Визуализация дендритных шипиков крысы первичной нейронов гиппокампа с помощью структурированного подсветки микроскопия

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

В этой статье описывается рабочего протокола к фото дендритных шипиков от нейронов гиппокампа в пробирке с использованием структурированного подсветки микроскопия (SIM). Супер-разрешение микроскопии с использованием SIM предоставляет разрешение изображения существенно за световой дифракционного предела во всех трех пространственных измерениях, позволяя визуализацию отдельных дендритных шипиков с улучшенной подробно.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schouten, M., De Luca, G. M., Alatriste González, D. K., de Jong, B. E., Timmermans, W., Xiong, H., Krugers, H., Manders, E. M., Fitzsimons, C. P. Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (87), e51276, doi:10.3791/51276 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Дендритные шипы выступы, возникшие в результате дендрита нейрона и представляют собой первичные постсинаптические целей возбуждающим сигналам в головном мозге. Технологические достижения определили эти структуры в качестве ключевых элементов в связи нейронов и синаптической пластичности. Количественный анализ позвоночника морфологии с использованием световой микроскопии остается существенной проблемой из-за технических ограничений, связанных с внутренней предела рефракции света. Дендритные шипы могут быть легко идентифицированы с помощью конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии. Однако измерение тонкие изменения в форме и размеру шипами трудно, потому что позвоночник размеры, отличные от длины, как правило, меньше, чем при обычном оптическом разрешении, установленного теоретического предела разрешения световой микроскопии в 200 нм.

Несколько современные методы суперразрешением были использованы для изображения клеточных структур, меньших 200 нм, в том числе дендритных шипиков. ТHESE методы основаны на классических операций дальнего поля и, следовательно, позволяют использовать существующие методы подготовки образца и имиджу за пределами поверхности образца. Описанный здесь является рабочим протокол применять суперразрешения структурированы освещения микроскопии (SIM) в визуализации дендритных шипиков в первичных гиппокампа культур нейронных. Возможные применения SIM пересекаются с конфокальной микроскопии. Тем не менее, две технологии представляют различные применения. SIM предлагает более высокую эффективную боковую разрешение, в то время как конфокальной микроскопии, в связи с использованием физического обскуры, приводит к усовершенствованию разрешения за счет удаления вне фокуса света. В этом протоколе, первичные нейроны культивировали на покровных стеклах с использованием стандартного протокола, трансфицированных ДНК-плазмиды, кодирующие флуоресцентные белки и отображаемого использованием SIM. Весь протокол, описанный здесь занимает около 2 недель, потому дендритных шипиков изображаются после 16-17 дней в пробирке, когдадендритных развития является оптимальным. После завершения протокола, дендритных шипиков может быть восстановлена ​​в 3D от серии SIM стеки использованием специализированного программного обеспечения.

Introduction

Дендритных позвоночника небольшой выступ мембраны нейрона. Эта характеристика структура специализируется на обычно получают входной сигнал от одного синапса и представляет собой физическую площадь контакта между двумя нейронами. Большинство функционально зрелые дендритные шипики состоят из шарового наконечника, называемая головой и тонкой шеей, которая соединяет головку с дендритных вала. Тем не менее, шипы не являются статичными и активно двигаться и изменить свою морфологию непрерывно даже во взрослом мозге 2. В течение 2-недельного периода времени, крысы первичных культурах гиппокампа нейронов, полученные с конца эмбриона или раннем послеродовом время разработки сложных дендритных беседки с многочисленными мембранных выступов, которые развиваются с начала filipodia чтобы шиповидных структур 3. На основе этого динамического поведения и других характеристик, дендритных шипиков, как полагают, обеспечивают анатомическую субстрат для хранения памяти и синаптической 4,5 передачи.

Учитывая йэ важная роль, что дендритные размер позвоночника и форма уже в синаптической функции, важно измерять их параметры точно. Шипы варьировать от около 200 до 2000 нанометров в длину и могут быть легко идентифицированы с помощью конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии. Тем не менее, позвоночника размеры, отличные от длины, как правило, ниже разрешение обычных оптических систем ", теоретически, установленного дифракции около 200 нанометров 6. Эти разрешающей способности недостаточны для работы с изображениями тонкости, такие как ширина позвоночника шеи и головы. Большая работа была посвящена решить эту проблему и многие относительно новые методы микроскопии сверхвысокого разрешения предоставили существенный прогресс. В частности, можно добиться разрешения за пределы классического предела, не отказываясь любой свет выбросов с помощью боков структурированный освещения микроскопии (SIM) в широкоэкранном поля, не-конфокальной микроскопии 7-10. Используя эту технику в сочетании с не-Lineaметоды микроскопии г, теоретически можно улучшить боковую разрешение оптического микроскопа неограниченным коэффициентом 11. Тем не менее, в большинстве экспериментальных условиях, SIM позволяет превзойти предел разрешения в двух 1. Другие супер-разрешением методы оптической микроскопии, такие как Вынужденное истощение выбросов (STED) микроскопии 12 и фото-активации локализации микроскопии (PALM) 12 были применены к визуализации дендритных шипиков. Локализация на основе методов, таких как PALM требуют очень большого количества необработанных изображений для достижения супер-разрешения и поэтому ограничены в скорости. С другой стороны, STED может достичь высокую скорость обработки изображений, хотя при относительно низких фотоотсчетов и небольших полей зрения, которые не могут быть в случае SIM 13.

В этой статье цель заключается в предоставлении рабочего протокола для изображения дендритных шипиков от крыс первичных нейронов гиппокампа, культивируемых в пробирке

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры с участием животных были оптимизированы, чтобы уменьшить страдания животных и были одобрены Комиссией по экспериментов на животных, Университет Амстердама, DEC протокола # DED204 и DED250.

1. Покровные Подготовка

  1. Сокращенный покровные до размера 15 мм х 15 мм с использованием карбида или алмаз палочки так, чтобы они соответствовали в лунки 12-луночного планшета.
  2. Во время работы в вытяжном шкафу, начать покровное покрытие, полностью погружая покровные в концентрированном растворе азотной кислоты (70% вес / вес) в стеклянной таре. Для обеспечения равномерной сотрясения, то инкубировать в течение минимум 4 часов. Это можно повторно использовать концентрированный раствор азотной кислоты в течение приблизительно 2 раза, но он может потерять цвет при воздействии света.
  3. Извлеките концентрированного раствора азотной кислоты и мыть покровные четыре раза в дистиллированной воде в течение 30 мин, осторожно встр хиванием после каждой промывки.
  4. С осторожностью удалитьвода.
    Примечание: следующие три этапы выполняются в стерильной камере с ламинарным потоком.
  5. Замочите покровные в 96% этанола. Удалить покровные из раствора этанола и дайте им высохнуть.
  6. Пламя покровные и положить их в стеклянную емкость. Используйте тонкий пинцет для обработки покровные (Дюмон стиль no.5 Пинцет для примера).
  7. Накройте емкость с алюминиевой фольгой и запекать в сухожаровой духовке в течение 12-16 часов при 180 ° С Запеченные покровные можно хранить при комнатной температуре в течение до 1 месяца, если покрыт плотно.

2. Покровные Покрытие

Процедура покровное покрытие способствует нейронов привязанность к поверхности стекла и дендритов 14.

  1. В стерильной ламинарным укрытием, использовать стерильные небольшие щипцы разместить отдельные покровные в единичных скважинах 12-луночный планшет.
  2. Добавить 500 мкл поли-L-лизин раствора (или достаточное количество, чтобы погрузить покровные).
  3. Оберните тон пластины в алюминиевую фольгу для предотвращения испарения и оставить его на ночь при комнатной температуре.
  4. Перед началом культуры, аспирации поли-L-лизин раствор осторожно в стерильном ламинарном шкафу.
  5. Вымойте каждую лунку с 1 мл стерильной воды в два раза, в то время не давая им высыхать.
  6. Аспирируйте вода полностью, добавить 1 мл посева среду и не оставляют покровные в культуре ткани инкубаторе до готовности пластины клеток. Рекомендуется пластины клеток в течение 24 часов.

3. Удаление Мозги от E16-E19 Rat эмбрионов

  1. Стерилизовать хирургических инструментов путем нагревания их в сухом стерилизатора на ночь или мыть их с 70% этанола. Тщательно высушите если этанол используется.
  2. Подготовьте несколько 30 мм блюда с 1x HBSS буфера и держать их на льду.
  3. Эвтаназии крысы плотины с внутрибрюшинной инъекцией Euthasol (160 мг / кг Euthasol в объеме ± 0,4 мл).
  4. Проверьте отсутствие рефлексов.
  5. Спрей живот плотины с 70% этанола.
  6. Сделайте надрез вдоль живота и удалению матки.
  7. Удалить эмбрионов из матки и поместите их в 100 мм диаметром Петри.
  8. Удалите головы эмбрионов с большими ножницами и поместить головы в новом чашку Петри, содержащую холодный буфер 1x HBSS.
    Примечание: отсюда к шагу 7.1 процедура проводится в стерильных условиях в шкафу с ламинарным потоком.
  9. Удерживая головы по бокам с большими щипцами.
  10. С маленькими ножницами, сделать сагиттальной разрез в коже на верхней части головы, затем с боков очистить кожу вниз с большой щипцами.
  11. Используйте тот же подход, что и в шаге 3.10, чтобы удалить череп. Сделать сагиттальный разрез, начиная с хвостового конца; мягко вскрытия черепной коробки, не повреждая ткани мозга. Сложите две половинки черепа в боковом направлении, разоблачающих мозг.
  12. С тупым шпателем, выкопайте мозг и поместить его в свежей холодной 1x HBSS.
  13. 4. Рассечение гиппокампов

    Это очень важно, что рассечение делается как можно быстрее в стерильных условиях, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток. Держите образцы холодного на льду.

    1. Снимите и выбросьте мозжечок с прекрасными ножницами.
    2. Отделите два полушария мозга, сделав сагиттальный разрез по средней линии.
    3. Возьмите каждую полушарие и поместить как в новой 30 мм блюдо с пресной холодной 1x HBSS.
    4. Место каждого полушария, так что височная стоит дно тарелки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отсюда, рекомендуется использовать рассекает микроскопом.
    5. Придерживая средний мозг с помощью небольшого пинцета и удалить средний мозг с другой парой щипцов. Оставьте оставшуюся часть полушария нетронутыми, содержащий кору и гиппокамп.
    6. Переверните ткани, так что гиппокамп в настоящее время стоит дно тарелки.
    7. Придерживая полушарие в ркружева с тонким пинцетом. С помощью еще тонкий пинцет, тщательно и аккуратно удалить мозговых оболочек. Легче начать в обонятельной луковице. Будьте осторожны, чтобы не повредить гиппокамп.
    8. Расположите ткань так, что гиппокамп теперь вверх. Гиппокамп теперь можно увидеть на его характерной С-образной структуры.
    9. Используя тонкий пинцет, рассекать из гиппокамп. Соберите его в новом 30 мм блюдо с пресной холодной 1x HBSS.

    5. Для диссоциации клеток и покрытия

    1. Подсчитать общее количество гиппокампе, а затем вырезать их на мелкие кусочки.
    2. Соберите части в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую 3 мл 1x HBSS.
    3. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант.
    4. Добавить 6 мкл трипсина на гиппокампе.
    5. Выдержите в течение макс 20 мин при 37 ° С Вихревой через 3 мин.
    6. Вымойте два раза с 5 мл свежей холодной 1x ССРХ и отбросить супернатант.
    7. После СЕКОй мыть, добавить 1,5 мл обшивки среде, предварительно нагревают до 37 ° С Сыворотка в электролитической среде инактивирует активности трипсина.
    8. Медленно растирают 30x с огневой полировкой пипетки Пастера, пока все кусочки ткани не однородно рассеяны на отдельные клетки. Избегайте пузырьков.
    9. Добавить 5 мл покрытие среднего предварительно нагревают до 37 ° С
    10. Граф клеток с использованием голубой жизненно окрашивание трипанового.
    11. Seed 50000 клеток на лунку 12-луночного планшета в 1 мл обшивки среду, подготовленные в разделе 2 (общий объем 2 мл).
    12. Осторожно покачайте пластину, чтобы равномерно распределить клетки.
    13. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО 2. После 2-3 дней, замените половина обшивки среде (0,5 мл) с культуральной среде, содержащей 10 мкМ ФУДР.
      Примечание: дендритных изображений позвоночника выполняется 16-17 дней после посева (16-17 дней в пробирке, DIV).

    6. Гиппокампа крысы Первичная Нейрон Трансфекцию помощью Lipofectamine

    1. Подготовка плазмидной ДНК, экспрессирующих GFP и инкубационной среде (10 мл Neurobasal среде с 100 мкл глютамаксом).
    2. Предварительно теплой инкубационный среднего до 37 ° С
    3. Подготовьте смесь ДНК (Tube A). Для каждого покровное добавить 1 мкг ДНК в 100 мкл простой Neurobasal среды. Аккуратно перемешать.
    4. Подготовка Lipofectamine смеси (Tube B). Для каждого покровное добавить 2 мкл Lipofectamine в 100 мкл простой Neurobasal среды. Аккуратно перемешать.
    5. Добавить смесь Lipofectamine по каплям смеси ДНК.
    6. Инкубировать в ламинарном боксе в течение 30 мин при комнатной температуре.
    7. Добавьте 1 мл подогретого среду инкубации к пластине 1.
    8. Магазин пластина 2 в течение 5 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
    9. Аккуратно добавить по каплям 200 мкл ДНК / Lipofectamine смешать в каждую лунку и инкубировать в течение 45 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
    10. С использование небольших щипцов поднять coversliпс, содержащий нейроны и ополосните их, опуская их в 3-см чашку, содержащую свежий теплый Neurobasal среды и переместить их к пластине 2.
    11. Выдержите трансфектированных нейронов при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 48 часов.
    12. Проверьте эффективность трансфекции через 24 часа после трансфекции.

    7. Иммуноокрашивание и Монтаж гиппокампа крысы первичных нейронов

    Для улучшения интенсивности флуоресценции в трансфицированных клеток, выполнить протокол Иммуноокрашивание улучшения обнаружения GFP 48 часа после трансфекции.

    1. Подготовка 4% PFA и 0,05 М TBS.
    2. Нагрейте 4% раствор PFA до 37 ° С.
    3. Осторожно аспирации среды из лунок, содержащих покровные.
    4. Добавить 500 мкл теплой 4% PFA тщательно, чтобы предотвратить повреждения дендритов.
    5. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
    6. Промыть 1x HBSS 3 раза в течение 5 мин.
      Примечание: в этой точке образцы можно хранить до 3 недель при 4 ° Сили иммуноокрашивание можно начинать сразу.
    7. Если образцы хранили, промывают 0,05 М TBS 3 раза в течение 5 мин.
    8. Блок с TBS-BSA (1%) раствору при комнатной температуре в течение 30 мин.
    9. Промыть 0,05 М TBS 3 раза в течение 5 мин.
    10. Добавить первичное антитело разбавленный в инкубационном смеси.
    11. Инкубируйте пластин в течение 1 часа при комнатной температуре.
    12. Кроме того, инкубировать в течение ночи при 4 ° С при осторожном встряхивании.
    13. Удалить первичное антитело.
    14. Промыть 0,05 М TBS 3x течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: с этого момента, держите покровные защищенном от света месте.
    15. Добавьте вторичной флуоресцентной-сопряженных антитела, разведенного в инкубационном смеси.
    16. Инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов.
    17. Снимите вторичного антитела.
    18. Промыть 0,05 М TBS 3 раза в течение 5 мин.
    19. Промыть 1X ТБ 2 раза в течение 5 мин.
    20. Используйте тонкий пинцет, чтобы удалить его в покровных из скважин.
    21. Высушите избытка ТБ с ткани и смонтировать CoVerslips использовать монтажный среду.
    22. Печать с лаком для ногтей, чтобы предотвратить испарение монтажной среды.

    8. Дендритных позвоночника изображений с помощью Структура подсветки микроскопия

    Дендритные позвоночника изображений с использованием системы SIM описано в материалах имеет боковую разрешение (XY) значение приблизительно 85-110 нм и величину осевой (Z) разрешение между 200 - 250 нм, что обеспечивает коэффициент 2 раза улучшением по сравнению с разрешением широкого поля микроскопии.

    ПРИМЕЧАНИЕ: дендритных позвоночника визуализации с использованием SIM делается обычно через 2 дня после шага 7,22, но можно было бы сделать до 3 недель позже, если образцы хранятся в темноте и в контролируемой температуре 22 - 23 ° С.

    1. Включите 488 нм лазера на, ртутной лампы, контроллер этапе, контроллер пьезо, галогенной лампы для проходящего света и ПК и запуска программного обеспечения SIM в режиме "ANDOR для N-SIM".
    2. Очистите 100x объект TIRFив 95% этанолом три раза, а при необходимости петролейным эфиром.
    3. Используйте следующие настройки фильтра: 520 ЗО с 488 дихроичных.
    4. Поместите каплю иммерсионного масла на цели. Убедитесь, что нет никаких пузырьки воздуха в нефтяной-капли. Перемещение цели вверх, пока масло не касается образца.
      Примечание: место крышку над стадии защиты образца от окружающего света и тусклый свет в комнате как можно больше.
    5. Установка коррекции воротник целью до 37 ° С, 200 мкм, чтобы получить наилучшее симметрию PSF. Для того чтобы установить правильное положение воротник, первое место цель звонка на оптимальном номинального положения, а затем проверить в 100 нм образец шарик. По симметрии лучшую PSF, в слегка изменить положение воротник вокруг номинальной.
    6. Для освещения используйте 3D-SIM решетку (3D 1layer 100X/1.49 всех длин волн). Для начала решетки место выравнивание выбранного решетки блока в SIM-осветителя, с 100X 1,49 цель на месте. Используйте 100 нм шарик образец, установленный в средствах массовой информации, с концентрацией, которые могут позволить изолировать 10-15 бусы для поля зрения (FOV). После установки объективную коррекции воротник в нужное положение, выберите освещение 3D-SIM и начать процедуру выравнивания программного обеспечения наведением. Он будет работать (5 фаз) х (1 направление) х (100 Z-плоскости) изображения, из которого он будет реконструировать поле зрения с бисером. После выбора одного шарика через соответствующий ROI, охватывающих весь шарик в том числе из фокуса размытым свет, программное обеспечение будет начать автоматическое PSF фитинга, и она будет регулировать положение дифракционной решетки в соответствии с результатом.
    7. Для проверки правильности функционирования микроскопа, повторите решетки выравнивание каждые 2 недели, из-за возможного смещения, вызванного движений стола и / или температуры дрейфа. Кроме того, дополнительно проверьте интенсивность и стабильность лазерного соответствии с предложениями изготовителя.
    8. Очистите поверхность образца с 95% ETHAnol три раза.
      Примечание: Для следующих шагов см. рисунок 3 для обзора панелей управления и правильных настроек в программном обеспечении SIM.
    9. В программном обеспечении SIM, выберите Оптический Configuration глаз FITC и выберите пустой блок фильтра в турель 1 для визуального контроля с белым светом.
    10. Установите скорость фокусировки и скорость таблице XY для "тонкой" пути.
    11. Открыть затвор и быстро сосредоточиться на образце.
    12. Закройте затвор и установить Z-координату к нулю.
    13. Выберите зеленый фильтр в турель 1 для визуального контроля с помощью зеленого канала.
    14. Установите интенсивность ртутной лампы в минимальное значение.
    15. Переход к границе образца тщательно, убедившись, что цель не касается герметик.
    16. Откройте затвор и быстро сканировать через образец с минимально возможной интенсивностью.
    17. После столкновения достаточно яркий дендрит интереса и центрирования сегмент интересв поле зрения, закрыть затвор.
    18. Установите программное обеспечение для оптического Configuration 3D-SIM 488 и настройками камеры для чтения из режима EM, получить 1 МГц 16-бит, время экспозиции 100 мс, мощность лазера 5% и Е.М. получить 200.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что зеленый фильтр в турель 2 выбран и что башни 1 пуст.
    19. Убедитесь, что решетка установлена ​​на 'Перемещение' и нажмите Живая чтобы посмотреть образец лазерным светом и через камеру.
    20. Активируйте справочную таблицу.
    21. Сосредоточьте интересующий объект при необходимости и сосредоточиться с фокусирующей скорости, установленной в тончайших.
      ПРИМЕЧАНИЕ: в режиме чтения из EM получить 1 МГц 16-бит, целевая интенсивность для хорошего SIM изображения между 30,000-45,000.
    22. Быстро настроить параметры камеры, чтобы получить значение интенсивности между 30,000-45,000 в режиме чтения из EM получить 1 МГц 16-битный. Первоначально использовать:
      1. Мощность лазера: 0% - 20% (с образцов, полученных, как описано выше, 5% или 2,6 мВт достаточно)
      2. Экспозиция:50 мс-2 сек
      3. Режим Считывание: Е. М. получаете 1 МГц 16-бит
      4. Е.М. получите: 0-300
      5. Усиления преобразования: 1x - 5.1x
      6. Формат для Live: Нет биннинга
      7. Формат для Capture: Нет биннинга
        ПРИМЕЧАНИЕ: при таких настройках достигнуто 6,3% ± 1,3% отбеливания регулярно, в 10% предела приемлемого максимального отбеливания, которые могут существенно повлиять на качество изображения 15.
    23. Нажмите Stop, чтобы отключить Live View.
    24. Настройте параметры стека 3D Z в последовательности панели Н.Д. к:
      1. Диапазон: 2 мкм
      2. Установить размер: 120 нм
      3. Z самолет
      4. Нажмите исходное положение
      5. Выберите оптической конфигурации 3D-SIM 488 в разделе Лямбда-
    25. Выберите 3D-SIM в качестве режима сбора в площадку N-SIM.
    26. Запустите приобретение Sequence ND и сохранить исходные данные.
    27. Выберите оптической конфигурации глаз FITC снова и повторите шаги 8.15-8.27, пока весь образец не был в образ
    28. 3D-реконструкция изображения: Данные, полученные в шаге 8,23 может быть либо реконструированы сразу же или позже. Начните с реконструкции Z стек с настройками по реконструкции умолчанию в режиме Реорганизация Slice или реконструировать Stack и при необходимости отрегулировать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения наилучших результатов, Z стеки должны быть сделаны с указанным размером шага и реконструированы в режиме Реорганизация Stack. Всегда проверяйте правильность восстановленного изображения, сравнивая его с необработанным данным или, предпочтительно, широким полем изображения. Параметры, которые можно отрегулировать для процесса восстановления являются контраст и подавление высокочастотного шума. Оба они влияют, как различные сырые изображения свойства учитываются в процессе реконструкции. В случае низкой глубины модуляции исходных данных, параметр контрастности играет важную роль. Если у пользователя есть наборы данных с низким соотношением сигнал-шум, то параметр подавления высокочастотных помех может влиять на качество реконструкции себеverely.
    29. При визуализации в готовом, центра стадии XY и переместите цели все, вплоть до ее положения покоя.
    30. Отключите образец и очистить как образец и объектив с 95% этанола.
    31. Завершите работу программного обеспечения и ПК и выключите все другие устройства.
    32. 3d реконструкция и позвоночника классификация получаемых изображений может осуществляться после конвертирования файлов в формате TIFF, как описано выше, используя программное обеспечение NeuronStudio (см. рисунок 4) 16.
    33. Используйте следующие параметры для реконструкции в программном обеспечении NeuronStudios:
      1. Объем: размеры воксельные: X: 0,03 мкм; Y: 0,03 мкм; Z: 0.120 мкм.
      2. Обнаружение Дендрит: Прикрепите соотношение: 1.3; Минимальная длина: 5 мкм; Дискретизация побед: 1; Realign переходов: Да.
      3. Позвоночник обнаружения: Минимальная высота: 0,2 мкм; Максимальная высота: 5,001 мкм; Максимальная ширина: 3 мкм; Минимальная короткими размер: 10 воксели; Минимальная без короткими размер: 5 голосELS.
      4. Позвоночник классификатора: соотношение шеи (отношение головы и шеи): 1.1; Тонкий отношение: 2.5; Размер Гриб: 0,35 мкм;
    34. Параметры NeuronStudio, используемые для оказания: нейрита форму вершины: твердый затмение; Нейритов вершина цвет: по типу; Нейритов форма края: линия; Нейритов цвет края: один цвет; Позвоночник форму: твердый затмения; Позвоночник цвет: по типу.
      Примечание: После 3D-реконструкция это также можно задать объем визуализации. Пороговое значение по умолчанию был установлен на 20 с опцией 'Восстановить объем рендеринга "активный. Непрозрачность был установлен «Автоматическая Intensity" проверено. "Поверхность только 'и опции' использовании точки Подготовка к Rendering 'были также активны

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Описанный здесь представляет собой стандартизированный рабочий протокол для работы с изображениями дендритных шипиков от крыс первичных нейронов гиппокампа в пробирке с использованием SIM. Рабочий процесс протокол и его решающие этапы показаны на рисунке 1. Целом, протокол занимает около 2 недель экспериментальной работы, разделенные на первом этапе подготовки образца, в том числе культурой, развитием и трансфекции крысы первичных нейронов гиппокампа и иммуногистохимии, и второй этап образца визуализации с использованием SIM. Крыса первичные нейроны гиппокампа фиксируются приблизительно через 2 недели после начала культивирования, когда нейроны разработали сложные дендритных беседки принимая многочисленные дендритных шипиков 3,5. Использование протокола подробно описаны в разделах 1-8, можно систематически изображений дендритные шипы с суперразрешением. По сравнению с обычным способом дендритной изображения позвоночника с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии, описанное до 16,17, протокол описано здесь с использованием SIM обеспечивает значительно более высокое разрешение изображения и 3D-реконструкция, позволяя идентификация и классификация нейронных мембран выступов, начиная с раннего filipodia для позвоночника-подобных структур.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема показывает рабочий процесс протокол, свои шаги и сроки.

Рисунок 2
Рисунок 2. Типичные микрофотографии дендритов и дендритных шипиков полученную с конфокальной (А) и SIM-микроскопии (B). Представитель SIM-микрофотография была приобретена, как описано в разделе 8, представитель конфокальной микрофотография была приобретена Uпеть физической обскуры размер: 30 мкм мощность лазера 2,6 мВт, нет усреднения. Приобретения были реконструированы с конфокальной и SIM изображений и D, соответственно) с использованием программного обеспечения NeuronStudio, как описано выше 16. Дендриты были прослежены и шипы автоматически классифицируются с программным обеспечением после регулировки основных параметров, таких как длина шеи, диаметром горлышка и диаметром головки. В коробках области показывают один индивидуальный дендритных позвоночника, полученную с использованием конфокальной (А) и SIM-(B) и реконструированный из соответствующих им Z стеков (C и D), изображающих различия в разрешении и точности полученных 3D реконструкции. По более высоким разрешением сима, количественный анализ как головы (E) и шеи (F) Диаметр показывает, что SIM меры значительно меньшие размеры, чем конфокальной микроскопии для тех же дендритных шипиков, указывая, что SIM-способен обнаруживать меньшие изменения в дендритных позвоночника морфологии. D ата в Е и F нормированы измерений ссылка конфокальной. Результаты представлены в виде среднее ± стандартное отклонение 3 дендритных шипиков, извлеченных из 5 дендритных сегментов отображается в обоих конфокальной и режимов микроскопа SIM. Для диаметром горлышка была значительная разница (** р = 0,0049) между конфокальной (100,0 ± 4,296 нормированные единицы) и SIM-картой (50,61 ± 7,642 нормированные единицы) изображения, при испытании с Студентов т-тест (E). Для диаметром головки была значительная разница (* р = 0,0209) между конфокальной (100,0 ± 6,255 нормированные единицы) и SIM-картой (58,12 ± 9,451 нормированные единицы) изображения, при испытании с Студентов т-тест.

Рисунок 3
Рисунок 3. Скриншот из ННГ Elements 6.14 SIM программного пакета в компании Nikon с настройками, описанными в данном протоколе.

ve_content "FO: держать-together.within-страницу =" всегда "> Рисунок 4
Рисунок 4. Скриншот из NeuronStudio 3D реконструкции и позвоночника классификации программного обеспечения представительного образа дендрита.

Таблица 1
Таблица 1. Список реагентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье рабочая протокол изображения дендритных шипиков от крыс первичных нейронов гиппокампа, культивируемых в лабораторных использованием SIM описывается. Основной метод гиппокампа нейрон культура как адаптация оригинального метода, описанного Kaech и Banker 18. Основные отличия заключаются использование Neurobasal/B27 культуральной среды, что исключает требование астроглиальных культур фидерных и добавлением ингибитора митотической ФУДР на 3 день, что способствует выживаемость нейронов, подавляя глиальных пролиферацию, как описано Brewer и др. 19.

Есть много важных шагов в протоколе. Толщина покровных используемых для пластины клеток имеет решающее значение для точного эксперимента SIM-карты. Стерильность в ходе подготовки покровного и покрытия важно. Не позволяйте поли-L-лизин, обработанных покровные высохнуть в течение 2.3 и 2.4. Диаметр пипетки пламени полированный, используемого на стадии 5.8 имеет решающее значение.Слишком узкий кончик приведет к низкой жизнеспособности клеток на более поздних стадиях. Выделение гиппокампе как можно быстрее обеспечит высокую жизнеспособность клеток. Сроки инкубации и концентрации трипсина имеют решающее значение для обеспечения высокой жизнеспособности клеток. Потеря ферментативной активности трипсина могут также влиять на жизнеспособность клеток. Наконец, добавление ФУДР на шаге 5,14 важно, чтобы способствовать выживанию нейронов и глии ингибируют пролиферацию.

Фазы изображения образца проста, когда выполняется следующее строго протокол, описанный здесь и результаты в приобретении изображений сверхвысокого разрешения, которые могут быть легко реконструированных в 3D для анализа и классификации дендритных шипиков в соответствии с их морфологическими особенностями. Как показано на рисунке 2, качество изображений, полученных в режиме SIM существенно лучше, чем образы точно такими же дендритных сегментов и отдельных шипами приобретенных с помощью конфокальной режим того же микроскопа. Этот результат позволяет предположить тхат использование SIM может обеспечить прекрасную возможность изображения более тонкие изменения в дендритных позвоночника морфологии, а количественно в цифрах 2E и 2F.

До сих пор в основном (флуоресцентные) широким полем микроскопии был использован для изображений живых клеток, благодаря своей низкой фототоксичности. Точно так же, в связи с его низкой фототоксических эффектов и хорошей комбинации с обычными (генетических) fluophores, SIM позволяет живые клетки изображений и идентификация дендритных шипиков в низкой fluophore выражающих клетки на супер-разрешением. По сравнению с другими методами микроскопии супер-разрешения, например, STED или PALM, SIM обеспечивает быстрый и доступный способ для визуализации дендритных шипиков от крыс первичных нейронов гиппокампа в пробирке. Хотя на практике только SIM увеличивает разрешение по два раза по сравнению с обычным конфокальной микроскопии.

Одним из примеров ограничения SIM является то, что он опирается на флуоресценции, который внекоторые экспериментальные установки может быть трудно применить. С этой целью методы микроскопии, которые не опираются на флуоресценции, таких как электронная микроскопия может обеспечить возможное решение. Тем не менее, электронная микроскопия, в частности, является утомительным, дорого медленный метод. Кроме того, электронная микроскопия может быть осуществлено только на фиксированных образцов. Таким образом, SIM является более подходящим для супер-разрешением изображения живых клеток. Основанием для применения флуоресцентного белка кодирования плазмиды трансфекции в том, что это приводит к редким, но воспроизводимого цитоплазматической маркировки изолированных клеток, предотвращая перекрытие дендритов из разных клеток и идентификацию отдельных дендритных шипиков. Сочетание трансфекции с использованием иммунной Ранее было показано, для повышения флуоресценции 17. Тем не менее, другие флуоресцентные методы могут также быть применимы к визуализации дендритных шипов с SIM, например достаточное количество флуоресцентного окрашивания могут быть получены с помощью недавно деразвитого актина обязательные зонды 20.

Поскольку последние технические разработки позволили применение SIM к визуализации динамических клеток, демонстрируя, что высокоскоростной структурирован-подсветка микроскоп способен разрешением 100 нм с частотой кадров до 11 Гц 13, очень логично будущего применения протокола, описанного здесь может быть ее применение к покадровой SIM живых нейронах крыс первичных гиппокампа и анализа быстрых динамических изменений в дендритных позвоночника морфологии. Следующей задачей для этого приложения может быть ожидаемая совокупная фототоксичность связаны с длиной временных интервалов живой микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была финансироваться за счет VIDI числа грант H64.09.016 от Нидерландской организации научных исследований (NWO) к СПС. СПЛ благодарен доктору Сильвина А. Fratantoni за ее критические замечания и поправки на окончательный вариант рукописи. GMRDL / EMMM поддерживаются голландской технологии Foundation STW (проект 12151 и 11350), которая является частью НМП и которая частично финансируется Министерством экономики. Мы благодарим Кэтрин Китс и Питера Drent из Nikon Instruments Europe BV для помощи и поддержки. HX при поддержке Royal Dutch академии искусств и наук (грант 11CDP10) и WT выполнена при поддержке гранта Нидерландской организации научных исследований (грант 820.02.006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker
Name Company Catalog Number Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
  2. Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
  3. Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
  4. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
  6. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 Forthcoming.
  7. Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
  8. Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. 185-196 (1999).
  9. Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
  10. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
  11. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
  12. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
  13. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
  14. James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
  15. Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
  16. Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. (2012).
  17. van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. (2009).
  18. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  19. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  20. Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics