroorzaken of veroorzaken auto-immuunreacties.
    2. Gebruik een 27 G canule voor de MOG 35-55 oplossing en een 20 G canule voor CFA. Vermijd luchtbellen en verbind beide spuiten met tenrie-weg-klep.
    3. Stuur de emulsie ve spuit aan de andere en meng gedurende ten minste 10 minuten een goed emulgeren is een kritische stap. Near-sluit de drie-weg-klep te emulgeren ondersteunen. De oplossing moet wit, stijf en viskeuze met geen scheiding van fasen.
    4. Emulsies kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen voor immunisatie. Wacht tenminste 30 minuten na het bereiden van de emulsies te kijken of ze stabiel. Voorafgaand aan de immunisatie, zuig de oplossing in een van de twee spuiten en sluit een 27 G canule.

3. Bereiding van Pertussis Toxine

  1. Verschillende hoeveelheden pertussis toxine kan worden gevonden in de literatuur die ook afhankelijk van de toedieningsweg (bijvoorbeeld intraveneus of intraperitoneaal). Onze laboratoriumtoepassingen 400 ng pertussis toxine in 200 pl PBS intraperitoneaal op de dag van immunisering en twee dagen later. LET OP: pertussistoxine heeft vele biologische effecten. Vermijd inademing, inslikken en aanraking met de huid en ogen.
  2. Reconstitueer 50 ug pertussis toxine in 500 pl DDH 2 O 100 ug / ml voorraadoplossing. Bewaren bij 4 ° C.
  3. Verdun 1:50 met PBS. 200 ul bevatten nu 400 ng van PBS. Bereid de benodigde hoeveelheid spuiten en beschouwen extra overmaat volume van ~ 100 ul per naaldnaaf.

4. Animal Immunisatie

  1. Raadpleeg de institutionele Animal Care en gebruik Comite voor specifieke criteria voor de vereiste korte termijn euthanasie. Ons laboratorium maakt gebruik van korte narcotizatie met isofluraan terwijl andere protocollen zoals ketamine / xylazine injectie of Halothan ook mogelijk kan zijn. Wacht anesthesie en gebruik een voorvoet teen knijpen om het niveau van anesthesie beoordelen.
  2. Zorg ervoor dat immunisatie wordt uitgevoerd door een ervaren persoon om stress voor dieren te minimaliseren en om een ​​optimale immunisatie te garanderen.
  3. Injecteer 100 ui antigen / CFA emulsie subcutaan in twee verschillende plaatsen op elke achterste flank. Zorg ervoor dat een bolvormige massa vormen onder de huid die moet blijven bestaan ​​gedurende het experiment.
  4. Injecteer 200 ul pertussistoxine intraperitonelly.
  5. Ervoor te zorgen dat individuele muizen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd voor de dagelijkse evaluatie, bijvoorbeeld door kleur markeringen op de staart basis.
  6. Dien een tweede dosis van pertussis toxine op dag twee na immunisatie.

5. EAE Monitoring

  1. Gewicht en de klinische score moet dagelijks worden geëvalueerd. Het begin van EAE correleert gewoonlijk met gewichtsverlies, die kan worden gebruikt als een indicator van ziekteactiviteit. Raadpleeg de institutionele Animal Care en gebruik Comite criteria vooraf definiëren wanneer individuele muizen moeten worden genomen van de experimenten. Dit moet worden overwogen bij gewichtsverlies dan 20% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht of bij ernstige klinische symptomen (EAE score 7 of erger) optreden. Raadpleeg de rerespectievelijke richtlijnen van de respectieve institutionele Animal Care en gebruik Comite voor toegestane maximale scores.
  2. Bij muizen hebben klinische symptomen van EAE is belangrijk dat de fles water nog kan worden bereikt en dat voedsel op de kooi geplaatst.
  3. Verschillende scoren symptomen kunnen worden gebruikt. In ons laboratorium een ​​schaal van 0-10 is gevestigd.
Graad Klinische Commentaar
0 Geen klinische symptomen Normale gang, de staart beweegt en kan worden verhoogd, staart wraps rond een rond voorwerp als de muis wordt gehouden op de basis van de staart
1 Gedeeltelijk slap staart Normale gang, puntje van de staart droops
2 Verlamd staart Normale gang, staart droops
3 Achterste ledematen parese, ongecoördineerde beweging Ongecoördineerde gang, staart hinkt, achterste ledematen reageren op knijpen
4 Een achterste ledematen verlamd Ongecoördineerde gang met een achterste ledematen slepen, staart hinkt, gaat men achterste ledematen niet reageren op knijpen
5 Beide achterpoten verlamd Ongecoördineerde gang met beide achterpoten slepen, staart hinkt, doe beide achterste ledematen niet reageren op knijpen
6 Achterpoten verlamd, zwakte in voorpoten Ongecoördineerde gang met voorpoten worstelen om lichaam, voorpoten reflex trek na knijpen, staart hinkt
7 Achterpoten verlamd, een voorpoot verlamd Muis kan niet bewegen, een voorpoot reageert op teen knijpen, staart hinkt
8 Achterpoten verlamd, beide voorpoten verlamd Muis kan niet bewegen, beide voorpoten niet reageren op teen knijpen, staart hinkt
9 Zieltogende Geen beweging, veranderde ademhaling
10 Dood

Tabel 1. Klinische scoresysteem.

Representative Results

Na immunisatie, muizen dagelijks worden onderzocht op veranderingen in gewicht en klinische symptomen. Ziektebegin wordt typisch gecorreleerd met een vermindering van gewicht dat zou kunnen beginnen 1-2 dagen voor EAE-symptomen zichtbaar. Klinische verschijnselen van EAE beginnen meestal tussen dag 9 en 14 post-immunisatie. Aangezien laesies voornamelijk worden gelokaliseerd in het ruggenmerg MOG-EAE in C57BL / 6 muizen, ze meestal ontwikkelen voornamelijk motorische symptomen bij een caudaal rostrale patroon. Een voorbeeld afbeelding van een muis geïmmuniseerd met EAE symptomen (score 6) is weergegeven in figuur 1A. Sommige atypische EAE symptomen kunnen ook optreden als rollen axiaal roterende wijze gebogen uiterlijk of overgevoeligheid die niet tot uiting in de klassieke EAE score weergegeven in Tabel 1. Al motorische symptomen zijn de belangrijkste kenmerken in het model, ofwel deze score ons een goede indicatie van de ernst van de ziekte. Verschillende bewakingssystemen (bijv. score 0 -5 of 0-6) en complexere samengestelde scores beoordelen verschillende tekorten zijn ook gepubliceerd. Let muizen met ernstige symptomen moeten worden genomen van de proef volgens de respectieve institutionele Animal Care en gebruik commissie. Muizen in het algemeen gedeeltelijk herstel van de symptomen in de komende 10-20 dagen. Een vertegenwoordiger ziektebeloop wordt weergegeven in figuur 1B. Er zijn verschillende momenten tijdens EAE die van belang zijn voor de beoordeling van uitkomstmaten. Enkele typische assays die vaak te vinden zijn zeer kort beschreven. Bij maximale ziekte, kunnen muizen worden geëvalueerd voor cytokine productie of proliferatie na herstimulatie van geïsoleerde immuuncellen met MOG 35-55 peptide in vitro (MOG recall-test). Immune cellen kunnen worden geïsoleerd uit de hersenen en ruggenmerg van muizen met EAE symptomen en verder verwerkt, bijvoorbeeld door flowcytometrie. Histologische analyse van ruggemerg kan bij ziekte m worden uitgevoerdaximale voor laesies en demyelinisatie, terwijl op latere tijdstippen markers voor neurodegeneratie en neuronale celdood interessant kunnen zijn.

Figuur 1
Figuur 1. Representatieve resultaten EAE. A. representatief beeld van een geïmmuniseerd C57BL / 6 muis met EAE symptomen (EAE score 6). Ziekteverloop B. Vertegenwoordiger na immunisatie dan 30 dagen. Gegevens worden getoond als gemiddelde en de standaardafwijking van het gemiddelde (n = 5). Klik hier voor grotere afbeelding .

Discussion

Een veelvoud van verschillende EAE modellen met actieve immunisatie protocollen is beschreven in de afgelopen decennia. Terwijl de rat modellen zijn op grote schaal gebruikt tot voor kort, muizen zijn nu de meest populaire modelorganisme voor EAE onderzoek. Deze ontwikkeling is onder andere door de grote en steeds toenemende repertoire beschikbare transgene muizen. Immunisatie van C57BL / 6 muizen met MOG 35-55 peptide is een van de wijdst verspreide EAE modellen en kan worden beschouwd als een betrouwbare, reproduceerbare en goed te gebruiken diermodel. In veel neuroimmunologische laboratoria wordt de MOG 35-55 geïnduceerde EAE opgericht als het model van keuze, terwijl andere EAE modellen worden gebruikt voor meer specifieke experimentele vragen.

Een kritisch punt van overweging is de planning van de experimentele instellingen om ervoor te zorgen dat de EAE experimenten worden uitgevoerd methodologisch correct. Voor de interne validiteit, wordt verblind scoren van ziektesymptomen sterk aanbevolen. Experimental groepen moeten zijn leeftijd, gewicht en geslacht gematchte en muizen moeten willekeurig worden toegewezen aan behandelingsgroepen. Experimenten moeten altijd worden uitgevoerd in overeenstemming met het dierenwelzijn regelgeving. EAE studies zijn vaak underpowered en geen rekening houden met statistische type II fouten. Daarom vóór experimenten steekproefgrootte worden uitgevoerd. Noodzakelijke groepsgrootte afhankelijk van de verwachte grootte effect. Raadpleging van een deskundige voor statistische analyse zou voordat EAE experimenten worden beschouwd.

Een aantal beperkingen van het protocol moet in gedachten worden gehouden. Het belangrijkste is interpretatie van aeae gegevens gecompromitteerd door de wijze van immunisatie met het gebruik van adjuvans en pertussis toxine, welke aanvullende invloed op de immunologische reactie. Ook moet worden overwogen dat de MOG 35-55 EAE model toont vooral een CD4 + T-cel gedreven immunologische respons. CD8 + T-cellen en B-cellen speleneen minder prominente rol en alternatieve protocollen moeten worden overwogen bij het aanpakken van deze celtypen. De verwachte koers ziekte is acuut, monofasisch en zelf-beperkt. Alternatief kan een recidieve ziekte uiteraard ook verwezenlijkt in alternatieve EAE modellen. Een andere belangrijke beperking van het protocol is een zekere voorkeur voor de immunologische component van de MS pathofysiologie. Gedurende de laatste jaren is het steeds duidelijker dat MS heeft een sterke neurodegeneratieve component geworden. De dood van oligodendrocyten en neuronen resulteert in een progressieve accumulatie van neurologische tekorten. Er moet rekening mee worden gehouden dat de EAE model niet volledig geschikt zijn om experiment vragen over neurodegeneratieve mechanismen van auto-ontsteking pakken. Alternatieve diermodellen met een focus op CNS pathologie kan worden beschouwd - zoals de cuprizone model dat giftige demyelination compromissen zonder betrokkenheid van het perifere immuunsysteem.

De beschreven protocol worden beschouwd als een basis neuro experimenteel model en kunnen worden aangepast voor andere toepassingen. De hierboven beschreven experimentele procedure kan gemakkelijk worden toegepast op andere protocollen EAE door het variëren muizen stammen of de soort en hoeveelheid eiwit (bv gebruiken PLP 139-151 peptide en SJL muizen een relapsing remitting EAE ziekteverloop die is bijzonder geschikt voor het beoordelen van therapeutische effecten op recidieven). De beschreven protocol kan ook gebruikt worden voor adoptieve transfer experimenten (passieve EAE). In dit model worden C57BL / 6 muizen geïmmuniseerd met MOG 35-55 peptide en CFA zoals hierboven beschreven. Daarentegen wordt pertussis toxine niet vereist. Na 7-15 dagen, milt of lymfeknopen geïsoleerd en immuuncellen in vitro opnieuw gestimuleerd met MOG 35-55 peptide en diverse cytokinen vóór de overdracht in een nieuwe groep C57BL/6se muizen. Deze ontvanger muizen een paar dagen eerder dan na clas ontwikkelen EAESical immunisatie. In vitro omstandigheden kan worden gevarieerd voor specifieke immunologische vragen (bijv. polarisatie in T H 1 of T H 17 cellen).

Soms kan lage incidentie van de ziekte of zwakke symptomen een experimentele uitdaging. Een aantal aanbevelingen voor het oplossen van problemen zijn:

- Ernst van de ziekte kan worden gevarieerd met verschillende hoeveelheden peptide / muis.

- Optimale CFA concentratie kan variëren van 1-5 mg / ml. Overweeg een titratie van CFA bij het vaststellen van de experimenten. Verwijzen wij u naar de betreffende richtlijnen van de respectieve institutionele Animal Care en gebruik Comite voor toegestane CFA concentraties zo veel regels verbieden CFA concentraties van meer dan 2 mg / ml.

- Verschillende methoden worden beschreven voor het bereiden van de emulsie. Alternatieve methoden zoals vortexen gedurende 1 uur of sonicatie kan worden beschouwd als slechte emulgering wordt beschouwd als possible fout bron.

- Leeftijd, geslacht, seizoen van het jaar en milieuomstandigheden in het dier faciliteit zijn belangrijke factoren die EAE gevoeligheid beïnvloeden. Er moet voor worden gezorgd dat de omstandigheden vergelijkbaar zijn tussen onafhankelijke experimenten.

Zoals hierboven beschreven, kan het genoemde protocol worden gebruikt als uitgangspunt voor adoptieve EAE experimenten. Dit model is vooral geschikt voor het scheiden van perifere en centrale zenuwstelsel werkt een genetische fenotype (bijv. door overdracht encefalitogene knockout cellen in wildtype ontvangende muizen) en specifieke immunologische vragen het fenotype van de overgedragen cellen grondig gekarakteriseerd. De nieuwste ontwikkeling in EAE onderzoek gedurende de afgelopen jaren zijn T-cel-receptor transgene muizen. Deze muizen ontwikkelen EAE symptomen spontaan zonder invloed van buitenaf te omzeilen het probleem van adjuvante inenting. Echter, dit model vereist grote hoeveelheden dieren breeding tot voldoende groepsgrootte verzekeren. Evaluatie van knockout muizen vereist kruisen voor EAE experimenten in tegenstelling tot aeae. Aangezien elke muis ontwikkelt ziektesymptomen op een andere dag, kan evaluatie van nieuwe stoffen nogal ingewikkeld. Daarom is de waarde van klassieke aeae voor neuro-inflammatoire steeds onaangetast.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Münster (SEED 12/3, SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight e.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) e.g. Pepceuticals Ltd Store at -20 °C
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Sigma-Aldrich Co. F5506 Store at 4 °C
Syringes, 1 ml with 26 G 3/8 in needle  e.g. Becton Dickinson & Co. 309625
Syringes, 2 ml e.g. B. Braun 7389
Needles, 25 G 5/8 in and 30 G 1/2 in  e.g. Becton Dickinson & Co., 305122, 305106
Three way valve e.g. B. Braun 16494 C
Pertussis toxin, lyophilized in buffer Enzo Life Sciences Inc. BML-G100 Store at 4 °C
M. tuberculosis H37 RA BD Difco 231141 Store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Wiendl, H. Neuroinflammation: the world is not enough. Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).
  3. vander Star, B. J., et al. In vitro and in vivo models of multiple sclerosis. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).
  4. Pachner, A. R. Experimental models of multiple sclerosis. Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).
  5. Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).
  6. Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis. Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).
  7. Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. EAE: an immunologist's magic eye. Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).
  8. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).
  9. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).
  10. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).
  11. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J. Immunol. 169, 117-125 (2002).

Comments

5 Comments

  1. Dear Authors - you describe various conditions that contribute to a less than adequate disease response. But, do you have experience with conditions that create an exaggerated response in C57/Blk6 Jax, that result in animals dieing due to severe neurologic signs, rather than stabilizing and recovering as your discussion describes? For the past year, we have been struggling with a model that "used to work" at Harvard, but since moving to the National Cancer Institute, the model fails in that the previously resistant Tbet-/- (Tbx21) mice now develop EAE and both they and the Blk6 proceed to death. We have ruled out/excluded pathogens/commensals (segmented filamentous bacteria, Helicobacter, and norovirus), we have tried to emulate the same husbandry conditions as Harvard (using sterile micro-isolator caging, acidified water, even switching to a different diet)- but to no avail. Do you have any suggestions?

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 24, 2016 - 12:32 PM
  2. Dear Melody,
    these are rather strange experiences and my guess would be that there is a General Problem which renders your mice so over-succeptible to EAE. These changes are not so uncommon and can be rather tricky to solve. My advice would be to:
    - Try a delivery of your mice to another animal Provider (in europe we would for example choose Harlan or Janvier instead)
    - Try another animal housing facility at your University if available - the specific Environment can result in tremendous differences (even if there are no pathogens), People Report that regularly. The microbiome is suspected to be responsible for that while there are no specific tests for that.
    - Of course reduce amount of MOG (100 µg or lower)
    Hope that helps and good luck!
    Best, Stefan

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 25, 2016 - 9:16 AM
  3. Stefan- Thank you for your response. The investigator was using 100ug MOG and dropped it to 50ug, but this has not changed the profiles. We have done replicate studies in different facilities - same problem. Yesterday I found the following intriguing comments on the commercial Hooke EAE CRO site - they stated that you must titrate the pertussis dose for each lab, and if EAE is too severe, lower the dose (see below). Have you ever heard of this before? Does this sound reasonable? If you could give me your email, I can send you some of our mean clinical score graphs and you will see our problem. Here is their web site.
    http://www.hookelabs.com/protocols/eaeAI_C57BL6.html
    "Titration for optimal dosage of pertussis toxin. We strongly recommend that new customers establish the optimal PTX dose by inducing EAE in 10 mice in their own lab. The optimal PTX dose needed to obtain good EAE is typically 100 to 250 ng/mouse for each of the two PTX administrations. Larger doses of PTX are needed if mice experience higher levels of stress. The dose required decreases with mouse age. Even with identical mice and reagents, the PTX dose required varies from lab to lab. Finally, PTX potency varies from lot to lot; this affects the required dose. Hooke tests each lot of PTX in mice; the dilutions recommended in this protocol are the result of our testing.
    To determine the best PTX dose for the lab conditions, adjust PTX concentration to 4 µg/mL; this gives 400 ng PTX in each 0.1 mL dose (6000/1.5*0.1). Immunize 10 mice. Score mice daily starting 7 days after immunization, continuing until 28 days after immunization. (See Appendix A - EAE scoring guide.)

    If EAE is too severe, reduce PTX concentration to ~2.8 – 3.4 µg/mL (280 to 340 ng PTX/dose).
    If EAE is too mild, a higher dose of PTX is required;

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 25, 2016 - 12:03 PM
  4. My email is stefan.bittner@unimedizin-Mainz.de, you can reply directly there.
    I know Hooke kits and to our experience there is no obvious Change compared to self-made Solutions (for some People they work a bit better, for others not) - the main reason why we are not working with them routinously are Price + no flexibility in MOG/CFA composition.
    Pertussis: We never had Problems there and are not doing the testing (perhaps we are just lucky that our ptx is quite stable from Batch to Batch), but i know that other labs are doing the Titration as described by you and it might be a good Point for Trouble-Shooting!

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 27, 2016 - 6:20 AM
  5. Dear Stefan,

    I am trying to induce EAE in a B6/129 mixed background strain of mice. I wonder would the same protocol work?
    Thanks,

    Donghai

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 1, 2016 - 6:41 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics