Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu makale Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu (SIM) kullanılarak in vitro hipokampalinden görüntü dendritik dikenler bir çalışma protokolünü açıklar. SIM kullanarak süper çözünürlüklü mikroskopi geliştirilmiş detaylar bireysel dendritik dikenler görüntüleme sağlayan, önemli ölçüde her üç boyutta ışık kırınım sınırı aşan görüntü çözünürlüğü sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schouten, M., De Luca, G. M., Alatriste González, D. K., de Jong, B. E., Timmermans, W., Xiong, H., Krugers, H., Manders, E. M., Fitzsimons, C. P. Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (87), e51276, doi:10.3791/51276 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dentritik dikenler bir nöronun dendrit çıkan çıkıntılar ve beyinde uyarıcı girdilerin birincil postsinaptik hedeflerini temsil eder. Teknolojik gelişmeler nöron bağlantısı ve sinaptik plastisite kilit unsurlar olarak bu yapıları belirledik. Işık mikroskopisi kullanılarak omurga morfolojisi kantitatif analiz dolayı ışığın intrinsik kırılma limitli ilgili teknik sınırlamalara önemli bir problem olmaya devam etmektedir. Dentritik dikenler kolayca konfokal lazer tarama floresan mikroskobu ile tespit edilebilir. Uzunluğundan daha başka omurga boyutları genellikle 200 nm ışık mikroskobu teorik çözünürlük limiti ile sabit bir geleneksel optik çözünürlük daha küçüktür Ancak, dikenler şekil ve boyut olarak ince değişiklikleri ölçmek zordur.

Yakın zamanda geliştirilen birçok süper çözünürlük teknikleri dendritik dikenler de dahil olmak üzere 200 nm 'den daha küçük bir görüntü hücresel yapılara kullanılmıştır. THese teknikleri klasik uzak alan işlemlere dayalı ve bu nedenle bir numunenin yüzeyinin ötesine mevcut numune hazırlama yöntemlerinin ve görüntü kullanımına izin verir. Burada anlatılan primer hipokampal nöron kültürlerinde dendritik dikenler görüntüleme süper çözünürlük yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) uygulamak için bir çalışma protokoldür. SIM Olası uygulamalar konfokal mikroskopi olanlar ile örtüşmektedir. Ancak, iki teknik farklı uygulanabilirliğini sunmak. Konfokal mikroskopi nedeniyle fiziksel bir iğne deliği kullanımına, odak ışığın dışarı çıkarılma pahasına çözünürlük iyileşme elde ederken SIM, daha etkin yanal çözünürlük sunuyor. Bu protokol, birincil nöronlar DNA plasmidleri floresan proteinleri kodlayan ve SIM kartını kullanarak görüntülü ile transfekte edilmiş bir standart protokol kullanılarak cam lameller üzerinde kültürlenmiştir. Dendritik dikenler, in vitro olarak 16-17 gün sonra, ne zaman görüntülü, çünkü burada tarif edilen tüm protokol, yaklaşık olarak 2 hafta sürerdendritik gelişim uygunudur. Protokolünün tamamlanmasından sonra, dendritik dikenler özel yazılımlar kullanarak, SIM görüntü yığınlarının serisinin 3D olarak yeniden inşa edilebilir.

Introduction

Bir dendritik omurga nöron zarın küçük bir çıkıntı olduğu. Bu karakteristik yapı, genellikle tek bir sinaps giriş almak için uzman ve iki nöronlar arasındaki fiziksel temas alanını temsil eder. En çok işlevsel olgun dendritik dikenleri bir küresel ucu, kafa olarak adlandırılan ve dendritik mile baş bağlayan ince bir boyun içerir. Ancak, dikenler statik değildir ve aktif hareket ve hatta yetişkin beyninde 2 sürekli kendi morfolojisi değiştirin. Bir zaman 2 haftalık süre içinde, geç embriyonik ya da erken doğum sonrası zaman türetilmiş sıçan primer hipokampal nöron kültürleri omurga benzeri yapıların 3 erken filipodia gelişmeye çok sayıda membran çıkıntılar ile karmaşık dendritik milleri gelişir. Bu dinamik davranış ve diğer özelliklerine göre, dendritik dikenler bellek depolama ve sinaptik transmisyon 4,5 'için anatomik bir alt-tabaka temin ettiği düşünülmektedir.

Inci göz önüne alındığındadendritik omurga boyutu ve şekli sinaptik fonksiyon, doğru boyutlarını ölçmek için önemli olduğunu e kritik rolü. Dikenler uzunluğu yaklaşık 200 ile 2000 nanometre arasında değişir ve hali hazırda konfokal lazer tarama floresan mikroskobu ile tespit edilebilir. Ancak, uzunluğu dışındaki omurga boyutları genellikle teorik 200 nanometre yaklaşık 6 difraksiyonu ile sabit geleneksel optik sistemlerinin çözünürlük, aşağıda belirtilmiştir. Bu çözme güçler, omurga boyunları ve kafaların genişliği gibi ince ayrıntıları, görüntüleme için yetersizdir. Çok iş bu sorunu çözmek için tahsis edilmiştir ve birçok nispeten yeni süper çözünürlük mikroskopi teknikleri önemli bir ilerleme sağladı. Özellikle, bir geniş alan, non-konfokal mikroskop 7-10 yanal olarak yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanarak herhangi bir ışık emisyon göz ardı etmeden, klasik sınırı aşan bir çözünürlük elde etmek mümkündür. Non-linea ile birlikte bu teknik kullanılarak,r mikroskopi teknikleri, sınırsız bir faktör 11 ile optik mikroskop yanal çözünürlüğü artırmak için teorik olarak mümkündür. Bununla birlikte, pek çok deneysel koşullar altında, iki 1 SIM bir faktör ile çözünürlük limiti aşmak için izin verir. Böyle uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi 12 ve foto-aktivasyon yerelleştirme mikroskobu (PALM) 12 gibi diğer süper çözünürlüklü optik mikroskopi teknikleri dendritik dikenler görüntüleme uygulandı. Palmiye gibi yerelleştirme-tabanlı yöntemler süper çözünürlük elde etmek için ham görüntülerin çok sayıda gerektirir ve bu nedenle hız sınırlıdır. Öte yandan, STED'in, yüksek görüntüleme hızı elde edebilirsiniz nispeten düşük foton sayıları ve SIM 13 için böyle olmayabilir bakış küçük alanlarda, rağmen.

Bu yazıda amacı, in vitro kültürlenmiş fare birincil hippokampal nöronlar görüntü dendritik dikenler için çalışan bir protokol sunmaktır

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanları içeren tüm deneysel prosedürleri hayvan acı azaltmak için optimize edildi ve Hayvan Deneyleri, Amsterdam Üniversitesi, Aralık protokol # DED204 ve DED250 için Komisyon tarafından onaylanmıştır.

1.. Lamel hazırlanması

  1. Bir 12-yuvalı plakanın yuvaları içine uyacak şekilde, bir karbür veya elmas bir çubuk kullanarak 15 mm x 15 mm'lik bir boyuta lamelleri azaltın.
  2. Bir çeker ocak içinde, çalışma sırasında tam bir cam kap içerisinde konsantre edilmiş nitrik asit solüsyonu (% 70 ağırlık / ağırlık) lamelleri daldırarak kaplama lamel başlar. Hatta dağıtım titremesini sağlamak için, daha sonra 4 saat arasında, en az inkübe edin. Bu yaklaşık 2 kere konsantre edilmiş nitrik asit çözeltisi tekrar kullanılması mümkündür, ama ışığa maruz kalma ile renk gevşek olabilir.
  3. Konsantre nitrik asit çözeltisi dikkatli bir şekilde çıkarın ve her bir yıkamadan sonra çalkalanarak, 30 dakika için damıtılmış su içinde lamelleri dört kez yıkayın.
  4. Dikkatli kaldırsu.
    Not: Bir sonraki üç adım steril bir laminer akış kabininde gerçekleştirilir.
  5. % 96 EtOH lamelleri bekletin. EtOH çözümden lamelleri çıkarın ve kurumaya bırakın.
  6. Lamelleri alev ve bir cam kaba koyun. Lamelleri (örneğin Dumont tarzı No.5 forseps) işlemek için ince forseps kullanın.
  7. 180 ° C de 12-16 saat için bir kuru ısı fırın içinde alüminyum folyo ve fırında ile konteyner Kapak Sıkıca kapalı ise pişmiş lamelleri 1 aya kadar oda sıcaklığında saklanabilir.

2.. Lamel Kaplama

Lamel kaplama işlemi, cam yüzey ve dendritik arborization 14 nöron eki yanadır.

  1. Steril bir laminer başlık olarak, 12 oyuklu bir plakanın bir gözü içindeki tek tek lamelleri yerleştirmek için küçük steril bir forseps kullanır.
  2. (Lamelleri daldırın ya da yeterli miktarda) 500 Poli-L-lisin çözeltisinin ul ekleyin.
  3. T Wrapo buharlaşmasını önlemek ve gece boyunca oda sıcaklığında bırakmak için alüminyum folyo ile plaka.
  4. Kültür başlamadan önce, steril bir laminer kaputu dikkatlice Poli-L-lisin solüsyonu aspire.
  5. Kurumasına engel iken, iki kez steril su ile 1 ml her bir oyuğa yıkayın.
  6. Aspire su, tamamen orta kaplama 1 ml ekleyin ve hücreleri plaka hazır kadar doku kültürü inkübatör lamelleri bırakın. Bu, 24 saat içindeki hücreler, plaka önerilir.

E16-E19 Rat embriyoların Brain 3.. Kaldırma

  1. Gece boyunca, kuru bir sterilizatör ısıtılarak veya% 70 EtOH ile yıkanarak cerrahi aletler sterilize edin. EtOH kullanıldığında iyice kurulayın.
  2. 1x HBSS tamponu ile birkaç 30 mm yemekleri hazırlamak ve buz üzerinde saklayın.
  3. (± 0.4 ml'lik bir hacim içinde 160 mg / kg Euthasol) Euthasol bir intraperitoneal enjeksiyonu ile sıçan baraj Euthanize.
  4. Reflekslerin yokluğu kontrol edin.
  5. % 70 EtOH ile baraj karın püskürtün.
  6. Karın boyunca bir kesi yapmak ve rahim kaldırmak.
  7. Rahim embriyolar çıkarın ve 100 mm çaplı petri koyun.
  8. Büyük makas ile embriyoların başkanları çıkarın ve soğuk 1x HBSS tampon içeren yeni bir petri kafaları yerleştirin.
    Not: buradan prosedür, düzgün akış kabininde, steril koşullar altında gerçekleştirilir 7.1 adıma.
  9. Büyük forseps ile kenarları boyunca başlarını basılı tutun.
  10. Küçük bir makas ile, daha sonra yanal büyük bir forseps ile cilt soyma aşağı, baş üstüne deri bir sagital kesim yapmak.
  11. Kafatası kaldırmak için adım 3.10 olarak aynı yaklaşımı kullanın. Kaudal sonunda başlayan bir sagital kesim olun; yavaşça beyin dokusuna zarar vermeden kafatasını açmadan. Uzak yanal beyin açığa kafatasının iki yarısını katlayın.
  12. Künt spatula ile, beyin oymak ve taze soğuk 1x HBSS'de yerleştirin.
  13. Hipokamplardan 4. Diseksiyon

    Bu diseksiyon hücre canlılığı sağlamak için steril şartlarda mümkün olduğunca çabuk yapılır çok önemlidir. Buz üzerinde soğuk örnekleri tutun.

    1. Çıkarın ve ince makas ile beyincik atın.
    2. Orta hat boyunca bir sagital kesim yaparak beynin iki hemisfer ayırın.
    3. Her yarımkürede alın ve taze soğuk 1x HBSS içeren yeni bir 30 mm çanak hem yerleştirin.
    4. Temporal lob yemeğin dibini bakacak biçimde her yarımkürede yerleştirin.
      NOT: Burada itibaren, bir mikroskop kullanılması tavsiye edilir.
    5. Yavaşça küçük bir forseps kullanarak Ortabeyin tutun ve forseps başka bir çift ile Ortabeyin çıkarın. Korteks ve hipokampus içeren sağlam hemisfer kalanını bırakın.
    6. Hipokampus artık çanağın tabanı bakacak şekilde, doku ters çevirin.
    7. Yavaşça p yarımkürede tutunince bir pens ile dantel. Başka bir ince forseps kullanarak, dikkatli ve yavaşça meninks çıkarın. Bu koku ampul başlamak daha kolaydır. Hipokampus zarar vermemek için dikkatli kullanın.
    8. Hipokampus şimdi yukarı bakacak şekilde doku yönlendirin. Hipokampus şimdi karakteristik C-şekilli bir yapı ile görülebilir.
    9. Ince forseps kullanarak, hipokampus teşrih. Taze soğuk 1x HBSS içeren yeni bir 30 mm çanak toplamak.

    5.. Hücre Ayrılma ve Kaplama

    1. Küçük parçalar halinde doğrayın, sonra hippocampi toplam sayısını.
    2. 3 ml 1 x HBSS içeren bir 15 ml santrifüj tüpüne parçalarını toplamak.
    3. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ve dikkatlice süpernatant kaldırmak.
    4. Hipokampus başına tripsin 6 ul ekleyin.
    5. 37 ° C'de maksimum 20 dakika boyunca inkübe 3 dakika sonra çalkalanır.
    6. Taze soğuk 1x HBSS'de 5 ml ile iki kez yıkayın ve süpernatant atın.
    7. Seco sonrand, yıkama, 37 ° C'ye önceden ısıtılmış kaplama ortamın 1.5 ml, ekleme Kaplama ortamdaki serum tripsin aktivitesi etkisiz olacaktır.
    8. Doku bütün parçaları homojen bir hücre içine dağılmış kadar yavaşça bir ateş cilalı Pastör pipeti ile 30x çiğnemek. Herhangi köpüren kaçının.
    9. Kaplama ve 5 ml ortam 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış
    10. Bir Trypan mavi hayati lekeleme kullanarak hücreleri saymak.
    11. Bölüm 2 (toplam hacim 2 ml) içinde, orta kaplama 1 ml, 12-çukurlu plaka içinde çukur başına 50,000 hücre, tohum.
    12. Yavaşça eşit hücrelerini dağıtmak için plakayı sallayın.
    13. 37 ° C'de inkübe edilir,% 5 CO2. 2-3 gün sonra, 10 uM FUDR ihtiva eden kültür ortamı ile kaplama ortamın yarısı (0.5 mi) değiştirin.
      Not: dendritik omurga görüntüleme 16-17 gün sonra kaplama yapılır (in vitro 16-17 gün, DIV).

    Lipofektamin 6 kullanarak. Rat hipokampus İlköğretim Nöron Transfection

    1. GFP ve inkübasyon ortamı (Glutamax, 100 ul, Neuro temelli ortam 10 ml) ifade eden plasmid DNA hazırlanması.
    2. 37 ° C'ye ön-kuluçka ortamı sıcak
    3. DNA karışımı (Tüp A) hazırlayın. Her bir lamel için düz Neurobasal ortamın 100 ul içinde 1 ug DNA ekleyin. Hafifçe karıştırın.
    4. Lipofektamin karışımı (Tüp B) hazırlayın. Her bir lamel için düz Neurobasal ortamın 100 ul 2 ul Lipofektamin ekleyin. Hafifçe karıştırın.
    5. DNA karışımı damla damla Lipofectamine karışımını ekleyin.
    6. Oda sıcaklığında 30 dakika için laminar akış başlığı içinde inkübe edin.
    7. 1 plaka önceden ısıtılmış inkübasyon ortamının 1 ml ilave edilir.
    8. 37 ° C'de 5 dakika boyunca deposu plakası 2,% 5 CO2.
    9. Yavaşça DNA / Lipofectamine 200 ul her bir göze karıştırın ve 37 ° C,% 5 CO2 'de 45 dakika boyunca inkübe damla damla ekleyin.
    10. Küçük forseps kullanımı coversli asansör ileps nöron içeren ve taze sıcak Neurobasal ortamı içeren bir 3 cm çanak onları daldırma ile durulayın ve 2 plaka taşıyın.
    11. 37 ° C, 48 saat boyunca% 5 CO2 de transfekte nöronlar inkübe edin.
    12. Transfeksiyon etkinliği için transfeksiyondan 24 saat sonra kontrol edin.

    7. İmmünoboyama ve Montaj Sıçan Hipokampal İlköğretim Nöronlar

    Transfekte hücrelerde fluoresans yoğunluğu geliştirmek için, GFP algılamasını, transfeksiyondan 48 saat sonra geliştirmek için bir immüno-boyama protokolü gerçekleştirin.

    1. % 4 PFA ve 0.05 M TBS hazırlayın.
    2. 37 ° C'ye% 4 PFA çözeltisi Sıcak
    3. Yavaşça lamelleri içeren kuyulardan ortam aspire.
    4. Dendrite zarar görmesini önlemek için dikkatli bir şekilde sıcak% 4 PFA 500 ul ekleyin.
    5. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    6. 5 dakika boyunca 1 x HBSS ile 3 kez yıkayın.
      Not: bu noktada numune, 4 ° C'de 3 haftaya kadar depolanabilirveya İmmünbüyanmanın hemen başlamış olabilir.
    7. Numuneler saklanmıştır ise, 5 dakika boyunca 0.05 M TBS ile 3 kez yıkayın.
    8. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında TBS-BSA (% 1) çözeltisi ile bloke edin.
    9. 5 dakika için 0.05 M TBS ile 3 kez yıka.
    10. Kuluçka karışımı içinde seyreltilmiş birincil antikor ekleyin.
    11. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
    12. Bundan başka, bir gece boyunca inkübe nazik çalkalama ile 4 ° C'de.
    13. Birincil antikoru çıkarın.
    14. 5 dakika için 0.05 M TBS 3x ile yıkayınız.
      NOT: Bu noktadan itibaren, ışıktan korumalı lamelleri tutmak.
    15. Kuluçka karışımı içinde seyreltilmiş ikincil floresan-konjuge antikor ekleyin.
    16. 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
    17. Ikincil antikor çıkarın.
    18. 5 dakika için 0.05 M TBS ile 3 kez yıka.
    19. 5 dakika için 1X TB ile 2 kez yıkayın.
    20. Kuyulardan lamelleri kaldırmak için ince cımbız kullanın.
    21. Bir doku ile TB fazlalıkları kurulayın ve cov montemontaj orta kullanarak erslips.
    22. Montaj orta buharlaşmasını önlemek için tırnak cilası ile mühür.

    8. Dentritik Omurga Görüntüleme Yapı Aydınlatma Mikroskopi kullanarak

    Karşılaştırıldığında çözünürlükte 2 kez iyileşme faktörü sağlayarak, 250 nm - materyallerde tarif SIM sistemini kullanarak dendritik omurga görüntüleme yanal çözünürlük yaklaşık 85-110 nm (XY) değer ve 200 arasındaki eksenel (Z) çözünürlük değeri vardır geniş alan mikroskobu.

    NOT: SIM kullanarak dendritik omurga görüntüleme 2 gün adım 7.22 sonra genellikle yapılır, ancak numuneler karanlıkta ve 22 kontrollü bir sıcaklık altında tutulur eğer daha sonra 3 hafta kadar yapılabilir - 23 ° C

    1. 488 nm lazer, civa lamba, sahne denetleyicisi, piezo kontrolör, iletilen ışık için halojen lamba ve bilgisayarı açın ve "ANDOR N-SIM için" modunda SIM yazılımını başlatın.
    2. 100x TIRF nesne temizlemek% 95 etanol ile üç kez ive ve petrol eter ile gerekirse.
    3. 488 dikroik ile 520 LP: Aşağıdaki filtre ayarlarını kullanın.
    4. Amaç üzerinde daldırma bir damla yağ koyun. Petrol-açılan hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Yağ örneği değene kadar yukarı hedefi taşıyın.
      Not: yerleştirin ortam ışıktan örnek korumak ve mümkün olduğunca odasında ışıkları loş sahne üzerinde bir kapak.
    5. PSF en iyi simetrisini elde etmek üzere, 37 ° C, 200 um objektif düzeltme yaka ayarlayın. Doğru yaka pozisyonunu, ilk pozisyonunu optimum nominal konumda objektif halka ayarlayın ve sonra 100 nm boncuk örneği kontrol etmek için. Iyi PSF en simetri göre, hafifçe anma birinin etrafında yaka pozisyonunu değiştirin.
    6. Aydınlatma, 3D-SIM ızgara (100X/1.49 tüm dalga boylarında 1layer 3D) kullanın. 1 ile, SIM aydınlatıcı içine ızgara hizalama yerde seçilen ızgara bloğu başlamak içinYerine 00X 1.49 objektif. Görüntüsü (FOV) bir alan için 10-15 boncuk izole izin veren bir konsantrasyon ile, ortam içinde monte edilmiş bir 100 nm boncuk örnek kullanın. Istenilen konuma objektif düzeltme yaka ayarladıktan sonra, 3D-SIM aydınlatma seçin ve yazılım güdümlü hizalama işlemini başlatmak. Bu (1 yönü) x (100 z-düzlemleri) bu boncuklar ile FOV'yi yeniden hangi görüntüleri, x (5 evrelerini) çalışacaktır. Out-of-odak bulanık ışık da dahil olmak üzere tüm boncuk kapsayan, uygun bir yatırım getirisi üzerinden tek bir boncuk seçtikten sonra, yazılım uydurma bir otomatik PSF başlayacak ve sonuca göre ızgara konumunu ayarlamak olacaktır.
    7. Mikroskop performansını kontrol etmek, çünkü tablo hareketleri ve / veya sıcaklık sürüklenen kaynaklanan olası karışmalar arasında ızgara uyum her 2 haftada bir tekrarlayın. Dahası, aynı zamanda üreticinin önerilerine göre lazer yoğunluğunu ve stabilite kontrol.
    8. % 95 ETH ile numune yüzeyini temizleyinüç kez Anole.
      Not: Sonraki adımlar, kontrol panelleri ve SIM yazılım içinde doğru ayarlara genel bir bakış için Şekil 3'e bakın.
    9. SIM yazılım, optik Yapılandırma Göz FITC seçin ve beyaz ışık ile görsel inceleme için taret 1 boş bir filtre bloğu seçin.
    10. Odaklama hızını ve XY masaya "Güzel" seyahat hızını ayarlayın.
    11. Deklanşörü açın ve hızlı bir örnek üzerinde odaklanmak.
    12. Tekrar deklanşöre kapatın ve ayarlamak sıfıra Z-koordinat.
    13. Yeşil kanalı kullanılarak görsel inceleme için taret 1 yeşil filtresini seçin.
    14. Düşük ayara cıva lamba yoğunluğunu ayarlayın.
    15. Nesnel dolgu macunu temas etmez emin, dikkatli numunenin sınırına taşıyın.
    16. Deklanşörü açın ve hızlı bir şekilde mümkün olan en düşük yoğunluğu ile numune boyunca tarama.
    17. Ilgi yeterince aydınlık dendrit karşılaşma ve ilgi bir segment merkezleme Upongörüş alanında, deklanşör kapatın.
    18. , Mod EM-okumak 1 MHz 16-bit kazanmak, pozlama süresi 100 msn, lazer güç% 5 ve EM 200 kazanmak için Optik Yapılandırma 3D-SIM 488 ve kamera ayarları için yazılım ayarlayın.
      NOT: Ayna üzerindeki 2 yeşil filtre seçili olduğunu kontrol edin ve Kule 1 boş olduğunu.
    19. Izgara 'taşıma' olarak ayarlanmış olduğundan emin olun ve lazer ışığı ve kamera ile örnek görmek için tıklayın Canlı.
    20. Yukarı Bak Tablo etkinleştirin.
    21. Gerekirse ilgi nesneyi ortalamak ve Ekstra İnce ayarında odaklama hızı ile odak.
      NOT: okuma-out modda EM 1 MHz 16-bit kazanmak, iyi bir SIM görüntü için hedef yoğunluk 30,000-45,000 arasında.
    22. Çabuk EM 1 MHz 16-bit kazanç Okuması modda 30,000-45,000 arasında bir yoğunluk değeri elde etmek için kamera ayarlarını. İlk olarak kullanımı:
      1. Lazer gücü:% 0 - 20% (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan numuneler,% 5 ya da 2.6 mW ile yeterlidir)
      2. Pozlama süresi:50 msn-2 sec
      3. Oku-out modu: EM 1 MHz 16-bit kazanmak
      4. EM kazanç: 0-300
      5. Dönüşüm kazanç: 1x - 5.1x
      6. Live için Format: Hayır binning
      7. Yakalama için Format: Hayır binning
        NOT: Bu ayarlar ile% 1,3 beyazlatma ± 6.3% rutin önemli ölçüde görüntü kalitesini 15 etkileyecek kabul edilebilir maksimum beyazlatma,% 10 sınırı içinde elde edilir.
    23. Canlı görünümü kapatmak için Durdur tıklayın.
    24. ND Sıra panelinde 3B Z yığının ayarlarını yapılandırın:
      1. Menzil: 2 mikron
      2. Boyut: 120 nm
      3. Z düzlemi
      4. Ev konumunu tıklayın
      5. Lambda bölümünde Optik Yapılandırma 3D-SIM 488 seçin
    25. N-SIM pedi edinim mod olarak 3D-SIM seçeneğini seçin.
    26. ND Dizi edinimi çalıştırın ve ham verileri kaydetmek.
    27. Tekrar Optik Yapılandırma Göz FITC seçin ve tüm numune görüntülenmiştir kadar tekrar 8,15-8,27 adımları
    28. 3D Görüntü rekonstrüksiyonu: adım 8.23 ​​edinilen veriler ya hemen ya da daha sonra yeniden inşa edilebilir. Yeniden İnşa Dilim veya Yeniden İnşa Yığın modunda varsayılan ayarlarla yeniden Z yığını yeniden başlayın ve gerekirse ayarlayın.
      NOT: En iyi sonuçlar için, Z yığınlarının belirtilen adım büyüklüğü ile yapılmalı ve Yeniden İnşa Stack modunda yeniden. Her ham veri, veya tercihen, bir geniş alan görüntüye karşılaştırarak yeniden oluşturulan görüntünün geçerliliğini kontrol edin. Yeniden yapılanma süreci için ayarlanabilir parametreler kontrast ve yüksek frekanslı gürültü bastırma vardır. İkisi farklı ham görüntü özelliklerini yeniden yapılanma sürecinde dikkate alınır nasıl etkilemektedir. Düşük modülasyon derinliği ham veri durumunda, kontrast parametre önemli bir rol oynar. Kullanıcının düşük sinyal-gürültü oranı ile veri setlerini varsa, yüksek frekanslı gürültü bastırma parametre çatılmayı etkileyebilir severely.
    29. Ne zaman bitmiş, merkezi XY aşamasında görüntüleme ve tüm yol aşağı dinlenme pozisyonuna amacı taşıyın.
    30. Örnek çözün ve% 95 etanol ile ve örnek amacı hem temizleyin.
    31. Yazılım ve PC kapatın ve diğer tüm cihazları kapatın.
    32. Elde edilen görüntü 3d imar ve omurga sınıflandırma NeuronStudio yazılımı kullanmadan önce açıklandığı gibi 16 (bkz. Şekil 4) TIFF dosya dönüştürme sonra yapılabilir.
    33. NeuronStudios yazılım rekonstrüksiyon için aşağıdaki parametreleri kullanın:
      1. Hacim: Voxel ölçüleri: X: 0.03 mikron; Y: 0,03 um; Z: 0.120 mikron.
      2. Dendrite algılama:; 1.3: oranını takın Minimum uzunluğu: 5 mm; Discretization Oranı: 1; Kavşaklar realign: Evet.
      3. Minimum yükseklik: algılamayı Sırta 0.2 mikron; Maksimum yükseklik: 5.001 mikron; Maksimum genişlik: 3 mikron; Minimum güdük boyutu: 10 vokselin; Asgari olmayan güdük boyutu: 5 voxels.
      4. Boyun oranı (baş-boyun oranı): Sınıflandırıcı Omurga 1.1; İnce Oranı: 2.5; Mantar boyutu: 0.35 mikron;
    34. Neurite köşe şekli: render için kullanılan NeuronStudio parametreler katı eclipse; Nörit köşe renk: türüne göre; Nörit kenar şekli: çizgi; Nörit kenar color: tek renk; Şekil Omurga: katı eclipse; Omurga color: türüne göre.
      Not: 3D rekonstrüksiyon o ses işlemek ayarlamak da mümkündür sonra. Varsayılan eşik aktif 'Regenerate volume rendering' seçeneği ile 20 kurulmuştur. Saydamlık kontrol 'Otomatik Şiddeti' tarafından kuruldu. 'Yüzey sadece' ve 'Use Nokta Pre-Rendering' seçenekleri de aktifti

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada tarif SIM kullanılarak in vitro fare birincil hippokampal nöronların dendritik dikenler görüntülenmesi için standart bir çalışma protokoldür. Protokol akışı ve önemli aşamalar, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Genel olarak, iletişim kuralı Kültür, gelişim ve fare birincil hippokampal nöronlar ve immünohistokimya transfeksiyonu da dahil olmak üzere örnek hazırlama bir birinci faz, ayrılmış deneysel çalışma, yaklaşık 2 hafta sürer ve ikinci aşama SIM kullanarak örnek görüntüleme. Fare birincil hippokampal nöronlar, yaklaşık 2 hafta nöronları çok sayıda dendritik dikenler, 3,5 taşıyan kompleks dentritik milleri geliştirdik kültür, başladıktan sonra sabittir. 1-8 bölümleri de detaylı olarak tarif edilen protokol kullanılarak, süper çözünürlük ile beraber görüntü dendritik dikenler mümkündür. 16 daha önce açıklanan aynı odaklı flüoresan mikroskopi kullanılarak geleneksel bir dendritik omurga görüntüleme yöntemi ile karşılaştırıldığında,17, SIM kullanarak burada açıklanan protokol sağlayan, önemli ölçüde daha iyi görüntü çözünürlüğü ve 3D rekonstrüksiyon sağlar erken filipodia gelen omurga benzeri yapıların değişen nöron membranı çıkıntılarının tanımlanması ve sınıflandırılması.

Şekil 1
Şekil 1.. Düzeni bir protokol iş akışı, onun adımlarını ve zamanlamasını gösterir.

Şekil 2,
Şekil 2.. Confocal (A) ve SIM mikroskobu (B) ile görüntülenmiş dendritler ve dendritik dikenler Temsilcisi mikrograflan. Bölüm 8 'de tarif edildiği gibi Örnek SIM mikrografıdır satın alınmıştır, temsilci konfokal mikrografıdır u satın alındı30 mikron lazer gücü 2.6 mW, hayır ortalama: fiziksel iğne deliği boyutunu şarkı. Satın Alma 16 daha önce tarif edildiği gibi NeuronStudio yazılımı kullanılarak konfokal ve SIM görüntüler (sırasıyla C ve D) için yeniden inşa edildi. Dendritler takip edildi ve dikenler gibi boyun uzunluğu, boyun çapı ve baş çapı gibi ana parametreleri ayarladıktan sonra yazılım otomatik olarak sınıflandırıldı. , Kutu içindeki bölümler konfokal (A) ve SIM (B) ile görüntülenmiş ve çözünürlük ve elde edilen 3D rekonstrüksiyonlar doğruluğu açısından farklılıklar gösteren bunların tekabül eden Z yığınları (C ve D) 'den yeniden bir tek dendritik omurga göstermektedir. SIM'in yüksek bir çözünürlüğe göre, baş (E) ve boyun (F) hem de kantitatif analiz çapı ortaya koymaktadır SIM dendritik omurga morfolojisi küçük değişiklikleri tespit yeteneğine sahip olduğunu belirten aynı dendritik dikenler için konfokal mikroskopi daha SIM tedbirler önemli ölçüde daha küçük boyutlar,. D E ve F ata referans konfokal ölçümler normalize vardır. Sonuçlar confocal ve SIM mikroskop modlarında hem görüntülü 5 dendritik kesimleri çıkarılan 3 dendritik dikenler ortalama ± SD olarak sunulmaktadır. Boyun çapı için konfokal (100.0 ± 4.296 normalize adet) ve SIM (50.61 ± 7.642 normalize birimler) arasında anlamlı bir fark (** p = 0.0049) vardı görüntüleri, bir Öğrenci t-testi (E) ile test gibi. Kafa çapı için konfokal (100.0 ± 6.255 normalize adet) ve SIM (58.12 ± 9.451 normalize birimler) arasında anlamlı bir farklılık (* p = 0.0209) vardı görüntüleri, bir Öğrenci t-testi ile test gibi.

Şekil 3,
Şekil 3. Screenshot bu protokolü açıklanan ayarları ile Nikon'un NiS Elements 6.14 SIM yazılım paketi.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Şekil 4,
NeuronStudio 3D rekonstrüksiyon ve dendrit bir temsili görüntü omurga sınıflandırma yazılımı 4. Screenshot rakam.

Tablo 1
Reaktiflerin Tablo 1.. Listesi. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda SIM kartını kullanarak, in vitro olarak kültürlenen fare birincil hippokampal nöronlar görüntü dendritik dikenler için bir çalışma protokolü tarif edilmektedir. Primer hipokampal nöron kültürü yöntemi KAECH ve Banker 18 tarafından açıklanan orijinal yönteminin bir uyarlamasıdır. Brewer ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi 19 ana fark, Neurobasal/B27 kültür astroglial besleyici kültürlerin ortam gereksinimini ortadan kaldırır, ve glial çoğalmasının bastırılması sırasında nöronal hayatta kalmayı teşvik 3. günde, mitotik inhibitör FUDR ilavesinin kullanımıdır.

Protokolünde çok kritik adımlar vardır. Hücreleri kaplamak için kullanılan lamelleri kalınlığı doğru bir SIM deney için çok önemlidir. Lamel hazırlanması ve kaplama sırasında sterilite önemlidir. Poli-L-lisin-tedavi lamelleri 2.3 ve 2.4 sırasında kurumasına izin vermeyin. Adım 5.8 'de kullanılan alevle parlatılmış pipet çapı çok önemlidir.Çok dar bir ucu daha sonraki aşamalarında düşük hücre canlılığı neden olur. Mümkün olduğunca çabuk Hipokampuslardan izolasyonu yüksek hücre canlılığı sağlayacaktır. İnkübasyon ve tripsin konsantrasyonları zamanlaması yüksek hücre canlılığı sağlamak için çok önemlidir. Tripsin enzimatik aktivite kaybı da hücre canlılığı etkileyebilir. Son olarak, adım 5.14 FUDR ilavesinin nöron canlılığını geliştirmek ve glial çoğalmasını inhibe etmek için çok önemlidir.

Numune görüntüleme faz basittir kesinlikle protokol kolayca kendi morfolojik özelliklerine göre dendritik dikenler analiz etmek ve sınıflandırmak için 3D yeniden olabilir süper çözünürlük görüntülerin edinimi burada ve sonuçları açıklanan aşağıdaki yapıldığında. Şekil 2'de gösterildiği gibi, SIM modunda alınan görüntülerin kalitesi aynı konfokal mikroskop modunu kullanarak elde edilen aynı dendritik segment ve bireysel dikenler görüntüleri çok daha iyidir. Bu sonuç göstermektedir that SIM kullanımı Şekil 2E ve 2F nicellefltirilen dendritik omurga morfolojisi ince değişiklikler, daha fazla görüntü için mükemmel bir fırsat sağlayabilir.

Şimdiye kadar, daha çok (flüoresan) geniş alan mikroskopisi nedeniyle, düşük fototoksisite için, görüntü canlı hücreler için kullanılmıştır. Benzer şekilde, düşük olmasından dolayı fototoksik etkileri ve konvansiyonel (genetik) fluophores ile iyi bir kombinasyon için, SIM verir canlı hücreleri görüntüleme ve süper çözünürlükte ifade hücreleri düşük fluophore dendritik dikenler tanımlama. Böyle STED'in veya PALM gibi diğer süper çözünürlüklü mikroskopi yöntemleri ile karşılaştırıldığında, SIM in vitro sıçan primer hipokampal nöronlar dendritik dikenler görüntüleme için hızlı ve ekonomik bir yöntem sağlar. Uygulamada SIM sadece konvansiyonel konfokal mikroskopi kıyasla iki kat çözünürlük artar rağmen.

SIM bir sınırlama bir örnek, floresan dayanır, burada olmasıdırBazı deneysel kurulumları uygulamak zor olabilir. Bu amaçla, örneğin elektron mikroskobu gibi floresan güvenmeyin mikroskopi teknikleri, olası bir çözüm sağlayabilir. Bununla birlikte, özellikle elektron mikroskobu bir sıkıcı, pahalı bir yavaş bir yöntemdir. Ayrıca, elektron mikroskobu sadece sabit numuneler üzerinde ifa edilebilir. Bu nedenle, SIM canlı hücrelerin süper çözünürlük görüntüleme için daha uygundur. Bir floresan proteini kodlayan plazmid transfeksiyon uygulanması için gerekçe farklı hücrelerden dendritler çakışmasını ve bireysel dendritik dikenler tanımlanmasını önlenmesi, bir izole edilmiş hücre az, ancak tekrarlanabilir sitoplazmik etiketleme neden olmasıdır. Immün ile transfeksiyon kombinasyonu floresan 17 geliştirmek için daha önce gösterilmiştir. Bununla birlikte, diğer floresan teknikleri de SIM ile dendritik dikenler görüntüleme için geçerli olabilir, örneğin, yeterli bir floresan boyama son de kullanılarak elde edilebilirveloped aktin bağlayıcı sondalar 20.

Son teknik gelişmeler, yüksek hızlı yapılandırılmış-aydınlatma mikroskobu 11 Hz 13, burada açıklanan protokol çok mantıklı gelecek kadar uygulama kare hızlarında 100-nm çözünürlük yeteneğine sahip olduğunu gösteren, dinamik hücre görüntüleme için SIM uygulama izin beri Time-lapse canlı sıçan primer hipokampalinden SIM ve dendritik omurga morfolojisi hızlı, dinamik değişikliklerin analizi uygulama olabilir. Bu uygulama için bir sonraki sorun, canlı mikroskobi uzun zaman aralıkları ile ilişkili beklenen toplu fototoksisite olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma CPF Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (NWO) bir VIDI hibe sayısı H64.09.016 tarafından finanse edilmiştir. CPF onun eleştirel yorumlar ve taslakla ilgili düzeltmeler için Dr Silvina A. Fratantoni minnettardır. GMRDL / Emmm Hollandalı Teknoloji Vakfı NWO parçasıdır STW (proje 12151 ve 11350), ve hangi kısmen Ekonomik İşler Bakanlığı tarafından finanse edilmektedir tarafından desteklenmektedir. Biz yardım ve destek için Nikon Instruments Europe BV Catherine Kitts ve Peter Drent teşekkür ederim. HX hibe Bilimsel araştırma için Hollanda Örgütü (hibe 820.02.006) tarafından desteklenen Royal Dutch Sanatları ve Bilimleri Akademisi (hibe 11CDP10) ve WT tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker
Name Company Catalog Number Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
  2. Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
  3. Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
  4. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
  6. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 Forthcoming.
  7. Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
  8. Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. 185-196 (1999).
  9. Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
  10. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
  11. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
  12. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
  13. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
  14. James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
  15. Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
  16. Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. (2012).
  17. van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. (2009).
  18. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  19. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  20. Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics