Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit artikel beschrijft een werkprotocol op de foto dendritische stekels van hippocampale neuronen in vitro met behulp van Structured Illumination Microscopy (SIM). Superresolutietechnieken gebruik van SIM biedt beeldresolutie aanzienlijk verder gaan dan het licht limiet diffractie in alle drie ruimtelijke dimensies, waardoor de beeldvorming van individuele vertakte stekels met verbeterde details.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schouten, M., De Luca, G. M., Alatriste González, D. K., de Jong, B. E., Timmermans, W., Xiong, H., Krugers, H., Manders, E. M., Fitzsimons, C. P. Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (87), e51276, doi:10.3791/51276 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dendritische uitsteeksels die uit de dendriet van een neuron en vormen de voornaamste doelwitten van prikkelende postsynaptische inputs in de hersenen. Technologische ontwikkelingen hebben deze structuren geïdentificeerd als de belangrijkste elementen in neuron connectiviteit en synaptische plasticiteit. De kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie met behulp van licht microscopie blijft een essentieel probleem te wijten aan technische beperkingen in verband met intrinsieke breking limiet licht's. Vertakte stekels kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door confocale laser scanning fluorescentie microscopie. Echter, het meten van subtiele veranderingen in de vorm en grootte van stekels is moeilijk omdat dan lengte ruggengraat afmetingen zijn meestal kleiner dan conventionele optische resolutie van de theoretische resolutie limiet van 200 nm lichtmicroscopie is vastgesteld.

Verschillende recent ontwikkelde super resolutie technieken zijn gebruikt om het cellulaire structuren kleiner dan 200 nm, met inbegrip van vertakte stekels. Teze technieken zijn gebaseerd op klassieke ver-acties in het veld en het dus mogelijk het gebruik van bestaande monster bereidingswijzen en imago voorbij de oppervlakte van een monster. Hier beschreven is een werkprotocol om super resolutie gestructureerde verlichting microscopie (SIM) van toepassing zijn op de beeldvorming van vertakte stekels in primaire hippocampus neuron culturen. Mogelijke toepassingen van SIM overlappen met die van confocale microscopie. De twee technieken met uiteenlopende toepasbaarheid. SIM biedt hogere effectieve laterale resolutie, terwijl de confocale microscopie, als gevolg van het gebruik van een fysieke pinhole, realiseert verbetering resolutie ten koste van de verwijdering van onscherp licht. In dit protocol primaire neuronen gekweekt op dekglaasjes gebruik van een standaard protocol, getransfecteerd met DNA plasmiden die fluorescerende eiwitten en afgebeeld met SIM. Het hele protocol hierin beschreven duurt ongeveer 2 weken, omdat dendritische stekels worden afgebeeld na 16-17 dagen in vitro, wanneerdendritische ontwikkeling optimaal. Na voltooiing van het protocol, kan vertakte stekels worden gereconstrueerd in 3D uit serie van SIM image stacks met behulp van gespecialiseerde software.

Introduction

Een dendritisch wervelkolom is een klein uitsteeksel van het neuron membraan. Dit karakteristieke structuur is gespecialiseerd in typisch ontvangen input van een enkele synaps en vertegenwoordigt het fysieke contact tussen twee neuronen. Meest functioneel mature dendritische uitsteeksels bestaan ​​uit een bolvormige tip, genoemd hoofd, en een dunne nek die het hoofd verbindt met de dendritische as. Echter, stekels zijn niet statisch en actief bewegen en voortdurend veranderen hun morfologie, zelfs in de volwassen hersenen 2. Binnen een periode van 2 weken tijd, rat primaire hippocampus neuron culturen afkomstig van late embryonale of vroege postnatale tijd ontwikkelen complex dendritische priëlen met tal membraan uitsteeksels die evolueren van vroege filipodia tot wervelkolom-achtige structuren 3. Op basis van deze dynamische gedrag en andere kenmerken, dendritische gedacht dat een anatomisch substraat voor geheugenopslag en synaptische transmissie 4,5 verschaffen.

