وضع ما يصل إلى
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Medicine
 

Summary

كان الهدف من هذه الدراسة للتحقق من صحة استنساخ لنموذج BBB في المختبر تنطوي على الفئران مسانج شارك في ثقافة من الخلايا البطانية والخلايا النجمية. أحادي الطبقة الخلية البطانية قدم عالية ومنخفضة النفاذية طير LY. التعبير عن البروتينات TJ محددة، تم تقييم الاستجابات الوظيفية للالتهاب وظائف النقل والمستقبلات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​ينظم تحديدا تدفق الجزيئية والخلوية بين الدم والأنسجة العصبية. كان هدفنا لتطوير وتميز مسانج الفئران تكرار للغاية في نموذج المختبر من BBB باستخدام المشترك الثقافات من الفئران الخلايا البطانية الدماغ الأولية (المكتب الإقليمي) والخلايا النجمية لدراسة مستقبلات المشاركة في transcytosis عبر أحادي الطبقة الخلية البطانية. تم عزل الخلايا النجمية عن طريق تشريح الميكانيكية التالية الهضم التربسين وجمدت في وقت لاحق شارك في الثقافة. تم عزل المكتب الإقليمي من القشور الفئران القديمة 5 أسابيع. تم تنظيف أدمغة السحايا والمادة البيضاء، وفصلها ميكانيكيا التالية الهضم الأنزيمية. بعد ذلك، تم طرد جناسة الأنسجة في ألبومين المصل البقري لفصل أجزاء السفينة من النسيج العصبي. خضع شظايا سفينة الهضم الأنزيمية الثانية إلى الخلايا البطانية خالية من المصفوفة خارج الخلية الخاصة بهم. تم جمعة المتبقية الخلايا تلويث مثل pericytesurther القضاء عليه من خلال طلاء شظايا في microvessel التي تحتوي على بوروميسين المتوسط. كانوا ثم passaged على مرشحات لاشتراكهما في الثقافة مع الخلايا النجمية نمت على الجزء السفلي من الآبار. أعرب المكتب الإقليمي مستويات عالية من مفرق ضيق (TJ) البروتينات مثل occludin، claudin-5 وZO-1 مع توطين نموذجية في حدود الخلية. وصلت إلى المقاومة الكهربائية transendothelial (طير) من الدماغ الطبقات الوحيدة البطانية، مما يدل على ضيق TJS 300 أوم · 2 سم في المتوسط. كانت معاملات نفاذية البطانية (PE) لوسيفر الصفراء (لي) استنساخه للغاية بمتوسط ​​قدره 0.26 ± 0.11 × 10 -3 سم / دقيقة. أعرب الخلايا البطانية في الدماغ التي تنظم في الطبقات الوحيدة للهروب رأس المال نقل ف بروتين سكري (P-GP)، أظهر النقل الاستقطاب من رودامين 123، ويجند لP-GP، وأظهر النقل المحددة من ترانسفيرين-CY3 وDiILDL عبر أحادي الطبقة الخلية البطانية. في الختام، ونحن نقدم بروتوكول للإقامة في المختبرنموذج BBB التي هي تكرار للغاية نظرا لأساليب ضمان الجودة، والتي هي مناسبة للبحث في نقل BBB والمستقبلات.

Introduction

وضعت العديد من الأدوية لعلاج الجهاز العصبي المركزي (CNS) اضطرابات غير قادرين على الوصول إلى لحمة الدماغ في تركيزات ذات الصلة علاجيا. ويحمي الدماغ BBB النسيج العصبي من تذبذب تكوين البلازما، من العوامل الممرضة، ويحافظ على التوازن من لحمة الدماغ عن طريق تقييد تدفق غير محددة من الأيونات، والببتيدات والبروتينات وحتى الخلايا داخل وخارج الدماغ 1.

وبفعل الخصائص BBB والتي تحتفظ بها القرب الحميم وعبر الحديث بين الطبقة المتخصصة microvessel الدماغ الخلايا البطانية والعناصر المجاورة من حدة العصبية الدبقية والأوعية الدموية (NGVU) مثل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية (على نحو أدق نجمية نهاية أقدام)، وpericytes مغمد في الغشاء القاعدي الذي يتألف أساسا من نوع الكولاجين الرابع، فبرونيكتين، laminin والبروتيوغليكان 2،3. Pericytes تغطية حوالي 22 - 32٪ من البطانة على المستوى الشعري وتضطلع بدور هامدور في تنظيم انتشار البطانة، الأوعية الدموية والعمليات الالتهابية. الخلايا البطانية تشكيل ورقة المستمر الذي يغطي السطح الداخلي للالشعيرات الدموية. مترابطة من قبل TJS، والتي تشكل بنية تشبه الحزام في المنطقة القمية والتي تسهم في الاستقطاب الخلية. الخلايا النجمية تنظيم خصائص BBB ومصادر من العوامل التنظيمية الهامة مثل TGF-β، GDNF، bFGF وIL-6. الخلايا النجمية نقص في GFAP مع وظيفة غير مكتملة ليست قادرة على تنظيم خصائص BBB 4. الخلايا العصبية لا يشاركون مباشرة هيكليا في تشكيل BBB ولكن أيضا تنظيم جوانب هامة من البروتين التعبير وظائف BBB 5.

من أجل مواصلة دراسة بنية، علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض من BBB، وقد وضعت في المختبر نماذج من BBB كأدوات للبحث. وقد تم استخراج الخلايا البطانية الدماغ من الأنواع المختلفة لتنفيذ نماذج في المختبر BBB مقرهاعلى انخفاض مرور الثقافات الأولية من الأبقار 6،7، 8،9 الخنازير، الفئران 10،11،12، والماوس 13 وأيضا الإنسان 14،15. ومن المعروف أن هذه النماذج لمحاكاة في الجسم الحي BBB، ولا سيما عندما شارك في تربيتها مع الخلايا الدبقية من الفئران أو الفئران و / أو pericytes 16،12، و / أو السلف المستمدة من الخلايا النجمية العصبية 17 و / أو الخلايا العصبية 18. غالبا ما تنتج نماذج "في مختبر" من القوارض لأنها تسمح في المختبر / في التجارب المجراة ومقارنات و / أو دراسة الخلايا البطانية الدماغ المنتجة من النماذج المعدلة وراثيا 19.

وضعت حديثا في نماذج BBB المختبر كما تم تصميمها للمساعدة في التنبؤ امتصاص الدماغ من المرشحين المحتملين للمخدرات CNS قبل في الجسم الحي اختبار 15،20،21،3،6،22،11،23. وعادة ما تستخدم في المختبر نماذج BBB للمقارنة نقل المخدرات مع: ط) المعروف تغلغل في الجهاز العصبي المركزي أو مع لترآه نفاذية عبر BBB وليس له آثار المركزية، والثاني) الظاهر بي من نفس العقاقير قياس في النماذج الحيوانية من نفس النوع. الأدوية التي تمر بسهولة BBB هي في معظمها محبة للدهون وعبور أغشية الخلايا البطانية الدماغ عن طريق بوساطة الدهون نشرها مجانا (الكافيين، كاربامازيبين، الخ). المخدرات تنقل سلبا مثل الديجوكسين، فيراباميل أو السيكلوسبورين A تنبثق بنشاط الدماغ البطانية نقل هروب رأس المال مثل P-GP. ومع ذلك، فإن العديد من الجزيئات العلاجية المطورة حديثا هي المستحضرات الصيدلانية البيولوجية، مثل البروتينات المؤتلف، الرناوات siRNAs أو الاجسام المضادة. معظمهم لا عبور BBB بسبب: أ) عدم وجود نقل معينة، والثاني) طبقة معبأة بإحكام من الخلايا البطانية التي تمنع الجزيئات عالية الوزن الجزيئي من تمر مرور paracellular. مع هذه الحدود، وقد تم تنفيذ استراتيجيات "حصان طروادة" باستخدام ناقلات (الأجسام المضادة، الببتيدات) ضد مستقبلات المعروفة في BBB، والمشاركة طن مستقبلات بوساطة النقل أو transcytosis (RMT)، مثل ترانسفيرين (TF) مستقبلات (TFR)، ومستقبلات الأنسولين (IR)، أو أعضاء من مستقبلات LDL (LDLR) المتعلقة بالأسرة مستقبلات (LDLR، LRP1). تم العثور على هذه المستقبلات على الشعيرات الدموية في الدماغ ومعزولة في BBB في الجسم الحي 24،25. ملامح النسخي لهذه المستقبلات، ولا سيما تلك الأسرة LDLR، تم تحليل ومقارنة بين الخلايا البطانية الدماغ والخلايا البطانية الدماغ شارك في تربيتها مع الخلايا النجمية أو في الشعيرات الدموية في الدماغ مباشرة بعد استخراجها من الدماغ 26. Pardridge 24 فتح المجال مع الأجسام المضادة OX-26 ضد مستقبلات ترانسفيرين (TFR)، تليها أجسام مضادة ضد مستقبلات الانسولين والانسولين مستقبلات عامل النمو 27،28. مع هذه النواقل مقرها الأجسام المضادة، وقد وضعت تقنيات ArmaGen لBBB الجزيئية طروادة الحصان منصة تكنولوجيا لتوصيل الأدوية، بما في ذلك البروتينات، عبر BBB 29. الالأدب غنية في التعبير LRP1 بيانات تظهر في الخلايا البطانية الدماغ ودورها بوصفها قوية التقامي / زبال مستقبلات. اقترح تحليل لطخة غربية أن يتم التعبير عن LRP1 في الكسور المخصب في الشعيرات الدموية في الدماغ والمخ في الفئران الخلايا البطانية الشعرية 30. شركات مثل Angiochem الهدف LRP1 مع ناقلات الببتيد المستمدة من أبروتينين التي تعزز كفاءة تدفق المخدرات عبر BBB 31. ومع ذلك، وتشارك أيضا في LRP1 النقل النشط من Aβ وهروب رأس المال في / تصريح من الدماغ لحمة الدم 32. تنطوي هذه البيانات LRP1 في نقل ثنائي الاتجاه عبر BBB اعتمادا على بروابط لها. biOasis تطور التكنولوجيا تجاوز باستخدام melanotransferrin البروتين لنقل البيولوجية مثل الانزيمات الليزوزومية والأجسام المضادة عبر BBB-33 بينما VECT حورس تطور ناقلات الببتيد التي تستهدف LDLR 34. هناك بيانات تشير إلى أن الدوريات طويلة المدى وLDLR يمكن استخدامها لنقل فرقجزيئات erent مثل الانزيمات الليزوزومية 35،36 المجمعات أو جسيمات متناهية الصغر عبر BBB 37.

لدينا مجال الاهتمام هو تسليم المخدرات الى الجهاز العصبي المركزي باستخدام جزيئات النواقل وvectorized-المرشحين المخدرات لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي. على وجه الخصوص، تسليم المخدرات عبر BBB لابد من النظر في سياق neuroinflammation، وهي العملية التي قد تختلف في مداها، ولكن ربما كان هذا هو مشترك بين جميع الآفات والأمراض الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك التهاب الدماغ، والتصلب المتعدد، ومرض الزهايمر الخ Neuroinflammation ويرتبط مع التهاب BBB وربما مع تغييرات في وظائف الأعضاء ونفاذية BBB معتبرا أن paracellular والنقل العابر للخلايا يمكن تضخيمها في الحالات المرضية 38،39،40،41،42،43. على سبيل المثال، TNF-α، القرص، والسيتوكينات الأخرى تعدل الالتهاب، وأظهرت التجارب في المختبر مع نماذج BBB أنها يمكن أن يغير خصائص paracellular من اله البطانية أحادي الطبقة خلية 38،39،40 والتي TNF-α يؤدي أيضا إلى زيادة في النقل العابر للخلايا من LDL 41، 42 holotransferrin واللاكتوفيرين 43.

كان هدفنا لتطوير وتميز على الوجه الأمثل، وتكرار للغاية مسانج الفئران BBB النموذج باستخدام المشترك الثقافات من الخلايا البطانية الدماغ الأولية والخلايا النجمية. كنا فئران ويستار القديمة 5 أسبوع وحديثي الولادة لإنتاج الخلايا البطانية الدماغ والإنتاج نجمية على التوالي. كان واحدا تحديا لوضع بروتوكول يسمح للإنتاج "استنساخه الأسبوعية" نماذج BBB. للوصول إلى هذا الهدف، تم تنفيذ كل خطوة من بروتوكول الإنتاج في أيام محددة من الأسبوع، بدءا من إنتاج microvessel المخ يوم الأربعاء من الأسبوع الأول. أجريت تشريح كل أسبوع تقريبا خلال السنوات ال 3 الماضية. لزيادة تحسين استنساخ الثقافات، تم إنشاء نظام لضمان الجودة. جميع reagenوالمشار إليه البحوث والمواد الكيميائية في قاعدة بيانات (تاريخ الدخول، الأوراق المالية، ومدة الصلاحية، وغيرها).

وقد تميزت نموذج التالية عددا من المعايير، مثل المنظمة الخلايا البطانية والنقاء، طير، LY النفاذية، ردا على وكلاء الموالية للالتهابات، والتعبير النوعي والكمي للبروتينات TJ، وظائف من الناقلين هروب رأس المال مثل P-GP، ومستقبلات المشاركة في transcytosis عبر أحادي الطبقة الخلية البطانية مثل معدل الخصوبة الاجمالي أو LDLR.

Protocol

1. إنتاج الجرذ النجمية

لكل إعداد استخدام 10 فئران ويستار حديثي الولادة من كلا الجنسين.

  1. التضحية الفئران عن طريق خفض الرؤوس مع زوج من مقص ونقلها على الفور في طبق بتري الجافة تحت غطاء تدفق الصفحي. إزالة أدمغة من الجمجمة دون المخيخ ونقلها على الفور في طبق بتري تحتوي العازلة تشريح الباردة: تستكمل HBSS مع 1٪ الأبقار مصل الزلال (مستوى منخفض من الذيفان الداخلي BSA)، البنسلين 100 وحدة / مل الستربتوميسين و100 ميكروغرام / مل.
  2. خفض العقول في النصف، للفصل بين نصفي الكرة المخية (2) ونقلها إلى طبق بيتري نظيفة مع العازلة تشريح على الجليد. قطع العصب البصري وإزالة السحايا تحت stereomicroscope.
  3. غسل قطعة القشرية على نطاق واسع في 50 مل من العازلة تشريح الباردة.
  4. وضع قطعة القشرية من 3 العقول في أنبوب 15 مل الصقر وفصل من قبل pipetting صعودا وهبوطا انقلابلو مرات مع 10 مل ماصة المتاح مجهزة مع طرف زرقاء في 6 مل من التربسين 0.05٪ - EDTA 0.02٪ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  5. إضافة 24 مل من DMEM تستكمل مع FBS 10٪ والمضادات الحيوية التالية، البنسلين 100 وحدة / مل الستربتوميسين و100 ميكروغرام / مل، وسائل الاعلام اسمه وسائل الاعلام الخلية الدبقية (GCM)، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT. وقد تم اختيار دفعات FBS والتحقق من صحتها لنمو وبقاء cutures نجمية.
  6. resuspend الكرية تحتوي على خلايا فصلها في 10 مل GCM وصفيحة إلى 75 سم 2 T-قارورة (T75). تغيير المتوسطة في اليوم التالي لإزالة الحطام الخلية والحمض النووي. استبدال سائل الإعلام والثقافة مرتين في الأسبوع.
  7. بعد 1 اسبوع من الانتشار، ويهز بلطف الخلايا الدبقية مع شاكر المداري في 60 دورة في الدقيقة خلال 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في GCM. إذا لا يمكن أن توضع T75 في حاضنة مع 5٪ CO 2/95٪ الهواء عند 37 درجة مئوية جو مرطب، تكملة وسائل الإعلام مع 5 ملي HEPES. غسل الخلايا مرتين لصemove خلايا دبقية غير ملتصقة.
  8. بعد ثلاثة أسابيع من البذر، وغسل الخلايا مرتين مع DPBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. إضافة 3 مل من التربسين 0.05٪ الحارة-EDTA 0.02٪، واحتضان عند 37 درجة مئوية والانتظار حتى يتم فرقت طبقة الخلايا (عادة 5 دقائق). تمنع النشاط التربسين وذلك بإضافة 10 مل من GCM، ونقل تعليق خلية في 15 مل فالكون أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 120 x ج لمدة 8 دقائق.
  9. resuspend الكرية نجمية في 90٪ FBS - 10٪ DMSO، نقلها إلى cryovials (2 × 10 6 خلايا في cryovial) وتخزينها في النيتروجين السائل.

2. عزل الدماغ الجرذ Microvessels

تمت الموافقة على إجراءاتنا التجريبية من قبل لجنة الأخلاقيات من كلية الطب في مرسيليا وتتفق مع اللوائح الوطنية والأوروبية (توجيه الاتحاد الأوروبي رقم 86/609). تم بذل كل الجهود لتقليل معاناة الحيوانات وتقليل عدد الحيوانات المستخدمة.

  1. لكل إعداد واحد لexperimenteص، استخدام 3 فئران ويستار خمسة أسابيع من العمر.
  2. يوم الاثنين من الأسبوع الأول، وإعداد 2 قوارير T75 بواسطة طلاء مع نوع الكولاجين الرابع وفبرونيكتين، سواء على 1 ميكروغرام / سم 2 في الماء المعقم ثقافة (10 مل لكل T75). تسمح التمسك عند 37 درجة مئوية حتى microvessel البذر.
  3. صباح يوم الأربعاء من الأسبوع الأول، الموت ببطء الفئران تحت تدفق متزايد من CO 2 للحث على النعاس، وفقدان الموقف والتنفس انقطاع، ثم تليها خلع عنق الرحم. رش رؤساء مع الايثانول 70٪. قطع الرؤوس مع زوج من مقص ونقلها إلى طبق بتري الجافة تحت غطاء تدفق الصفحي.
  4. إزالة أدمغة من الجمجمة دون المخيخ والأعصاب البصرية، ثم نقلها إلى طبق بيتري المبردة على الجليد ومليئة العازلة تشريح الباردة (HBSS تستكمل مع 1٪ BSA، البنسلين 100 وحدة / مل الستربتوميسين و100 ميكروغرام / مل) .
  5. خفض العقول في نصف لفصل نصفي الكرة المخية والدماغ المتوسط ​​2 منفصلة عن لebrain. نقل forebrains في طبق بتري نظيفة على الجليد مع العازلة تشريح.
  6. يستغرق بضعة نصفي الكرة الأرضية في طبق بتري جديدة مع العازلة تشريح البارد لإزالة بعناية السحايا من forebrains تحت stereomicroscope مع N ° 5 ملقط المنحني. ثم، وتنظيف المناطق الداخلية من الدماغ لإزالة حاف المايلين والحصول على قذيفة من القشرة. وينبغي لهذه الخطوات لا تأخذ أكثر من 2 ساعة للحفاظ على الأنسجة وبقاء الخلية.
  7. فصل القشرة من 3 إلى 6 أدمغة مل من العازلة تشريح الباردة في 7 مل الخالط Dounce بنسبة 10 صعودا وهبوطا السكتات الدماغية مع كل من المطاحن 2 من التصاريح مختلفة، 71 ميكرومتر تليها 20 ميكرون.
  8. تقسيم التعليق للحصول على ما يعادل 1 القشرة في 1 مل من 50 مل فالكون أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. تجاهل طاف.
  9. هضم تعليق من القشرة 1 مع 1 مل من محلول الأنزيمية التي تحتوي على مزيج من collagenases / dispase (60 ميكروغرام / مل R11؛ 0.3 U / مل)، الدناز النوع الأول (35 ميكروغرام / مل - 20 K وحدة / مل) والجنتاميسين (50 ميكروغرام / مل) في شاكر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  10. خلط 1 مل من 1 هضم القشرة مع 10 مل من 25٪ BSA / HBSS 1X ومنفصلة بواسطة الطرد المركزي كثافة تعتمد على 3،600 x ج لمدة 15 دقيقة في RT. نقل بعناية القرص العلوي (المايلين والدماغ حمة) وطاف في أنبوب 50 مل نظيفة فالكون وتكرار الطرد المركزي. الحفاظ على بيليه الناتجة تحتوي على microvessels الدماغ في 4 درجات مئوية.
  11. تجاهل بعناية القرص العلوي وطاف. في resuspend كل من الكريات الناتجة تحتوي على microvessels الدماغ مع 1 مل من البرد HBSS 1X ونقل إلى أنبوب 50 مل نظيفة فالكون.
  12. غسل microvessels بإضافة 20 مل من البرد HBSS 1X وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
  13. مزيد من هضم microvessels من 1 القشرة مع 1 مل من نفس الحل الأنزيمية كما هو موضح في الخطوة 2.9 خلال 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في ركلات الترجيحالعكر.
  14. ثم، مزج microvessels هضمها من كل من 3 قشرات في أنبوب واحد وكذلك فصل إلى قسمين 50 مل أنابيب فالكون للحصول على microvessels المستخرجة من تعادل واحد ونصف (1.5) القشرة في الأنبوب. إضافة 30 مل من العازلة تشريح الباردة وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
  15. resuspend الكرية microvessel في 10 مل من DMEM/F12 تستكمل مع 20٪ الصفيحات البقري البلازما المستمدة الفقراء في الدم، الخلايا الليفية الأساسية عامل النمو (bFGF، 2 نانوغرام / مل)، الهيبارين (100 ميكروغرام / مل)، جنتاميسين (50 ميكروغرام / مل) وHEPES (2.5 ملم)، واسمه وسائل الاعلام الخلايا البطانية (ECM) تستكمل مع بوروميسين في 4 ميكروغرام / مل.
  16. اتخاذ المغلفة 2 قوارير T75 من الحاضنة، نضح تتجاوز طلاء وطبق على microvessels من كل أنبوب في واحدة قارورة T75 (microvessels المستخرجة من القشرة 1.5 في قارورة T75).

3. تنقية وانتشار المكتب الإقليمي Primocultures

  1. تنقية: من الأربعاء إلى الجمعة، إضافة puromفايز في 4 ميكروغرام / مل إلى وسائل الإعلام والثقافة. تغيير متوسطة يوم الخميس. يوم الجمعة، وغسل الخلايا وإضافة بوروميسين في 2 ميكروغرام / مل حتى يوم الاثنين.
  2. الانتشار: يوم الاثنين من الأسبوع الثاني، وغسل الخلايا وإضافة الأنسولين، ترانسفيرين والصوديوم زيلونيت تكملة لوسائل الإعلام والثقافة حتى الثقافات تصل إلى 90٪ التقاء يوم الأربعاء من الأسبوع الثاني.

4 التمايز: إعداد نموذج في المختبر BBB

  1. يوم الاثنين من الأسبوع الثاني، وإعداد مرشحات (البولي ايثلين و12 بئرا، المسام حجم 1.0 ميكرون) من خلال طلاء مع مزيج من نوع الكولاجين الرابع وفبرونيكتين سواء في 0.5μg/cm 2 في الماء المعقم ثقافة (500 ميكرولتر من المزيج في المقصورة العلوية و 1.5 مل من الماء المعقم الثقافة في الطبقة السفلى من المقصورة). تسمح التمسك عند 37 درجة مئوية حتى المكتب الإقليمي البذر.
  2. يوم الاثنين من الأسبوع الثاني، وذلك قبل خمسة أيام من إنشاء الثقافة المشتركة، ذوبان الجليد في الخلايا النجمية من cryovials عند 37 درجة مئوية ونقلفي فالكون 15 مل مع 10 مل GCM. الطرد المركزي تعليق في 120 x ج لمدة 8 دقائق في RT.
  3. resuspend الكرية نجمية في GCM وصفيحة في كثافة 30 × 10 3 خلية لكل سم 2 في لوحات 12 أيضا.
  4. الأربعاء من الأسبوع الثاني، قبل تفكك المكتب الإقليمي مع التربسين، ويغسل مرتين مرشح قبل المغلفة مع DMEM/F12 المتوسط. قبل ملء الغرف مع ECM: 1.5 مل في أسفل المقصورة و 0.5 مل في المقصورة العليا.
  5. يوم الأربعاء من الأسبوع الثاني، ويغسل مرتين مع المكتب الإقليمي DPBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. إضافة 4 مل من التربسين الدافئ 0.05٪ - EDTA حل 0،02٪ عند 37 درجة مئوية في قارورة T75 خلال 30 ثانية بالضبط. ثم إزالة 3.5 مل من محلول التربسين ومراقبة تحت المجهر. عندما تبدأ طبقة الخلايا لفصل من المصفوفة، ومساعدتهم من خلال استغلال بلطف حافة القارورة T75 حتى جميع الخلايا العائمة.
  6. إضافة 9 مل من ECM في T75 القارورة ونقل في أنبوب 15 مل الصقر. فصل بلطف جدا الخليةتعليق من قبل pipetting صعودا وهبوطا 4 مرات مع ماصة 10 مل مزودة غيض الأصفر (تجنب إنتاج فقاعات في الحل). عد الخلايا في التعليق (حوالي 3 × 10 6 cells/T75) وطبق على الفور على مرشحات قبل المغلفة والمعبأة سلفا في مناطق ذات كثافة عالية (160 × 10 3 خلية / تصفية بالتالي ما يقرب من 18 filters/T75) (الشكل 8 ). في اليوم التالي (الخميس) مرتين تغيير وسيلة من المقصورة العلوية لإزالة الحطام الخلية.
  7. الخميس الأسبوع الثاني، وقبل يوم من إنشاء الثقافة المشتركة، تحل محل وسائل الإعلام الثقافة نجمية بنسبة 1.5 مل من وسائل الإعلام التمايز (ECM مع الهيدروكورتيزون في 500 نانومتر) التي يمكن أن تستكمل مع 1/3 المتوسط ​​مكيفة من المقصورة القاعدية من السابق شارك في الثقافة (3 أيام من الاتصال بين الخلايا البطانية والخلايا النجمية).
  8. ويعرف الجمعة من الاسبوع الثاني كما في اليوم 0 من التمايز؛ استبدال سائل الإعلام والثقافة من كونتا الفلاترining في المكتب الإقليمي مع وسائل الإعلام التمايز. نقل المكتب الإقليمي الفلاتر في الآبار التي تحتوي على الخلايا النجمية. في ظل هذه الظروف، في المختبر نماذج التفريق والتعبير عن البروتينات المرتبطة مفترق خلال 3 أيام.
  9. نماذج حفاظ على التمايز الأمثل خلال 3 أيام أخرى، وبين الاثنين والاربعاء من الاسبوع الثالث.

Representative Results

بروتوكول الإنتاج
ويمكن تقسيم البروتوكول إلى 3 مراحل المقابلة لتغييرات كبيرة في تكوين ثقافة وسائل الإعلام: (أ) تنقية الخلايا البطانية من microvessels، (ب) الانتشار، و (ج) التمايز على مرشحات (لوحات البولي ايثيلين 12 جيدا مع مسامية 1 ميكرومتر) في الثقافة المشتركة مع الخلايا النجمية. تم تعيين الخطوات المختلفة للبروتوكول الإنتاج إلى أيام محددة من الأسبوع من أجل زيادة استنساخ الثقافات الخلية الأولية (الشكل 1). يوم الأربعاء من الأسبوع الأول، وبالتالي قبل 9 أيام إقامة نظام المشاركة في الثقافة، تم عزل microvessels (الشكل 2A). لتنقية الخلايا البطانية، وأبقى الثقافات في وجود انخفاض تركيزات بوروميسين لمدة 5 أيام. تم القضاء على معظم الخلايا الملوثة (pericytes أساسا) وكان النمو أبطأ من الخلايا البطانية دون تعديل النمط الظاهري الخاصة بهم. المغزل لياليخلايا haped تنبثق من شظايا الشعرية المعزولة من الفئران الدماغ الرمادية المسألة (الشكل 2B). يوم الاثنين من الأسبوع الثاني، كانت مطلية الخلايا النجمية الفئران على الجزء السفلي من لوحات 12 أيضا. الأربعاء، أضيفت المكتب الإقليمي لمقصورة اللمعية من المرشحات. عالية الكثافة في البذر 160 × 10 3 خلية / سم 2 (الشكل 2C) يساعد على تجنب الثغرات في محيط مرشح (الشكل 2D) ويولد التمايز متجانسة من الخلايا البطانية أحادي الطبقة. تظهر الخلايا في التشكل ممدود على شكل مغزل نموذجية، محاذاة طوليا، وتشكيل أحادي الطبقة موحدة. تم تغيير الخميس نجمية مستنبت للتمايز المتوسطة مكيفة مع وسائل الإعلام شارك في الثقافة السابقة (الشكل 2E). الجمعة المكتب الإقليمي على مرشحات كانت تزرع في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على الهيدروكورتيزون 500 نانومتر ونقلت عوامل التصفية لوحات 12 أيضا تحتوي على الخلايا النجمية. على الأسبوع الثالث، والتجارب ثيحرث يقوم بين الاثنين والاربعاء.

المكتب الإقليمي توصيف وتحديد عناصر من أحادي الطبقة النفاذية
تميزت المكتب الإقليمي عن طريق المناعية من البطانية وعلامات BBB وكذلك قياسات للطير، نفاذية LY وظيفة نقل هروب رأس المال مثل P-GP.

المكتب الإقليمي تم الحصول عليها من خلال طريقة تنقية بوروميسين (الشكل 1 و 2) نما في الطبقات الوحيدة المستمر غير المتداخلة التي عرضت إعاقة النمو في التقاء وعرض الرئيسي يعارضها بإحكام، على شكل مغزلي والمغزل التشكل. أعرب المكتب الإقليمي الثقافات علامات نموذجية من الخلايا البطانية: أظهروا المناعية إيجابية لالصفائح الدموية البطانية جزيء التصاق الخلية (الشكل 3A؛ CD31/PECAM) والتعبير عن عامل فون ويلبراند (الشكل 3B). من دون علاج بوروميسين، وغزت RBECs بسرعة عن طريق pericytes الكشف عنها بواسطة immunos desminTAINING (الشكل 3C). ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) التي أعربت عنها النجمية (الشكل 3D) هي علامة التمايز مهم من الخلايا النجمية. مع عدد مرور عالية، النجمية تفقد قدرتها على إحداث تمايز الخلايا البطانية. لهذا السبب، تم توحيد الثقافات نجمية على وقتهم للثقافة وخضع فقط مرور واحدة.

زراعة المكتب الإقليمي مع وسائل الإعلام تستكمل مع الهيدروكورتيزون، تليها شارك في الثقافة مع الخلايا النجمية والمتوسطة مع مشروط من المقصورة السفلي من شارك في الثقافات السابقة أدت إلى تحريض قوية من interendothelial TJS بالمقارنة مع المكتب الإقليمي مثقف وحدها. أعرب الخلايا claudin-5، ZO-1 وoccludin البروتينات، والتي كانت مترجمة في تقاطعات خلية خلية، كما هو مبين من قبل المناعي (الشكل 4B-D) والتي كشفت عنها تحليل لطخة غربية لZO-1 وoccludin البروتينات (الشكل 4E ). توزيع المورفولوجية في جالذراع الى خلية الاتصالات في تكوين مثل سحاب يعكس (أ) ضيق من أحادي الطبقة، (ب) أصل الدماغي من الخلايا البطانية الشعرية، و (ج) هو سمة من الخلايا البطانية الدماغي متباينة للغاية. تم رصد نفاذية Paracellular طبقة البطانية عن طريق قياس طير ومعدل تدفق LY (457 دا) من العلوي إلى السفلي من المقصورة المرشحات. وقد تم قياس طير باستخدام ENDOHM-12 أكواب الثقافة 12 ملم متصلة voltohmmeter EVOM. بلغ طير من الدماغ الطبقات الوحيدة البطانية، مما يدل على ضيق TJS 300 أوم · سم 2 في المتوسط ​​(الفلاتر من 12 لوحات جيدة، لا تظهر البيانات). وصلت بي لLY (بي (لي)، كما تستخدم عنصر تحكم سلامة الحاجز وحضنت بالاشتراك مع مركبات اخضعت للاختبار) بمتوسط ​​0.26 ± 0.11 × 10 -3 سم / دقيقة (الشكل 4F) على مدى فترة سنة 1.

من أجل حمل التهاب المكتب الإقليمي استخدمنا العلاقات العامةس للالتهابات خلوى TNF-α في 5 نانوغرام / مل لمدة 24 ساعة، وتليها الاستجابة الالتهابية عن طريق قياس CCL2 (MCP-1) عن طريق إفراز المكتب الإقليمي في المقصورة العليا من نظام الثقافة التي تضاعف من 120 نانوغرام / مل (غير معاملة السيطرة) إلى 250 نانوغرام / مل (الشكل 5A). العلاج TNF-α في 5 نانوغرام / مل أو 50 نانوغرام / مل لمدة 24 ساعة أيضا فتح BBB كما يتضح من بي (لي) قياس (الشكل 5B).

وقد تصور P-GP في المكتب الإقليمي متباينة من قبل كيمياء سيتولوجية مناعية (الشكل 6A). ومن المعروف P-GP التوطين أن تكون مستقطبة للغاية وأعرب أساسا في الغشاء القمي للخلايا البطانية 44 في حين أن الغلوتامات نقل-1 (GLT-1) ويوجد أساسا في جزء basolateral 45. لتقييم مدى الاستقطاب لدينا مثقف المكتب الإقليمي، تم فصل البروتينات وقمية basolateral من الاستعدادات غشاء البلازما باستخدام كثافة السكروز التدرجات 46. وكان تحليل لطخة غربيةأجريت لتقييم مستويات التعبير عن P-gp و غلت-1 في البلازما، والقمي والاستعدادات الغشاء القاعدي. واستخدمت Microvessels المستخرج حديثا من دماغ الفئران بأنها أقرب الضوابط الإيجابية للتوزيع في الجسم الحي من هذه البروتينات (الشكل 6B). في كل microvessels ومتباينة الاستعدادات غشاء المكتب الإقليمي، وأعرب عن P-GP كما عصابة من 170 كيلو دالتون، المترجمة أساسا في F1 قمية كسر الغشاء (الشكل 6B، C). وأعرب GLT-1 الواقع في التعبير F3 جزء من الغشاء القاعدي كما microvessels عصابة من 65-70 كيلو دالتون، ولكن لم يتم الكشف في المكتب الإقليمي مثقف.

في التجارب بالتوازي مع ذلك، تم اختبار النشاط الوظيفي من P-GP في أحادي الطبقة الخلية البطانية باستخدام رودامين 123 (R123) كما يجند. كان مجافي اللمعة لاللمعية (B إلى A) هروب رأس المال من R123 أعلى 1.7 مرة مما كانت عليه في الاتجاه المعاكس (الشكل 6D). لإثبات تورط ف سباق الجائزة الكبرى، استخدمنا مثبطات محددة P-GP، verapamiل (25 ميكرومتر، 30 دقيقة حضن مسبق) والسيكلوسبورين A (1 ميكرومتر، 30 دقيقة حضن مسبق). مع فيراباميل والعلاج السيكلوسبورين، وزيادة تراكم R123 في المكتب الإقليمي 1.6 أضعاف أضعاف و 2 على التوالي، مقارنة بالشاهد (الشكل 6E).

مستقبلات مستقبلات المشاركة في وساطة Transcytosis (RMT) آليات
وقد تميزت نموذج آخر للتعبير عن مستقبلات مختلفة يحتمل أن تشارك في آليات transcytosis في BBB، مثل LRP1، LDLR أو معدل الخصوبة الاجمالي (الشكل 7A).

أجريت دراسات النقل وظيفية مع بروابط لمعدل الخصوبة الاجمالي وLDLR. وحضنت العيش مع المكتب الإقليمي ترانسفيرين الفئران المسمى مع CY3 (TF-CY3) لمدة 180 دقيقة في 37 ° C (الشكل 7B، C). أظهرت الكمي للTF-CY3 امتصاص والنقل في الفئران في المختبر نموذج BBB أن المنحدر من منحنيات انخفاضا طفيفا يتجاوز 2،400 بيكو مولق (الشكل 7B)، مما يوحي بأن ملزمة / امتصاص كانت تشبع. علاوة على ذلك، فقد ارتبط تشبع ملزمة / امتصاص مع تراكم تمويل الإرهاب في الجزء الأسفل من المقصورة. لتأكيد هذه الملاحظة، وقد حضنت TF-CY3 في 1،200 picomoles (الجزء الصاعد من منحنى) مع وجود فائض من فريق العمل في غير الفلورسنت في 4،800 picomoles (الهضبة / التشبع) (الشكل 7C). وأظهرت هذه التجارب انخفاض تراكم TF-CY3 في أسفل المقصورة وأكد آلية تشبع نموذجية للتفاعل مستقبلات يجند في منطقتنا في المختبر BBB الطراز.

وبالمثل، وقد تجلى ظائف LDLR من امتصاص ونقل DiILDL يجند في جميع أنحاء أحادي الطبقة الخلية البطانية (الشكل 7D، E). وحضنت الحية مع المكتب الإقليمي DiILDL لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لم ترتبط الربط / امتصاص مع تراكم DiILDL في الجزء الأسفل من المقصورة (الشكل 7D). الكمي للDiILأظهرت النقل DL أن المنحدر من منحنيات انخفضت إلى ما بعد 2 ميكروغرام، مما يشير إلى أن النقل كان تشبع والمتعلقة مستقبلات في نموذجنا. تمت إضافة أزيد الصوديوم 0.05٪ في 15 دقيقة قبل DiILDL الحضانة (الشكل 7E). وجرى تقييم حالة عدم وجود سمية أزيد الصوديوم الحضانة عند 0.05٪ من قبل بي (لي) قياس (لا تظهر البيانات). وأظهرت هذه التجارب انخفض تراكم DiILDL في أسفل المقصورة. عموما، نتائجنا تشير RMT لDiILDL في منطقتنا في المختبر BBB الطراز.

نماذج أخرى في المختبر BBB يعتمد على الخلايا البطانية من الفئران الحبل الشوكي أو الدماغ ماوس
الهضم الأنزيمي مع مزيج من collagenases / dispase هي واحدة من المعلمات الرئيسية للسيطرة من حيث بقاء الخلية والعائد إنتاج microvessels الدماغي. تركيز الانزيم والأهم من ذلك هو النسبة بين كمية الإنزيم النسبي للأنسجة، نeeds لتكون محسوبة بدقة بين الدماغ الفئران، الفئران الحبل الشوكي والدماغ الفئران. تم ربط Microvessel كثافة البذر وعدد من الخلايا البطانية لتصل إلى 90٪ التقاء (9 أيام آخر microvessel البذر) ومعلمات هامة لتحسين نمو الخلايا، والحد من عدد السكان تضاعف ونوعية النماذج. أنتجت الفئران microvessels الحبل الشوكي مع نفس البروتوكول كما هو موضح هنا لmicrovessels الدماغ الفئران (من حيث كمية الأنسجة، 2 النخاع الشوكي المقابلة تقريبا إلى 1 الدماغ) للحصول على نفس الكمية من الخلايا في قارورة T75 ضمن نفس النطاق الزمني . كانت السحايا من العمر 5 أسابيع C57BL6 الفئران الدماغ يصعب القضاء عليها لأنها تلتصق القشرة. يظهر العلاج وجيزة من الدماغ مع dispase لتسهيل إزالة السحايا. وسلط الضوء على المعالم الهامة التي تسهم في إنتاج استنساخه الطبقات الوحيدة الخلية البطانية من الدماغ الفئران، الفئران الحبل الشوكي والدماغ الماوس وتلخيصها فيالرقم 8.

الشكل 1
الشكل 1. تدفق الرسم البياني تلخص الخطوات الرئيسية للفي المختبر BBB إعداد نموذج. تم تعيين الخطوات المختلفة للبروتوكول الإنتاج إلى أيام محددة من الأسبوع من أجل زيادة استنساخ الثقافات الخلية البطانية الأولية. يبدأ البروتوكول يوم الأربعاء من الأسبوع الأول، مع إنتاج microvessel من فئران ويستار القديمة 5 أسابيع.

الرقم 2
الشكل 2. photomicrographs النقيض من المرحلة المكتب الإقليمي، النجمية ونظام المشاركة في الثقافة. (A) 5 أسابيع ويستار الفئران شظايا microvessel القديمة في وقت الطلاء خارج.(ب) المكتب الإقليمي الثقافات القديمة لمدة ثلاثة أيام للعلاج من أيام 2 مع الركيزة بوروميسين ف سباق الجائزة الكبرى في 4 ميكروغرام / مل. (C) الصرفة الطبقات الوحيدة البطانية متكدسة في يوم 1 بعد الطلاء على المرشحات ميليبور من 12 لوحة جيدا المغلفة مع نوع الكولاجين الرابع وفبرونيكتين. (D) تجانس أحادي الطبقة الخلية في المحيط الخارجي للمرشح إدراج. (E) مندمج الثقافة نجمية في يوم تأسيس ثقافة مشتركة تظهر تتميز التشكل العسل. (F) مخطط يمثل الثقافة المشتركة النظام مع توطين photomicrographs في C، D و E.

الرقم 3
الرقم 3. توصيف الثقافات المكتب الإقليمي عن طريق المناعي المجهري. (A) الخلايا البطانية الدماغ التعبير عن الخلايا البطانية الصفائح الدمويةPECAM/CD31 جزيء التصاق الخلايا على الحدود، (B) عامل فون ويلبراند (VWF) يظهر تلطيخ منقط نسبيا، وأكثر إشراقا وأكثر مجمعة في بعض الخلايا من غيرها، وتتركز في منطقة محيط بالنواة. (C) بدون علاج بوروميسين من المكتب الإقليمي الثقافات، تم الكشف عن pericytes مع المناعية إيجابية لdesmin (باللون الأخضر) ولها نواة جولة صغيرة مميزة. (D) النجمية تعبير عن الدبقية ييفي الحمضية البروتين (GFAP). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. توصيف Immunocytochemical من الفئران في المختبر، ونموذج BBB نفاذية paracellular منLY عبر أحادي الطبقة البطانية. تم immunostained وأحادي الطبقة الخلية مع (A) vimentin لتكشف عن وجود متموجة البطانية أحادي الطبقة خلية الدماغ مع عدم التداخل التشكل والمغزل على شكل خلايا نموذجية مع التشكل البطانية والتعبير عن البروتينات مفرق ضيق (B) claudin-5 ، (C) ZO-1 و (D) تم تقييم occludin، الكشف أيضا عن طريق لطخة غربية لZO-1 وoccludin البروتينات (E) (F) أحادي الطبقة ضيق في نموذج 12-BBB جيدا عن طريق قياس النقل لوسيفر الصفراء (LY-CH، dilithium الملح)، وهو جزيء ماء صغيرة (MW 457 دا) من المعروف أن يحتفظ بها BBB. لفترة وجيزة، وقد حضنت LY في المقصورة العليا من نظام الثقافة في اتصال مع الخلايا البطانية الدماغي لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد هذا الوقت، تم جمعها وسيلة أقل المقصورة وكان كميا مضان من خلال تحليل الفلور مع spectrofluorimetإيه مع الإثارة في 430 نانومتر، والانبعاثات عند 535 نانومتر. يتم التعبير عن النتائج في النفاذية أو بي في 10 -3 سم / دقيقة. ويعتبر حاجز نفاذية أو مفتوحة عندما بي من LY فوق 0.6x10 -3 سم / دقيقة. خلال كل تجربة 1 ساعة، وتآمر حجم تطهيرها المتوسط ​​مقابل الوقت والمنحدر يقدر من خلال تحليل الانحدار الخطي. وتدل على ميل منحنى التخليص للمرشحات التحكم مع نوع الكولاجين-IV فبرونيكتين طلاء وتدل قوات الأمن الفلسطينية والمنحدر من منحنى إزالة المرشحات مع الطبقات الوحيدة الخلية البطانية الدماغ PST. تم حساب قيمة PS لأحادي الطبقة البطانية (السوق) من: الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المعادلة 1

تم تقسيم القيم سوق فلسطين عن طريق منطقة البرتغالكان غشاء الأوس (1.1 سم 2 للمرشحات ميليبور من لوحات 12 أيضا) ونتيجة معامل نفاذية (بي) بمتوسط ​​قدره 0.26 ± 0.11 × 10 -3 سم / دقيقة. يتم عرض النتائج مع التمثيل العمودي مبعثر مؤامرة لن = 90 المقايسات (يعني ن = 3 إلى n = 6 الطبقات الوحيدة في مقايسة).

الرقم 5
الرقم 5. في المختبر BBB استجابة النموذج للعلاج مع الموالية للالتهابات وكيل TNF-α. تم استبدال سائل الإعلام والثقافة من ثقافة النظام قبل المعاملة TNF α في 5 نانوغرام / مل في المقصورة العلوية لمدة 6 ساعة، 12 ساعة وعلى مدار 24 ساعة. وكان كميا الإفراج CCL2 من قبل المكتب الإقليمي في المقصورة العلوية بواسطة ELISA مقايسة مقارنة مع السيطرة غير المعالجة. لاحظ أن مستويات MCP-1 زيادة طفيفة بوصفها وظيفة من الوقت، حتى في الآبار غير المعالجة. وكشف سلامة الحاجز الخلايا البطانية البطانية يقاس بي لLY بي (لي) زيادة نفاذية أحادي الطبقة بنسبة 24 ساعة العلاج مع TNF-α في 5 نانوغرام / مل أو 50 نانوغرام / مل في حدود 0.62 ± 0.02 × 10 - 3 سم / دقيقة و 0.7 ± 0.01 × 10 -3 سم / دقيقة على التوالي، مقارنة مع السيطرة على 0.33 ± 0.03 × 10 -3 سم / دقيقة (ر اختبار الطالب، ف <0.05).

الرقم 6
الرقم 6. الوظيفية للنقل هروب رأس المال ف gp و المكتب الإقليمي الاستقطاب. التعبير عن هروب رأس المال نقل P-GP في الدماغ الخلايا البطانية شارك في تربيتها مع الخلايا النجمية التي كتبها كيمياء سيتولوجية مناعية (A) وصمة عار الغربية (B & C). تم استخراج البروتينات غشاء الخلية مع fractiona البروتين الخلويطقم نشوئها. تم الحصول على البلازما بواسطة الأغشية ناقص التوتر تحلل والتفضيلية centrifugations للقضاء على العضيات ونوى. تم الحصول على فصل البروتينات القمي والأغشية basolateral من البلازما بواسطة السكروز التدرج الكثافة. وكان مترجم P-GP أساسا في جزء القمي (F1)، في حين تم نقل الغلوتامات-1 (GLT-1) مترجمة أساسا في جزء basolateral (F3). واستخدمت microvessels تنقيته قبل الطلاء عن السيطرة لتوطين في الجسم الحي من هذه البروتينات. تم تحديد النشاط من P-GP عن طريق قياس قطبية نقل R123، يجند P-GP. تم قياس تدفق من 1 ميكرومتر R123 لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في اللمعية-إلى مجافي اللمعة (A إلى B) ومجافي اللمعة في الاتجاهات-إلى اللمعية (B إلى A) عكس ذلك. وقد أدركت التجربة نفسها من دون المكتب الإقليمي لتقييم الانتشار السلبي عبر مرشح إدراج وتم تطبيع البيانات المتعلقة هذه القيمة لبي (R123) حساب (انظر الشكل 5 (R123) (A إلى B). فيراباميل (25 ميكرومتر، 30 دقيقة حضن مسبق) كانت تستخدم والسيكلوسبورين A (1 ميكرومتر، 30 دقيقة حضن مسبق) كمرجع ف سباق الجائزة الكبرى مثبطات. وقد تم قياس تراكم R123 في المكتب الإقليمي بعد 2 ساعة مع أو بدون حضن مسبق مع مثبطات P-GP (ر اختبار الطالب، ف <0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. توصيف مستقبلات مستقبلات المشاركة في وساطة تراnscytosis (RMT). (A) وimmunostained والمكتب الإقليمي أحادي الطبقة متباينة مع الأجسام المضادة ضد كثافة البروتين الدهني منخفض المتعلقة مستقبلات 1 (LRP1) ومستقبلات البروتين الدهني المنخفض الكثافة (LDLR). صورة متحد البؤر من المكتب الإقليمي لبحثها امتصاص DiILDL، يجند فلوري من LDLR وللامتصاص من الفئران ترانسفيرين-CY3، يجند فلوري من العرض معدل الخصوبة الاجمالي منقط تلطيخ على سطح الخلية، مع بعض المجموعات في المنطقة محيط بالنواة. (B) وأضاف الفئران TF-CY3 إلى المقصورة العلوية التي تحتوي على المكتب الإقليمي أحادي الطبقة متباينة في 75، 150، 300، 600، 1،200، 2،400 و4،800 picomoles / إدراج لمدة 180 دقيقة في 37 درجة مئوية (200 ميكرولتر في المقصورة العلوية و1،200 ميكرولتر في مقصورة أقل). بعد هذا الوقت، وكان كميا CY3 مضان في الخلية المحللة (200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 0.1٪ تريتون X100) وانخفاض في المقصورة من خلال تحليل الفلور مع spectrofluorimeter مع الإثارة في 550 نانومتر، والانبعاثات في 570 نم. تم تحويل وحدات مضان في picomoles باستخدام مجموعة العمل الخطي. (C) للتجارب التشبع، وأضيف الفئران TF-CY3 إلى المقصورة العلوية التي تحتوي على أحادي الطبقة المكتب الإقليمي متباينة في 1،200 picomoles / إدراج لمدة 180 دقيقة في 37 درجة مئوية مع أو بدون 15 دقيقة قبل الحضانة مع 4،800 picomoles / إدراج تمويل الإرهاب غير الفلورسنت. وكان كميا النقل في الطبقة السفلى من المقصورة كما في (B) (ر اختبار الطالب، ف <0.05). تمت إضافة (D) DiILDL إلى المقصورة العلوية التي تحتوي على المكتب الإقليمي أحادي الطبقة متباينة في 1 و 2 و 4 و 8 مرشحات ميكروغرام / إدراج لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (200 ميكرولتر في المقصورة العلوية و1،200 ميكرولتر في أسفل المقصورة). بعد هذا الوقت، وكان كميا الجاذبة مضان في الخلية المحللة (200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 0.1٪ تريتون X100) وانخفاض في المقصورة من خلال تحليل الفلور مع spectrofluorimeter مع الإثارة في 554 نانومتر، والانبعاثات في 571 نانومتر. الفلوريةتحولت cence وحدة في ميكروغرام باستخدام مجموعة العمل الخطي. (E) لعرقلة نقل التجارب، تم إضافة أزيد الصوديوم 0.05٪ في 15 دقيقة قبل الحضانة من DiILDL في 2 ميكروغرام / إدراج لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وكان كميا النقل في الطبقة السفلى من المقصورة كما في (D) (ر اختبار الطالب، ف <0.05). وجرى تقييم حالة عدم وجود سمية أزيد الصوديوم الحضانة عند 0.05٪ من قبل بي (لي) قياس (لا تظهر البيانات). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8
الرقم 8. في المختبر نماذج BBB من الفئران الحبل الشوكي الخلايا البطانية أو من مخ الفأر. الجدول عاليةأضواء المعلمات هامة لاستخراج microvessel من الدماغ الفئران، الفئران الحبل الشوكي والدماغ الماوس. تظهر Photomicrographs المناعية للZO1 وoccludin في الطبقات الوحيدة الخلية البطانية أعدت من الدماغ الفئران، الفئران الحبل الشوكي والدماغ الماوس.

Discussion

وصفنا تنفيذ بروتوكول استنساخه الأسبوعية لعزل وطلاء من microvessels الدماغ، وبعد تنقية وثقافة المكتب الإقليمي وكذلك إعداد المشترك الثقافات مع الخلايا النجمية الفئران الأولية لإنشاء نموذج BBB في المختبر مع خصائص مميزة BBB.

إنشاء بنجاح موحدة في الثقافات BBB المختبر يتطلب الظروف المثلى في خطوات متعاقبة متعددة من العملية. كان (أ) نموذج الأمثل للحصول على أقل نفاذية paracellular، الذي لا يزال "الكأس المقدسة" في المختبر نماذج BBB، و (ب) التحقق من صحة لهروب رأس المال وآليات RMT.

إنتاج وتنقية وانتشار المكتب الإقليمي

التحدي الأكبر عندما زراعة المكتب الإقليمي هو لتحقيق التكاثر بين الثقافات المختلفة. توحيد بروتوكول يتطلب أدوات ذات جودة عالية لديسقسم والكواشف ذات جودة عالية واحترام تواريخ انتهاء الصلاحية كاشف. يحتاج المجرب لتكون ماهرة في تشريح الصغرى تحت stereomicroscope لإزالة السريع لالسحايا والأوعية كبيرة من سطح القشرة. مرة واحدة يتم عزل العقول وفصلها ميكانيكيا، واحدة من التحديات الرئيسية هي الهضم الأنزيمي الأمثل للmicrovessels الدماغ معزولة حديثا. نوع ونوعية الانزيمات تستخدم أمر بالغ الأهمية. تم استخدام مزيج من collagenases النوع الأول والثاني وdispase في تركيز عال مع تقلب منخفض بين دفعات. المهم أيضا هي مدة الهضم الأنزيمي والنسبة بين الوزن تركيز انزيم / الأنسجة / حجم الهضم. تم الحصول على أفضل عائد الإنتاج microvessel الدماغ مع ما يعادل قشرات الدماغ من 1 في 1 مل من collagenases / dispase خلط في 60 ميكروغرام / مل على حد سواء أثناء الهضم، على التوالي 30 دقيقة و 1 ساعة.

بالغ الأهمية أيضا هو القضاء على تلوث الخليةق (الخلايا النجمية وأساسا pericytes). تتكاثر هذه الخلايا بمعدل أعلى من الخلايا البطانية وليس إنشاء منعطفات ضيقة مع هذا الأخير، وبالتالي منع إقامة أحادي الطبقة خلية متجانسة مع حسن paracellular التقييد. بالنظر إلى أن الخلايا البطانية الدماغ تعبير عن مستويات أعلى بكثير من المضخات هروب رأس المال، وخاصة P-GP، مقارنة مع أنواع الخلايا الأخرى الموجودة في microvessels، فإنها تحمل أفضل التركيزات السامة إلا من ف سباق الجائزة الكبرى يجند المخدرات، في حين يتم التخلص من الخلايا غير البطانية. وأعقب العلاج بوروميسين في 4 ميكروغرام / مل لأول يومين قبل يومين عند 2 ميكروغرام / مل جيدة للحصول على نقاء الخلايا البطانية. يمكن هذا الاختيار أيضا لصالح الخلايا البطانية الشعرية مقابل تلك من الأوردة، والشرايين قبل شعري أو microvessels أكبر، وتؤدي إلى تشديد الطبقات الوحيدة. بالإضافة إلى ذلك، استخدام الفقراء مصل بقري المستمدة من البلازما أمر حتمي للحصول على ثقافات نقية من الخلايا البطانية 47،48. البلازما وديرمصل IVED يفتقر المستمدة من الصفائح الدموية عامل النمو (PDGF)، وهو مولد للتفتل لالليفية، لخلايا العضلات الملساء وبالتالي لpericytes.

لاحظنا أن العلاج من البلاستيك والفلاتر مع مزيج من نوع الكولاجين الرابع من الفئران والإنسان فبرونيكتين تعطي ميزة كبيرة، مع زيادة بنسبة 2 أضعاف العائد من انتشار بالمقارنة مع نوع الكولاجين أنا أوصى تقليديا من ذيل فأر. وتقدم العظة هامة لتكاثر الخلايا عن طريق المصفوفة خارج الخلية مثل إنتغرين وعامل النمو (bFGF) التنشيط 49. وقد وصفت تركيز العازلة والرقم الهيدروجيني للثقافة وسائل الإعلام للتأثير إيجابا على ضيق paracellular 50 و لاحظنا استنساخ أفضل بين الثقافات مع إضافة العازلة HEPES في 5 ملم.

التفريق بين المكتب الإقليمي: إنشاء المشارك الثقافة على إدراج الفلاتر

بمجرد ب الخلايا البطانية الدماغالتابعين تنقيته وتكاثرت لمدة 6 أيام، ويمكن مطلي على المرشحات. الطلاء الخلية في عالية الكثافة أمر بالغ الأهمية للحصول على أحادي الطبقة الكمال. وكان من كثافة البذر من 160x10 3 خلايا في 12 لوحة جيدا الفلاتر اللازمة والكافية للحصول على متكدسة أحادي الطبقة 24 ساعة بعد البذر. ومع ذلك، عزل الخلايا البطانية الشعرية الدماغ الأولية من بيئتهم مفارقة في بناء BBB في المختبر النموذجي كما أنه من المعروف أن الخلايا الأولية، والخلايا البطانية الشعرية وخاصة الدماغ، وينظم بقوة بيئتهم والعوامل التي تنتجها الاستقرائي مختلف أنواع الخلايا المحيطة. الخلايا البطانية الشعرية الدماغ مثقف وحده بسرعة إزالة التفريق وتفقد بعض علامات محددة البطانية الدماغ. وبالتالي، الخلايا البطانية الأولية ينبغي أن تستخدم في انخفاض مرور (P1) وإعادة توصيل، على الأقل جزئيا، مع بيئتهم من خلال ثقافة مشتركة مع الخلايا النجمية أو متوسطة مشروطة النجمية 47،51. هذا حاصلوتشارك ينطبق على تمايز نجمية كما الخلايا البطانية الدماغ والخلايا النجمية في اتجاهين الاستقراء. زراعة الخلايا النجمية مع المكتب الإقليمي أدى إلى تحريض قوية من TJ interendothelial 52،23. الآليات الجزيئية إعادة الاستقراء، لا تزال مجهولة إلى حد كبير، والبحث جار في العديد من المختبرات لتحديد العوامل المحددة التي يفرزها تحوير الخلايا النجمية، والتي يمكن أن تعزز الأمثل تمايز الخلايا البطانية 53،54. وقد تبين أن العوامل التي يفرزها الدماغ بما في ذلك الخلايا البطانية عامل اللوكيميا المثبطة (LIF) للحث على تمايز نجمي 55،56. قبل إنشاء ثقافة مشتركة، وتعرضوا لتمايز الخلايا النجمية المتوسطة التي تحتوي على مستقبلات ناهض الهيدروكورتيزون جلايكورتيكود، وشارك في الثقافة مكيفة المتوسط. ومن المعروف الهيدروكورتيزون لتحسين ضيق من الخلايا البطانية في الدماغ ويستخدم في نماذج BBB خاصة من الفئران 57 و الماوس 58،59 الخلايا البطانية. وميدي مكيفةيتم جمع أم من المقصورة السفلي من الخلية / نجمية نظام التعاون ثقافة البطانية بعد 3 أيام، وتجميدها لاستخدامها لاحقا. استخدام المتوسطة شارك في الثقافة مكيفة تخفيض وقت تمايز الخلايا البطانية إلى 3 أيام مع الأمثل نفاذية paracellular لمدة 2 ايام اخرى وتحسنت أيضا استنساخ بين الثقافات.

وعموما، فإن البروتوكول وصفنا تعطي طير استنساخه أكثر من 300 أوم · 2 سم ومتوسط ​​معامل نفاذية paracellular بي (لي) 0.26 ± 0.11 × 10 -3 سم / دقيقة، على غرار أفضل خلية مقرها النماذج الأولية BBB 22، 12. البروتوكول وصفنا في مخطوطة موجودة مع التشكيل المقترح للmicrovessel الأنزيمية الهضم يمكن أن تمتد إلى الخلايا البطانية من الفئران الحبل الشوكي و60 من الفئران الدماغ.

توصيف الجزيئية والوظيفية

بالإضافةلTJ الاستقراء، النجمية تسهم أيضا في التعبير عن النقل هروب رأس المال مثل P-GP في الخلايا البطانية الدماغ 61. وتبين لنا الواقع تعبير عن هروب رأس المال نقل P-GP في النموذج BBB ونحن لشرح قطبية ف سباق الجائزة الكبرى مضخة هروب رأس المال باستخدام نهج التعريب والكيمياء الحيوية، والنشاط P-GP باستخدام مقايسة وظيفية. تم الكشف عن GLT-1 التعبير في جزء من الغشاء القاعدي microvessels ولكن لم يتم الكشف في المكتب الإقليمي مثقف. نحن نفترض أن GLT-1 وينظم المكتب الإقليمي لأسفل في الثقافة لدينا مقارنة مع الظروف في الجسم الحي، وبالتالي لا يمكن كشفها بواسطة تحليل لطخة غربية. الغلوتامات الزائدة هي أعصاب والحية، GLT-1 هي المسؤولة عن الغلوتامات هروب رأس المال من المقصورة القاعدية (حمة) إلى حجرة القمي (الدورة الدموية). في الثقافات نجمية، لا يزال GLT-1 التعبير منخفضة للغاية والناجم عن إضافة الغلوتامات في المتوسط ​​62،63.

نحن أيضا أسيوطIRM التعبير عن نقل تدفق في الغشاء القمي مثل LRP1، LDLR ومعدل الخصوبة الاجمالي. وقد تجلى ظائف معدل الخصوبة الاجمالي وLDLR مع ملزمة والنقل تجارب TF-CY3 وDiLDL من اللمعية إلى الجانب مجافي اللمعة من أحادي الطبقة كما هو موضح سابقا مع الأبقار في المختبر BBB نموذج 64. ومن المثير للاهتمام، وقد تبين أن شرط الدهون من الخلايا النجمية يزيد من التعبير عن LDLR على الخلايا البطانية الشعرية الدماغ 65،66 مزيد من التأكيد على الحديث المتبادل بين الفسيولوجية النجمية والخلايا البطانية في الدماغ، بما في ذلك في المختبر. لقد اخترنا لتجسيد النقل مع مثل هذه الأصباغ الفلورية كما CY3 والجاذبة بالنظر إلى أن تحليل spectrofluorimetric هو متاح في معظم المختبرات، ويمكن أن تكون مفيدة للتحقق من صحة في المختبر نماذج BBB. ومع ذلك، الكمي لمضان هو أبعد ما يكون أقل حساسية من النشاط الإشعاعي ويتطلب زيادة في عدد من التجارب للحصول على بيانات هامة. من الناحية المثالية، وفريق العمل وLDL وعادة ما تكون رديولبلد (اليود 125) لمثل هذه التجارب ملزمة / الامتصاص والنقل.

وتبين لنا أيضا أن الخلايا البطانية أحادي الطبقة المتباينة التي تم الحصول عليها مع البروتوكول المقترح يستجيب لالتهاب الناجم عن TNF-α، كما يتضح من الإفراج CCL2 وBBB الافتتاح. CCL2 تشارك (MCP-1) وCCR2 مستقبله في أمراض الجهاز العصبي المركزي مثل التصلب المتعدد، والتهاب الدماغ والنخاع المناعة الذاتية التجريبية (EAE) 67، 68 CNS الصدمات والمعروفة باسم الوسطاء للهجرة الكريات البيض في الجهاز العصبي المركزي في ظل ظروف neuroinflammatory 69،70. مع بروتوكول اختبار، لا يمكننا أن نستنتج على إفراز الاستقطاب من CCL2 لأن BBB الافتتاح يسمح للتركيز CCL2 للتوازن بين كلا العليا (القمي) وانخفاض (القاعدية) المقصورات. وبالتالي، فإننا نقلل بوضوح مقدار CCL2 التي تنتجها المكتب الإقليمي في المقصورة القمي في 24 ساعة (الشكل 5A).

> نظرة عامة عامة والقيود من BBB في المختبر نماذج: أنا ن فيفو مقابل في المختبر والقوارض مقابل مقارنات الإنسان

العديد من الأدوية CNS الواعدة التي أثبتت فعاليتها في BBB مرور في المختبر فشلت في التجارب السريرية بسبب عدم القدرة على التنبؤ من نماذج في المختبر BBB غالبا ما تستند على خلايا معزولة عن الأنواع الأخرى من الإنسان. إلى حد علمنا، في المختبر نماذج BBB هي على الأرجح أكثر التنبؤية عندما يتعلق الأمر بدراسة الجوانب الميكانيكية للشبكات البروتين، ونقل الإشارة، ونقل المستقبلات. كل آلية، المسار أو الهدف لدراستها في المختبر لابد تتميز عن التنظيم من خلال العظة البيئية التكميلية (أنواع الخلايا الأخرى، والمواد الكيميائية والبروتينات)، والجمع بين لفي الدراسات الموقعية مع الأنواع الحيوانية نفس، وعندما يكون ذلك ممكنا، مع microvessels والخلايا البطانية المعزولة من البشر، مع القيود والحذر أثار أدناه.

في المختبر نماذج BBB يجب أن ينظر إليها على أنها أنظمة مستقلة، معزولة عن تنظيم الجسم، ولكن لا يزال هبوا الرئيسية في الجسم الحي خصائص وإمكانات التنظيم من قبل العظة البيئية. لا "مثالية" تم اقتراح نموذج في المختبر BBB بعد 71،72،73 لأن الطبقات الوحيدة الخلية البطانية تفتقر إلى عدد من المكونات الهامة للوحدة الوعائية العصبية الدبقية (NGVU) ويتم عزل من الدم وتنظيم الجسم. عدم وجود pericytes 74،16 أو 17،18 أو الخلايا العصبية المكونة مختلفة من المصفوفة خارج الخلية المستخدمة لطلاء من البلاستيك أو مستنبت والمصل المستخدمة في نمو الخلايا في الأكثر شيوعا و"أسهل تقدم" في المختبر نماذج BBB يعتمد على البطانية خلايا متباينة مع الخلايا النجمية قد تعدل بروتين تعبير طن مقارنة مع الوضع في الجسم الحي 75. هذه النماذج قد أعرب العديد من الناقلين عرضها في الجسم الحي، ولكن ليس كل شيء. في بعض الحالات، وتم التحقق من المعلمات النقل الأولى في microvessels معزولة (الأقرب إلى الوضع في الجسم الحي)، وبعد ذلك درس في أنظمة زراعة الخلايا 76،61.

وقد سمح البحوث البيولوجيا الجزيئية توصيف الجينات والبروتينات التعبير في microvessels معزولة ومنخفضة مرور البطانية مزارع الخلايا من نفس النوع، وبين الأنواع المختلفة، في معظم الأحيان من الحيوانات الصغيرة مثل القوارض (الفئران والجرذان) أو من البقر والخنازير في بالمقارنة مع البشر 77،78،75،15. وأظهرت المقارنة بين Transcriptomic في الجسم الحي والخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ المختبر العديد من النصوص الجينات التي تم وأعرب تفاضلي في معظم الأحيان downregulated بشكل ملحوظ في المختبر. النصوص ترميز نقل تدفق مثل معدل الخصوبة الاجمالي والعلاقات العامةوdownregulated oteins المتورطين في الاتجار حويصلة أساسا في الخلايا البطانية مثقف الدماغ، مما يشير إلى انخفاض عام في الإلتقام والنقل الحويصلي في مثل هذه الخلايا. التلاعب الثقافة من حيث النقاء (العلاج بوروميسين) والعلاج مع الهيدروكورتيزون قد يساعد على استعادة أكثر "في الجسم الحي مثل" التعبير الجيني الشخصي 77. كشفت الدراسات Transcriptomic أيضا اختلافات هامة بين الأنواع التي تزيد من تعقيد التوقعات على امتصاص الدواء في البشر على أساس القوارض في المختبر نماذج BBB 75. وقد وصفت في المختبر نماذج BBB تنطوي الثقافة المشارك للخلايا النجمية والبطانية الإنسان 15. على الرغم من أن ذات الصلة، وهذه النماذج هي أكثر صعوبة لتنفيذ على أساس منتظم لأنها تتطلب تنظيم الوصول إلى الأنسجة البشرية بعد الوفاة، وهناك عدم تجانس في جودة / خصائص الخلايا البطانية الدماغ البشري اعتمادا على العمر والأمراض، وربما الطبية المعاملهر من الجهات المانحة. الجهود يجب أن تبذل لتطوير نماذج جديدة في المختبر التي تتكاثر بشكل أفضل الفسيولوجية، التشريحية والخصائص الوظيفية لفي الجسم الحي BBB. الثقافات، تشترك الأنواع الثلاثة خلية مقيدة للغاية، ويبدو من الصعب تنفيذ بشكل روتيني. حتى الآن، والأكثر تعقيدا في المختبر نماذج BBB هي ديناميكية في المختبر نماذج (DIV-BBB) والتي تشمل تنظيم مثل السفينة مع الخلايا النجمية وتشمل تدفق المتوسطة الذي يحاكي تدفق الدم 75،79،80،81،82، 83،84،85. عندما تتعرض الخلايا البطانية الدماغي إلى التدفق، وإجهاد القص ولدت ينشط mechanotransducers على سطح الخلية، والتي تعدل التعبير عن الجينات المختلفة المشاركة في فسيولوجيا الخلية البطانية مثل انقسام الخلايا، والتمايز، والهجرة وموت الخلايا المبرمج 80. في الجسم الحي، إجهاد القص الناتجة عن تدفق الدم هي المسؤولة عن اعتقال الإنقسامية في الاتصال الخليوي، والذي يسمح بإنشاءأحادي الطبقة الخلايا البطانية في الأوعية الدموية 80. وأظهر التحليل الجيني والبروتين من الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري العادي تأثير إجهاد القص في BBB البطانية علم وظائف الأعضاء 84. إجهاد القص هو المسؤول عن بقاء الخلية، وعلى درجة أعلى من التصاق الخلايا البطانية، هروب رأس المال مضخة الاستقراء والاستقطاب أفضل للنقل 75، وتنظيم استقلاب الجلوكوز 75،86، والأكسدة بوساطة الإنزيمات CYP450 75 وتنظيم نفاذية paracellular عن طريق زيادة التعبير من الجينات ترميز لعناصر صلي بين الخلايا مثل occludin وZO-1 87،75،80 وبالتالي ارتفاع طير حوالي 1،500 - 2،000 أوم · سم والأقرب إلى المعروفة في الجسم الحي المعلمات 79،80

في صناعة التكنولوجيا الحيوية والمستحضرات الصيدلانية، بالتحري الروتيني للأدوية أو حتى عالية الإنتاجية الفرز (HTS) والجهود المبذولة للحد من التجارب على الحيوانات، أدتلتطوير خطوط مختلفة من الخلايا لاستخدامها في استبدال ثقافة الأولية من الخلايا البطانية الدماغي التي لا تزال أكثر صعوبة لانشاء روتيني. في معظم الحالات، و transduced الثقافات الأولية من الخلايا البطانية الدماغي مع الجينات تخليد (SV40 أو التورام الفيروس كبيرة T-مستضد أو اتش E1A)، إما عن طريق ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد أو عن طريق العدوى باستخدام ناقلات فيروسات 88،89،75. وقد وضعت العديد من خطوط الخلايا البطانية المنشأ الدماغي مثل RBE4، GP8/3.9، GPNT، RBEC1، TR-BBBS أو rBCEC4 خطوط الخلايا الفئران 88،75، خط خلية b.End3 الماوس 90،75، وPBMEC/C1 - 2 الخنزيري خط خلية 87،75، وخط الخلية البشرية hCMEC/D3 89،75. وتستند النماذج الأخرى على خلايا المنشأ غير الدماغي مثل مدين، داربي الكلى الكلاب (MDCK) أو خطوط الخلايا Caco2 12،75. بين مختلف خطوط الخلايا البطانية الدماغي الإنسان، وhCMEC/D3 تم الاستشهاد على نطاق واسعد وتحسين كنموذج للBBB منذ إنشائها في عام 2005 91،92. مثل الثقافات الأولية، وخطوط الخلايا مزايا وقيود الحاضر. أنها أسهل في التعامل معها من الثقافات الأولية، ولها فترة حياة طويلة، وتتميز بشكل جيد وتسمح استنساخ التجارب بين نطاق واسع. ومع ذلك، يمكن خطوط الخلايا تفقد وظائف الأنسجة محددة، وتفقد التنظيم البيئي والحصول على النمط الظاهري الجزيئية مختلفة تماما من الخلايا في الجسم الحي 75، 89. على وجه الخصوص، الطبقات الوحيدة الناتجة من خطوط الخلايا على أن يخفض ضيق، وانخفاض طير ونقل البيانات الشخصية تظهر التباين 75،89. وبالتالي التجارب على الحيوانات أو دراسات في الخلايا الأولية في كثير من الأحيان ويفضل على الرغم من تعقيدها إضافية.

Acknowledgments

ومن المسلم به الدعم المالي لVECT-حورس من فون الفريدة Interministériel (مشروع FUI / MEDUL) وVECT-حورس والمختبر UMR7259 من الوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR، TIMPAD، VECtoBrain، VEC2Brain، ADHOC والمشاريع التعاونية PREVENTAD) . كما يقر المختبر UMR7259 الدعم المالي من CNRS وإيكس مرسيليا من جامعة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubin, L. L., Staddon, J. M. The cell biology of the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 22, 11-28 (1999).
  2. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 5-23 (2005).
  3. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6, (8), 650-661 (2007).
  4. Pekny, M., Stanness, K. A., Eliasson, C., Betsholtz, C., Janigro, D. Impaired induction of blood-brain barrier properties in aortic endothelial cells by astrocytes from GFAP-deficient mice. Glia. 22, (4), 390-400 (1998).
  5. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J Appl Physiol. 100, (1), 328-335 (2006).
  6. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. J Neurochem. 54, (5), 1798-1801 (1990).
  7. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicol In Vitro. 22, (3), 799-811 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. Porcine brain microvessel endothelial cells as an in vitro model to predict in vivo blood-brain barrier permeability. Drug Metab Dispos. 34, (11), 1935-1943 (2006).
  9. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Res. 1521, 1-15 (2012).
  10. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  11. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochem Int. 54, (3-4), 253-263 (2009).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71, (1), 113-128 (2011).
  13. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab Invest. 85, (6), 734-746 (2005).
  14. Josserand, V., et al. Evaluation of drug penetration into the brain: a double study by in vivo imaging with positron emission tomography and using an in vitro model of the human blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 316, (1), 79-86 (2006).
  15. Lacombe, O., et al. In vitro primary human and animal cell-based blood-brain barrier models as a screening tool in drug discovery. Mol Pharm. 8, (3), 651-663 (2011).
  16. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cell Mol Neurobiol. 27, (6), 687-694 (2007).
  17. Lippmann, E. S., Weidenfeller, C., Svendsen, C. N., Shusta, E. V. Blood-brain barrier modeling with co-cultured neural progenitor cell-derived astrocytes and neurons. J Neurochem. 119, (3), 507-520 (2011).
  18. Xue, Q., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9, (2), 174-189 (2013).
  19. Sohet, F., Daneman, R. Genetic mouse models to study blood-brain barrier development and function. Fluids Barriers CNS. 10, (1), 3 (2013).
  20. Shayan, G., Choi, Y. S., Shusta, E. V., Shuler, M. L., Lee, K. H. Murine in vitro model of the blood-brain barrier for evaluating drug transport. Eur J Pharm Sci. 42, (1-2), 148-155 (2011).
  21. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev. 36, (2-3), 165-178 (1999).
  22. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25, (1), 59-127 (2005).
  23. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-1 (2007).
  24. Pardridge, W. M., Buciak, J. L., Friden, P. M. Selective transport of an anti-transferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 259, (1), 66-70 (1991).
  25. Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. J Neurochem. 53, (2), 340-345 (1989).
  26. Gosselet, F., Candela, P., Sevin, E., Berezowski, V., Cecchelli, R., Fenart, L. Transcriptional profiles of receptors and transporters involved in brain cholesterol homeostasis at the blood-brain barrier: use of an in vitro model. Brain Res. 1249, 34-42 (2009).
  27. Pardridge, W. M. Vector-mediated drug delivery to the brain. Adv Drug Deliv Rev. 36, (2-3), 299-321 (1999).
  28. Pardridge, W. M., Boado, R. J. Reengineering biopharmaceuticals for targeted delivery across the blood-brain barrier. Methods Enzymol. 503, 269-292 (2012).
  29. Boado, R. J., Lu, J. Z., Hui, E. K., Sumbria, R. K., Pardridge, W. M. Pharmacokinetics and brain uptake in the rhesus monkey of a fusion protein of arylsulfatase a and a monoclonal antibody against the human insulin receptor. Biotechnol Bioeng. 110, (5), 1456-1465 (2013).
  30. Ito, S., Ohtsuki, S., Terasaki, T. Functional characterization of the brain-to-blood efflux clearance of human amyloid-beta peptide (1-40) across the rat blood-brain barrier. Neurosci Res. 56, (3), 246-252 (2006).
  31. Demeule, M., et al. Identification and design of peptides as a new drug delivery system for the brain. J Pharmacol Exp Ther. 324, (3), 1064-1072 (2008).
  32. Yamada, K., et al. The low density lipoprotein receptor-related protein 1 mediates uptake of amyloid beta peptides in an in vitro model of the blood-brain barrier cells. J Biol Chem. 283, (50), 34554-34562 (2008).
  33. Gabathuler, R. New protein vectors for physiological transfer of therapeutic agents to the central nervous system. Biol Aujourdhui. 206, (3), 191-203 (2012).
  34. Malcor, J. D., et al. Chemical optimization of new ligands of the low-density lipoprotein receptor as potential vectors for central nervous system targeting. J Med Chem. 55, (5), 2227-2241 (2012).
  35. Wang, D., et al. Engineering a lysosomal enzyme with a derivative of receptor-binding domain of apoE enables delivery across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (8), 2999-3004 (2013).
  36. Spencer, B. J., Verma, I. M. Targeted delivery of proteins across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, (18), 7594-7599 (2007).
  37. Kreuter, J., et al. Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier. J Drug Target. 10, (4), 317-325 (2002).
  38. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Brain endothelial cell-cell junctions: how to 'open' the blood brain barrier. Curr Neuropharmacol. 6, (3), 179-192 (2008).
  39. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68, (5), 311-323 (2002).
  40. Stephan, D., et al. TWEAK/Fn14 pathway modulates properties of a human microvascular endothelial cell model of blood brain barrier. J Neuroinflammation. 10, (9), (2013).
  41. Descamps, L., Cecchelli, R., Torpier, G. Effects of tumor necrosis factor on receptor-mediated endocytosis and barrier functions of bovine brain capillary endothelial cell monolayers. J Neuroimmunol. 74, (1-2), 173-184 (1997).
  42. Miller, F., et al. The MAP kinase pathway mediates transcytosis induced by TNF-alpha in an in vitro blood-brain barrier model. Eur J Neurosci. 22, (4), 835-844 (2005).
  43. Fillebeen, C., Dehouck, B., Benaïssa, M., Dhennin-Duthille, I., Cecchelli, R., Pierce, A. Tumor necrosis factor-alpha increases lactoferrin transcytosis through the blood-brain barrier. J Neurochem. 73, (6), 2491-2500 (1999).
  44. Zhang, Y., Schuetz, J. D., Elmquist, W. F., Miller, D. W. Plasma membrane localization of multidrug resistance-associated protein homologs in brain capillary endothelial cells. J Pharmacol Exp Ther. 311, (2), 449-455 (2004).
  45. Kane, R. L., Martínez-López, I., DeJoseph, M. R., Viña, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters (EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. A mechanism for glutamate removal. J Biol Chem. 274, (45), 31891-31895 (1999).
  46. Kannan, R., Mittur, A., Bao, Y., Tsuruo, T., Kaplowitz, N. GSH transport in immortalized mouse brain endothelial cells: evidence for apical localization of a sodium-dependent GSH transporter. J Neurochem. 73, (1), 390-399 (1999).
  47. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103, (1), 23-37 (1992).
  48. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, (2), 279-289 (2005).
  49. Tsou, R., Isik, F. F. Integrin activation is required for VEGF and FGF receptor protein presence on human microvascular endothelial cells. Mol Cell Biochem. 224, (1-2), 81-89 (2001).
  50. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. AAPS J. 12, (4), 759-770 (2010).
  51. Rubin, L. L., Sanes, J. R. Neuronal and glial cell biology. Curr Opin Neurobiol. 6, (5), 573-575 (1996).
  52. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, (1), 41-53 (2006).
  53. Deracinois, B., et al. Glial-cell-mediated re-induction of the blood-brain barrier phenotype in brain capillary endothelial cells: a differential gel electrophoresis study. Proteomics. 13, (7), 1185-1199 (2013).
  54. Haseloff, R. F., Blasig, I. E., Bauer, H. C., Bauer, H. In search of the astrocytic factor(s) modulating blood-brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 25, (1), 25-39 (2005).
  55. Mi, H., Haeberle, H., Barres, B. A. Induction of astrocyte differentiation by endothelial cells. J Neurosci. 21, (5), 1538-1547 (2001).
  56. Abbott, N. J. Astrocyte endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. J. Anat. 200, (6), 629-638 (2002).
  57. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. J Neurochem. 97, (4), 922-933 (2006).
  58. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).
  59. Förster, C., Waschke, J., Burek, M., Leers, J., Drenckhahn, D. Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific. J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).
  60. Ge, S., Pachter, J. S. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine spinal cord. J Neuroimmunol. 177, (1-2), 209-214 (2006).
  61. Berezowski, V., Landry, C., Dehouck, M. P., Cecchelli, R., Fenart, L. Contribution of glial cells and pericytes to the mRNA profiles of P-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins in an in vitro model of the blood-brain barrier. Brain Res. 1018, (1), 1-9 (2004).
  62. Duan, S., Anderson, C. M., Stein, B. A., Swanson, R. A. Glutamate induces rapid upregulation of astrocyte glutamate transport and cell-surface expression of GLAST. J Neurosci. 19, (23), 10193-10200 (1999).
  63. Gegelashvili, G., Dehnes, Y., Danbolt, N. C., Schousboe, A. The high-affinity glutamate transporters GLT1, GLAST, and EAAT4 are regulated via different signalling mechanisms. Neurochem Int. 37, (2-3), 163-170 (2000).
  64. Candela, P., et al. Physiological pathway for low-density lipoproteins across the blood-brain barrier: transcytosis through brain capillary endothelial cells in vitro. Endothelium. 15, (5-6), 254-264 (2008).
  65. Dehouck, B., Dehouck, M. P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Upregulation of the low density lipoprotein receptor at the blood-brain barrier: intercommunications between brain capillary endothelial cells and astrocytes. J Cell Biol. 126, (2), 465-473 (1994).
  66. Dehouck, B., Fenart, L., Dehouck, M. P., Pierce, A., Torpier, G., Cecchelli, R. A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the blood-brain barrier. J Cell Biol. 138, (4), 877-889 (1997).
  67. Mahad, D. J., Ransohoff, R. M. The role of MCP-1 (CCL2) and CCR2 in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Semin Immunol. 15, (1), 23-32 (2003).
  68. Glabinski, A. R., Ransohoff, R. M. Chemokines and chemokine receptors in CNS pathology. J Neurovirol. 5, (1), 3-12 (1999).
  69. Stamatovic, S. M., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 regulation of blood-brain barrier permeability. J Cereb Blood Flow Metab. 25, (5), 593-606 (2005).
  70. Semple, B. D., Kossmann, T., Morganti-Kossmann, M. C. Role of chemokines in CNS health and pathology: a focus on the CCL2/CCR2 and CXCL8/CXCR2 networks. J Cereb Blood Flow Metab. 30, (3), 459-473 (2010).
  71. Veszelka, S., Nakagawa, S., Niwa, M., Deli, M. A. Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery. Recent Pat CNS Drug Discov. 6, (2), 107-118 (2011).
  72. Patabendige, A. The value of in vitro models of the blood-brain barrier and their uses. Altern Lab Anim. 40, (6), 335-338 (2012).
  73. Ogunshola, O. O. In vitro modeling of the blood-brain barrier: simplicity versus complexity. Curr Pharm Des. 17, (26), 2755-2761 (2011).
  74. Vandenhaute, E., et al. Modelling the neurovascular unit and the blood-brain barrier with the unique function of pericytes. Curr Neurovasc Res. 8, (4), 258-269 (2011).
  75. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 14, (1), 120-136 (2013).
  76. Vernon, H., Clark, K., Bressler, J. P. In vitro models to study the blood brain barrier. Methods Mol Biol. 758, 153-168 (2011).
  77. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 28, (1), 135-148 (2008).
  78. Uchida, Y., Ohtsuki, S., Kamiie, J., Terasaki, T. Blood-brain barrier (BBB) pharmacoproteomics: reconstruction of in vivo brain distribution of 11 P-glycoprotein substrates based on the BBB transporter protein concentration, in vitro intrinsic transport activity, and unbound fraction in plasma and brain in mice. J Pharmacol Exp Ther. 339, (2), 579-588 (2011).
  79. Cucullo, L., Aumayr, B., Rapp, E., Janigro, D. Drug delivery and in vitro models of the blood-brain barrier. Curr Opin Drug Discov Devel. 8, (1), 89-99 (2005).
  80. Naik, P., Cucullo, L. In vitro blood-brain barrier models: current and perspective technologies. J Pharm Sci. 101, (4), 1337-1354 (2012).
  81. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10, (18), 3725-3731 (1999).
  82. Santaguida, S., et al. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109, (1), 1-13 (2006).
  83. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31, (2), 767-777 (2011).
  84. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, M., Marchi, V., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, (40), (2011).
  85. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. (2013).
  86. Qutub, A. A., Hunt, C. A. Glucose transport to the brain: a systems model. Brain Res Brain Res Rev. 49, (3), 595-617 (2005).
  87. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125, (1), 127-141 (2006).
  88. Roux, F., Couraud, P. O. Rat brain endothelial cell lines for the study of blood-brain barrier permeability and transport functions. Cell Mol Neurobiol. 25, (1), 41-58 (2005).
  89. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, (13), 1872-1874 (2005).
  90. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990, (1-2), 995-112 (2003).
  91. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10, (1), (2013).
  92. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J Cereb Blood Flow Metab. 28, (2), 312-328 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics