구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

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Neuroscience

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Summary

이 문서는 구조적 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 체외에서 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동 프로토콜을 설명합니다. SIM을 사용하여 초 고해상도 현미경 개선 된 세부 사항과 함께 개별 돌기 쪽의 영상을 허용, 크게 세 가지 차원 공간에서 빛의 회절 한계를 넘어 이미지 해상도를 제공합니다.

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Schouten, M., De Luca, G. M., Alatriste González, D. K., de Jong, B. E., Timmermans, W., Xiong, H., Krugers, H., Manders, E. M., Fitzsimons, C. P. Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (87), e51276, doi:10.3791/51276 (2014).

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Abstract

돌기 쪽은 신경 세포의 수상 돌기에서 나오는 돌출부이며, 뇌의 흥분성 입력의 기본 시냅스 대상을 나타냅니다. 기술의 발전은 신경 세포의 연결 및 시냅스 가소성의 핵심 요소로 이러한 구조를 발견했습니다. 광학 현미경을 사용하여 척추의 형태의 정량 분석​​에 의한 빛의 굴절 고유 제한과 관련된 기술적 인 한계에 대한 근본적인 문제가 남아있다. 돌기 쪽이 용이하게 공 초점 레이저 주사 형광 현미경에 의해 식별 될 수있다. 길이 아닌 다른 척추 치수는 일반적으로 200 ㎚의 광학 현미경의 이론적 인 해상도 한계에 의해 고정 된 기존의 광학 해상도보다 작은 있기 때문에, 척추의 모양과 크기에 미묘한 변화를 측정하는 것은 어렵다.

몇 가지 최근에 개발 된 슈퍼 해상도 기술이 돌기 쪽을 포함하여 200 나노 미터보다 작은 이미지 세포 구조에 사용되어왔다. 티HESE 기술은 고전적인 원방 조작에 기초하기 때문에 시료의 표면을 넘어 기존의 샘플 준비 방법과 이미지를 사용할 수있게됩니다. 여기에 설명 된 기본 해마 신경 세포의 문화에 돌기 쪽의 영상을 초 고해상도 구조 조명 현미경 (SIM)을 적용하는 작업 프로토콜입니다. SIM의 가능한 응용 프로그램은 공 초점 현미경의 사람들과 겹칩니다. 그러나,이 기술은 다양한 적용 가능성을 제시한다. 공 초점 현미경으로 인해 실제 구멍의 사용에 초점 빛을 밖으로 제거의 비용으로 해상도 향상을 달성하면서 SIM은, 높은 효과적인 측면 해상도를 제공합니다. 이 프로토콜에서 기본 뉴런은 DNA 플라스미드는 형광 단백질을 인코딩하고 SIM을 사용하여 몇 군데로 형질 표준 프로토콜을 사용하여 유리 커버 슬립에 배양. 돌기 쪽이 체외에서 16-17일 후, 때 이미지가 있기 때문에 여기에 설명 된 전체 프로토콜은, 약 2 주 소요수지상 개발이 최적이다. 프로토콜을 완료 한 후, 돌기 쪽이 전문 소프트웨어를 사용하여 SIM 이미지 스택의 시리즈에서 3D로 재구성 할 수있다.

Introduction

수지상 척추 신경 막의 작은 돌기이다. 이 특징적인 구조는 일반적으로 단일 시냅스로부터 입력을 수신하도록 전문이 뉴런 사이의 물리적 접촉 면적을 나타내고있다. 대부분의 기능적 성숙 돌기 쪽은 구형 팁,라고 머리, 그리고 돌기 축에 머리를 연결하는 얇은 목으로 구성되어 있습니다. 그러나 등뼈가 정적되지 않고 적극적으로 이동하고 심지어 성인의 뇌 2에 지속적으로 형태를 변경합니다. 시간이 2 주 기간 내에서 후반 배아 또는 출생 초기 시간에서 파생 된 쥐 차 해마 신경 세포 배양은 척추와 같은 구조 3 초 filipodia 진화 수많은 막 돌기 복잡한 돌기 아버을 개발한다. 이러한 동적 동작과 다른 특성에 기초하여, 돌기 쪽은 메모리 저장 및 시냅스 전달의 4,5위한 해부 기판을 제공하는 것으로 생각된다.

일을 감안할 때돌기 척추의 크기와 모양이 시냅스 기능에, 정확하게 자신의 치수를 측정하는 것이 중요하다 것을 전자 중요한 역할. 등뼈의 길이는 약 200 내지 2000 나노 미터에서 변화 좀처럼 공 초점 레이저 주사 형광 현미경에 의해 식별 될 수있다. 그러나 길이보다 다른 척추의 크기는 일반적으로 이론적으로 200 나노 미터 6 주위 회절에 의해 고정 된 종래의 광 시스템의 해상도, 아래에. 이러한 해결 능력은 척추의 목 및 머리의 폭과 미세한 세부 사항을, 이미징에 충분하다. 많은 일이 문제를 해결하기 위해 전념하고있다 많은 비교적 새로운 슈퍼 해상도 현미경 기술은 상당한 진전을 제공하고 있습니다. 특히, 광 시야, 비 촛점 현미경 7-10에서 측방 구조화 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 임의의 발광색을 폐기하지 않고 고전 넘어선 해상도를 달성 할 수있다. 비 리네아와 함께이 기술을 사용R 현미경 기법, 그것은 제한 요소 (11)에 의해 광학 현미경의 측 방향 해상도를 개선하기 위해 이론적으로 가능하다. 그러나, 대부분의 실험 상황에서, SIM은이 하나의 요인에 의한 해상도 한계를 넘어 설 수있다. 이러한 자극 방출 고갈 (STED) 현미경 (12)와 사진 활성화 현지화 현미경 (PALM) 12와 같은 다른 슈퍼 해상도 광학 현미경 기술은 돌기 쪽의 영상에 적용되었습니다. 같은 PALM 등 현지화 기반의 방법은 최고 해상도를 달성하기 위해 RAW 이미지의 매우 큰 숫자를 필요로하기 때문에 속도가 제한됩니다. 한편, STED 높은 촬상 속도를 달성 할 수있는 비교적 낮은 광자 카운트 및 SIM (13)에 대한 경우가 아닐 수도 보이는 작은 필드에서 비록.

이 문서의 목적은 체외에서 배양 한 쥐의 기본 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동하는 프로토콜을 제공하는 것입니다

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Protocol

동물을 포함한 모든 실험 절차는 동물의 고통을 줄이기 위해 최적화하고, 동물 실험, 암스테르담 대학교, 12 월 프로토콜 번호의 DED204 및 DED250의위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 커버 슬립 준비

  1. 그들은 12 - 웰 플레이트의 우물에 맞도록, 카바이드 또는 다이아몬드 스크라이브를 사용하여 X 15mm 15mm의 크기로 커버 슬립을 잘라.
  2. 흄 후드에서 작업하는 동안, 완전히 유리 용기에 진한 질산 용액 (70 % 중량 / 중량)에 커버 슬립을 잠수하여 커버 슬립 코팅을 시작합니다. 균일 한 분포의 흔들림을 보장하기 위해 다음 4 시간의 최소 품어. 약 2 시간 동안 농축 된 질산 용액을 재사용하는 것이 가능하지만, 빛에 대한 노출에 의해 색을 풀 수있다.
  3. 농축 된 질산 용액을 제거하고 신중하게 각 세척 후 떨고, 30 분 동안 증류수에 커버 슬립 네 번 씻는다.
  4. 주의 제거물.
    참고 : 다음 세 단계 멸균 층류 캐비닛에서 수행됩니다.
  5. 96 %의 EtOH에 커버 슬립을 적신다. 을 EtOH 용액에서의 coverslips를 제거하고 건조 할 수 있습니다.
  6. 커버 슬립을 불꽃과 유리 용기에 넣어. 커버 슬립 (예를 들어 뒤몽 스타일의 5 번 집게를) 처리하는 미세 집게를 사용합니다.
  7. 180 ℃에서 12 ~ 16 시간 동안 건조 열 오븐에 알루미늄 호일과 빵과 용기를 커버 단단히 덮여 있으면 구운 커버 슬립 위로 1 달 동안 실온에서 저장 될 수있다.

2. 커버 슬립 코팅

커버 슬립 코팅 절차는 유리면과 수지상 arborization 14 뉴런 첨부 호의.

  1. 멸균 층류 후드에서 12 - 웰 플레이트의 한 우물에서 개별 커버 슬립을 배치 멸균 작은 집게를 사용합니다.
  2. (커버 슬립을 잠수함 또는 충분한 양) 500 폴리-L-라이신 솔루션의 μl를 추가합니다.
  3. T 포장그는 증발을 방지하고 실온에서 하룻밤을 떠나 알루미늄 호일을 접시.
  4. 문화를 시작하기 전에, 멸균 층류 후드에 신중 폴리-L-라이신 솔루션을 대기음.
  5. 건조하는 것을 방지하는 동안, 두 번 멸균 물 1 ㎖를 각 잘 씻으십시오.
  6. 대기음 물을 완전히 매체를 도금의 1 ML을 추가하고 세포를 도금 할 준비가 될 때까지 조직 문화 인큐베이터에서 커버 슬립을 둡니다. 그것은 24 시간 내에 세포를 도금하는 것이 좋습니다.

E16-E19 쥐 태아에서 뇌의 3. 제거

  1. 밤새 건조 멸균기를 가열 또는 70 % EtOH로들을 세척하여 수술 도구를 소독. EtOH를 사용하는 경우 완전히 건조.
  2. 1X HBSS 버퍼와 여러 30mm 요리를 준비하고 얼음에 보관하십시오.
  3. (± 0.4 ㎖를 160 ㎎ / ㎏ Euthasol) Euthasol의 복강 내 주사로 쥐 댐을 안락사.
  4. 반사의 부재를 확인합니다.
  5. 70 % EtOH로 댐의 복부를 스프레이.
  6. 복부를 따라 절개를하고 자궁을 제거합니다.
  7. 자궁에서 배아를 제거하고 100 mm 직경의 페트리 접시에 놓습니다.
  8. 큰 가위로 태아의 머리를 제거하고 차가운 1X HBSS 버퍼를 포함하는 새로운 배양 접시에 머리를 놓습니다.
    참고 : 여기에서 프로 시저가 층류 캐비닛에 무균 조건 하에서 수행되는 7.1 단계.
  9. 큰 집게로 측면을 따라 머리를 누릅니다.
  10. 작은 가위로, 다음 가로 방향으로 큰 집게로 피부를 벗겨 머리 꼭대기에 피부에 시상을 잘라주십시오.
  11. 두개골을 제거하는 단계 3.10에서와 같은 방법을 사용합니다. 꼬리 끝에서 시작하여 시상 ​​컷을; 온화 뇌 조직을 손상시키지 않고, 두개골을 열기. 멀리 옆으로 뇌를 노출 두개골의 두 부분을 접습니다.
  12. 무딘 주걱으로, 뇌를 꺼내서 신선한 차가운 1X HBSS에 배치합니다.
  13. 해마의 4. 해부

    이는 절개는 세포 생존을 위해 멸균 조건에서 가능한 한 빨리 완료하는 것이 매우 중요하다. 얼음에 찬 샘플을 보관하십시오.

    1. 제거하고 미세 가위로 소뇌를 버린다.
    2. 중간 선을 따라 시상 컷을 만들어 뇌의 두 반구를 분리합니다.
    3. 각 반구를 가지고 신선한 차가운 1X HBSS를 포함하는 새로운 30mm 접시에 모두 배치합니다.
    4. 측두엽은 접시의 바닥을 향하도록 각 반구를 놓습니다.
      참고 : 여기부터,이 해부 현미경을 사용하는 것이 좋습니다.
    5. 부드럽게 작은 집게를 사용하여 중뇌를 잡고 포셉의 다른 쌍의 중뇌를 제거합니다. 피질과 해마를 포함 그대로 반구의 나머지를 남겨주세요.
    6. 해마는 이제 접시의 바닥을 향하도록, 조직을 통해 전원을 켭니다.
    7. 부드럽게 P의 반구를 개최미세 집게로 끈으로 묶는다. 다른 미세 집게를 사용하여 신중하고 조심스럽게 수막을 제거합니다. 그것은 후각 망울에서 시작하는 것이 더 쉽습니다. 해마가 손상되지 않도록주의해야합니다.
    8. 해마는 지금 향하도록 조직의 방향을. 해마는 이제 특성 C 모양의 구조로 볼 수 있습니다.
    9. 미세 집게를 사용하여, 해마를 해부. 신선한 차가운 1X HBSS를 포함하는 새로운 30mm 요리에 수집합니다.

    5. 세포 해리와 도금

    1. 작은 조각으로 절단 한 다음 그들을, 해마의 총 수를 센다.
    2. 3 ML 1X HBSS를 포함하는 15 ML의 원심 분리기 튜브 조각을 수집합니다.
    3. 5 분 300 XG에 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 제거합니다.
    4. 해마 당 트립신 10 μl를 추가합니다.
    5. 37 ° C에서 최대 20 분 알을 품다 3 분 후 소용돌이.
    6. 신선한 차가운 1X HBSS 5 ㎖로 2 회 세척하고 상층 액을 버린다.
    7. 세코 후차, 세탁 37 ℃로 미리 예열 도금 매체의 1.5 ML를 추가 도금 배지에서 혈청 트립신 활성을 불 활성화한다.
    8. 조직의 모든 조각이 균일하게 단일 세포로 분산 될 때까지 천천히 불 광택 파스퇴르 피펫으로 30 배를 씹다. 모든 버블을 피하십시오.
    9. 도금의 5 ML을 추가 매체를 37 ℃로 미리 예열
    10. 트리 판 블루 중요한 염색을 이용하여 세포를 계산합니다.
    11. 제 2 절 (총 2 권 ml)에 준비 매체를 도금 1 ㎖에 12 - 웰 플레이트의 웰 당 50,000 세포를, 씨.
    12. 부드럽게 골고루 세포를 배포 할 판 바위.
    13. 37 품어 ° C, 5 % CO 2. 2-3일 후, 10 μM FUDR를 포함하는 배지와 도금 매체의 절반 (0.5 ㎖)을 교체.
      참고 : 수지상 척추 영상이 16~17일 도금 후에 수행된다 (체외에서 16~17일, DIV).

    리포 펙 타민을 사용하여 6. 쥐 해마 차 신경 세포 형질

    1. GFP 및 배양 배지 (루타 100 μL와 Neurobasal 매체의 10 ㎖)을 표현하는 플라스미드 DNA를 준비합니다.
    2. 37 ° C.에 사전 따뜻한 배양 배지
    3. DNA 믹스 (튜브)을 준비합니다. 각 coverslip에 들어 일반 Neurobasal 매체의 100 μL의 DNA 1 μg을 추가합니다. 조심스럽게 섞는다.
    4. 리포 펙 타민 믹스 (튜브 B)를 준비합니다. 각 coverslip에 들어 일반 Neurobasal 매체의 100 μL에 2 ㎕의 리포 펙 타민을 추가합니다. 조심스럽게 섞는다.
    5. DNA 믹스 적하에 리포 펙 타민 믹스를 추가합니다.
    6. 실온에서 30 분 동안 층류 후드에서 배양한다.
    7. 1 판에 예열 배양 매체의 1 ML을 추가합니다.
    8. 37 ° C에서 5 분 스토어 플레이트 2, 5 % CO 2.
    9. 부드럽게 DNA / 리포 펙 타민 200 ㎕를 각 웰에 혼합하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 45 분 동안 품어 적가를 추가합니다.
    10. 작은 포셉 사용 coversli을 리프트PS 뉴런을 포함하고 신선한 따뜻한 Neurobasal 매체를 포함하는 3cm 접시에 그들을 찍기를 씻어 2 판에 이동합니다.
    11. 37 ° C, 48 시간 동안 5 % CO 2의 형질 전환 된 뉴런을 배양한다.
    12. 형질 전환 효율을위한 형질 전환 후 24 시간을 확인합니다.

    7. 면역 염색 및 설치 쥐 해마 신경 세포의 기본

    형질 세포에서 형광 강도를 개선하기 위해, GFP 감지에게 형질 전환 후 48 시간을 향상시키기 위해 면역 염색 프로토콜을 수행합니다.

    1. 4 % PFA 0.05 M의 TBS를 준비합니다.
    2. 37 ℃에 4 % PFA 솔루션을 따뜻하게
    3. 부드럽게 커버 슬립을 포함하는 우물에서 매체를 대기음.
    4. 수상 돌기의 손상을 방지하기 위해주의 깊게 따뜻한 4 % PFA 500 μl를 추가합니다.
    5. 15 분 동안 실온에서 배양한다.
    6. 5 분 1X HBSS로 3 회 반복한다.
      참고 :이 시점에서 샘플은 4 ° C에서 3 주까지 저장 될 수또는 면역 염색을 즉시 시작할 수 있습니다.
    7. 샘플을 저장 한 경우, 5 분 동안 0.05 M TBS로 3 회 세척한다.
    8. 30 분 동안 실온에서 TBS-BSA (1 %) 용액으로 차단.
    9. 5 분 동안 0.05 M TBS로 3 회 반복한다.
    10. 배양 혼합 희석 차 항체를 추가합니다.
    11. 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 배양한다.
    12. 또한, 품어 하룻밤 부드러운 흔들림 4 ° C에서.
    13. 일차 항체를 제거합니다.
    14. 5 분 동안 0.05 M TBS 배 씻으시오.
      참고 :이 시점에서, 빛으로부터 보호 커버 슬립을 유지합니다.
    15. 배양 혼합 희석 보조 형광 - 복합 항체를 추가합니다.
    16. 실온에서 2 시간 동안 배양한다.
    17. 이차 항체를 제거합니다.
    18. 5 분 동안 0.05 M TBS로 3 회 반복한다.
    19. 5 분 1X TB로하는 과정을 2 회 반복한다.
    20. 우물에서 커버 슬립을 제거하는 미세 핀셋을 사용합니다.
    21. 조직과 TB의 과잉 건조 및 COV 마운트설치 매체를 사용하여 erslips.
    22. 설치 매체의 증발을 방지하기 위해 매니큐어를 가진 물개.

    8. 돌기 척추 이미징 구조 조명 현미경을 사용하여

    에 비해 해상도가 2 배 향상의 요인을 제공하고, 250 나노 - 재료에 설명 SIM 시스템을 사용하여 수지상 척추 이미징이 횡 방향 해상도 약 85-110 ㎚의 (XY) 값과 200 사이의 축 방향 (Z) 해상도 값을 가지고 광 시야 현미경.

    참고 : SIM을 사용하여 수지상 척추 영상 2 일간 단계 7.22 후 일반적으로 수행되지만 샘플이 어둠 속에서, 22의 온도 제어 아래에 보관하는 경우 이후 3 주까지 수행 될 수 - 23 ° C.

    1. 488 nm의 레이저, 수은 램프, 무대 컨트롤러, 압전 컨트롤러, 전송 된 빛의 할로겐 램프와 PC의 전원을 켜고 "ANDOR N-SIM에 대해"모드에서 SIM 소프트웨어를 시작합니다.
    2. 100X TIRF 개체를 청소95 % 에탄올로 3 회 필자 및 석유 에테르로 필요한 경우.
    3. 488 다이크로 익 (520) LP : 다음 필터 설정을 사용하십시오.
    4. 목적에 침지 기름 한 방울을 넣어. 기름 방울에 공기 기포가 없는지 확인합니다. 오일 샘플에 닿을 때까지 위쪽으로 목표를 이동합니다.
      참고 : 놓습니다 주변 빛으로부터 샘플을 보호하고 최대한 방에 조명을 차단하는 단계에 커버를.
    5. PSF의 최고 대칭을 얻기 위해, 37 ° C, 200 μm의 목적의 보정 칼라를 설정합니다. 정확한 칼라 위치, 첫 번째 위치 최적의 공칭 위치에서 목표 링을 설정 한 후 100 nm의 비드 샘플을 확인하기 위해. 최고의 PSF의 대​​칭성에 따라 약간의 공칭 하나의 주위에 고리의 위치를​​ 변경합니다.
    6. 조명, 3D-SIM 격자 (100X/1.49 모든 파장 1layer 3D)를 사용합니다. 1, SIM의 조명으로 격자 맞춤의 장소는 선택된 격자 블록을 시작하려면장소에 00X 1.49 목적. 뷰 (FOV)의 필드에 대해 10 ~ 15 구슬을 분리 할 수​​ 있습니다 농도, 미디어에 장착 된 100 nm의 비드 샘플을 사용합니다. 원하는 위치로 대물 보정 고리를 설정 한 후, 3D-SIM 조명을 선택하고 소프트웨어 유도 정렬 절차를 시작한다. 그것은 (1 방향) × (100 Z-평면)은 비즈 FOV를 재구성 할에서 이미지, 배 (5 단계)를 실행합니다. 포커스 아웃 흐리게 조명 등 비드 전체를 덮고, 적절한 ROI 통해 단일 ​​비드를 선택한 후에, 소프트웨어는 자동 피팅 PSF를 시작하고 그 결과에 따라 격자 위치를 조정할 것이다.
    7. 현미경의 성능을 확인하기 때문에 테이블의 움직임 및 / 또는 온도 표류로 인해 발생 가능한 어긋남, 격자 정렬 2 주마다 반복합니다. 또한, 또한 제조 업체의 제안에 따라 레이저의 강도와 안정성을 확인합니다.
    8. 95 % ETH와 시료 표면을 청소세 번 anol.
      참고 : 다음 단계는 컨트롤 패널 및 SIM 소프트웨어 내에서 올바른 설정의 개요를 그림 3을 참조하십시오.
    9. SIM 소프트웨어에서 광학 구성 아이 FITC를 선택하고 흰색 빛을 육안 검사에 터렛 1의 빈 필터 블록을 선택합니다.
    10. 초점 속도와 XY 테이블에 "순수"의 이동 속도를 설정합니다.
    11. 셔터를 열고 신속하게 샘플에 초점을 맞 춥니 다.
    12. 다시 셔터를 닫고 설정 제로 Z를 좌표입니다.
    13. 녹색 채널을 사용하여 육안 검사에 터렛 1의 녹색 필터를 선택합니다.
    14. 가장 낮은 설정으로 수은 램프의 강도를 설정합니다.
    15. 목적은 밀봉 접촉하지 않는 것을 확인하고,주의 깊게 샘플의 경계로 이동합니다.
    16. 셔터를 열고 신속하게 가장 낮은 강도 샘플을 검사합니다.
    17. 관심 충분히 밝은 덴 드라이트 (dendrite)가 발생하고 그 부분을 중심으로시시야에서 셔터를 닫는다.
    18. , 모드 EM을 읽어 1 MHz의 16 비트를 얻을 수, 노출 시간이 100 밀리 초, 레이저 파워 5 %와 EM 200을 얻기 위해 광학 구성 3D-SIM 488과 카메라 설정에 소프트웨어를 설정합니다.
      참고 : 터렛 2의 녹색 필터가 선택되어 있는지 확인하고 터렛 1이 비어입니다.
    19. 격자가 '이동'으로 설정되어 있는지 확인하고 레이저 광과 카메라를 통해 샘플을 볼 라이브 클릭합니다.
    20. 찾는 테이블을 활성화합니다.
    21. 필요한 경우 관심의 대상 센터와 여분의 순수로 설정 초점 속도로 초점을 맞 춥니 다.
      참고 : 판독 모드에서 EM 1 MHz의 16 비트를 얻을 좋은 SIM 이미지의 대상 강도는 30,000-45,000 사이입니다.
    22. 빨리 EM은 1 MHz의 16 비트를 얻을 판독 모드에서 30,000-45,000 사이의 강도 값을 얻을 수있는 카메라 설정을 조정합니다. 처음 사용
      1. 레이저 출력 : 0 % - 20 % (상기와 같이 제조 된 샘플, 5 % 또는 2.6 mW의 함께 충분하다)
      2. 노출 시간 :50 밀리 초 - 2 초
      3. 판독 모드 : EM 1 MHz의 16 비트를 얻을
      4. EM은 얻을 : 0-300
      5. 변환 이득 : 1X - 5.1
      6. 라이브에 대한 형식 : 없음 비닝 (binning)
      7. 캡처에 대한 형식 : 없음 비닝 (binning)
        NOTE : 이러한 설정으로 1.3 % 표백 ± 6.3 %가 일상적으로 크게 화질 (15)에 영향을 미칠 수있는 허용 가능한 최대 표백도의 10 %의 한도 내에서 달성된다.
    23. 라이브 뷰를 끄려면 중지를 클릭합니다.
    24. 의 ND 시퀀스 패널에서 3D Z 스택의 설정을 구성합니다 :
      1. 범위 : 2 μm의
      2. 설정 크기 : 120 nm의
      3. Z 평면
      4. 홈 위치를 클릭
      5. 람다 섹션의 광학 구성 3D-SIM 488을 선택
    25. N-SIM 패드에서 획득 모드로 3D-SIM을 선택합니다.
    26. ND 시퀀스 획득을 실행하고 원시 데이터를 저장합니다.
    27. 다시 광학 구성 아이 FITC를 선택하고 전체 샘플 이미지를 만들 때까지 반복 8.15-8.27 단계
    28. 3D 이미지 재구성 : 8.23​​ 단계에서 획득 한 데이터는 어느 즉시 또는 나중에 복원 할 수 있습니다. 재구성 슬라이스 또는 재구성 스택 모드에서 기본 재구성 설정으로 Z 스택을 재구성하여 시작하고 필요한 경우 조정합니다.
      주 : 최상의 결과를 위해, Z 스택이 표시 스텝 크기로 만든되어야하고 재구성 스택 모드에서 재구성. 항상 원시 데이터 또는 바람직 광 시야 화상과 비교하여, 재구성 된 이미지의 유효성을 확인. 재구성 처리를 위해 조정될 수 파라미터는 콘트라스트와 고주파 노이즈 억제한다. 둘 다 다른 RAW 이미지 속성이 재건 과정에서 고려하는 방법에 영향을 미친다. 낮은 변조 깊이 원시 데이터의 경우에는, 콘트라스트 파라미터는 중요한 역할을한다. 사용자는 낮은 신호 대 잡음비를 가진 데이터 세트를 가지고 있다면, 고주파 노이즈 억제 파라미터는 재구성 품질에 영향을 미칠 수있는 SEverely.
    29. 때 완성, 센터 XY 단계에서 이미징 및 모든 방법을 내려 휴식 위치로 목표를 이동합니다.
    30. 샘플을 마운트 해제하고 95 % 에탄올로 시료와 목적을 모두 청소합니다.
    31. 소프트웨어와 PC를 종료하고 다른 모든 장치의 전원을 켭니다.
    32. 획득 된 영상의 3D 재구성 및 척추 분류는 NeuronStudio 소프트웨어를 사용하기 전에 설명 된 16 (도 4 참조)에 TIFF 파일을 변환 한 후에 수행 될 수있다.
    33. NeuronStudios 소프트웨어의 재구성에 대해 다음과 같은 매개 변수를 사용합니다 :
      1. 양 : 복셀 크기 : X : 0.03 μm의; Y : 0.03 μm의; Z : 0.120 μm의.
      2. 덴 드라이트 탐지 :; 1.3 : 비를 부착 최소 길이 : 5 μm의; 이산화 비율 : 1; 접합을 다시 정렬 : 예.
      3. 최소 높이 : 검출 척추 0.2 μm의; 최대 높이 : 5.001 μm의; 최대 폭 : 3 μm의; 최소 그루터기 크기 : 10 복셀; 최소 비 그루터기 크기 : 5 복스ELS.
      4. 목 비율 (머리 목 비율) : 등급 분류 척추 1.1; 얇은 비율 : 2.5; 버섯의 크기 : 0.35 μm의;
    34. 신경 돌기 정점 형태 : 렌더링하는 데 사용 NeuronStudio 매개 변수 고체 일식; 신경 돌기의 정점 색상 : 유형에 의하여; 신경 돌기 가장자리 모양 : 라인; 신경 돌기 가장자리 색깔 : 단 하나 색깔; 척추 모양 : 고체 일식; 척추 색상 : 유형에 의하여.
      참고 : 3D 재구성은 볼륨 렌더링 설정하는 것도 가능합니다 후. 기본 임계 값은 활성화 된 '재생성 볼륨 렌더링'옵션을 20으로 설정했다. 불투명도는 확인 '자동 강도'에 의해 설립되었다. '표면 만 사용'및 '포인트 프리 렌더링'옵션도 활성화했다

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Representative Results

여기에 설명하는 것은 SIM을 사용하여 체외에서 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징을위한 표준화 작업 프로토콜입니다. 프로토콜 워크 플로우와의 중요한 단계는 그림 1에 나타내었다. 전반적으로, 프로토콜 문화, 개발, 쥐 차 해마 신경 세포 및 면역 조직 화학 염색의 형질을 포함한 샘플 준비의 첫 단계에서 분리 실험적인 작업의 약 2 주가 걸리고, 두 번째 단계 SIM을 사용하여 샘​​플 이미징. 쥐 차 해마의 뉴런은 약 이주 뉴런은 수많은 돌기 쪽이 3,5 베어링 복잡한 돌기 아버를 개발 한 문화의 시작 후 고정되어 있습니다. 섹션 1-8에 자세히 설명 된 프로토콜을 사용하여, 최고 해상도의 이미지를 체계적으로 돌기 쪽이 가능합니다. (16) 이전에 설명하는 공 초점 형광 현미경을 이용하여 종래의 수지상 척추 영상 법에 비해,(17), SIM을 사용하여 본원에 기재된 프로토콜 있도록 훨씬 더 나은 이미지 해상도 및 3D 재구성을 제공 초기 filipodia에서 척추와 같은 구조에 이르기까지 신경 세포막 돌기의 식별 및 분류.

그림 1
그림 1. 방식은 프로토콜 워크 플로우의 단계와 타이밍을 보여줍니다.

그림 2
그림 2. 공 초점 (A)와 SIM 현미경 (B) 몇 군데 수상 돌기 및 돌기 쪽의 대표 현미경 사진. 제 8 항에 기술 된 바와 같이 대표 SIM 현미경을 획득 한, 대표 공 초점 현미경은 u에게 인수되었다30 μm의 레이저 출력 2.6 mW의, 아니 평균 : 실제 구멍의 크기를 노래. 인수는 16 전에 설명 된대로 NeuronStudio 소프트웨어를 사용하여 공 초점 및 SIM 이미지 (각각 C와 D)에서 재구성되었다. 수상 돌기는 추적하고, 등뼈는 이러한 목의 길이, 목 직경과 헤드 직경과 주요 매개 변수를 조정 한 후 소프트웨어와 함께 자동으로 분류되었다. 박스 영역은 공 초점 (A)와 SIM (B) 몇 군데 및 해결하고, 생성 된 3D 복원의 정확도의 차이를 묘사 해당 Z 스택 (C와 D)에서 재구성 한 개인 돌기 척추를 보여줍니다. SIM의 높은 해상도에 따르면, 헤드 (E)과(F) 양의 정량 분석은 직경이 보여 그 SIM이 돌기 척추 형태의 작은 변화를 감지 할 수있는 것을 나타내는 같은 돌기 쪽을위한 공 초점 현미경보다 SIM 조치 상당히 작은 크기. 디 E와 F의 ATA는 기준 공 초점 측정에 정규화됩니다. 결과는 공 초점 및 SIM 현미경 모드 두 군데 5 돌기 부분에서 추출 된 3 돌기 쪽의 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 목 직경 공 초점 (100.0 ± 4.296 정규화 단위) 및 SIM (50.61 ± 7.642 정규화 단위) 사이에 유의 한 차이 (** p = 0.0049)가 있었다 이미지, 학생 T-테스트 (E) 테스트로. 헤드 직경 공 초점 (100.0 ± 6.255 정규화 단위) 및 SIM (58.12 ± 9.451 정규화 단위) 사이에 유의 한 차이 (* P = 0.0209)가 있었다 이미지, 학생 t-검정 테스트로.

그림 3
그림 3. 스크린 샷이 프로토콜에 설명 된 설정으로 니콘의 NIS 요소 6.14 SIM 소프트웨어 패키지에서.

ve_content "FO : 유지 - together.within 페이지를 ="항상 "> 그림 4
NeuronStudio 3D 재건과 수상 돌기의 대표 이미지의 척추 분류 소프트웨어에서 4. 스크린 샷 그림.

표 1
시약의 표 1. 목록. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 문서에서는 SIM을 사용하여 체외에서 배양 된 쥐의 기본 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동 프로토콜을 설명한다. 차 해마 신경 세포 배양법 Kaech와 뱅커 (18)에 의해 설명 된 방법 일본어의 적응이다. 브루 19에 의해 설명 된 주된 차이점은, Neurobasal/B27 배양 astroglial 피더 문화의 요구를 제거 가능 매체, 및 아교 세포의 증식을 억제하면서 신경의 생존을 촉진 일 3에 유사 분열 억제제 FUDR의 첨가의 사용이다.

프로토콜의 여러 중요한 단계가 있습니다. 세포를 플레이트에 사용되는 커버 슬립의 두께가 정확한 SIM 실험을 위해 결정적이다. 커버 슬립 준비 및 코팅 동안 불임이 중요합니다. 폴리-L-라이신 처리 된 커버 슬립 2.3 및 2.4 동안 건조하게하지 마십시오. 단계 5.8에서 사용 된 화염 연마 펫의 직경은 중요하다.너무 좁은 끝은 나중 단계에서 낮은 세포 생존에 발생합니다. 빨리 가능한 한 해마의 분리는 높은 세포 생존 능력을 보장합니다. 인큐베이션과 트립신 농도의 타이밍은 높은 세포 생존을 보장하기 위해 중요하다. 트립신 효소 활성의 손실은 세포 생존에 영향을 미칠 수 있습니다. 마지막으로, 단계 5.14의 FUDR의 첨가는 신경 세포의 생존을 촉진하고 신경교 증식을 억제하기 위해 매우 중요하다.

샘플 이미징 단계는 간단합니다 엄격히 프로토콜은 쉽게 자신의 형태 학적 특징에 따라 돌기 쪽을 분석하고 분류하기 위해 3D로 재구성 할 수있는 최고 해상도의 이미지의 취득에 여기와 결과를 설명하는 다음을 수행합니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, SIM 모드에서 취득 된 화상의 품질이 동일한 공 초점 현미경의 모드를 사용하여 획득 정확히 동일한 수지상 세그먼트 및 개별 등뼈의 이미지보다 실질적으로 더 낫다. 이 결과는 그쪽을 제안합니다T SIM의 사용도 2E2 층에 정량으로 돌기 척추 형태의 미묘한 변화,보다 더 많은 이미지에 좋은 기회를 제공 할 수 있습니다.

지금까지 대부분 (형광) 와이드 필드 현미경으로 인해 낮은 광독성로, 이미지 살아있는 세포에 사용되어왔다. 마찬가지로 인해 낮은 광독성 효과와 기존의 (유전) fluophores 좋은 조합, SIM은 허용 살아있는 세포 이미징 및 최고 해상도로 표현 세포 낮은 fluophore에 돌기 쪽의 식별. 이러한 STED 또는 PALM 같은 다른 슈퍼 해상도 현미경 방법에 비해, SIM은 체외에서 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽의 이미징을위한 신속하고 저렴한 방법을 제공합니다. 실제로 SIM은 기존의 공 초점 현미경에 비해 두 배에 의해 해상도를 증가하지만.

SIM의 제한의 한 예는 형광에 의존하는 점이다일부 실험적인 설정이 적용하기 어려울 수 있습니다. 이를 위해, 예컨대, 전자 현미경 등의 형광에 의존하지 않는 현미경 기술은 가능한 해결책을 제공 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 특히 전자 현미경은 지루한, 비싼 느린 방법입니다. 또한, 전자 현미경은 단지 고정 된 샘플들에 수행 될 수있다. 따라서 SIM은 살아있는 세포의 초 고해상도 영상에 대한 더 적합합니다. 형광 단백질을 인코딩 플라스미드 형질 감염을인가하기위한 이론적 근거는 다른 세포로부터 수상 돌기의 오버랩 개별 돌기 쪽의 식별을 방지 절연 세포의 부족, 아무런 재현성 세포질 라벨링을 초래한다는 것이다. 면역 염색과 형질의 조합은 형광 (17)을 향상시키기 위해 이전에 표시되었습니다. 그럼에도 불구하고, 다른 형광 기법은 또한 SIM과 돌기 쪽의 영상에 적용 할 수있는, 예를 들어 충분한 형광 염색은 최근 드를 사용하여 획득 할 수있다개발 하였다 액틴 결합 프로브 (20).

최근의 기술 개발은 고속 구조적 조명 현미경은 11 Hz에서 13, 여기에 기술 된 프로토콜의 매우 논리적 미래의 응용 프로그램에 따라 프레임의 속도로 100 nm의 해상도를 할 수 있음을 보여주는 역동적 인 세포 이미징에 SIM의 응용 프로그램을 허용했기 때문에 시간 경과 살아있는 쥐의 기본 해마 신경 세포의 SIM과 돌기 척추 형태의 빠르고 역동적 인 변화의 분석에의 응용이 될 수 있습니다. 이 응용 프로그램에 대한 다음 도전은 라이브 현미경의 긴 시간 간격과 관련된 예상 누적 광독성이 될 수 있습니다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 작품은 CPF에 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO)의 VIDI 인증 번호의 H64.09.016에 의해 재정되었다. CPF는 그녀의 중요한 의견과 최종 원고에 대한 수정 박사 Silvina A. Fratantoni에 감사합니다. GMRDL / 네 ..는 네덜란드의 기술 재단 NWO의 일부입니다 STW (프로젝트 12151 및 11350), 어느 부분적 경제부에 의해 자금 지원에 의해 지원된다. 우리는 도움과 지원을 위해 니콘 인스트루먼트의 유럽 BV의 캐서린 키츠 피터 Drent 감사합니다. HX 보조금 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (부여 820.02.006)에 의해 지원되었다 네덜란드 왕립 예술 과학 아카데미 (부여 11CDP10) 및 WT에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker
Name Company Catalog Number Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil

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References

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