Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

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Summary

En este artículo se describe un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo in vitro utilizando Estructurado Iluminación Microscopía (SIM). Super-resolución de la microscopía utilizando SIM ofrece una resolución de imagen de manera significativa más allá del límite de difracción de la luz en las tres dimensiones espaciales, lo que permite la obtención de imágenes de las espinas dendríticas individuales con detalles mejorados.

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Schouten, M., De Luca, G. M., Alatriste González, D. K., de Jong, B. E., Timmermans, W., Xiong, H., Krugers, H., Manders, E. M., Fitzsimons, C. P. Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (87), e51276, doi:10.3791/51276 (2014).

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Abstract

Las espinas dendríticas son protuberancias que salen de la dendrita de una neurona y representan los objetivos primarios postsinápticos excitatorios de entradas en el cerebro. Los avances tecnológicos han identificado estas estructuras como elementos clave de la conectividad neuronal y la plasticidad sináptica. El análisis cuantitativo de la morfología de la columna vertebral utilizando microscopía de luz sigue siendo un problema esencial debido a las limitaciones técnicas asociadas con límite de refracción intrínseca de la luz. Las espinas dendríticas pueden identificarse fácilmente por confocal de escaneo láser microscopía de fluorescencia. Sin embargo, la medición de los cambios sutiles en la forma y tamaño de las espinas es difícil debido a las dimensiones de la columna vertebral que no sean de longitud son generalmente más pequeñas que la resolución óptica convencional fijada por resolución límite teórico de la microscopía de luz de 200 nm.

Varias técnicas de resolución de súper desarrollados recientemente se han utilizado para imagen estructuras celulares más pequeños que los 200 nm, incluyendo las espinas dendríticas. Tstos técnicas se basan en operaciones de campo lejano clásicos y por lo tanto permiten el uso de los métodos existentes de preparación de muestras y para la imagen más allá de la superficie de una muestra. Descrito aquí es un protocolo de trabajo para aplicar la resolución estructurada de iluminación microscopía super (SIM) para la obtención de imágenes de las espinas dendríticas en cultivos de neuronas del hipocampo primaria. Posibles aplicaciones de SIM se solapan con las de microscopía confocal. Sin embargo, las dos técnicas presentan diferente aplicabilidad. SIM ofrece una resolución lateral efectiva más alta, mientras que la microscopía confocal, debido al uso de un agujero de alfiler física, logra una mejora de resolución a costa de la eliminación de fuera de la luz de enfoque. En este protocolo, las neuronas primarias se cultivan en cubreobjetos de vidrio utilizando un protocolo estándar, transfectadas con plásmidos de ADN que codifican proteínas fluorescentes y fotografiado usando SIM. Todo el protocolo descrito en el presente documento toma aproximadamente 2 semanas, porque las espinas dendríticas son imágenes después de 16-17 días in vitro, cuandodesarrollo dendrítico es óptima. Después de completar el protocolo, las espinas dendríticas pueden ser reconstruidos en 3D de la serie de SIM pilas de imágenes utilizando el software especializado.

Introduction

Una espina dendrítica es una pequeña protuberancia de la membrana de la neurona. Esta estructura característica está especializada para recibir normalmente el aporte de una sola sinapsis y representa el área de contacto físico entre dos neuronas. La mayoría de las espinas dendríticas funcionalmente maduros consisten en una punta globular, jefe llamado, y un cuello delgado que conecta la cabeza con el árbol dendrítico. Sin embargo, las espinas no son estáticos y se mueven y cambian su morfología continuamente, incluso en el cerebro adulto 2 activa. Dentro de un período de 2 semanas de tiempo, cultivos de neuronas del hipocampo de rata primaria derivados de tarde tiempo postnatal embrionario o temprano desarrollan árboles dendríticos complejos con numerosas protuberancias de la membrana que evolucionan a partir filipodia pronto para estructuras de la columna vertebral como 3. Sobre la base de este comportamiento dinámico y otras características, se cree que las espinas dendríticas para proporcionar un sustrato anatómico para el almacenamiento de memoria y 4,5 transmisión sináptica.

Dada ªe papel crítico que el tamaño de la espina dendrítica y la forma han en la función sináptica, es importante medir con precisión sus dimensiones. Espinas varían de alrededor de 200 a 2000 nanómetros de longitud y pueden ser identificados fácilmente por confocal de escaneo láser microscopía de fluorescencia. Sin embargo, las dimensiones de la columna vertebral que no sean de longitud están por debajo de la resolución de los sistemas ópticos convencionales ", teóricamente fijado por la difracción en torno a 200 nanómetros 6. Estos poderes resolver son insuficientes para obtener imágenes de detalles más finos, tales como la anchura de los cuellos de la columna vertebral y la cabeza. Mucho trabajo se ha dedicado a resolver este problema y muchas técnicas relativamente nuevas de super-resolución de microscopía han proporcionado avances sustanciales. En particular, es posible conseguir una resolución más allá del límite clásico sin descartar ninguna emisión de luz mediante el uso de microscopía de iluminación estructurada lateralmente (SIM) en un campo amplio, microscopio confocal no 7-10. El uso de esta técnica en combinación con la no lineatécnicas de microscopía r, es teóricamente posible mejorar la resolución lateral del microscopio óptico por un factor de 11 sin límite. Sin embargo, en la mayoría de circunstancias experimentales, SIM permite superar el límite de resolución en un factor de dos 1. Otras técnicas de microscopía óptica super-resolución, tales como el agotamiento de emisión estimulada (STED) microscopía 12 y foto-activación de localización de microscopía (PALM) 12 se han aplicado a las imágenes de las espinas dendríticas. Los métodos basados ​​en localización como la palma requieren un gran número de imágenes en bruto para conseguir super-resolución y por lo tanto están limitados en velocidad. Por otro lado, STED puede conseguir una elevada velocidad de imagen, aunque en el recuento de fotones relativamente bajos y los pequeños campos de visión, que puede no ser el caso para SIM 13.

En este artículo, el objetivo es proporcionar un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo primaria de rata en cultivo in vitro

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales con animales han sido optimizados para reducir el sufrimiento de los animales y fueron aprobados por la Comisión de Experimentación Animal de la Universidad de Amsterdam, diciembre protocolo # DED204 y DED250.

1. Preparación Cubreobjetos

  1. Reduzca los cubreobjetos a un tamaño de 15 mm x 15 mm con un carburo o escribano diamante, para que quepan en los pocillos de una placa de 12 pocillos.
  2. Mientras trabajaba en una campana extractora, inicie recubrimiento cubreobjetos sumergiendo totalmente cubreobjetos en solución de ácido nítrico concentrado (70% peso / peso) en un recipiente de vidrio. Para asegurar incluso el movimiento de distribución, a continuación, se incuba durante un mínimo de 4 horas. Es posible volver a usar la solución de ácido nítrico concentrado durante aproximadamente 2 veces, pero puede perder el color por exposición a la luz.
  3. Retire la solución de ácido nítrico concentrado y lavar los cubreobjetos cuatro veces en agua destilada durante 30 minutos, agitando con cuidado después de cada lavado.
  4. Con cuidado retire elagua.
    Nota: los tres pasos siguientes se llevan a cabo en una cabina de flujo laminar estéril.
  5. Sumerja los portaobjetos en 96% EtOH. Quitar los cubreobjetos de la solución de EtOH y déjelos secar.
  6. Flamear los cubreobjetos y ponerlos en un recipiente de vidrio. Utilice unas pinzas finas para manejar los cubreobjetos (fórceps no.5 estilo Dumont, por ejemplo).
  7. Cubra el recipiente con papel aluminio y hornee en horno de calor seco, durante 12 a 16 horas a 180 ° C. Cubreobjetos al horno se pueden almacenar a temperatura ambiente por hasta 1 mes, si bien cerrado.

2. Cubreobjetos Revestimiento

El procedimiento de recubrimiento cubreobjetos favorece unión neurona a la superficie del vidrio y la arborización dendrítica 14.

  1. En una campana laminar estéril, usar pequeñas pinzas estériles para colocar el cubreobjetos individuales en pocillos individuales de una placa de 12 pocillos.
  2. Añadir 500 l de solución de poli-L-lisina (o cantidades suficientes para sumergir los cubreobjetos).
  3. Envuelva tque plato en papel de aluminio para evitar la evaporación y se deja durante la noche a temperatura ambiente.
  4. Antes de comenzar la cultura, aspirar la solución de poli-L-lisina cuidadosamente en una campana laminar estéril.
  5. Lavar cada pocillo con 1 ml de agua estéril dos veces, mientras que la prevención de que se sequen.
  6. Aspirar el agua por completo, añadir 1 ml de medio de baño y dejar los cubreobjetos en la incubadora de cultivo de tejidos hasta que se vaya a la placa de las células. Se recomienda a la placa las células dentro de 24 horas.

3. Eliminación de cerebros de rata E16-E19 embriones

  1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos por calentamiento en un esterilizador seco durante la noche o lavándolas con EtOH al 70%. Secar a fondo si se utiliza EtOH.
  2. Prepare varios platos de 30 mm con tampón 1x HBSS y mantenerlos en hielo.
  3. La eutanasia a la presa de rata con una inyección intraperitoneal de Euthasol (160 mg / kg de Euthasol en un volumen de ± 0,4 ml).
  4. Compruebe la ausencia de reflejos.
  5. Rocíe el abdomen de la presa con el 70% de EtOH.
  6. Hacer una incisión a lo largo del abdomen y extraer el útero.
  7. Retire los embriones del útero y colocarlos en una placa de Petri de diámetro 100 mm.
  8. Retirar las cabezas de los embriones con grandes tijeras y coloque las cabezas en una nueva placa de Petri que contiene tampón 1x HBSS frío.
    Nota: de aquí al paso 7.1 el procedimiento se lleva a cabo en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.
  9. Mantenga presionada las cabezas a los lados con grandes pinzas.
  10. Con unas tijeras pequeñas, hacer un corte sagital en la piel en la parte superior de la cabeza, después pele lateralmente la piel hacia abajo con una gran pinza.
  11. Utilice el mismo método que en el paso 3.10 para quitar el cráneo. Haga un corte sagital de partida en el extremo caudal; abrir suavemente el cráneo sin dañar el tejido cerebral. Dobla las dos mitades de la calavera de distancia exponiendo lateralmente el cerebro.
  12. Con la espátula roma, saca el cerebro y lo coloca en frío fresco 1x HBSS.
  13. 4. Disección de los hipocampos

    Es muy importante que la disección se realiza lo más rápidamente posible en condiciones estériles para asegurar la viabilidad celular. Mantener las muestras en frío en hielo.

    1. Retire y deseche el cerebelo con las tijeras finas.
    2. Separar los dos hemisferios del cerebro haciendo un corte sagital en la línea media.
    3. Tome cada hemisferio y colocar tanto en una nueva placa de 30 mm que contiene fría 1x HBSS.
    4. Coloque cada hemisferio de manera que el lóbulo temporal se enfrenta a la parte inferior del plato.
      NOTA: A partir de aquí, se recomienda el uso de un microscopio de disección.
    5. Aplique suavemente el cerebro medio usando unas pequeñas pinzas y retire el cerebro medio con otro par de pinzas. Deje el resto del hemisferio intacto que contiene la corteza y el hipocampo.
    6. Girar sobre el tejido, de manera que el hipocampo se enfrenta ahora a la parte inferior del plato.
    7. Aplique suavemente el hemisferio en el pencaje con un pinzas finas. Mediante el uso de otras pinzas finas, retire con cuidado y suavemente las meninges. Es más fácil comenzar en el bulbo olfatorio. Tenga cuidado para no dañar el hipocampo.
    8. Oriente el tejido de manera que el hipocampo está ahora mirando hacia arriba. El hipocampo se puede ver ahora por su estructura en forma de C característico.
    9. Mediante el uso de unas pinzas finas, diseccionar el hipocampo. Reunir en un nuevo plato de 30 mm que contiene fría 1x HBSS.

    5. Disociación Celular y Plating

    1. Cuente el número total de hipocampos, luego se corta en trozos pequeños.
    2. Recoger los pedazos en un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 3 ml 1x HBSS.
    3. Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante.
    4. Añadir 6 l de tripsina por el hipocampo.
    5. Incubar max 20 min a 37 ° C. Agitar después de 3 min.
    6. Lavar dos veces con 5 ml de HBSS frío fresco 1x y descartar el sobrenadante.
    7. Después de la Second lavar, añadir 1,5 ml de medio chapado, pre-calentado a 37 ° C. El suero en el medio de chapado se inactivar la actividad tripsina.
    8. Poco a poco se tritura 30x con una pipeta Pasteur pulida al fuego hasta que todos los trozos de tejido se dispersan homogéneamente en células individuales. Evite cualquier burbujeo.
    9. Añadir 5 ml de chapado pre-calentado medio a 37 ° C.
    10. Contar las células utilizando una tinción vital azul de tripano.
    11. Semillas de 50.000 células por pocillo de una placa de 12 pocillos en 1 ml enchapado medio, preparado en la Sección 2 (volumen total de 2 ml).
    12. Agite suavemente la placa para distribuir uniformemente las células.
    13. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. Después de 2-3 días, reemplace la mitad del medio de recubrimiento (0,5 ml) con medio de cultivo que contiene 10 mM FUDR.
      Nota: la imagen de la espina dendrítica se realiza 16-17 días después de la siembra (16-17 días in vitro, DIV).

    6. Rata primarias del hipocampo de la neurona transfección utilizando Lipofectamine

    1. Preparar plásmido de ADN que expresa GFP y medio de incubación (10 ml de medio Neurobasal con 100 l de glutamax).
    2. Pre-caliente el medio de incubación a 37 ° C.
    3. Prepare la mezcla de ADN (Tubo A). Para cada cubreobjetos añadir 1 g de ADN en 100 l de medio Neurobasal llano. Mezclar suavemente.
    4. Prepare la mezcla de Lipofectamine (Tubo B). Para cada cubreobjetos añadir 2 l Lipofectamine en 100 l de medio Neurobasal llano. Mezclar suavemente.
    5. Añadir la mezcla de Lipofectamina gota a gota a la mezcla de ADN.
    6. Incubar en la campana de flujo laminar durante 30 min a temperatura ambiente.
    7. Añadir 1 ml de medio de incubación pre-calentado a la placa 1.
    8. Placa de la tienda 2 de 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
    9. Añadir con cuidado gota a gota 200 l de la ADN / lipofectamina se mezclan a cada pocillo e incubar durante 45 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
    10. Con el uso de pequeñas pinzas levantar el coverslips que contiene las neuronas y enjuagarlos sumergiéndolos en un plato de 3 cm que contenía medio Neurobasal caliente fresco y moverlos a la placa 2.
    11. Incubar las neuronas transfectadas a 37 º C, 5% de CO 2 durante 48 horas.
    12. Compruebe la eficacia de transfección de 24 horas después de la transfección.

    7. Inmunotinción y montaje de rata hipocampo neuronas primarias

    Para mejorar la intensidad de la fluorescencia en células transfectadas, lleve a cabo un protocolo de inmunotinción para mejorar la detección de GFP 48 horas después de la transfección.

    1. Preparar 4% PFA y 0,05 M TBS.
    2. Se calienta la solución de PFA 4% a 37 ° C.
    3. Se aspira suavemente el medio de los pocillos que contienen los cubreobjetos.
    4. Añadir 500 l de tibia 4% PFA con cuidado para evitar dañar las dendritas.
    5. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
    6. Lavar con 1x HBSS 3 veces por 5 min.
      NOTA: en este punto, las muestras se pueden almacenar hasta 3 semanas a 4 ° Co inmunotinción se puede iniciar inmediatamente.
    7. Si se almacenaron muestras, lavar con TBS 0,05 M 3 veces durante 5 min.
    8. Bloquear con TBS-BSA (1%) solución a temperatura ambiente durante 30 min.
    9. Lavar con TBS 0,05 M 3 veces durante 5 min.
    10. Añadir el anticuerpo primario diluido en la mezcla de incubación.
    11. Incubar las placas durante 1 hora a temperatura ambiente.
    12. Además, incubar durante la noche a 4 ° C con agitación suave.
    13. Retire el anticuerpo primario.
    14. Lavar con TBS 0,05 M 3x durante 5 min.
      NOTA: a partir de este momento, mantenga los cubreobjetos protegidos de la luz.
    15. Añadir el anticuerpo secundario conjugado fluorescente diluido en la mezcla de incubación.
    16. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
    17. Retire el anticuerpo secundario.
    18. Lavar con TBS 0,05 M 3 veces durante 5 min.
    19. Lavar con 1X TB 2 veces durante 5 min.
    20. Use unas pinzas finas para eliminar a los cubreobjetos de los pozos.
    21. Seque cualquier exceso de la tuberculosis con un pañuelo de papel y montar la coverslips utilizando medio de montaje.
    22. Selle con esmalte de uñas para evitar la evaporación del medio de montaje.

    8. Dendríticas Spine Imaging utilizando Estructura Iluminación Microscopía

    De formación de imágenes de la espina dendrítica utilizando el sistema de SIM se describe en los materiales tiene una resolución lateral (XY) valor de aproximadamente 85-110 nm y un valor de resolución axial (Z) entre 200 - 250 nm, proporcionando un factor de 2 veces la mejora en la resolución en comparación con los La microscopía de campo amplio.

    NOTA: las imágenes de la espina dendrítica utilizando SIM se realiza normalmente 2 días después del paso de 7.22, pero se podría hacer hasta 3 semanas más tarde si las muestras se mantuvieron en la oscuridad y bajo una temperatura controlada de 22 - 23 ° C.

    1. Encienda el láser de 488 nm, la lámpara de mercurio, el controlador de fase, el controlador piezoeléctrico, la lámpara halógena de luz transmitida y el PC e inicie el software SIM en el "ANDOR para N-SIM" de modo.
    2. Limpie el objeto TIRF 100xive con etanol al 95% tres veces, y si es necesario con éter de petróleo.
    3. Utilice los siguientes parámetros de filtro: 520 LP con una dicroica 488.
    4. Ponga una gota de aceite de inmersión sobre el objetivo. Comprobar que no hay burbujas de aire en la gota de aceite. Mueva el objetivo hacia arriba hasta que el aceite toca la muestra.
      Nota: Coloque una cubierta sobre el escenario para proteger la muestra de la luz ambiente y apagar las luces de la habitación lo más posible.
    5. Ajuste el collar de corrección del objetivo de 37 ° C, 200 m, para obtener la mejor simetría de PSF. Con el fin de establecer la posición de cuello correcta, primero coloque el anillo de objetivo en la posición nominal óptima y luego marque una muestra de perlas de 100 nm. De acuerdo con la simetría del mejor PSF, cambiar ligeramente la posición de collar alrededor de la nominal.
    6. Para la iluminación, el uso de rejilla 3D-SIM (3D 1layer 100X/1.49 todas las longitudes de onda). Para empezar el lugar alineación rejilla del bloque de rejilla seleccionada en el iluminador SIM, con el 100X 1,49 objetivo en su lugar. Utilice una muestra de perlas de 100 nm montado en los medios de comunicación, con una concentración que puede permitir el aislamiento de 10-15 cuentas para un campo de visión (FOV). Después de ajustar el collar de corrección objetiva a la posición deseada, seleccione la iluminación 3D-SIM y empezar el proceso de alineación de software guiado. Se ejecutará (5 fases) x x (1 dirección) (100 z planos) imágenes, de la que será reconstruir el campo de visión con los granos. Después de seleccionar una sola cuenta a través de un retorno de la inversión adecuada, que cubra todo el cordón que incluye la luz borrosa fuera de foco, el software se iniciará un PSF automática de montaje y que se ajustará la posición de rejilla de acuerdo con el resultado.
    7. Para comprobar el funcionamiento del microscopio, repita la alineación de rejilla cada 2 semanas, debido a la posible desalineación causada por movimientos de la mesa y / o la deriva de la temperatura. Además, compruebe también la intensidad del láser y la estabilidad de acuerdo con las sugerencias del fabricante.
    8. Limpie la superficie de la muestra con un 95% ethAnol tres veces.
      Nota: Para los próximos pasos ver figura 3 para una descripción de los paneles de control y los ajustes correctos en el software SIM.
    9. En el software SIM, seleccione la configuración óptica FITC Eye y seleccionar un bloque de filtro vacía en Torreta 1 para la inspección visual con luz blanca.
    10. Ajuste la velocidad de enfoque y la velocidad de desplazamiento de la mesa XY para "Fino".
    11. Abra el obturador y rápidamente centrarse en la muestra.
    12. Cierre la tapa de nuevo y establecer la coordenada Z a cero.
    13. Seleccione el filtro verde en Torreta 1 para la inspección visual con el canal verde.
    14. Ajuste la intensidad de la lámpara de mercurio a la posición más baja.
    15. Mover a la frontera de la muestra con cuidado, asegurándose de que el objetivo no toca el sellador.
    16. Abra el obturador y rápidamente escanear a través de la muestra con la intensidad más bajo posible.
    17. Al encontrarse con una dendrita suficientemente brillante de interés y centrar un segmento de interésen el campo de visión, cierre el obturador.
    18. Configure el software para Optical Configuración 3D-SIM 488 y los ajustes de la cámara a la lectura de modo EM, ganar 1 MHz de 16 bits, el tiempo de exposición de 100 ms, potencia del láser 5% y EM ganar 200.
      NOTA: Compruebe que se ha seleccionado el filtro verde en Torreta 2 y que Torreta 1 está vacía.
    19. Compruebe que la rejilla está en 'Mover' y haga clic en vivo para ver la muestra con luz láser ya través de la cámara.
    20. Active el Look Up Table.
    21. Centre el objeto de interés si es necesario y se centran en la velocidad de enfoque ajustado a Extra Fino.
      NOTA: en el modo de lectura de EM ganar 1 MHz de 16 bits, la intensidad target image una buena SIM se necesita es de 30,000-45,000.
    22. Ajuste rápidamente los ajustes de la cámara para obtener un valor de intensidad entre 30,000-45,000 en el modo de lectura de EM ganar 1 MHz 16-bit. Inicialmente usar:
      1. Potencia del láser: 0% - 20% (con muestras preparadas como se describe anteriormente, 5% o 2,6 mW es suficiente)
      2. Tiempo de exposición:50 mseg-2 seg
      3. Modo de Lectura: EM ganar 1 MHz de 16 bits
      4. EM ganar: 0-300
      5. Ganancia de conversión: 1x - 5.1x
      6. Formato para el vivo: No hurgar en la basura
      7. Formato de captura: No hurgar en la basura
        NOTA: con esta configuración se consigue habitualmente 6,3% ± 1,3% de blanqueo, dentro de un límite del 10% del blanqueo máximo aceptable, lo que podría afectar de manera significativa la calidad de la imagen 15.
    23. Haga clic en Detener para desactivar la Vista en vivo.
    24. Configure los valores de la pila 3D de Z en el panel de secuencias ND a:
      1. Rango: 2 m
      2. Fijar Tamaño: 120 nm
      3. Plano Z
      4. Haga clic en la posición inicial
      5. Seleccione la configuración óptica 3D-SIM 488 en la sección de Lambda
    25. Seleccionar 3D-SIM como el modo de adquisición de la plataforma de N-SIM.
    26. Ejecute la secuencia de adquisición ND y guardar los datos en bruto.
    27. Seleccione la configuración óptica FITC ojos de nuevo y repita los pasos del 8.15 a 8.27 hasta que toda la muestra ha sido fotografiada
    28. Reconstrucción de imágenes 3D: Los datos obtenidos en el paso 8.23 ​​o bien se pueden reconstruir de inmediato o en el futuro. Comience por la reconstrucción de la pila de Z con la configuración por defecto en el modo de reconstrucción Reconstruir Slice o reconstruir pila y ajustar si es necesario.
      NOTA: para obtener mejores resultados, Z pilas deben hacerse con el tamaño del paso indicado y reconstruidos en modo Reconstruir Stack. Siempre verifique la validez de la imagen reconstruida comparándolo con los datos en bruto o, preferiblemente, una imagen de gran campo. Los parámetros que se pueden ajustar para el proceso de reconstrucción son el contraste y supresión de ruido de alta frecuencia. Ambos influyen en cómo se tienen en cuenta las diferentes propiedades de imagen en bruto durante el proceso de reconstrucción. En caso de baja profundidad de modulación de datos en bruto, el parámetro de contraste juega un papel importante. Si el usuario tiene conjuntos de datos con una baja relación señal-ruido, entonces el parámetro de supresión de ruido de alta frecuencia puede influir en la calidad de la reconstrucción SEseveramente.
    29. Cuando las imágenes en acabados, centro de la platina XY y mover el objetivo hasta el final abajo a su posición de descanso.
    30. Desmonte la muestra y limpiar tanto la muestra y objetiva con etanol al 95%.
    31. Cierre el software y el ordenador y desconecte todos los demás dispositivos.
    32. 3d reconstrucción y la columna vertebral clasificación de las imágenes adquiridas puede llevarse a cabo después de la conversión de los archivos de TIFF como se describe antes de usar software de NeuronStudio (véase la Figura 4) 16.
    33. Utilice los siguientes parámetros para la reconstrucción en el software NeuronStudios:
      1. Volumen: vóxel dimensiones: X: 0,03 m; Y: 0,03 m; Z: 0.120 micras.
      2. Detección Dendrita: Adjuntar relación: 1,3; Longitud mínima: 5 m; Ratio Discretización: 1; Vuelva a alinear las uniones: Si.
      3. Spine detección: Altura mínima: 0,2 m; Altura máxima: 5.001 m; Anchura máxima: 3 m; Tamaño rechoncho mínima: 10 voxels; Tamaño no rechoncho mínima: 5 voxels.
      4. Spine Clasificador: relación de Cuello (relación cabeza-cuello): 1,1; Relación fino: 2,5; El tamaño de la seta: 0,35 m;
    34. Parámetros NeuronStudio utilizados para la representación: la forma de vértice Neurite: Eclipse sólido; Color de vértice Neurite: por tipo; Forma del borde Neurite: Línea; Neurite borde de color: color único; Spine forma: Eclipse sólido; Color Spine: por tipo.
      Nota: Después de la reconstrucción 3D es también posible ajustar el volumen de procesamiento. El umbral predeterminado se establece en 20, con la opción 'Regenerar volumen rendering' activo. Opacidad fue fijado por 'Intensidad automática "activada. 'Superficie único' y las opciones 'Usar Point Pre-Rendering' también fueron activos

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Representative Results

Descrito aquí es un protocolo de trabajo estandarizado para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria in vitro utilizando SIM. El flujo de trabajo de protocolo y sus pasos cruciales se muestran en la Figura 1. En general, el protocolo de toma aproximadamente 2 semanas de trabajo experimental separados en una primera fase de preparación de la muestra, incluyendo la cultura, el desarrollo y la transfección de las neuronas del hipocampo de rata primaria e inmunohistoquímica, y la segunda fase de imágenes de muestra usando SIM. Las neuronas del hipocampo de rata primaria se fijan aproximadamente 2 semanas después del inicio del cultivo, cuando las neuronas se han desarrollado árboles dendríticos complejos teniendo numerosas espinas dendríticas 3,5. Utilizando el protocolo descrito en detalle en las secciones 1-8, es posible imagen sistemáticamente las espinas dendríticas con súper resolución. En comparación con un método de formación de imágenes de la espina dendrítica convencional usando microscopía de fluorescencia confocal que se describe antes de 16,17, el protocolo descrito en este documento usando SIM proporciona significativamente mejor resolución de imagen y la reconstrucción en 3D, lo que permite la identificación y clasificación de las protuberancias de la membrana de las neuronas que van desde filipodia pronto para estructuras vertebrales similares.

Figura 1
Figura 1. El esquema muestra un flujo de trabajo de protocolo, sus pasos y el calendario.

Figura 2
Figura 2. Micrografías representativas de las dendritas y espinas dendríticas reflejado con confocal (A) y microscopía de SIM (B). La micrografía SIM representante fue adquirida como se describe en la sección 8, la micrografía confocal representante fue adquirido ucantar el tamaño del agujero de alfiler física: 30 m potencia del láser 2.6 mW, sin promedio. Adquisiciones fueron reconstruidos a partir de imágenes de confocal y SIM (C y D, respectivamente) utilizando software NeuronStudio como se describe antes de los 16. Las dendritas fueron identificados y espinas se clasificaron automáticamente con el software después de ajustar los parámetros principales, tales como la longitud del cuello, diámetro del cuello y el diámetro de la cabeza. Las zonas de los cuadros muestran una espina dendrítica individuo fotografiado con confocal (A) y SIM (B) y reconstruido a partir de sus correspondientes pilas Z (C y D), que representan las diferencias de resolución y exactitud de las reconstrucciones 3D resultantes. De acuerdo con la resolución más alta de SIM, el análisis cuantitativo de tanto la cabeza (E) y el cuello (C) de diámetro revela que las medidas SIM dimensiones significativamente más pequeñas que la microscopía confocal para las mismas espinas dendríticas, lo que indica que SIM es capaz de detectar pequeños cambios en la morfología de la espina dendrítica. D ATA en E y F se normalizan a las mediciones confocal de referencia. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar de 3 espinas dendríticas extraídas de 5 segmentos dendríticas fotografiados en ambos modos confocal y microscopio SIM. Para diámetro de cuello había una diferencia significativa (p = 0,0049 **) entre confocal (100,0 ± 4,296 unidades normalizadas) y SIM (50.61 ± 7.642 unidades normalizadas) imágenes, según las pruebas realizadas con una t de Student (E). Para diámetro de la cabeza que había una diferencia significativa (p = 0,0209 *) entre confocal (100,0 ± 6,255 unidades normalizadas) y SIM (58.12 ± 9.451 unidades normalizadas) imágenes, según las pruebas realizadas con un t-test estudiantes.

Figura 3
Figura 3. Imagen del NiS Elementos paquete de software 6.14 SIM de la Nikon con los ajustes descritos en este protocolo.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 4
Figura 4. Imagen de la reconstrucción NeuronStudio 3D y software de clasificación columna vertebral de una imagen representativa de una dendrita.

Tabla 1
Cuadro 1. Lista de los reactivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este artículo se describe un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata en cultivo primario in vitro utilizando SIM. El método de cultivo de neuronas del hipocampo primaria es una adaptación del método original descrito por Banker Kaech y 18. Las diferencias principales son el uso de medio Neurobasal/B27 cultura, lo que elimina el requisito de las culturas de alimentación astroglial, y la adición de la FUDR inhibidor mitótico en el día 3 que promueve la supervivencia neuronal, mientras que la supresión de la proliferación glial, como se describe por Brewer et al 19.

Hay muchos pasos críticos en el protocolo. El espesor de los cubreobjetos utilizados a la placa las células es crucial para un experimento SIM precisa. La esterilidad durante la preparación del cubreobjetos y el revestimiento es importante. No deje cubreobjetos poli-l-lisina tratados se sequen durante el 2,3 y el 2,4. El diámetro de la pipeta pulida a la llama utilizado en el paso 5.8 es crucial.Demasiado estrecha punta se traducirá en baja viabilidad celular en las etapas posteriores. El aislamiento de los hipocampos lo más rápidamente posible se asegurará la viabilidad celular alta. El momento de la incubación y concentraciones de tripsina son cruciales para asegurar la viabilidad celular alta. La pérdida de la actividad enzimática de tripsina también puede afectar a la viabilidad celular. Finalmente, la adición de FUDR en el paso 5.14 es crucial para promover la supervivencia de neuronas y de inhibir la proliferación glial.

La fase de formación de imágenes de la muestra es sencillo cuando se lleva a cabo siguiendo estrictamente el protocolo descrito aquí y los resultados en la adquisición de imágenes de súper resolución que pueden ser reconstruidos fácilmente en 3D para analizar y clasificar las espinas dendríticas de acuerdo a sus características morfológicas. Como se muestra en la Figura 2, la calidad de las imágenes adquiridas en el modo de SIM es sustancialmente mejor que las imágenes de exactamente los mismos segmentos dendríticas y espinas individuales adquiridos usando el modo confocal de la misma microscopio. Este resultado sugiere THAt el uso de SIM podría proveer una excelente oportunidad para imagen más que cambios sutiles en la morfología de la espina dendrítica, según se cuantifique en las figuras 2E y 2F.

Hasta ahora, la mayoría (fluorescente) microscopía de campo amplio se ha utilizado para las células vivas de imagen, debido a su baja fototoxicidad. Del mismo modo, debido a sus efectos fototóxicas bajos y buena combinación con fluophores (genéticos) convencionales, SIM permite que las células vivas de imágenes e identificación de las espinas dendríticas en baja fluophore que expresan las células en super-resolución. En comparación con otros métodos de microscopía de super-resolución como STED o PALMA, SIM proporciona un método rápido y económico para la obtención de imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria in vitro. Aunque en la práctica SIM sólo aumenta la resolución por dos veces en comparación con la microscopía confocal convencional.

Un ejemplo de una limitación de la tarjeta SIM es que se basa en la fluorescencia, que enalgunos montajes experimentales pueden ser difíciles de aplicar. Para este fin, técnicas de microscopía que no se basan en la fluorescencia, tales como microscopía electrónica pueden proporcionar una posible solución. Sin embargo, la microscopía electrónica, en particular, es un caro un método tedioso, lento. Además, la microscopía electrónica sólo puede llevarse a cabo sobre muestras fijadas. Por lo tanto, la tarjeta SIM es más adecuado para super-resolución de imágenes de células vivas. La razón para aplicar una proteína fluorescente plásmido que codifica la transfección es que resulta en un etiquetado citoplásmico escasa, aún reproducible de células aisladas, evitando la superposición de las dendritas de las diferentes células y la identificación de las espinas dendríticas individuales. La combinación de transfección con inmunotinción se ha demostrado previamente para aumentar la fluorescencia 17. Sin embargo, otras técnicas fluorescentes también podría ser aplicable a la formación de imágenes de las espinas dendríticas con SIM, por ejemplo, la tinción fluorescente suficiente podría ser adquirida usando recientemente dessondas de unión de actina desarrollados 20.

Dado que los avances técnicos recientes han permitido la aplicación de SIM para imágenes de células dinámico, lo que demuestra que la alta velocidad microscopio de iluminación estructurada es capaz de una resolución de 100 nm a velocidades de cuadro de hasta 11 Hz 13, una futura aplicación muy lógica del protocolo descrito en el presente documento podría ser su aplicación en time-lapse SIM de neuronas de rata en vivo del hipocampo primaria y el análisis de los cambios dinámicos rápidos en la morfología de la espina dendrítica. Un nuevo reto para esta aplicación podría ser la fototoxicidad acumulada esperada asociada con largos intervalos de tiempo de la microscopía en vivo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por una subvención número H64.09.016 VIDI de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO) a la ACB. CPF agradece a la Dra. Silvina A. Fratantoni por sus comentarios críticos y correcciones en el manuscrito final. GMRDL / EMMM son apoyados por la Fundación de Tecnología STW holandés (12151 proyecto y 11350), que forma parte del Nuevo Orden Mundial, y que es financiado en parte por el Ministerio de Asuntos Económicos. Agradecemos a la Catalina Kitts y Peter Drent de Nikon Instruments Europe BV de asistencia y apoyo. HX fue apoyada por la Real Academia Holandesa de Artes y Ciencias (subvención 11CDP10) y WT recibió el apoyo de subvención a la Organización Holandesa para la Investigación Científica (subvención 820.02.006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker
Name Company Catalog Number Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil

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References

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