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1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Medicine
 

Summary

本研究的目的是要验证的体外血脑屏障模型涉及的大鼠同源内皮细胞和星形胶质细胞的共培养物的再现性。内皮细胞单层呈现高跨膜电阻和低LY渗透性。具体TJ蛋白的表达,功能反应,炎症和运输者和受体的功能进行了评估。

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Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

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Abstract

血脑屏障(BBB)的具体规定血液和神经组织之间的分子和细胞通量。我们的目标是开发和使用特性原代大鼠脑血管内皮细胞(RBEC)的共培养和星形胶质细胞,研究涉及跨内皮细胞单层transcytosis的受体具有高度重复性的大鼠同基因血脑屏障体外模型。星形胶质细胞是由机械清扫下面的胰蛋白酶消化分离和被冻结后共培养。 RBEC从5周龄的大鼠皮层分离。大脑进行清洗脑膜及白质和机械分离下列酶消化。此后,将组织匀浆离心中的牛血清白蛋白从神经组织中分离容器的片段。血管片段从它们的细胞外基质进行了第二次酶消化以释放的内皮细胞。剩余的污染细胞如周细胞中further通过电镀的微血管片段中含有嘌呤霉素培养基中消除。然后将它们传代到过滤器共培养生长在孔的底部的星形胶质细胞。 RBEC高表达紧密连接(TJ)蛋白如occludin的,claudin-5的和ZO-1具有典型的定位在单元格边框。该跨内皮电阻脑内皮细胞单层的(TEER),表示TJS的松紧度达到300欧姆·厘米2的平均水平。内皮渗透性系数(PE)对荧光黄(LY)是平均为0.26±0.11×10 -3厘米/分钟高度重复性。组织单层脑血管内皮细胞所表达的流出转运蛋白P-糖蛋白(P-gp)的,表明若丹明123,配体为P-gp的偏振传输,并表现出转铁Cy3和DiILDL的特定运输穿过内皮细胞单层。总之,我们提供了一个协议,用于建立体外BBB模型,是由于质量保证方法高重现性,并且适合在BBB转运和受体的研究。

Introduction

开发用于治疗中枢神经系统(CNS)许多药物疾病都无法达到治疗浓度有关脑实质。血脑屏障保护脑的神经组织从血浆成分的波动,从致病剂,以及通过限制离子,肽,蛋白质,甚至细胞的非特异性的磁通流入和流出的大脑1保持大脑软组织的动态平衡。

BBB特性诱导和维持由专门的类脑微血管内皮细胞和神经胶质细胞 - 血管单元的相邻单元(NGVU)如神经细胞之间的紧密接近度和串扰,神经胶质细胞(更精确的星形胶质细胞最终英尺),和周细胞ensheathed在基底膜主要由IV型胶原,纤连蛋白,层粘连蛋白和蛋白聚糖2,3。周细胞覆盖约22 - 内皮的32%在毛细血管水平,发挥了重要中的内皮细胞增殖,血管生成和炎性过程的调控作用。内皮细胞形成连续片材覆盖在毛细管的内表面上。它们是由TJS,形成了带状的结构在心尖区并且有助于细胞极化互连。星形胶质细胞调节BBB属性,并且是重要的调节因子如TGF-β,GDNF,bFGF和IL-6的来源。星形胶质细胞短少在与GFAP功能不全不能调节血脑屏障特性4。神经元不直接参与结构在血脑屏障的形成还能调节蛋白的表达和血脑屏障功能5的重要方面。

为了进一步研究血脑屏障的结构,生理和病理,血脑屏障体外模型被开发作为研究工具。脑血管内皮细胞,乃摘录自不同物种体外 BBB模型,实现基于从牛6,7低传原代培养,猪8,9,10,11,12大鼠,小鼠和13也是人类14,15。这些模型是已知的,以模仿体内血脑屏障,特别是当共培养的大鼠或小鼠和/或周细胞16,12胶质细胞和/或神经祖细胞衍生的星形胶质细胞17和/或神经元18。在“在实验室”模型通常由鼠类产生的,因为它们允许在体外 / 体内实验和比较和/或从转基因模型19产生的脑血管内皮细胞的研究。

新研制的体外血脑屏障模型也被用于帮助预测潜在的中枢神经系统的候选药物之前, 体内试验15,20,21,3,6,22,11,23的脑摄取。 体外 BBB模型通常用于比较i)称为渗透到中枢神经系统或L:药物与运输超重穿过BBB和无中枢作用的渗透性,以及ii)在同一物种的动物模型中测定的相同药物的表观PE。这很容易通过血脑屏障的药物大多是亲脂性和脂质介导的自由扩散(咖啡因,卡马西平等)穿越脑血管内皮细胞膜。负运送药物,如地高辛,维拉帕米或环孢菌素A正在积极通过挤压脑内皮转运蛋白如P-gp的。然而,许多新开发的治疗性分子是生物药物,如重组蛋白,siRNAs的或单克隆抗体。他们中的大多数不跨越血脑屏障由于:i)并无特定转运,细胞和内皮细胞,从而防止超高分子量分子的经历旁通道ii)本紧凑层。有了这些限制,“特洛伊木马”战略已经使用向量(抗体,多肽)与已知受体在BBB级,涉及我实现Ñ​​受体介导的运输或转作用(RMT),如转铁蛋白(Tf)受体(TFR),胰岛素受体(IR)或低密度脂蛋白受体(LDLR)相关的受体家族(低密度脂蛋白受体,LRP11)的成员。这种受体被发现对离体脑毛细血管和血脑屏障体内 24,25。这些受体表达谱,特别是那些在LDLR家族,进行了分析和脑血管内皮细胞和脑血管内皮细胞共培养的星形胶质细胞或在脑毛细血管后直接其提取从脑26之间进行比较。 Pardridge 24打开该字段与OX-26抗体对运铁蛋白受体(TFR),其次是抗胰岛素受体 ​​和胰岛素生长因子受体27,28。有了这些基础的抗体载体,ArmaGen技术开发了血脑屏障的分子木马的平台技术,提供药物,包括蛋白质,跨越血脑屏障29。该文学是丰富的数​​据显示,在脑血管内皮细胞LRP1表达及其作为一个功能强大的内吞/清道夫受体的作用。 Western blot分析表明,LRP1表现在分数富含脑毛细血管和大鼠脑微血管内皮细胞30。公司如Angiochem目标LRP1与抑肽酶衍生肽的载体,促进有效的药物涌入跨越血脑屏障31。然而,LRP11也参与了Aβ的主动转运和外排/间隙从脑实质血32。取决于它的配体,例如数据涉及LRP1在穿过BBB的双向传输。 biOasis使用蛋白melanotransferrin生物制剂,如溶酶体酶和抗体穿过血脑屏障33的运输,而VECT-HORUS发展为目标的低密度脂蛋白受体34肽载体开发的创见技术。有数据表明,该LRP和LDLR可以用来输送差异erent分子如溶酶体酶35,36或纳米颗粒复合物穿过BBB 37。

我们感兴趣的领域是利用载体分子和矢量药物候选中枢神经系统疾病的治疗药物输送到中枢神经系统。特别地,穿过BBB的药物递送,必须神经炎症,一个可在其范围变化过程的上下文中考虑的,但是这可能是共同的所有CNS损伤和疾病,包括脑炎,多发性硬化,阿尔茨海默氏病等神经炎症是伴有炎症的血脑屏障和潜在的变化血脑屏障生理和通透性考虑到旁和跨细胞的运输可以在病理条件下38,39,40,41,42,43被放大。例如,TNF-α,TWEAK,和其它细胞因子调节炎症反应,并用体外 BBB模型实验已经表明,他们可以改变次的细胞旁属性ë内皮细胞单层38,39,40和TNF-α也导致增加的LDL 41的跨细胞转运,holotransferrin 42和乳铁蛋白43。

我们的目标是开发和描绘的优化,并使用共同的文化原发性脑血管内皮细胞和星形胶质细胞的高度重复性的同基因大鼠血脑屏障模型。我们分别用了5周龄和新生儿Wistar大鼠脑血管内皮细胞的生产和星形胶质细胞的生产。一个挑战是建立一个协议,允许生产的“周刊重现的「BBB模型。为了达到这一目标,在每周的固定日子进行生产协议的每一步,从脑微血管生产的第一周周三开始。解剖是在近3年来几乎每个星期进行。为了进一步提高对文化的重现性,质量保证体系的建立。所有reagenTS和化学品数据库(入境之日起,股票,到期期限等)进行引用。

下面的一些标准,如内皮细胞组织和纯洁的模型进行了表征,TEER,LY透气性,响应亲消炎药,TJ蛋白定性和定量表达,转运蛋白如P-gp的功能,和受体参与跨内皮细胞单层,如铁蛋白或低密度脂蛋白受体胞转作用。

Protocol

1,生产鼠星形胶质细胞

对于每个准备使用,不论男女,10新生Wistar大鼠。

  1. 通过切割头有一对剪刀和在层流罩在干燥的培养皿马上转移他们处死大鼠。从头骨取出大脑没有小脑和立即传送它们到含有冷夹层缓冲培养皿:HBSS中补充有1%牛血清白蛋白(BSA的内毒素水平低),青霉素100单位/ ml链霉素和100微克/毫升。
  2. 切开大脑的一半,分开2大脑半球,并将它们转移到一个干净的培养皿上冰夹层缓冲。切视神经和除去在立体显微镜下的脑膜。
  3. 在50毫升冷夹层缓冲液洗广泛的皮质碎片。
  4. 将皮质碎片从3到大脑15毫升猎鹰管和移液器向上和向下分离政变的乐与10ml的一次性吸配备有蓝色尖端插入6毫升胰蛋白酶0.05%的倍 - EDTA 5分钟,0.02%,在37℃下
  5. 加24毫升的DMEM补充有10%FBS和下面的抗生素,青霉素100单位/ ml链霉素和100微克/毫升,命名为神经胶质细胞介质(GCM)一个媒体和离心机在300×g离心5分钟,在室温。 FBS批次被选定和确认为星形胶质细胞cutures的生长和存活。
  6. 重悬在含有分离的细胞在10毫升GCM和板成75 厘米的T-烧瓶中(T75)沉淀。改变介质翌日以除去细胞碎片和DNA。每周更换培养基的两倍。
  7. 1周增殖后,轻轻摇动胶质细胞在60转期间24小时轨道摇床37℃的GCM。如果T75不能被放置在恒温箱中,用5%CO 2/95%空气中于37℃潮湿气氛中,补充媒体用5mM HEPES。洗涤细胞两次对r的eMove非粘附的小胶质细胞。
  8. 播种三周后,用DPBS冲洗两次,在细胞没有钙和镁。加入3毫升温胰蛋白酶0.05%EDTA的0.02%,在37°C和等待,直到细胞层分散(通常为5分钟)。抑制胰蛋白酶活性通过加入10ml GCM的,在120×g离心8分钟将细胞悬浮液转移入15ml Falcon管中,并离心分离。
  9. 重悬沉淀星形胶质细胞在90%FBS - 10%DMSO中,将其转移到冷冻管(2×10 6每离心管细胞),并存储在液氮中。

大鼠脑微血管2。隔离

我们的实验过程由马赛医学院伦理委员会批准,并符合国家和欧洲法规(欧盟指令第86/609)。所做的一切努力,以尽量减少动物的痛苦,并减少使用动物的数量。

  1. 对于每个准备和一个experimenteR,可使用3家周龄Wistar大鼠。
  2. 第一周的周一,准备2 T75烧瓶用IV型胶原和纤连蛋白涂覆,无论是在1微克/厘米2在无菌培养水(每T75 10ml)中。让坚持在37°C,直到微血管播种。
  3. 周三上午的第一周,安乐死增加焊剂的CO 2下的大鼠诱发睡意,姿势和呼吸中断的损失,然后是颈椎脱位。喷洒头,用70%的乙醇。切头有一对剪刀和在层流罩将它们转移到一个干燥的培养皿中。
  4. 从头骨取出大脑没有小脑和视神经,然后将它们转移到培养皿中,在冰上冷却,并填充有冷剥离缓冲液(HBSS,补充有1%BSA,青霉素100单位/ ml和链霉素100微克/毫升) 。
  5. 切开大脑一半的2大脑半球及脑分开的距离分开ebrain。转让前脑到一个干净的培养皿上冰夹层缓冲。
  6. 需要几个半球在一个新的培养皿冷夹层缓冲来自前脑下,与N°5弯钳体视显微镜仔细去除脑膜。然后,清理大脑的内部去除髓鞘的羽绒被,并取得皮质外壳。这些步骤不应该超过2小时的组织保存和细胞的存活。
  7. 10上下冲程分别与2杵不同间隙,71微米其次是20微米分离的3大脑皮质成一个7毫升Dounce匀浆6毫升冷夹层缓冲。
  8. 划分悬浮取得1皮质在1ml的50ml Falcon管中,离心以1,000×g离心5分钟,在室温的等价物。弃上清。
  9. 从1皮质用1毫升含胶原酶/分散酶的混合物(60微克/毫升R一种酶溶液消化停牌11; 0.3单位/毫升),DNA酶I型(35微克/毫升 - 20的K单位/ ml)和庆大霉素(50微克/毫升),在摇床上30分钟,在37°C。
  10. 混合1毫升从1皮质消化,用10ml 25%BSA / HBSS中的1X和单独由密度依赖性离心3600×g离心15分钟,在RT。小心地将上盘(髓磷脂和脑实质),将上清液转移到50 mL的干净猎鹰管和重复离心。保持含有脑微血管在4℃下将所得沉淀
  11. 小心弃去上部盘和上清液。含悬浮脑微血管用1毫升冷的HBSS 1X两种所得的颗粒和转移到50 mL的干净猎鹰管。
  12. 通过加入20毫升冷HBSS的1X和离心机在1000×g离心5分钟,洗微血管。弃上清。
  13. 进一步消化微血管从1皮质用1ml相同的酶溶液作为一个sh在期间1小时步骤2.9中所述在37℃下阿克尔。
  14. 然后,从各3皮质混合消化的微血管成一管,并进一步分离成两50毫升Falcon管中,得到的微血管从每管一个半(1.5)皮质的等效萃取。加入30毫升冷剥离缓冲液和离心机在1000×g离心5分钟,在室温。
  15. 重悬微血管沉淀在10ml的DMEM/F12的补充有20%牛贫血小板血浆来源的血清,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,2纳克/毫升),肝素(100微克/毫升),庆大霉素(50微克/毫升)和HEPES(2.5毫摩尔),命名为内皮细胞培养基(ECM)的补充有嘌呤霉素在4微克/毫升。
  16. 就拿从孵化器中的2涂T75瓶,吸出多余的涂层和板从每管微血管在一个T75瓶(微血管每T75瓶1.5皮质中提取)。

3,净化RBEC Primocultures和扩散

  1. 净化:周三至周五,加purom霉素在4微克/毫升的培养介质。改变上周四的媒介。上周五,洗涤细胞,加入嘌呤霉素在2微克/毫升到星期一。
  2. 扩散:在第二周的周一,洗涤细胞,并添加胰岛素,转铁蛋白和亚硒酸钠补充培养基直到培养达到90%汇合在第二周的星期三。

4,差异化:设置在体外 BBB模型

  1. 第二周的周一,由双方在0.5μg/cm2在无菌培养与水IV型胶原和纤维连接蛋白的混合涂料(500微升组合在上格准备过滤器(聚乙烯,12孔,孔径1.0微米)和1.5毫升的无菌培养的水在下部隔室)。让坚持在37°C,直到RBEC播种。
  2. 第二周的周一,建立了联合培养的前五天,从解冻的冷冻管星形胶质细胞在37℃和转让在一个15毫升的猎鹰用10ml GCM。离心悬浮液,在120×g下在室温下8分钟。
  3. 重悬在GCM和板中的星形胶质细胞沉淀以每厘米2 30×10 3细胞在12孔板的密度。
  4. 第二周的星期三,只是RBEC的离解,用胰蛋白酶之前,用DMEM/F12培养基洗预涂过滤两次。预填充室与ECM:1.5 ml于下格和0.5ml在上格。
  5. 第二周的周三,用DPBS洗两次RBEC没有钙和镁。加4毫升温胰蛋白酶0.05% - EDTA 0.02%,报在30秒每完全相同的T75瓶中37℃的解决方案。然后取下将3.5毫升胰蛋白酶溶液,并在显微镜下观察。当细胞层开始从基体分离,帮助他们通过轻轻敲击T75瓶的边缘,直到所有的细胞是浮动的。
  6. 添加9毫升每T75瓶中的ECM和转移到15毫升猎鹰管。轻轻分离细胞悬浮液通过上下吹打用10毫升吸管装有黄色尖端4次(避免气泡在溶液中的制作)。计数细胞的悬浮液(约3×10 6 cells/T75),并立即镀上预涂和预填充的过滤器以高密度(160×10 3个细胞/过滤器,因此约18 filters/T75)( 图8中 )。翌日(星期四),改变上部隔室的介质两次以除去细胞碎片。
  7. 第二周的星期四,建立共培养的前一天,通过1.5毫升分化培养基(ECM与氢化可的松以500nM),可与从基室1/3的条件培养基进行补充更换星形胶质细胞的培养基先前的一项(内皮细胞和星形胶质细胞之间的接触3天)共培养。
  8. 第二周的星期五被定义为分化为0天;从过滤器CONTA更换培养基伊宁与分化培养基的RBEC。转移RBEC过滤器到包含星形胶质细胞的水井。在这些条件下, 在体外模型区分并在3天内表达结相关的蛋白质。
  9. 该机型在3天以上,第三周的星期一和星期三之间保持最佳的分化。

Representative Results

生产协议
该协议可分为3个阶段对应于主要变化在培养基组成:(1)纯化的微血管内皮细胞,(B)的增殖,以及(c)在过滤器上的分化(12孔聚乙烯板具有的孔隙率1微米)在共培养的星形胶质细胞。的不同步骤的生产协议被分配给一周中的特定天中以增加的原代细胞培养的再现性( 图1)。在第一周的周三,建立共培养体系,因此前9天,微血管分离( 图2A)。以纯化的内皮细胞,将培养物保持在降低嘌呤霉素的浓度,连续5天的存在。最污染的细胞(主要是周细胞)被淘汰和内皮细胞的生长较慢无其表型的修饰。主轴-Shaped细胞生长出的毛细片段从大鼠脑灰质( 图2B)中分离的。在第二周的周一,大鼠星形胶质细胞铺于12孔板的底部。星期三,RBEC加入到过滤器的腔室中。高密度接种于160×10 3个细胞/ cm 2( 图2C),有助于避免间隙在所述过滤器( 图2D)的外周,并生成内皮细胞单层的均匀分化。细胞显示典型的细长梭形形态,纵向对齐,并形成均匀的单层。周四,星形胶质细胞的培养基条件与以前的共培养培养基( 图2E)的分化培养基更换。周五,RBEC上筛选生长在含有500nM的可的松培养基和过滤器转移至含有星形胶质细胞的12孔板中。在第三周,实验瓦特ERE周一和周三之间进行。

RBEC表征及单层通透性的要素的确定
该RBEC进行了表征内皮和BBB标记的免疫染色,以及通过TEER,渗透性LY和流出转运蛋白如P-糖蛋白的功能的测量。

RBEC获得的嘌呤霉素的纯化方法( 图12)生长在非重叠的连续单层即表现出生长抑制汇合并显示紧紧apposed,梭形和纺锤形的形态。 RBEC文化表达的血管内皮细胞的典型标志:他们表现出阳性表达血小板内皮细胞粘附分子( 图3A; CD31/PECAM)和血管性血友病因子( 图3B)的表达。无嘌呤霉素治疗,RBECs正在迅速由结蛋白immunos检测周细胞侵泰宁( 图3C)。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)由星形胶质细胞( 图3D)表示的是星形胶质细胞的一个重要分化标志物。高通道数,星形胶质细胞失去它们诱导的内皮细胞的分化能力。出于这个原因,星形胶质细胞培养物标准化为他们的培养时间与只接受了一个通路。

培养RBEC用补充了氢化可的松媒体,接着共培养的星形胶质细胞,并与从先前的共培养物的下部隔室的条件培养基导致了强感应interendothelial TJS的相比于单独RBEC培养。该细胞表达紧密连接蛋白-5,ZO-1和occludin的蛋白,其主要定位在细胞-细胞连接,如图所示通过免疫荧光( 图4B-D)和免疫印迹分析为ZO-1和occludin的蛋白( 图4E显示)。形态分布位于c埃尔 - 细胞接触的拉链状结构反映了单层的(a)该气密性,(b)该毛细血管内皮细胞的脑由来,以及(c)是高度分化的脑血管内皮细胞的特征。内皮细胞层的细胞旁通透性是由从上测量TEER和LY(457大)的流入率,过滤器的下格监控。使用ENDOHM-12为连接到一个EVOM voltohmmeter12毫米培养杯TEER测定。脑内皮细胞单层的TEER,表明TJS的松紧度达到300欧姆·厘米2,平均(12孔板的过滤器,数据未显示)。在PE为LY(PE(LY),用作屏障和共同孵育试验化合物的完整性控制)达到在1年期间的平均0.26±0.11×10 -3厘米/分钟( 图4F)。

为了诱导RBEC炎症,我们使用了公关邻 - 炎症性细胞因子TNF-α在5毫微克/毫升为24小时,并随后在培养系统,该系统由120毫微克/毫升(非一倍的上部隔室测定的CCL2(MCP-1)的分泌由RBEC的炎症反应处理的对照)到250纳克/毫升( 图5A)。 TNF-α治疗在5毫微克/毫升或50 ng / ml的24小时也打开血脑屏障所揭示的PE(LY)测量( 图5B)。

P-gp的是可视化的差异化RBEC免疫细胞化学( 图6A)。 P-糖蛋白的定位是已知的高度偏振和在内皮细胞中44的顶膜表达基本上同时谷氨酸转运体1(GLT-1)主要存在于基底外侧部分45。为了评估偏振我们的培养RBEC的程度,顶端和基底外侧的蛋白用蔗糖密度从质膜制剂中分离梯度46。 Western blot分析是进行评估的P-gp和GLT-1的血浆中的表达水平,顶和底膜制剂。微血管从大鼠脑新鲜提取被用作最近的阳性对照,以这些蛋白质的体内分布( 图6B)。在这两种微血管和差异化RBEC膜制剂,P-gp的表达为170 kDa的乐队,主要定位于F1的顶膜部分( 图6B,C)。 GLT-1的表达确实表达于微血管为65-70 kDa的带的F3基底膜组分,但在培养RBEC没有被检测到。

在平行实验中,P-糖蛋白在内皮细胞单层的功能活性使用罗丹明123(R123)作为配体进行了测试。管腔(B到A)R123的流出腔外比在相反方向上( 图6D)的1.7倍。为了证明P-gp的参与,我们用具体的P-gp抑制剂,verapamiL(25微米,30分钟预孵育)和环孢素A(1微米,30分钟预孵育)。维拉帕米和环孢素治疗,R123积累在RBEC增加1.6倍和2倍,分别比未处理的对照( 图6E)。

受体参与受体介导的胞吞转运作用(RMT)机制
该模型被进一步特征为不同的受体可能参与胞转机制在血脑屏障,如LRP1,LDLR或铁蛋白( 图7A)的表达。

功能性运输研究进行了配体的铁蛋白和低密度脂蛋白受体。住RBEC孵育大鼠转铁蛋白在37℃( 图7B,C),用Cy3标记(TF-Cy3标记)为180分钟。的TF-Cy3的吸收和转运体外血脑屏障模型大鼠定量表明,曲线的斜率略有下降超过2,400皮摩尔秒( 图7B),这表明结合/摄取饱和。此外,该结合/摄取的饱和率与TF的下部隔室中的积聚。为了证实这种观察,TF-Cy3标记物在1200皮摩尔(曲线的上升部分)与在4800皮摩尔(高原/饱和度)( 图7C)的过量非荧光TF的。这些实验显示减少了TF-Cy3的积累下格,并证实可饱和机制,典型在我们的体外血脑屏障模型的配体-受体相互作用的。

同样,低密度脂蛋白受体功能证明了它的配体DiILDL跨内皮细胞单层( 图7D,E)的吸收和运输。活RBEC在37℃下孵育DiILDL 30分钟结合/摄取无相关性DiILDL的下部隔室( 图7D)的积累。 DIIL的定量DL传输表明,该曲线的斜率下降超过2微克,这表明传输是饱和的和在我们的模型受体相关。叠氮化钠的溶液中加入0.05%,15分钟前DiILDL孵育( 图7E)。没有叠氮化钠孵化毒性的0.05%是由PE(LY)测量(数据未示出)进行评估。这些实验显示,在下部隔室中下降DiILDL积累。总之,我们的结果在我们的体外血脑屏障模型表明RMT的DiILDL。

其他基于大鼠脊髓或小鼠脑血管内皮细胞的体外血脑屏障模型
酶消化与胶原酶/分散酶的混合物是主要的参数中的细胞生存力和脑微血管的制造成品率方面来控制1。酶相对于组织的数量,n的酶,更重要的比率的浓度电火工品将大鼠脑,脊髓和小鼠大脑之间的精确校准。微血管接种密度和血管内皮细胞的数目达到90%汇合(9天后微血管播种)被链接,并且改善细胞生长,限制群体倍增和模型的质量的数量的重要参数。大鼠脊髓微血管生成具有相同的协议如本文中所描述的大鼠脑微血管1(在组织量,相当于大约1脑2脊髓而言)获得相同的时间尺度内每T75烧瓶中细胞的数量相同。从5周龄C57BL6小鼠脑脊膜是难以消除的,因为他们坚持到皮层。大脑与分散酶的简要处理似乎有利于去除脑膜。这有助于生产的从大鼠脑,脊髓和小鼠脑重现的内皮细胞单层中的重要参数突出显示,并总结在图8。

图1
图1。流程图总结了在体外 BBB模型制备的主要步骤,不同的步骤生产协议被分配给一周中的特定天,以增加初级内皮细胞培养物的再现性。该协议开始的第一个星期的星期三,从5周龄Wistar大鼠微血管生产。

图2
图2。RBEC,星形胶质细胞和共培养系统的相衬的显微照片。 (一)5周龄的Wistar大鼠微血管在电镀出来的碎片时间。(B)治疗的2天,4微克/毫升的P-gp的底物的嘌呤霉素三日龄RBEC培养物(C)镀上一个12孔板中涂有Ⅰ型胶原的Millipore滤膜后在第1天纯汇合的内皮细胞单层单层细胞在插入过滤器周边的IV和纤维连接蛋白(D)均匀性(E)星形胶质细胞的汇合上建立共培养出特征蜂窝形态的天文化。(F)表示计划共培养系统用C,D和E的显微照片的定位

图3
图3。表征RBEC培养免疫荧光显微镜(A)脑血管内皮细胞表达血小板内皮细胞粘附分子PECAM/CD31小区边界,(B)血管性血友病因子(VWF)显示了一个比较点状着色,更明亮,更聚集在某些细胞比别人,且集中在核周区(C)无RBEC的嘌呤霉素治疗文化周细胞中检测到了阳性表达结蛋白(绿色)和有特色的小圆形的细胞核。(D)星形胶质细胞表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4大鼠体外血脑屏障模型和的旁通透性的免疫细胞化学鉴定LY穿过内皮细胞单层的细胞单层被免疫染色(A)的波形蛋白,揭示汇合脑内皮细胞单层与非重叠的形态和典型纺锤状细胞与内皮细胞的形态和紧密连接蛋白的表达(B)中 claudin-5的(C)ZO-1(D)occludin的,也是由蛋白质印迹的ZO-1和occludin的蛋白(E)的检测。(F)的单层紧度在12孔BBB模型,通过测量荧光黄的交通评估(LY-CH,二锂盐),一个小的亲水性分子(分子量457道尔顿)已知通过血脑屏障被保留。简言之,LY混合物在37℃下孵育培养体系的上部隔室中的脑内皮细胞进行60分钟的接触在此时间后,下部隔室的介质被收集和荧光进行定量荧光分析用spectrofluorimet呃,激发波长为430纳米,和在535nm处发射。其结果在10 -3厘米/分钟表示的渗透性或PE。障碍被认为是透水或打开时LY的市盈率高于0.6x10 -3厘米/分钟。在每1个小时的实验中,平均清除量是相对时间绘制和通过线性回归分析估计的斜率。的清除曲线与IV型胶原,纤连蛋白涂层的控制滤波器的斜率表示的PSf和用于筛选与脑内皮细胞单层的清除曲线的斜率表示为聚苯乙烯。 :为单层内皮细胞(PSE)的PS值从计算请点击这里查看这个数字的放大版本。

式(1)

该PSE值由POR的区域划分OUS膜(1.1 平方厘米为12孔板微孔过滤器),结果是渗透系数(PE),平均为0.26±0.11×10 -3厘米/分钟。结果都带有一个垂直的散点图表示对n = 90试验(3次的平均值为每测定N = 6单层)。

图5
图5 在体外 BBB模型响应与促炎剂TNF-α治疗。从培养系统中的培养介质代替刚刚的TNF-α处理之前,在上隔室5毫微克/毫升为6小时,12小时和24小时。 CCL2释放由RBEC定量在通过ELISA测定的上部隔室中与未处理的对照比较。注意,MCP-1水平与时间的函数略微增加即使在非处理井。内皮PE为LY PE(LY)测得的内皮细胞屏障的完整性透露24与TNF-α小时治疗在5毫微克/毫升或0.62±0.02×10〜50毫微克/毫升增加单层通透性- 3厘米 /分钟和0.7±0.01×10 -3厘米/分钟相比,分别为0.33±0.03×10 -3厘米/分钟(Student的t检验,p <0.05)的控制。

图6
图6。功能的P-gp的外排转运和RBEC极化外排转运P-糖蛋白在脑内皮细胞免疫细胞化学(A)和免疫印迹(B&C)共培养星形胶质细胞。表达 。细胞膜蛋白与细胞蛋白质分馏萃取tion套件。质膜通过低渗裂解和差分离心得到消除细胞器和细胞核。用蔗糖密度梯度,获得从质膜分离心尖和基底蛋白质。 P-糖蛋白主要定位在心尖组分(F1),而谷氨酸转运体1(GLT-1)主要定位在基底外侧部分(F3)。纯化的微血管电镀前用作对照的体内定位,这些蛋白质。 P-糖蛋白的活性通过测定R123,一个P-糖蛋白配体的运输极性决定的。 1μM的R123的磁通,测定1小时,于37℃在管腔至腔外(A到B),并在相反的近腔至腔(B到A)的方向。相同的实验,实现无RBEC横跨插入过滤器,以评估被动扩散和归一化数据相对于这个值对于PE(R123)的计算(参见图5 PE(R123)100%(A到B)。维拉帕米(25μM,30分钟预孵育)和环孢菌素A(1μM,30分钟预温育)被用作参考的P-gp抑制剂。 R123积累RBEC是2小时带或不带预孵育与P-gp的抑制剂(学生t检验,p <0.05),后测量。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7
涉及受体介导的茶受体的图7。表征nscytosis(RMT)(A)的区别RBEC单层免疫染色与抗低密度脂蛋白相关受体1(LRP1)和低密度脂蛋白受体(LDLR)。 RBEC的共聚焦图像探查吸收DiILDL后,低密度脂蛋白受体的荧光配体和对大鼠转铁蛋白-Cy3标记的转铁蛋白受体显示点状染色在细胞表面的荧光配体的摄取,并在核周区域某些聚类(B)大鼠TF-Cy3标记加入到含有分化RBEC单层在75上车厢,150,300,600,1,200,2,400和4,800皮摩尔/插入在37℃(200微升180分钟在上层车厢和1200μL的下格)。此时间之后,Cy3的荧光,通过荧光分析与激励一个荧光分光光度计在570Ñ550nm和发射定量在细胞裂解物(200μLPBS中0.1%的Triton X100),并在下部隔室米。荧光单位转化中使用的线性工作范围(℃)对于饱和实验皮摩尔,鼠TF-Cy3标记加入到含有分化RBEC单层在1200皮摩尔/插入时间为180分钟,在37℃下具有或不具有15的上隔室分钟预温育与非荧光TF的4800皮摩尔/插入。在下部隔室中的运输被量化为在(B)(学生t检验,p <0.05),(D)DiILDL加入含有分化RBEC单层在1,2,4和8微克/插入过滤器的上部隔室为30分钟,在37℃(200微升在上部隔室和1200微升在下部隔室)。此时间之后,的DiI荧光通过荧光分析与激励一个荧光分光光度计于在571纳米554纳米,发射定量在细胞裂解物(200μl的PBS中的0.1%的Triton X100),并在较低的室中。荧光cence单位被使用的线性工作范围变换中微克(E)对于运输阻断实验,叠氮化钠0.05%添加15分钟DiILDL在2微克/在37℃下将30分钟的孵育前在下部隔室中的运输被量化为在(D)(学生t检验,p <0.05)。没有叠氮化钠毒性潜伏期在0.05%是由PE(LY)测量(数据未显示)进行评估。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8
图8: 大鼠脊髓血管内皮细胞或小鼠大脑血脑屏障体外模型。表高灯从大鼠脑,脊髓和小鼠脑微血管萃取的重要参数。显微照片显示出免疫染色ZO1和紧密连接蛋白在大鼠脑,脊髓和小鼠脑准备内皮细胞单层。

Discussion

我们描述一个每周可重复的协议大脑微血管的隔离和电镀的实施,以下净化RBEC和文化,并进一步制定共同的文化与原代大鼠星形胶质细胞生成的体外血脑屏障模型的特点血脑屏障特性。

成功建立标准化体外 BBB培养物需要在多个连续步骤的过程中的最佳条件。该模型是(一)优化,以获得最低的旁通透性,这仍然是在体外血脑屏障模型的“圣杯”,以及(b)验证了外排和RMT机制。

生产,纯化及RBEC增殖

培养RBEC时,最大的挑战是实现不同文化之间的重现性。该协议的标准化要求对DIS高品质的工具节,高品质的试剂和尊重试剂过期日期。实验者需要在显微解剖显微镜下熟练用于快速去除脑膜和大血管的从皮质表面。一旦大脑分离和机械分离,主要的挑战之一是新鲜分离的脑微血管的最佳酶消化。所用的酶的类型和质量是至关重要的。的胶原酶I型和II和分散酶高浓度的批间变异性低的混合使用。同样重要的是酶消化的持续时间和消化酶浓度/组织重量/体积之间的比率。是与皮质相当于1毫升胶原酶获得1脑脑微血管生产的最佳产量/时既消化,分散酶混合在60微克/毫升分别为30分钟和1小时。

另外关键的是消除污染的细胞S(星形胶质细胞和周细胞为主)。这些细胞在增殖速度较内皮细胞高,不建立紧密连接与后者,从而防止建立一个均匀的单层细胞具有良好的细胞旁限制性。考虑到脑内皮细胞表达更高水平的外排泵,尤其是P-糖蛋白相比,在微血管中发现的其它类型的细胞,它们容忍越好否则毒性浓度的P-糖蛋白配体药物,非内皮细胞中被淘汰。其次是在2微克/毫升2天以上,在4微克/毫升的前两天嘌呤霉素处理以获得良好的内皮细胞的纯度。这一选择也可以有利于毛细血管内皮细胞与那些来自小静脉,预毛细动脉或更大的微血管,并导致更严格的单层。此外,使用血浆衍生的牛血清穷人是一个必要取得内皮细胞47,48的纯培养物。等离子体明镜IVED血清缺乏血小板衍生的生长因子(PDGF),这是有丝分裂为成纤维细胞,平滑肌细胞,因此对周细胞。

我们观察到治疗的塑料和滤波器的IV型胶原的小鼠和人纤连蛋白产生了显著优点的混合,与增殖产量与传统上建议I型胶原蛋白从鼠尾比较的2倍的增加。通过细胞外基质如整合素和生长因子(bFGF)活化49提供了用于细胞增殖的重要线索。缓冲液浓度和pH值的培养基中,已经描述了在细胞旁密封性50产生积极的影响,我们观察到培养物用加入了HEPES缓冲液之间的更好的再现性在5毫米。

共培养建立在插入过滤器:RBEC分化

一旦脑血管内皮细胞有bEEN纯化,并已经扩散了6天,它们可以被镀上的过滤器。细胞接种于高密度是至关重要的,以获得完美的单层。每12孔板筛选160x10 3细胞的接种密度是必要的,足以获得播种后覆盖单层24小时。然而,从环境的原发性脑毛细血管内皮细胞的分离是在一个BBB 体外模型,因为它是已知的原代细胞,并且特别是脑毛细血管内皮细胞,强烈受到环境调节和产生由感性因素的结构的悖论不同的周围的细胞类型。脑微血管内皮细胞单独培养快速去分化和宽松一些特定的脑内皮标记物。因此,初级内皮细胞应使用低传代(P1)和重新连接时,至少在一部分,通过共培养他们的环境,由星形胶质细胞47,51空调星形胶质细胞或培养基中。这个拥有是真对星形胶质细胞分化为脑血管内皮细胞和星形胶质细胞参与双向感应。培养RBEC与星形胶质细胞引起强烈的感应interendothelial TJ 52,23的。再诱导的分子机制仍是未知,而研究是持续的在几个实验室,以确定由星形胶质细胞分泌的特异性调节因子,可以促进最佳内皮细胞分化53,54。通过脑血管内皮细胞包括白血病抑制因子(LIF)分泌的因子已显示诱导星形胶质细胞分化55,56。共培养建立之前,星形细胞暴露于含有该糖皮质激素受体激动剂氢化可的松分化培养基中,并共培养的条件培养基。氢化是已知的改善脑血管内皮细胞的紧密性,并且特别是从大鼠57和鼠标58,59内皮细胞用于在体外BBB模型。该空调的Medi嗯是从血管内皮细胞/胶质细胞的共培养系统的下部隔室收集后3天并冷冻供以后使用。利用共培养条件培养基中的血管内皮细胞分化的时间减少到3天,最佳细胞旁渗透性为2天以上,也提高了文化之间的再现性。

总体而言,我们所描述的协议产生一个可重复的TEER的0.26±0.11×10 -3厘米/分,类似于最好的初级细胞系体外BBB模型22超过300欧姆·厘米2,平均细胞旁渗透性系数PE(LY), 12。我们描述了在本手稿与微血管酶消化的提议调制的协议可以扩展到从大鼠脊髓60和从小鼠脑内皮细胞。

分子与功能分析

此外到TJ感应,星形胶质细胞也有助于外排转运蛋白如P-糖蛋白在脑内皮细胞61的表达。我们的确显示了流出转运蛋白P-糖蛋白在血脑屏障模型的表达,我们证明了P-gp的外排泵的本地化的极性用生物化学的方法,和P-糖蛋白活性的使用功能测定法。在微血管的基膜部分中检测到的GLT-1的表达,但在培养RBEC未检出。我们推测,GLT-1的下调在我们的RBEC文化与体内条件,因而不被免疫印迹分析检测比较。过量的谷氨酸盐是神经毒性和体内,GLT-1是负责谷氨酸流出从基底隔室(实质内),以心尖隔室(血液循环)。在星形细胞培养,GLT-1的表达仍然是非常低的,并通过加入谷氨酸诱导的介质62,63。

我们还CONFIRM涌入转运体在顶膜如LRP1,低密度脂蛋白受体和转铁蛋白受体的表达。铁蛋白和低密度脂蛋白受体的功能,展示了与从管腔结合和运输TF-Cy3和DiLDL的实验,以单层的近腔侧如先前在体外 BBB模型64牛所示。有趣的是,已经表明由星形胶质细胞脂质要求增加LDLR的表达在脑毛细血管内皮细胞65,66进一步证实星形胶质细胞和脑血管内皮细胞之间的生理串扰,包括在体外我们选择了举例说明传输用的荧光染料,例如作为Cy3标记和DII考虑到荧光光度法分析可在大多数实验室,并能证明是有用的在体外BBB模型进行验证。然而,荧光定量远比放射性较不敏感,并且需要增加的实验次数取得显著数据。理想情况下,Tf和低密度脂蛋白通常是放射性标记(碘125)这样的绑定/吸收和转运实验。

我们还表明,已提出的协议中获得的分化内皮细胞单层回​​应炎症TNF-α诱导的,所揭示的CCL2释放和血脑屏障开放。 CCL2(MCP-1)及其受体CCR2涉及中枢神经系统疾病,如多发性硬化症,实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)67,中枢神经系统创伤68和神经炎性条件下69,70被称为白细胞迁移的介质进入CNS。随着测试的协议,我们不能对CCL2的极化分泌的结论,因为血脑屏障开放允许CCL2浓度到上部(顶)和较低(基础)室之间平衡。因此,我们清楚地低估的CCL2的RBEC在心尖隔室在24小时( 图5A)的生成量。

一般概述和血脑屏障的限制体外模型:I N体内体外和啮齿动物与人类的比较

许多有希望的中枢神经系统的药物,证明能有效通过血脑屏障体外 ,由于缺乏可预测性失败的临床试验在体外 BBB模型往往基于细胞从其他物种比人类的隔离。据我们所知, 在体外血脑屏障模型可能更预测,当涉及到研究蛋白质网络,信号转导,转运和受体的机械方面。每一个机构,途径或目标在体外进行研究已被表征,它的调节通过互补环境线索(其他细胞类型,化学品,蛋白质)和原位研究相结合,用相同的动物物种,并在可能的情况,从人类分离出来,与限制和谨慎微血管和内皮细胞引起下文。

在体外 BBB模型必须被看作是独立的系统中,从身体调节分离,但仍然赋予了重要的体内性能和用于调节由环境线索的电势。没有“理想” 在体外血脑屏障模型已经被提出但71,72,73是因为血管内皮细胞单层缺少了一些的神经胶质细胞血管单元(NGVU)的重要组成部分,并从血液和身体的调节是隔离的。周细胞74,16或神经元17,18或用于塑料涂层或培养基和血清用于细胞生长的基础上内皮最常见和“简单制造” 在体外 BBB模型中细胞外基质的不同成分的缺乏细胞分化与星形胶质细胞可调节蛋白表达我Ñ ​​与体内情况比较75。这些模型可以表达在体内表现出许多转运,但不是全部。在某些情况下,传输参数最初是在孤立的微血管(最接近体内的情况)核实,然后研究在细胞培养系统76,61。

分子生物学的研究已经允许在被隔离的微血管和低传代内皮细胞培养物来自相同物种的基因和蛋白表达的特征,以及不同物种之间,最常见的由小​​动物,如啮齿类动物(小鼠和大鼠),或从牛和猪中相较于人类77,78,75,15。 在体内体外的脑微血管内皮细胞之间转录组比较,显示差异表达是与体外最常显著下调众多基因的转录。成绩单编码流入转运,如转铁蛋白受体和公关oteins牵连的囊泡运输主要是下调培养的脑血管内皮细胞,表明在这些细胞内吞作用和膜泡运输普遍下降。文化操纵的纯度(嘌呤霉素处理)和氢化可的松治疗方面可能有助于还原更“ 体内样”基因表达谱77。转录组的研究也显示,涉及人体内皮细胞和星形胶质细胞共培养体外 BBB模型已经描述15种之间的重要区别是更加复杂的药物摄取的预测基于啮齿动物体外血脑屏障模型75人。虽然相关,这些模型都比较难以实施定期为它们需要验尸人体组织规范准入和根据年龄,疾病,医疗可能存在异质性在人脑血管内皮细胞的质量/性能treatmen吨捐助者。努力必须作出开发新的体外模型更好的再现的生理,解剖和体内血脑屏障的功能特性。涉及三个类型的细胞共培养是非常严格的,似乎难以实施常规。迄今为止,最复杂的体外血脑屏障模型是动态的体外模型(DIV-BBB),其中包括血管样组织,星形胶质细胞和包括介质的流量,模仿血流量75,79,80,81,82, 83,84,85。当脑血管内皮细胞暴露于一个流,所产生的剪应力激活mechanotransducers在细胞表面,从而调节参与内皮细胞生理学如细胞分裂,分化,迁移和凋亡的80个不同基因的表达, 在体内,剪切应力通过血流产生负责有丝分裂停滞在细胞接触,这允许建立一个内皮细胞单层中的血管80。正常的人脑微血管内皮细胞的基因组和蛋白质组分析显示,剪切应力在血脑屏障内皮细胞生理学84的影响。剪切应力是负责细胞存活,更高程度的内皮细胞粘附的,外排泵的诱导和更好极化转运蛋白75,葡萄糖代谢的调节75,86,氧化细胞色素P450介导的酶75和细胞旁渗透性通过增加表达的调控基因就像occludin和ZO-1 87,75,80,因此高TEER间交界元素编码约1,500 - 2,000欧姆·厘米2, 在体内已知的最接近的参数79,80

在生物技术和制药业,药品甚至是高通量筛选(HTS),并努力减少动物实验的常规筛查,导致在替代性脑内皮细胞保持更难以建立常规的原代培养物的情况下使用不同的细胞系的开发。在大多数情况下,脑血管内皮细胞的原代培养物转导的永生化基因(SV40或多瘤病毒大T抗原或腺病毒E1A),不管是使用逆转录病毒载体88,89,75通过质粒DNA的转染或感染。脑来源的几种内皮细胞系已被开发,如RBE4,GP8/3.9,GPNT,RBEC1,TR-BBBS或rBCEC4鼠细胞系88,75,该b.End3小鼠细胞系90,75,PBMEC/C1 - 2猪细胞系87,75和hCMEC/D3人细胞系89,75。其他的模型是基于非脑细胞的起源,如的Madin-Darby犬肾(MDCK)或CACO2细胞系12,75。在不同的人脑内皮细胞株中,hCMEC/D3已被广泛引用D和改进为BBB的自2005年91,92建立一个模型。像原代培养,细胞系存在的优势和局限性。它们比原代培养物来处理,具有延长的寿命,都是很好的特点,并允许大规模实验之间的再现性。然而,细胞会失去组织的特定功能,失去了环境监管,并获得一个分子表型的细胞在体内75,89完全不同。特别是,从细胞系存在降低密封性,低TEER并显示转运轮廓变化75,89生成的单层。因此,在原代细胞动物实验或研究,往往是首选,尽管他们增加了复杂性。

Acknowledgments

到VECT-HORUS财政支持从全宗独特Interministériel(FUI / MEDUL项目)和矢量中断 - 荷鲁斯和来自法新社国立德拉RECHERCHE(ANR,TIMPAD,VECtoBrain,VEC2Brain,ADHOC和PREVENTAD合作项目)的UMR7259实验室认可。该UMR7259实验室也承认来自法国国家科学研究中心和埃克斯 - 马赛UNIVERSITE资金支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

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References

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