Gezien the cruciale rol die dendritische spine grootte en vorm hebben in synaptische functie, is het belangrijk om de afmetingen te meten. Stekels variëren van ongeveer 200 tot 2000 nanometer lang en kan gemakkelijk worden geïdentificeerd door confocale laser scanning fluorescentie microscopie. Echter, andere dan lengte wervelkolom afmetingen zijn meestal onder de conventionele optische systemen 'resolutie, theoretisch vastgesteld door diffractie rond 200 nanometer 6. Deze oplossing van bevoegdheden ontoereikend zijn voor de beeldvorming van fijnere details, zoals de breedte van de wervelkolom nek en hoofd. Veel werk is gewijd aan dit probleem op te lossen en veel relatief nieuwe super-resolutie microscopie technieken hebben aanzienlijke vooruitgang verstrekt. Met name is het mogelijk de resolutie dan de klassieke limiet bereiken zonder waarbij een eventueel emissielicht met zijdelings gestructureerde verlichting microscopie (SIM) in een breed gebied, niet-confocale microscoop 7-10. Met deze techniek in combinatie met niet-linear microscopische technieken, is het theoretisch mogelijk om de laterale resolutie van de optische microscoop te verbeteren door een algemene factor 11. In de meeste experimentele omstandigheden SIM kan de resolutiegrens met een factor twee 1 overtreffen. Andere super-resolutie optische microscopie technieken zoals stimulated emission depletion (STED) microscopie 12 en foto-activering lokalisatie microscopie (PALM) 12 zijn toegepast op beeldvorming van dendritische stekels. Lokalisatie-gebaseerde werkwijzen zoals PALM vereisen zeer grote aantallen onbewerkte afbeeldingen super-resolutie te bereiken en daarom snelheid beperkt. Anderzijds kan STED hoge imaging snelheid te bereiken, maar bij relatief lage fotontellingen en kleine gezichtsveld, wat niet het geval voor SIM 13 kan zijn.

In dit artikel is het doel om een werkprotocol te verstrekken aan het vertakte stekels van de rat primaire hippocampale neuronen in vitro gekweekte

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures waarbij dieren werden geoptimaliseerd om dierenleed te verminderen en werden goedgekeurd door de Commissie voor Dierproeven, Universiteit van Amsterdam, december protocol # DED204 en DED250.

1. Coverslip Voorbereiding

  1. Bezuinigen de dekglaasjes tot een grootte van 15 mm x 15 mm met een carbide of diamant schrijver, zodat ze passen in de putjes van een 12-well plaat.
  2. Tijdens het werken in een zuurkast, beginnen dekglaasje coating door het volledig onder te dompelen dekglaasjes in geconcentreerd salpeterzuur (70% w / w) in een glazen container. Om gelijkmatige verdeling schudden waarborgen, dan incubeer gedurende minimaal 4 uur. Het is mogelijk om de geconcentreerde salpeterzuur ongeveer 2 maal opnieuw, maar het kan kleur verliezen door blootstelling aan licht.
  3. Verwijder de geconcentreerde salpeterzuur en was de dekglaasjes vier keer in gedestilleerd water gedurende 30 minuten, voorzichtig schudden na elke wasbeurt.
  4. Voorzichtig verwijderenwater.
    Opmerking: de volgende drie stappen worden uitgevoerd in een steriele laminaire flowkast.
  5. Week de dekglaasjes in 96% EtOH. Verwijder de dekglaasjes van de EtOH oplossing en laat ze drogen.
  6. Vlam de dekglaasjes en doe ze in een glazen container. Gebruik fijn pincet om de dekglaasjes (Dumont stijl No.5 tang bijvoorbeeld) af te handelen.
  7. Bedek de container met aluminiumfolie en bak in een droge warmte oven gedurende 12-16 uur bij 180 ° C. Gebakken dekglaasjes kan worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende 1 maand of goed afgesloten.

2. Coverslip Coating

Het dekglaasje bekledingswerkwijze begunstigt neuron hechting aan het glas en dendritische arborization 14.

  1. In een steriele laminaire afzuigkap, steriel kleine tang om de individuele dekglaasjes plaatsen in enkele putjes van een 12-wells plaat.
  2. Voeg 500 ul van poly-L-lysine-oplossing (of voldoende hoeveelheden om de dekglaasjes dompelen).
  3. Wrap tHij plaat in aluminiumfolie om verdamping te voorkomen en laat het overnacht bij kamertemperatuur.
  4. Voordat de cultuur, zuig het poly-L-lysine oplossing voorzichtig in een steriele laminaire afzuigkap.
  5. Was elk putje met 1 ml steriel water twee keer, en tegelijkertijd te voorkomen dat ze uitdrogen.
  6. Aspireren water volledig, voeg 1 ml plating medium en laat de dekglaasjes in de weefselkweek incubator totdat klaar om de cellen plaat. Het wordt aanbevolen om de cellen plaat binnen 24 uur.

3. Verwijdering van Brains van E16-E19 Rat embryo

  1. Steriliseer de chirurgische instrumenten door ze te verwarmen in een droge sterilisator overnachting of ze te wassen met 70% EtOH. Gronding drogen als EtOH wordt gebruikt.
  2. Bereid een aantal 30 mm gerechten met 1x HBSS buffer en bewaar ze op ijs.
  3. Euthanize de dam rat met een intraperitoneale injectie van Euthasol (160 mg / kg Euthasol in een volume van ± 0,4 ml).
  4. Controleer voor de afwezigheid van reflexen.
  5. Spray de buik van de dam met 70% EtOH.
  6. Maak een insnijding langs de buik en verwijder de baarmoeder.
  7. Verwijder het embryo uit de baarmoeder en plaats ze in een 100 mm petrischaal.
  8. Verwijder de hoofden van de embryo's met grote schaar en plaats de kop in een nieuwe petrischaaltje met koude 1x HBSS buffer.
    Opmerking: vanaf hier naar stap 7.1 de procedure wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire flowkast.
  9. Houd de hoofden langs de zijkanten met grote tang.
  10. Met een klein schaartje, maak een sagittale snede in de huid op de top van het hoofd, dan zijdelings schil de huid naar beneden met een grote tang.
  11. Gebruik dezelfde aanpak als in stap 3.10 aan de schedel te verwijderen. Maak een sagittale snede vanaf het caudale einde; voorzichtig openen van de schedel zonder schade aan het hersenweefsel. Vouw de beide helften van de schedel verwijderd zijdelings belichten van de hersenen.
  12. Met de botte spatel, schep de hersenen en plaats het in vers koud 1x HBSS.
  13. 4. Dissectie van de hippocampus

    Het is zeer belangrijk dat de dissectie zo snel mogelijk wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden levensvatbaarheid van de cellen te waarborgen. Houd de monsters koud op het ijs.

    1. Verwijderen en het cerebellum gooi met de fijne schaar.
    2. Scheid de twee hemisferen van de hersenen door het maken van een sagittale snede over de middellijn.
    3. Neem elk halfrond en plaats zowel in een nieuwe 30 mm schotel met vers koud 1x HBSS.
    4. Plaats elke hemisfeer zodat de temporale kwab tegenover de bodem van de schaal.
      LET OP: Vanaf hier, is het raadzaam om een ​​dissectie microscoop.
    5. Zachte hand de middenhersenen met een kleine tang en verwijder de middenhersenen met een ander paar pincetten. Voeg de rest van de halve bol intact met de cortex en de hippocampus.
    6. Draai het weefsel, waardoor de hippocampus nu geconfronteerd met de bodem van de schaal.
    7. Zachtjes Houd het halfrond in pkant met een fijne pincet. Door het gebruik van een andere fijne tang, zorgvuldig en voorzichtig de hersenvliezen te verwijderen. Het is gemakkelijker om te beginnen bij de bulbus olfactorius. Wees voorzichtig om niet de hippocampus beschadigen.
    8. Richt het weefsel, zodat de hippocampus nu naar boven is gericht. De hippocampus is nu te zien door zijn karakteristieke C-vormige structuur.
    9. Door het gebruik van fijne tang, ontleden de hippocampus. Verzamelen in een nieuwe 30 mm schotel met vers koud 1x HBSS.

    5. Celdissociatie en Plating

    1. Tel het totaal aantal zeepaardjes en snijd ze in kleine stukjes.
    2. Verzamel de stukken in een 15 ml centrifugebuis die 3 ml 1x HBSS.
    3. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten en verwijder voorzichtig de supernatant.
    4. Voeg 6 ul trypsine per hippocampus.
    5. Incubeer gedurende maximaal 20 minuten bij 37 ° C. Swirl na 3 min.
    6. Was twee keer met 5 ml vers koud 1x HBSS en gooi het supernatant.
    7. Na de second wassen, voeg 1,5 ml plating medium, voorverwarmd tot 37 ° C. Het serum van de beplating medium zal trypsinewerking inactiveren.
    8. Langzaam vermaal 30x met een brand-gepolijste Pasteur pipet totdat alle stukjes weefsel homogeen verspreid in afzonderlijke cellen. Vermijd borrelen.
    9. Voeg 5 ml plaatmedium voorverwarmd tot 37 ° C.
    10. Tellen cellen met behulp van een trypaanblauw vitale kleuring.
    11. Zaad 50.000 cellen per putje van een 12-wells plaat in 1 ml plating medium, bereid in afdeling 2 (totaal volume 2 ml).
    12. Schud de plaat om de cellen gelijkmatig te verdelen.
    13. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. Na 2-3 dagen vervangen helft van het plateren medium (0,5 ml) met kweekmedium dat 10 uM FUDR.
      Opmerking: Dendritische wervelkolom beeldvorming wordt uitgevoerd 16-17 dagen na plating (16-17 dagen in vitro, DIV).

    6. Rat hippocampus Primaire Neuron transfectie met behulp van Lipofectamine

    1. Bereid plasmide DNA dat GFP en incubatiemedium (10 ml Neurobasal-medium met 100 pl glutamax).
    2. Pre-warm de incubatie medium tot 37 ° C.
    3. Bereid DNA mix (Tube A). Voor elke dekglaasje commentaar 1 ug DNA in 100 pl normaal Neurobasal medium. Voorzichtig mengen.
    4. Bereid Lipofectamine mix (Tube B). Voor elke dekglaasje voeg 2 pl Lipofectamine in 100 ul vlakte Neurobasal medium. Voorzichtig mengen.
    5. Voeg de Lipofectamine mengsel aan het DNA mengsel druppelsgewijs toegevoegd.
    6. Incubeer in het laminaire stroming kap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
    7. Voeg 1 ml voorverwarmde incubatiemedium aan plaat 1.
    8. WINKEL plaat 2 gedurende 5 minuten bij 37 ° C, 5% CO2.
    9. Voeg voorzichtig druppelsgewijs 200 pi van het DNA / Lipofectamine mengen in elk putje en incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C, 5% CO2.
    10. Met het gebruik van kleine tang til de coverslips met de neuronen en spoel ze door ze onder te dompelen in een 3 cm schotel met verse warme Neurobasal medium en verplaats ze naar plaat 2.
    11. Incubeer de getransfecteerde neuronen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur.
    12. Controleer voor transfectie-efficiëntie 24 uur na transfectie.

    7. Immunokleuring en Plaatsing van Rat hippocampus primaire neuronen

    Fluorescentie-intensiteit in getransfecteerde cellen te verbeteren, voeren een immunostaining protocol om GFP detectie te verbeteren 48 uur na transfectie.

    1. Bereid 4% PFA en 0,05 M TBS.
    2. Warm de 4% PFA-oplossing tot 37 ° C.
    3. Zuig het medium uit de putjes die de dekglaasjes.
    4. Voeg 500 ul van warme 4% PFA zorgvuldig om te voorkomen dat schade aan de dendrieten.
    5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    6. Wassen met 1x HBSS 3 keer gedurende 5 minuten.
      LET OP: op dit punt monsters konden opgeslagen worden, met 3 weken bij 4 ° Cof immunostaining kan direct worden gestart.
    7. Als monsters werden opgeslagen, wassen met 0,05 M TBS 3 maal gedurende 5 minuten.
    8. Blokkeer met TBS-BSA (1%) oplossing bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    9. Wassen met 0,05 M TBS 3 keer gedurende 5 minuten.
    10. Voeg de primaire antilichaam verdund in incubatie mix.
    11. Incubeer de platen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
    12. Verder Incubeer overnacht bij 4 ° C onder zacht schudden.
    13. Verwijder het primaire antilichaam.
    14. Wassen met 0,05 M TBS 3x gedurende 5 minuten.
      LET OP: vanaf dit punt, houden de dekglaasjes beschermd tegen licht.
    15. Voeg de secundaire tl-geconjugeerd antilichaam verdund in incubatie mix.
    16. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
    17. Verwijder het secundaire antilichaam.
    18. Wassen met 0,05 M TBS 3 keer gedurende 5 minuten.
    19. Wassen met 1X TB 2 keer voor 5 minuten.
    20. Gebruik fijn pincet uit de putten te verwijderen om dekglaasjes.
    21. Droog eventueel overschot van TB met een tissue en monteer de coverslips behulp montage medium.
    22. Afdichting met nagellak om verdamping van montage medium te voorkomen.

    8. Dendritische Spine Beeldvorming met behulp van structuur Verlichting Microscopy

    Dendritische spine beeldvorming met de in de materialen beschreven SIM systeem heeft een laterale resolutie (XY) waarde heeft van ongeveer 85-110 nm en een axiale (z) Resolutie waarde tussen 200 - 250 nm, die een factor 2 maal verbetering van de resolutie ten opzichte wide-field microscopie.

    OPMERKING: Dendritische stekel beeldvorming met SIM gebeurt typisch 2 dagen na stap 7,22, maar kan worden gedaan tot 3 weken later als voorbeelden worden bewaard in het donker en onder een gecontroleerde temperatuur van 22 - 23 ° C.

    1. Schakel de 488 nm laser, de kwiklamp, het podium controller, de piëzo-controller, de halogeenlamp voor doorgelaten licht en de pc en start de SIM-software in de "ANDOR voor N-SIM"-modus.
    2. Reinig de 100x TIRF objective met 95% ethanol drie keer, en eventueel met petroleumether.
    3. Gebruik de volgende filter instellingen: 520 LP met een 488 dichroic.
    4. Een druppel immersie olie op het doel. Controleer of er geen luchtbellen in de olie-drop. Beweeg de doelstelling naar boven totdat de olie raakt het monster.
      Opmerking: Leg een deksel over het podium om het monster van omgevingslicht te beschermen en dim de lichten in de kamer zo veel mogelijk.
    5. Stel de correctie kraag van de doelstelling tot 37 ° C, 200 urn, de beste symmetrie PSF vinden. Om de juiste kraag positie, eerste positie het doel ring aan de optimale nominale positie in te stellen en vervolgens een controle op een 100 nm kraal monster. Volgens symmetrie de beste PSF's, licht de kraag positie rond het nominale veranderen.
    6. Voor verlichting, gebruik van 3D-SIM rooster (3D 1layer 100X/1.49 alle golflengten). Om te beginnen het rooster uitlijning plaats het geselecteerde rooster blok in de SIM-verlichting, met de 100X 1.49 doel op zijn plaats. Gebruik een 100 nm kraal monster gemonteerd in de media, met een concentratie die kan toestaan ​​isoleren 10-15 kralen voor een gezichtsveld (FOV). Na het instellen van de doelstelling correctie kraag naar de gewenste positie, selecteert u de 3D-SIM verlichting en start de software-begeleide uitlijningsprocedure. Het zal (1 richting) x (100 z-vliegtuigen) beelden, waaruit de FOV zal reconstrueren met kralen draaien (5 fasen) x. Na het selecteren van een enkele kraal via een geschikte ROI, die de hele kraal inclusief wazig licht out-of-focus, zal de software automatisch een PSF start montage en het zal het rooster aan te passen op basis van het resultaat.
    7. Om de prestaties van de microscoop controleren, herhaal het rooster uitlijning om de 2 weken, vanwege de mogelijke verkeerde uitlijning als gevolg van tafel bewegingen en / of temperatuur drifting. Bovendien, ook de laser intensiteit en stabiliteit volgens de suggesties van de fabrikant.
    8. Reinig het monster oppervlak met 95% ethAnol drie keer.
      Opmerking: Voor de volgende stappen zie figuur 3 voor een overzicht van de bedieningspanelen en de juiste instellingen binnen de SIM software.
    9. In het SIM-software, kies de Optical Configuration Eye FITC en selecteer een lege filter blok in Torentje 1 voor visuele inspectie met wit licht.
    10. Stel de focus snelheid en de rijsnelheid van de XY tafel op "Fijn".
    11. Open de sluiter en snel scherp te stellen op het monster.
    12. Sluit de sluiter weer en zet de Z-coördinaat nul.
    13. Selecteer de groene filter in Torentje 1 voor visuele inspectie met behulp van het groene kanaal.
    14. Stel de intensiteit van de kwiklamp om de laagste stand.
    15. Ga naar de grens van het monster zorgvuldig en zorg ervoor dat het doel de kit niet raakt.
    16. Open de sluiter en snel door het monster met de laagst mogelijke intensiteit.
    17. Bij het ontmoeten van een voldoende heldere dendriet van belang en het centreren van een segment van belangin het gezichtsveld, sluit de sluiter.
    18. Stel de software naar Optical Configuration 3D-SIM-488 en de camera-instellingen te uitleesmode EM, krijgen 1 MHz 16-bit, belichtingstijd 100 msec, laservermogen 5% en EM krijgen 200.
      OPMERKING: Controleer of het groene filter in Turret 2 is geselecteerd en dat Torentje 1 leeg is.
    19. Controleer of het rooster is ingesteld op 'Moving' en klik op Live to het monster met laserlicht en via de camera bekijken.
    20. Activeer de Look Up Table.
    21. Centreer het object van belang indien nodig en focus met de focus snelheid ingesteld op Extra Fine.
      OPMERKING: in de uitleesmode EM krijgen 1 MHz 16-bit, de trainingsintensiteit voor een goed imago SIM is tussen 30,000-45,000.
    22. Snel de camera-instellingen aan te passen aan een intensiteit waarde tussen 30,000-45,000 krijgen in de read-out modus EM krijgen 1 MHz 16-bit. Aanvankelijk gebruikt:
      1. Laservermogen: 0% - 20% (met monsters bereid zoals hierboven beschreven, 5% of 2,6 mW volstaat)
      2. Sluitertijd:50 msec-2 sec
      3. Uitleesmode: EM krijgen 1 MHz 16-bit
      4. EM krijgen: 0-300
      5. Conversie te krijgen: 1x - 5.1x
      6. Formaat voor Live: Nee binning
      7. Formaat voor Capture: Nee binning
        OPMERKING: met deze instellingen 6,3% ± 1,3% bleken wordt routinematig bereikt, binnen een grens van aanvaardbare maximale bleken, die een aanzienlijke invloed kunnen zijn op de beeldkwaliteit 15 10%.
    23. Klik op Stop Live View uit te schakelen.
    24. De instellingen van de 3D Z stapel Configureer het ND Sequence paneel:
      1. Bereik: 2 micrometer
      2. Set grootte: 120 nm
      3. Z-vlak
      4. Klik Basispositionering
      5. Selecteer de optische configuratie 3D-SIM-488 in de sectie Lambda
    25. Selecteer 3D-SIM de verwerving modus in het N-SIM pad.
    26. Voer het ND Sequence overname en de ruwe data op te slaan.
    27. Selecteer de optische configuratie Eye FITC opnieuw en herhaal de stappen 8,15-8,27 totdat het gehele monster is afgebeeld
    28. 3D Beeldreconstructie: De verworven in stap 8.23 ​​gegevens kunnen direct of later worden gereconstrueerd. Begin met het reconstrueren van de Z-stack met de standaard reconstructie instellingen in Reconstruct Slice of Reconstruct Stack-modus en pas indien nodig.
      OPMERKING: voor de beste resultaten, moet Z stapels worden gemaakt met de aangegeven stapgrootte en gereconstrueerd in Reconstruct Stack-modus. Controleer altijd de geldigheid van de gereconstrueerde beeld door het te vergelijken met de ruwe gegevens of, bij voorkeur, afbeelding van een wide-field. De parameters die kunnen worden aangepast voor de wederopbouw zijn de contrast en hoogfrequente ruis onderdrukking. Beiden beïnvloeden hoe verschillende grondstoffen beeld eigenschappen tijdens het proces van wederopbouw rekening wordt gehouden. In het geval van modulatiediepte lage ruwe data, de parameter contrast speelt een belangrijke rol. Als de gebruiker datasets met een lage signaal-ruisverhouding, vervolgens de parameter hoogfrequente ruis onderdrukking kan de reconstructie kwaliteit beïnvloeden severely.
    29. Bij beeldvorming in afgewerkte, midden de XY podium en verplaats de doelstelling helemaal naar beneden naar de ruststand.
    30. Unmount het monster en reinig zowel het monster en objectieve met 95% ethanol.
    31. Afsluiten van de software en de PC en schakel alle andere apparaten.
    32. 3D-reconstructie en de wervelkolom de indeling van de verkregen beelden kan na het omzetten van de bestanden naar TIFF zoals beschreven voor het gebruik van NeuronStudio software (zie figuur 4) 16 worden uitgevoerd.
    33. Gebruik de volgende parameters voor de wederopbouw in de NeuronStudios software:
      1. Volume: Voxel afmetingen: X: 0.03 micrometer; Y: 0.03 micrometer; Z: 0.120 urn.
      2. Dendriet detectie: Bevestig ratio: 1,3; Minimale lengte: 5 micrometer; Discretisatie Verhouding: 1; Lijn kruispunten: Ja.
      3. Spine detectie: Minimale hoogte: 0,2 micrometer; Maximale hoogte: 5.001 micrometer; Maximale breedte: 3 micrometer; Minimum gedrongen: 10 voxels; Minimum niet-gedrongen formaat: 5 voxels.
      4. Spine Classificator: Neck ratio (hoofd-hals-ratio): 1.1; Dunne ratio: 2,5; Paddestoel grootte: 0,35 micrometer;
    34. NeuronStudio parameters die worden gebruikt voor het renderen: neuriet vertex vorm: massief verduistering; Neuriet vertex kleur: per type; Neuriet edge vorm: lijn; Neuriet rand kleur: een kleur; Spine vorm: massief verduistering; Spine kleur: per type.
      Opmerking: Na het 3D reconstructie is het ook mogelijk om het volume te maken. De standaard drempel werd ingesteld op 20 met de optie 'Regenereren volume rendering' actief. Ondoorzichtigheid werd door 'Automatische Intensity' aangevinkt te stellen. 'Slechts Surface' en 'Use Point Pre-Rendering' opties waren ook actief

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier beschreven is een gestandaardiseerde werkprotocol voor het afbeelden van dendritische stekels van de rat primaire hippocampus neuronen in vitro gebruik van SIM. Het protocol workflow en zijn cruciale stappen zijn weergegeven in figuur 1. Kortom, het protocol duurt ongeveer 2 weken van experimenteel werk gescheiden in een eerste fase van de bereiding van de monsters, met inbegrip van cultuur, ontwikkeling en transfectie van primaire rat hippocampale neuronen en immunohistochemie, en tweede fase van het monster beeldvorming met behulp van SIM. De rat primaire hippocampus neuronen worden vastgesteld ongeveer 2 weken na het begin van de cultuur, wanneer neuronen complexe dendritische priëlen hebben ontwikkeld waarop talrijke vertakte stekels 3,5. Met behulp van de in detail beschreven in de paragrafen 1-8 protocol, is het mogelijk om systematisch beeld dendritische stekels met super resolutie. In vergelijking met een conventionele dendritische spine weergavemethode via confocale fluorescentiemicroscopie die beschreven voor 16,17, de hierin beschreven het gebruik van SIM-protocol geeft significant betere beeldresolutie en 3D-reconstructie, waardoor de identificatie en classificatie van neuron membraan uitsteeksels variërend van vroege filipodia tot wervelkolom-achtige structuren.

Figuur 1
Figuur 1. Het schema toont een protocol workflow, de stappen en het tijdschema.

Figuur 2
Figuur 2. Vertegenwoordiger microfoto van dendrieten en dendritische stekels afgebeeld met confocale (A) en SIM microscopie (B). De vertegenwoordiger SIM microfoto werd overgenomen zoals beschreven in hoofdstuk 8, werd de vertegenwoordiger confocale microscoop verworven uzingen fysieke pinhole grootte: 30 um laservermogen 2,6 mW, geen middeling. Acquisities werden gereconstrueerd uit confocale en SIM afbeeldingen (C en D respectievelijk) met NeuronStudio software zoals eerder beschreven 16. Dendrieten werden opgespoord en stekels werden automatisch ingedeeld bij de software na het aanpassen van de belangrijkste parameters zoals lengte hals, nek en hoofd diameter diameter. De boxed gebieden tonen een individu dendritische wervelkolom afgebeeld met confocale (A) en SIM (B) en gereconstrueerd uit hun corresponderende Z stacks (C en D), voorstellende verschillen in resolutie en nauwkeurigheid van de resulterende 3D-reconstructies. Volgens SIM's hogere resolutie, kwantitatieve analyse van zowel kop (E) en hals (F) diameter blijkt dat SIM maatregelen aanzienlijk kleinere afmetingen dan confocale microscopie dezelfde dendritische geven dat SIM kan waarnemen kleinere veranderingen in dendritische wervelkolom morfologie. D ata E en F van de referentieantenne confocale metingen. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD van 3 vertakte stekels gewonnen uit 5 dendritische segmenten afgebeeld in zowel confocale microscoop en SIM-modi. Voor de hals diameter was er een significant verschil (** p = 0,0049) tussen confocale (100,0 ± 4,296 genormaliseerde eenheden) en SIM (50,61 ± 7,642 genormaliseerde eenheden) beelden, zoals getest met een Students t-toets (E). Voor hoofd diameter was er een significant verschil (* p = 0,0209) tussen confocale (100,0 ± 6,255 genormaliseerde eenheden) en SIM (58,12 ± 9,451 genormaliseerde eenheden) beelden, zoals getest met een Students t-test.

Figuur 3
Figuur 3. Screenshot van de Nikon's NiS Elements 6,14 SIM-softwarepakket met de in dit protocol beschreven instellingen.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" altijd "> Figuur 4
Figuur 4. Screenshot van NeuronStudio 3D reconstructie en wervelkolom classificatie software van een representatief beeld van een dendriet.

Tabel 1
Tabel 1. Lijst van reagentia. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel een werkprotocol op de foto dendritische stekels van de rat primaire hippocampale neuronen gekweekt in vitro gebruik van SIM wordt beschreven. De primaire hippocampale neuron cultuur methode is een aanpassing van de oorspronkelijke methode beschreven door Kaech en Banker 18. De belangrijkste verschillen zijn het gebruik van Neurobasal/B27 kweekmedium, waardoor de eis van astrogliale feeder culturen elimineert, en de toevoeging van de mitotische remmer FUDR op dag 3 welke neuronale overleving bevordert en onderdrukt gliale proliferatie, zoals beschreven door Brewer et al. 19.

Er zijn veel kritische stappen in het protocol. De dikte van de dekglaasjes in de cellen plaat is cruciaal voor een accurate SIM experiment. Steriliteit tijdens dekglaasje en coaten is belangrijk. Laat je niet poly-l-lysine behandelde coverslips drogen tijdens 2.3 en 2.4. De diameter van de pipet-vlam gepolijst toegepast in stap 5.8 is cruciaal.Een te smalle tip zal resulteren in een lage levensvatbaarheid van de cellen in een later stadium. Isolatie van de hippocampus zo snel mogelijk zorgen voor een hoge cellevensvatbaarheid. De timing van de incubatie en trypsine concentraties cruciaal hoge cellevensvatbaarheid waarborgen. Verlies van trypsine enzymatische activiteit kan ook gevolgen hebben voor de levensvatbaarheid van cellen. Tenslotte, de toevoeging van FUDR in stap 5.14 cruciaal is voor neuron overleving bevorderen en remmen gliale proliferatie.

Het monster beeldvorming fase is duidelijk wanneer uitgevoerd door het volgen strikt het protocol hier beschreven en de resultaten in de overname van super resolutie beelden die gemakkelijk kan worden gereconstrueerd in 3D te analyseren en classificeren vertakte stekels op basis van hun morfologische kenmerken. Zoals getoond in figuur 2, de kwaliteit van de bij de SIM-modus beelden aanzienlijk beter dan beelden van dezelfde dendritische segmenten en afzonderlijke stekels verkregen met behulp van de confocale modus van dezelfde microscoop. Dit resultaat suggereert that het gebruik van SIM zou een uitstekende gelegenheid om de afbeelding meer dan subtiele veranderingen in de dendritische wervelkolom morfologie, zoals gekwantificeerd in de figuren 2E en 2F.

Tot nu toe voornamelijk (TL) breed-microscopie is gebruikt om beeld levende cellen, vanwege de lage fototoxiciteit. Op dezelfde manier, vanwege de lage fototoxische effecten en een goede combinatie met conventionele (genetische) fluophores, SIM laat levende cellen beeldvorming en identificatie van vertakte stekels in lage fluophore expressie cellen bij super-resolutie. In vergelijking met andere super-resolutie microscopie methoden zoals STED of PALM, SIM biedt een snelle en betaalbare methode voor de beeldvorming van dendritische stekels van de rat primaire hippocampus neuronen in vitro. Hoewel in de praktijk SIM alleen maar groter resolutie door twee maal in vergelijking met conventionele confocale microscopie.

Een voorbeeld van een beperking van de SIM is doordat het op fluorescentie, diesommige experimentele opstellingen kunnen moeilijk toe te passen zijn. Daartoe kan microscopische technieken die niet afhankelijk fluorescentie zoals elektronenmicroscopie mogelijke oplossing. Toch elektronenmicroscopie in het bijzonder is een vervelende, dure een langzame methode. Bovendien elektronenmicroscopie kan alleen worden uitgevoerd op vaste monsters. Daarom SIM is geschikt voor super-resolutie beeldvorming van levende cellen. De reden voor het aanbrengen van een fluorescerend eiwit codeert plasmide transfectie is dat het resulteert in een schaarse, maar reproduceerbaar cytoplasmatische etikettering van geïsoleerde cellen, het voorkomen van overlap van dendrieten uit verschillende cellen en de identificatie van individuele vertakte stekels. Combinatie van transfectie met immunokleuring werd aangetoond fluorescentie 17 verbeteren. Toch zou andere fluorescerende technieken ook voor de beeldvorming van dendritische stekels met SIM, bijvoorbeeld voldoende fluorescentiekleuring kon worden verkregen met behulp van onlangs DEwikkeld actine bindende probes 20.

Sinds de recente technische ontwikkelingen hebben toegelaten dat de toepassing van de SIM naar dynamische cell imaging, waaruit blijkt dat met hoge snelheid gestructureerde-verlichting microscoop is geschikt voor 100-nm resolutie bij beeldsnelheden tot 11 Hz 13, een zeer logische toekomstige toepassing van het protocol hierin beschreven toepassing time-lapse SIM levende ratten primaire hippocampale neuronen en analyse van snelle dynamische veranderingen in dendritische wervelkolom morfologie zijn. Een volgende uitdaging voor deze toepassing kan de verwachte cumulatieve fototoxiciteit geassocieerd met lange tijdsintervallen van levende microscopie zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door een VIDI subsidie ​​aantal H64.09.016 uit Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) naar CPF. CPF is dankbaar voor Dr Silvina A. Fratantoni voor haar kritische commentaar en correcties op de definitieve manuscript. GMRDL / emmm worden ondersteund door de Nederlandse Technologiestichting STW (project 12151 en 11350), dat deel uitmaakt van het NWO, en dat wordt mede gefinancierd door het Ministerie van Economische Zaken. Wij danken de Catherine Kitts en Peter Drent van Nikon Instruments Europe BV voor hulp en ondersteuning. HX werd ondersteund door de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen (subsidie ​​11CDP10) en WT werd ondersteund door subsidie ​​van Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk onderzoek (subsidie ​​820.02.006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker
Name Company Catalog Number Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
  2. Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
  3. Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
  4. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
  6. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 Forthcoming.
  7. Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
  8. Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. 185-196 (1999).
  9. Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
  10. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
  11. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
  12. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
  13. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
  14. James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
  15. Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
  16. Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. (2012).
  17. van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. (2009).
  18. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  19. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  20. Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics