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1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Medicine
 

Summary

本研究の目的は、ラット同系内皮細胞とアストロサイトの共培養が関与する生体外 BBBモデルの再現性を検証することでした。内皮細胞単層は、高いTEERと低LY透過性を提示した。特定のTJタンパク質の発現は、炎症および輸送体および受容体の機能性に機能的応答を評価した。

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Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

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Abstract

血液脳関門(BBB)は、特に、血液と神経組織との間の分子および細胞フラックスを調節する。私たちの目的は、内皮細胞単層全体にトランスサイトーシスに関与する受容体を研究するため、一次ラット脳内皮細胞(RBEC)とアストロサイトの共培養を用いて、BBBのin vitroモデル再現性の高いラット同系を開発し、特徴づけることでした。アストロサイトは、トリプシン消化後、機械的切開によって単離し、それ以降の共培養のために凍結した。 RBECは、5週齢のラット皮質から単離した。脳を髄膜と白質の洗浄、及び機械的に酵素消化後に解離させた。その後、組織ホモジネートは、神経組織から血管フラグメントを分離するためにウシ血清アルブミン中で遠心分離した。血管フラグメントは、それらの細胞外マトリックスからの内皮細胞を解放する第2の酵素消化を受けた。このような周皮細胞のような残りの混入細胞はFだったurtherピューロ含有培地中での微小血管フラグメントをめっきすることによって解消。次いで、それらをウェルの底上に成長させたアストロサイトとの共培養のためのフィルター上に継代した。 RBECは、セル境界での典型的な現地化などオクルディン、クローディン5およびZO-1のようなタイトジャンクショ​​ン(TJ)タンパク質を高レベルで発現した。脳内皮単層の経内皮電気抵抗(TEER)のTJの気密性 ​​が平均·cm 2で300オームに達したことを示す。ルシファーイエロー(LY)のための内皮透過係数(PE)は0.26±0.11×10 -3センチメートル/分の平均と高度に再現性があった。単層で編成脳内皮細胞は、流出輸送体P-糖タンパク質(P-gpの)を発現ローダミン123、P-gpのためのリガンドの偏光輸送を示し、内皮細胞単層を横切ってトランスフェリン-Cy3およびDiILDLの特定のトランスポートを示した。結論として、我々 は、in vitroを設定するためのプロトコルを提供により品質保証の方法に非常に再現性があり、それがBBBトランスポーターと受容体の研究に適してBBBモデル。

Introduction

中枢神経系(CNS)障害を治療するために開発された多くの薬物は、治療上適切な濃度で脳実質に到達することができない。 BBBは、病原体から、プラズマ組成の変動による脳の神経組織を保護し、脳1内外にイオンが、ペプチド、タンパク質、さらには細胞の非特異的フラックスを制限することにより、脳実質の恒常性を維持する。

BBB特性は、特殊なクラスの脳微小血管内皮細胞や、神経細胞、グリア細胞(より正確にはアストロサイトのエンドフィート)、などの神経グリア血管ユニット(NGVU)の隣接する要素間の密接な近接性やクロストークによって誘導され、維持されるおよび周皮細胞は、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンおよびプロテオグリカン2,3を中心に構成されて基底膜に鞘で覆わ。毛細血管レベルでの内皮の32%、重要なを果たしている - 周皮細胞は、約22をカバー内皮細胞増殖、血管新生および炎症プロセスの調節において役割。内皮細胞は、毛細血管の内表面を覆う連続シートを形成する。それらは、頂端領域で帯状構造を形成し、それが細胞極性に寄与するのTJ、相互に接続されている。星状細胞は、BBB特性を調節し、例えば、TGF-β、GDNF、bFGFおよびIL-6などの重要な調節因子の供給源である。不完全な機能を備えたGFAP欠損したアストロサイトは、BBBの特性4を規制することができません。ニューロンは直接BBBの形成に構造的に関係するだけでなく、タンパク質発現およびBBB機能5の重要な側面を規制されていません。

さらにBBBの構造、生理学、病理学を研究するために、BBBのin vitroモデルは、研究ツールとして開発されました。脳内皮細胞ベースのインビトロ BBBモデルにおいて実現するために、種々の種から抽出されている8,9ブタウシ6,7、、ラット10,11,12、また、マウス13とヒトの14,15から低継代初代培養上。これらのモデルは、in vivoでの BBBを模倣することが知られている場合に特にラットまたはマウスおよび/ ​​または周皮16,12からグリア細胞及び/又は神経前駆細胞由来のアストロサイト17および/ ​​またはニューロン18と共培養した。それらは、インビトロ / インビボ実験と比較および/ ​​またはトランスジェニックモデル19から製造脳内皮細胞の研究において可能にするので、「ラボにおける「モデルはしばしば齧歯類から製造される。

新たにインビトロ BBBモデルにおいて開発もインビボ試験15,20,21,3,6,22,11,23の前に潜在的なCNS薬剤候補の脳への取り込みを予測するのに役立つように設計されている。 インビトロ BBBモデルは、通常、比較するために使用されているCNSへのI)は、公知の浸透またはlと:を有する薬剤の輸送BBBなし中枢効果全体のOW透過性、及びii)同じ種の動物モデルで測定された、同じ薬の見かけPeの。容易にBBBを通過する薬物は、主に親油性であり、脂質媒介自由拡散(カフェイン、カルバマゼピンなど)によって脳内皮細胞膜を横切る。ジゴキシン、ベラパミルまたはシクロスポリンAのような負に運ば薬は積極的なP-gpのような脳内皮排出トランスポーターによって押し出される。しかしながら、新たに開発された治療用分子の多くは、そのような組換えタンパク質、siRNAまたはモノクローナル抗体などの生物薬剤である。特定のトランスポーターのI)が存在しない、と傍細胞経路を受けるの高分子量分子を防ぐ内皮細胞のII)しっかりと充填層:それらのほとんどが起因してBBBを通過しないでください。これらの制限により、「トロイの木馬」戦略は、ベクトル、BBBでの既知の受容体に対する(抗体、ペプチド)、関係Iを使用して実装されていますN受容体は、トランスポートまたはトランスサイトーシス(RMT)、トランスフェリンなど(TF)受容体(のTfR)、インスリン受容体(IR)、またはLDL受容体のメンバー(LDLR)関連受容体ファミリー(LDLR、LRP1)を媒介した。このような受容体は、 生体内で 24,25 孤立した脳毛細血管に及び、BBBで発見されている。これらの受容体の転写プロファイルは、特に、LDLRファミリーのものは、分析し、共培養直接脳26からのそれらの抽出後の星状細胞または脳毛細血管内の脳内皮細胞および脳内皮細胞間で比較した。 Pardridge 24は、インスリン受容体およびインスリン増殖因子受容体27,28に対する抗体、続いて、トランスフェリン受容体(TfRの)に対してOX-26抗体を用いてフィールドを開いた。これらの抗体ベースのベクターを用いて、ArmaGenテクノロジーズは、BBB 29を越え、タンパク質を含む、薬物を送達するために、BBBの分子トロイの木馬プラットフォーム技術を開発しました。ザ·文献はLRP1脳血管内皮細胞での発現と強力なエンドサイトーシス/スカベンジャー受容体としての役割を示すデータが豊富である。ウェスタンブロット分析は、LRP1が脳毛細血管に富む画分に、ラットの脳毛細血管内皮細胞30において発現されることを示唆した。このようなBBB 31を越え、効率的な薬物の流入を促進アプロチニン由来のペプチドベクターを用いたAngiochem目標LRP1などの企業。しかし、LRP1もAβおよび血液32に脳実質からの流出/クリアランスの能動輸送に関与している。このようなデータは、そのリガンドによってはBBBを通過双方向輸送にLRP1を伴う。 biOasisはVECT-HORUSがLDLR 34を対象とするペプチドベクトルを開発していますが、このようなBBB 33全体のリソソーム酵素や抗体などの生物製剤の輸送のためにタンパク質メラノを使っトランセンド技術を開発しています。データは、LRPおよびLDLRの差分を輸送するために使用できることがあるが示唆されているこのようなBBB 37全体のリソソーム酵素35,36またはナノ粒子複合体としてのerent分子。

我々の関心のある分野は、ベクター分子およびCNS疾患の治療のためのベクトル化された薬剤候補を用いて、CNSへの薬物送達である。具体的には、BBBを横切る薬物送達は、神経炎症、その範囲が変化してもよいプロセスのコンテキスト内で考慮されなければならないが、これは、脳炎、多発性硬化症、アルツハイマー病などの神経炎症を含む、おそらくすべてのCNS病変および疾患に共通であるBBBの炎症と、潜在的にBBBの生理学および透過性の変化は、傍細胞及び経細胞輸送は、病的状態の38,39,40,41,42,43で増幅することができることを考慮に関連付けられている。例えば、TNF-α、TWEAK、および他のサイトカインは、炎症を調節し、 インビトロ BBBモデルを用いた実験は、それらが目の傍細胞特性を変化させることができることを示しているE内皮細胞単層38,39,40と、そのTNF-αはまた、LDL 41の経細胞輸送の増加、ホロトランスフェリン42ラクトフェリン43につながる。

我々の目的は、開発し、特性化することでした最適化され、再現性の高いラット同系BBBモデルは、一次脳内皮細胞とアストロサイトの共培養を使用した。私たちは、それぞれ脳内皮細胞の生産とアストロサイト制作のための5週齢および新生児ウィスターラットを使用していました。 1つの課題は、「毎週再現可能な「BBBモデルの生成を可能にするプロトコルを確立することであった。この目的を達するために、生産プロトコルのすべてのステップは、最初の週の水曜日に脳の微小血管の生産から開始し、週の固定日に実施された。解剖は、過去3年の間にほぼ毎週行った。さらに、培養の再現性を向上させるために、品質保証システムを確立した。すべてreagenTSと化学物質データベース(入国日、株式、有効期限など)で参照されました。

モデルは、内皮細胞の組織化および純度などの多くの基準は、次の特徴づけられた、TEER、LY透過性、炎症誘発性剤、TJタンパク質の定性的および定量的な発現、例えば、P-gpのような排出トランスポーターの機能性、および受容体に応答しなどのTfRまたはLDLR内皮細胞単層全体にトランスサイトーシスに関与。

Protocol

ラットアストロサイトの1。生産

各調製のためのセックスのどちらかの10新生児のWistarラットを使用しています。

  1. ハサミで頭部を切断したラットを犠牲にし、層流フードの下で乾燥したペトリ皿にすぐに転送します。小脳なしに頭蓋骨から脳を取り出して、冷たい解剖バッファーを含むペトリ皿にそれらをすぐに転送する:HBSSを1%ウシ血清アルブミン(エンドトキシン、BSAの低レベル)、100μg/ mlのペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシンを補充した。
  2. 2大脳半球を分離し、氷上で解剖バッファーで清潔なペトリ皿にそれらを転送するために、半分に脳を切った。視神経をカットし、実体顕微鏡下で髄膜を除去します。
  3. 冷たい解剖バッファーの50ミリリットルで広く皮質の部分を洗ってください。
  4. 15ミリリットルファルコンチューブに3脳からの皮質の部分を配置し、ピペッティングにより解離し、クーデターダウンル回、10 mlの0.05%トリプシン6mlの中に青色チップを備えた使い捨てピペット - EDTA、37℃で5分間0.02%
  5. 24 10%FBSを添加したDMEM mlの以下の抗生物質、ペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシン100μg/ mlの、グリア細胞培地(GCM)という名前のメディア、そして室温で5分間300×gで遠心分離器を追加します。 FBSバッチはアストロサイトcuturesの成長と生存のために選択され、検証された。
  6. 75cm 2の Tフラスコ(T75)に10ミリリットルのGCMとプレートの解離した細胞を含むペレットを再懸濁します。細胞の破片やDNAを除去するために、次の日に培地を変更します。週に2回培養液を交換してください。
  7. 増殖の1週間後、そっとGCM中37℃で24時間の間に60 rpmでオービタルシェーカーでグリア細胞を振る。 T75は、37℃加湿雰囲気において、5%CO 2/95%空気のインキュベーター内に配置できない場合は、5mMのHEPESを含む培地を補う。 R 2回細胞を洗浄非付着性ミクログリア細胞を残したまま削除。
  8. 播種から3週間後に、カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSで細胞を2回洗浄します。 、温かいトリプシン3mlの0.05%-EDTA 0.02%の追加、37℃でインキュベートし、細胞層が分散するまで待つ(通常は5分)。 8分間、120×gで15ミリリットルのFalcon遠心チューブに細胞懸濁液を転送し、GCMを10mlを添加してトリプシン活性を阻害する。
  9. 90%FBS中で星状細胞ペレットを再懸濁し、10 - 10%のDMSO、液体窒素中で(2×10 6個のクライオバイアル当たり細胞)およびストアクリオバイアルにそれらを転送する。

ラット脳微小血管の2。分離

我々の実験手順は、マルセイユの医学部の倫理委員会によって承認され、国家と欧州の規制(EU指令第609分の86)に適合している。すべての努力が動物の苦痛を最小限にし、使用する動物の数を減らすために行われた。

  1. 各製造方法および1 experimente用R、3 5週齢のWistar系ラットを使用しています。
  2. 最初の週の月曜日には、両方の無菌培養水に1μgの/ 2程度(T75あたり10ミリリットル)で、IV型コラーゲンおよびフィブロネクチンでコーティングすることにより、2 T75フラスコを準備します。微小血管播種まで37℃で接着させる。
  3. 最初の週の水曜日の朝、頸椎脱臼に続いて、その後、姿勢と呼吸の中断の損失を眠気を誘発するために、CO 2の増加フラックス下にラットを安楽死させる。 70%エタノールで頭をスプレーします。ハサミで頭をカットし、層流フードの下で乾燥したペトリ皿にそれらを転送します。
  4. 氷上で冷却し、冷たい解剖緩衝液で満たされたペトリ皿にそれらを転送して、小脳および視神経ことなく頭蓋骨から脳を削除する(HBSSは1%のBSA、ペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシン100μg/ mlの添加) 。
  5. 用から2大脳半球と別々の脳を分離するために半分に脳をカットebrain。解剖用緩衝液で氷上でクリーンなペトリ皿に前脳を転送します。
  6. 慎重にN°5の湾曲鉗子で実体顕微鏡下で前脳から髄膜を除去するために冷たい解剖バッファを持つ、新しいシャーレに半球のカップルを取る。その後、ミエリンの羽毛布団を削除して、皮質のシェルを得るために、脳の内部を清掃してください。これらのステップは、組織保存と細胞生存のために2つ以上の時間を取るべきではありません。
  7. 20ミクロンに続く異なるクリアランスの2杵のそれぞれとストローク上下に10、71ミクロンで7ミリリットルダウンスホモジナイザー冷解剖バッファーの6ミリリットルに3脳から皮質を解離する。
  8. 室温で5分間千×gで50ミリリットルファルコンチューブと遠心分離機の1ミリリットル中1皮質と同等のものを得るために、サスペンションを分割。上清を捨てる。
  9. コラゲナーゼ/ディスパーゼ(60μg/ mlのRの混合物を含む酵素溶液1mlを1皮質からサスペンションダイジェスト11; 0.3 U / ml)を、DNアーゼI型(35μg/ mlの - 20 K単位/ ml)およびゲンタマイシン(50μg/ ml)を37℃で30分間、シェーカーで
  10. 1は、25%のBSA / HBSS 1X 10mlで1皮質から消化し、室温で15分間3600×gでの密度に依存する遠心分離による独立したミリリットル混ぜる。慎重にきれいな50ミリリットルファルコンチューブにアッパーディスク(ミエリンと脳実質)、上清を転送し、遠心分離を繰り返します。 4℃で脳の微小血管を含む得られたペレットを保つ
  11. 慎重にアッパーディスク、上清を捨てる。冷HBSS 1X 1mlで脳の微小血管を含む両方の得られたペレットを再懸濁し、きれいな50ミリリットルファルコンチューブに移す。
  12. 5分間1,000×gで、20冷HBSS 1X mlの遠心分離を加えることにより微小血管を洗ってください。上清を捨てる。
  13. SHで、37℃で1時間の間にステップ2.9で説明したように、さらに同じ酵素溶液1mlを1皮質から微小血管ダイジェストアーカー。
  14. その後、1チューブに3皮質のそれぞれから消化微小血管をミックスし、さらにチューブあたり1年半(1.5)皮質に相当から抽出された微小血管を得るために、2 50ミリリットルファルコンチューブに分離。室温で5分間1,000×gでの冷解剖バッファと遠心機の30ミリリットルを追加します。
  15. 20%のウシ乏血小板血漿由来血清、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF、2 ng / mlの)、ヘパリン(100μg/ ml)を、ゲンタマイシン(50μg/ ml)を補充したDMEM/F12 10ml中の微小血管ペレットを再懸濁およびHEPES(2.5 mM)を、4μg/ mlのピ​​ューロマイシンで補充した内皮細胞培地(ECM)と呼ば。
  16. 、インキュベーターから2コーティングされたT75フラスコを取り、コーティングの過剰を吸引し、1 T75フラスコ(T75フラスコあたり1.5皮質から抽出された微小血管)に各チューブから微小血管プレート。

RBEC Primoculturesの3。精製及び増殖

  1. 精製:水曜日から金曜日まで、puromを追加ycin培地に4μg/ mlの時。木曜日にメディアを変更します。金曜日に、月曜日までの2μg/ mlで細胞を洗浄し、ピューロを追加します。
  2. 増殖:第二週の月曜日に、細胞を洗浄し、培養物は第二週の水曜日に90%の集密度に達するまで培養培地にインスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸ナトリウムのサプリメントを追加します。

4分化: インビトロ BBBモデルの設定

  1. 第二週の月曜日、両方の無菌培養水中の0.5μg/cm2上部コンパートメント内のミックス(500μLでIV型コラーゲンとフィブロネクチンのミックスでコーティングすることにより、フィルター(ポリエチレン、12井戸、孔サイズ1.0μm)を用意と下部コンパートメント内の無菌培養水の1.5ミリリットル)。 RBEC播種まで37℃で接着させる。
  2. 二週目の月曜日には、5日間共培養の確立の前に、37℃、転送時クライオバイアルからアストロサイトを解凍10ミリリットルGCMと15ミリリットルファルコン中。室温で8分間120×gでサスペンションを遠心分離する。
  3. 12ウェルプレート中で1cm 2当たり30×10 3細胞の密度でプレートし、GCMにおける星状細胞ペレットを再懸濁。
  4. 第二週の水曜日は、ちょうどトリプシンでRBECの解離の前に、DMEM/F12培地で2回プレコーティングされたフィルターを洗浄。下部コンパートメント内の1.5ミリリットルと上の区画に0.5ミリリットル:ECMとチャンバーを事前に記入してください。
  5. 二週目の水曜日には、カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSで二回RBECを洗う。正確に30秒の間にT75フラスコあたりの37℃でのEDTA 0.02%溶液 - 暖かいトリプシン4ミリリットルの0.05%を追加します。その後、トリプシン溶液3.5ミリリットルを削除して、顕微鏡下で観察します。細胞層は、マトリックスからデタッチし始めると、すべてのセルは、フローティングされるまで静かにT75フラスコの端をタップすることで彼らを助ける。
  6. T75フラスコあたりのECMの9ミリリットルを加え、15ミリリットルファルコンチューブに移す。非常に静かに細胞を解離黄色のチップを搭載した10ミリリットルピペットで4回上下にピペッティングして懸濁液(溶液中の気泡の発生を避けるため)。懸濁液中の細胞(約3×10 6 cells/T75)をカウントし、すぐに高濃度(160×10 3細胞/フィルターゆえ約18 filters/T75)( 図8で予備コーティングし、プレフィルフィルターにプレート)。翌日(木曜日)、細胞破片を除去するための上部コンパートメントの二倍の媒体を変更してください。
  7. 第二週の木曜日、共培養の確立前日、基礎コンパートメントから1月3日馴化培地を補充することができる分化培地(500nmにおけるヒドロコルチゾンとECM)の1.5ミリリットルでアストロサイトの培養液を交換してください前の共培養(内皮細胞とアストロサイトとの間の接触の3日間)の。
  8. 二週目の金曜日は、分化の0日として定義されます。フィルタコンタから培養培地を交換分化培地でRBEC ining。アストロサイトを含むウェルにRBECフィルターを転送します。これらの条件下で、in vitroモデルは、分化し、3日以内に接合関連タンパク質を発現する。
  9. モデルは、第三週の月曜日と水曜日の間、3日以上の間、それらの最適な分化を維持する。

Representative Results

生産·プロトコル
の多孔度を有するフィルター上で(a)の微小血管からの内皮細胞の精製、(b)の増殖、および(c)分化(12ウェルポリエチレンプレート:プロトコルは、培養培地組成の大きな変化に対応する3つの段階に分けることができるアストロサイトとの共培養中の1程度)。製造プロトコルの異なるステップは、一次細胞培養物( 図1)の再現性を高めるために、特定の曜日に割り当てた。最初の週の水曜日に、それゆえ9日共培養系の確立の前に、微小血管は、( 図2A)を単離した。内皮細胞を精製するために、培養液を5日間ピューロマイシンの濃度を減少させるの存在下で維持した。ほとんどの混入細胞(主に周皮細胞)を排除し、内皮細胞の増殖は、それらの表現型を変更することなく遅かったした。スピンドルShaped細胞はラットの脳の灰白質( 図2B)から分離され、毛細管の断片から成長。第二週の月曜日に、ラットのアストロサイトは、12ウェルプレートの底に播種した。年RBEC、フィルタの管腔コンパートメントに添加した。 160×10 3細胞/ cm 2( 図2C)での高密度播種は、フィルタ( 図2D)の周囲に隙間を回避するのに役立ち、内皮細胞単層の均質な分化を生成する。細胞は、長手方向に整列する、典型的な細長い紡錘状の形態を示し、均一な単層を形成する。木曜日、星状細胞培養培地は、前の共培養培地( 図2E)でコンディショニング分化培地に変更した。金曜日RBECはフィルター上に500 nMのヒドロコルチゾンを含む培地で増殖させ、フィルタが星状細胞を含む12ウェルプレートに移した。第三週に、実験WERE月曜日と水曜日の間で行われる。

RBECキャラ単層浸透性の決定要素
RBECは、内皮てBBBマーカーの免疫染色によってだけでなく、TEER、LYの透過性や、P-gpのような排出トランスポーターの機能の測定によって特徴付けられた。

RBECピューロ精製法によって得られた( 図1及び2)の合流で成長阻害を示し、しっかりと並置、紡錘状や紡錘型の形態を示し、重複しない連続単層に成長した。 RBEC培養は、内皮細胞の典型的なマーカーを発現した:それらは、血小板内皮細胞接着分子( 図3A; CD31/PECAM)について陽性の免疫染色を示し、フォン·ヴィレブランド因子( 図3B)の発現。ピューロ処理なし、RBECs素早くデスミン免疫染色で検出された周皮細胞に侵略されるtaining( 図3C)。星状細胞( 図3D)で表さグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)は、星状細胞の分化に重要なマーカーである。高い継代数で、星状細胞は、内皮細胞の分化を誘導する能力を失う。この理由のために、星状細胞培養物は、培養の彼らの時間のために標準化つだけの通路を受けた。

アストロサイトとの共培養が続き、以前の共培養の下部コンパートメントからの条件培地で、ヒドロコルチゾンを補充した培地でRBECを培養する単独で培養RBECと比較してinterendothelialのTJの強い誘導につながった。細胞は、免疫蛍光( 図4B-D)によって示され、ZO-1およびオクルディンタンパク質についてウェスタンブロット分析によって明らかにされるように、細胞-細胞間結合に局在したオクルディンタンパク質は、 図4E(ZO-1、クローディン5を発現し)。 Cでの形態学的分布ジッパー様の構成でのエル - 細胞接触する単層の(a)の気密性を反映し、(b)は、脳毛細血管内皮細胞の起源、及び(c)は、高度に分化した脳内皮細胞の特徴である。内皮層の傍細胞透過性は、フィルタの上方区画から下方区画へのTEER及びLY(457ダルトン)の流入速度を測定することによりモニターした。 TEERは、EVOMのvoltohmmeterに接続された12mmの培養杯分ENDOHM-12を用いて測定した。のTJの気密性 ​​を示す脳内皮単層のTEERは、(12ウェルプレートのフィルタは、データは示さず)、平均して300オーム·cm 2達した。 LYのためのPE(PE(LY)、バリアの完全性のコントロールとして使用し、試験化合物と同時インキュベート)は1年間で0.26±0.11×10 -3センチメートル/分( 図4F)の平均に達した。

RBECの炎症を誘導するために、我々は、広報を用い24時間、5 ng / mlののo-ジ炎症性サイトカインTNF-α、および​​120 ngの/ mlの倍増培養系の上部コンパートメントにRBECによってCCL2(MCP-1)の分泌を測定することにより炎症反応に続く(非250 ng / mlの( 図5A)にコントロール)で処理した。 PE(LY)の測定( 図5B)によって明らかにされた24時間5 ng / mlのか、50 ng / mlの時のTNF-α処理もBBBをオープンしました。

P-gpのは免疫細胞化学( 図6A)によって区別RBECで可視化した。グルタミン酸トランスポーター1(GLT-1)は主に側底画分45中に見出されている間P-gpの局在化は、高度に分極であることが知られており、内皮細胞44の頂端膜において本質的に発現される。我々の培養RBECの偏光の程度を評価するために、頂端及び側底タンパク質は、スクロース密度を用いて原形質膜調製物から分離した46の勾配。ウェスタンブロット解析であった血漿中のP-gpのおよびGLT-1の発現レベルを評価し、頂端および基底膜調製物。新たにラット脳から抽出された微小血管は、これらのタンパク質のインビボ分布( 図6B)に最も近い正の対照として使用した。微小血管および分化RBEC膜調製物の両方において、P-gpは、主にF1頂端膜画分( 図6B、C)に局在し、170 kDaのバンドとして表した。 GLT-1の発現は、実際に、65〜70 kDaのバンドとしての微小血管のF3基底膜画分に発現したが、培養したRBECでは検出されなかった。

平行実験では、内皮細胞単層におけるP-gpの機能的活性は、リガンドとしてローダミン123(R123)を用いて試験した。 R123の反管腔側に(AとB)の流出は反対方向( 図6D)に比べて1.7倍高かった。 P-gpの関与を証明するために、我々はverapami、特定のP-gp阻害を用いL(25μM、30分のプレインキュベーション)とシクロス​​ポリンA(1μM、30分のプレインキュベーション)。ベラパミルおよびシクロスポリン治療で、RBECでのR123の蓄積は、未処理の対照( 図6E)に比べ、それぞれ1.6倍と2倍に増加した

受容体媒介トランスサイト(RMT)のメカニズムに関与する受容体
モデルは、LRP1、LDLRかのTfR( 図7A)のような潜在的に、BBBのトランスサイトーシスの機構に関与異なる受容体の発現のために、さらに特徴づけた。

機能的輸送研究は、LDLRのTfRおよびリガンドを用いて行った。生きRBECは37°C( 図7B、C)で180分間、CY3(Tfのアビジン-Cy3)で標識したラットトランスフェリンとインキュベートした。 体外 BBBモデルラットにおけるTF-Cy3の取り込みと輸送の定量化は、曲線の傾きがわずかに2400ピコモルを超えて減少した秒( 図7B)は、結合/取り込みが飽和であることが示唆された。また、結合/取り込みの飽和は下部コンパートメントにおけるTFの蓄積と相関していた。この観察を確認するために、Tfはアビジン-Cy3は4,800ピコモル(プラトー/飽和)( 図7C)で非蛍光Tfの過剰1,200ピコモル(曲線の上昇する部分)でインキュベートした。これらの実験は、下部コンパートメント内のTF-Cy3の蓄積の減少を示し、私たちのin vitro BBBモデルにおけるリガンド-受容体相互作用の代表的な可飽和メカニズムを確認した。

同様に、LDLRの機能は、内皮細胞単層( 図7D、E)を横切るそのリガンドDiILDLの取り込みおよび輸送によって実証された。ライブRBECを37℃で30分間DiILDLと共にインキュベートした結合/取り込みは、下の区画( 図7D)でのDiILDLの蓄積と相関していなかった。ジイルの定量化DLトランスポートは、曲線の傾きは輸送が、我々のモデルでは飽和し、受容体関連であることが示唆された、2μgのを超えて減少した。アジ化ナトリウムは、前DiILDLインキュベーション( 図7E)に0.05%、15分で添加した。 0.05%アジ化ナトリウムでのインキュベーションの毒性の有無をPeが(LY)測定(データは示さず)によって評価した。これらの実験は、下の区画にDiILDL蓄積を減少させられた。全体的に、我々の結果は、我々 のin vitro BBBモデルでDiILDLためRMTをお勧めします。

ラット脊髄またはマウス脳からの内皮細胞に基づいて他のインビトロ BBBモデル
コラゲナーゼ/ディスパーゼが混在する酵素消化は、細胞の生存率および脳微小血管の製造歩留まりの面で制御する主要なパラメータの一つである。酵素の濃度や、より重要な組織への酵素の相対量、Nの比率ラット脳、ラット脊髄およびマウスの脳の間を正確に校正するEEDS。微小血管の播種密度および内皮細胞数が90%コンフルエンス(9日後の微小血管播種)に到達するためには、リンクされ、細胞増殖を改善集団倍加とモデルの質の数を制限する重要なパラメータであるした。ラット脊髄微小血管は、同じ時間スケール内でT75フラスコあたりの細胞の同量を得るために、(組織量、1脳にほぼ対応する2脊髄換算)ラット脳微小血管のために本明細書に記載したものと同様のプロトコールで作製した。彼らは皮質に付いているので5週齢のC57BL6マウスの脳から髄膜を除去することが困難であった。ディスパーゼと脳の簡単な治療は、髄膜の除去を容易にするために表示されます。ラット脳、ラット脊髄およびマウス脳からの再現性の内皮細胞単層の生産に貢献する重要なパラメータが強調表示され、にまとめられている図8。

図1
図1 のin vitro BBBモデル作成の主なステップを要約するチャートフロー。生産プロトコルの異なるステップは、一次内皮細胞培養物の再現性を高めるために、特定の曜日に割り当てた。プロトコルは、5週齢のWistarラットからの微小血管の生産で、最初の週の水曜日に開始されます。

図2
図2 RBEC、星状細胞および共培養系の位相差顕微鏡写真。プレートアウト時に、(A)5週齢のWistar系ラットの微小血管断片。(B)は 4μg/ mlの時のP-gp基質ピューロで2日間処理三日目のRBEC培養。型コラーゲンでコーティングした12ウェルプレートのミリポアフィルターにめっき後、(C)1日目で純コンフルエント内皮単層共培養を表す特徴づけられたハニカム形態を示した共培養の設立の日に挿入フィルタの周囲の細胞単層のIVおよびフィブロネクチン(D)均一性。(E)融合性アストロサイトの文化。(F)スキームC、DおよびEの顕微鏡写真の局在を持つシステム

図3
図3。免疫蛍光顕微鏡によるRBEC培養のキャラクタリゼーション。(A)は、脳内皮細胞は、血小板内皮細胞を表明セル境界部接着分子PECAM/CD31、(B)、フォンヴィレブランド因子(VWF)は、他のものより明るく、一部の細胞においてより凝集比較的点状の染色を示し、核周囲ゾーン中で濃縮した。(C)RBECのピューロマイシン処理なし培養物は、周皮細胞が(緑色)デスミンに陽性免疫染色で検出し、特徴的な小さな丸い核を持っている。(D)アストロサイトはグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)を発現している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図4
図4。 体外 BBBモデルとの傍細胞透過性ラットの免疫細胞化学特性評価LYは、内皮単層を横断。細胞単層は、内皮の形態およびタイトジャンクションタンパク質の発現と重複しない形態と、典型的な紡錘形細胞とコンフルエント脳内皮細胞単層を明らかにするために、(A)、ビメンチンを用いて免疫染色した(B)クローディン5 、(C)ZO-1および(D)12ウェルBBBモデルにおいても、ZO-1およびオクルディンタンパク質(E)のためのウェスタンブロットによって検出オクルディン、(F)単層の気密性 ​​は、ルシファーイエローの輸送を測定することによって評価したBBBによって保持されることが知られている(LY-CH、ジリチウム塩)、小さな親水性分子(MW 457ダルトン)。簡潔には、LYを、37℃で60分間、脳内皮細胞と接触して培養系の上部区画中でインキュベートしたこの時間の後、下部コンパートメントの培地を回収し、蛍光をspectrofluorimetで蛍光分析により定量した430 nmで励起し、535 nmでの発光を伴うER。結果は、10 -3センチメートル/分で透過性又はPeの中で発現される。 LYのPeは0.6×10 -3センチメートル/分を超える場合に障壁が透過性または開放と考えられている。各1時間の実験中に、平均クリアボリュームは、時間と、線形回帰分析によって推定勾配に対してプロットした。コラーゲンタイプIV、フィブロネクチンのコーティングを有する制御フィルタのクリアランス曲線の傾きは、ポリスルホンおよび脳内皮細胞単層を有するフィルタのためのクリアランス曲線の傾きたPStを付した付した。内皮単層(PSE)用のPS値は、から計算したこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

式(1)

PSE値は、ポルの面積で割ったOUの膜(12ウェルプレートのミリポアフィルター1.1 cm 2)で、その結果は0.26±0.11×10 -3センチメートル/分の平均値と透過係数(PE)であった。結果は、(アッセイ当たり6単層にN = N = 3の平均値)のn = 90アッセイのための垂直散布図表現されています。

図5
図5。前炎症性薬剤、TNF-αを用いた治療するためのin vitro BBBモデルの応答。培養系からの培養培地は、わずか6時間の上限の区画に5 ng / mlの時のTNF-α処理の前に交換し、12時間および24時間。 RBECによるCCL2の放出は、非処理対照と比較して、ELISAアッセイにより、上部コンパートメントに定量した。 MCP-1レベルは、時間の関数としてわずかに増加することに注意してくださいでも非処理ウェル中。 LY PE(LY)のために内皮Peので測定した内皮細胞バリアの完全性は、5 ng / mlのか、0.62±0.02×10の範囲で50 ng / mlの時のTNF-αで24時間処理することにより、単層の透過性の増加を明らかにした- 0.33±0.03×10 -3センチメートル/分(スチューデントt検定、p <0.05)での対照と比較してそれぞれ3センチメートル /分、0.7±0.01×10 -3センチメートル/分。

図6
P-gp排出トランスポーターとRBEC偏光免疫細胞(A)とウエスタンブロット(B&C)でアストロサイトとの共培養脳内皮細胞における排出トランスポーターのP-gpの発現の図6。機能 。細胞膜タンパク質は、細胞タンパク質fractionaで抽出したのTiONキット。原形質膜は、細胞小器官および核を除去するために低張性溶解および微分遠心分離によって得た。原形質膜から頂端及び側底タンパク質の分離は、蔗糖密度勾配によって得た。グルタミン酸トランスポーター1(GLT-1)は、主に側底画分(F3)に局在している間、P-gpのは主に頂端画分(F1)に局在していた。プレーティング前に精製された微小血管は、これらのタンパク質のインビボでの局在化のための対照として使用した。 P-gpの活性は、R123、P-gpのリガンドの輸送極性を測定することにより決定した。 1μMR123のフラックスは管腔から反管腔側(BとA)及び反対側の反管腔側対(AとB)の方向に37°Cで1時間測定した。同様の実験を、インサート·フィルター全体に受動拡散を評価するためにRBECことなく実現され、データはPE(R123)の計算のために、この値を基準に正規化した( 図5を参照してください。 (R123)に基づいて、管腔側から反管輸送の100%(BのA)として表される。ベラパミル(25μM、30分のプレインキュベーション)とシクロス​​ポリンA(1μM、30分のプレインキュベーション)を参照P-gpの阻害剤として使用された。 RBECでのR123の蓄積は、P-gp阻害(スチューデントのt検定、p <0.05)とのプレインキュベーションの有無にかかわらず、2時間後に測定した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図7
図7。受容体を介したトラに関与する受容体のキャラクタリゼーションnscytosis(RMT)。(A)分化したRBEC単層を低密度リポタンパク質受容体関連1(LRP1)および低密度リポタンパク質受容体(LDLR)に対する抗体で免疫染色した。 RBECの共焦点画像はDiILDL、LDLRの蛍光リガンドの取り込みのために、そしてラットトランスフェリンのCy3、核周辺領域内のいくつかのクラスタリングを用いて細胞表面上のTFR表示点状の染色、蛍光リガンドの取り込みをプローブした。(B)ラットTF-Cy3のは75、150、300、600、1,200、2,400および4,800ピコモルで差​​別RBEC単層を含む上部区画に追加されました/ 37℃(200μLの上部コンパートメント内および1,200μLの中で180分間挿入下部コンパートメント)。この後、Cy3蛍光は570 Nで550 nmおよび放射で励起し蛍光分光光度計で蛍光分析によって細胞溶解物(PBS200μLの0.1%トリトンX100)にし、下部コンパートメントに定量化したM。蛍光単位は、線形動作範囲を用いてピコモルで形質転換した。(C)飽和実験では、ラットのTf-Cy3では1,200ピコモルで分化RBEC単層を含む上部コンパートメントに添加した/または15せずに37℃で180分間インサート4,800ピコモル/非蛍光Tfのインサートとのプレインキュベーション分。下部コンパートメントにおける輸送は、(B)(スチューデントt検定、p <0.05)のように定量した。(D)DiILDLは1、2、4、8μgの挿入/フィルターで分化したRBEC単層を含む上部コンパートメントに添加した37℃(上部コンパートメント内の200μLと下部コンパートメント1,200μL)で30分間。この時間の後、のDiIの蛍光は571 nmで554 nmおよび放射で励起し蛍光分光光度計で蛍光分析によって細胞溶解液(PBS、0.1%トリトンX100の200μL)にし、下部コンパートメントに定量化した。 Fluorescenceユニットは、線形動作範囲を用いてμgの中に形質転換した。(E)ブロッキング実験輸送のために、アジ化ナトリウムは、2μgの/ 37℃で30分間インサートでDiILDLのインキュベーションの前に、0.05%で15分間添加した下部コンパートメントにおける輸送は、(D)(スチューデントt検定、p <0.05)のように定量した。 0.05%のアジ化ナトリウムのインキュベーションの毒性がないことは、PE(LY)測定(データは示していない)により評価した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図8
図8 において、ラット脊髄内皮細胞から、またはマウス脳からのインビトロ BBBモデル。ハイテーブルラット脳、ラット脊髄およびマウス脳からの微小血管抽出のための重要なパラメータを点灯します。顕微鏡写真は、ラット脳、ラット脊髄およびマウス脳から調製された内皮細胞単層におけるZO1とオクルディンの免疫染色を示しています。

Discussion

私たちは、RBECの精製および培養後、さらに特徴的なBBB特性用いたin vitro BBBモデルを生成するために、初代ラットアストロサイトとの共培養のセットアップ、脳の微小血管の分離と、めっきのための週刊再生可能なプロトコルの実装について説明します。

首尾体外 BBB培養標準化を確立するプロセスの複数の連続的なステップで最適な条件を必要とする。モデルは、(A) のin vitro BBBモデルの「聖杯」のままで、最低傍細胞透過性を得るために最適化され、(b)の流出およびRMTメカニズムを検証した。

RBECの生産、精製及び増殖

RBEC栽培の最大の課題は、異なる文化間の再現性を達成することである。プロトコルの標準化は、DISのための高品質なツールが必要ですセクション、高品質の試薬および試薬の有効期限に関して。実験者は、皮質表面からの髄膜および大血管の迅速な除去のために実体顕微鏡下で顕微解剖の熟練される必要がある。脳を単離して、機械的に分離されると、大きな課題の一つは、新たに単離した脳の微小血管の最適な酵素消化である。使用される酵素の種類と品質が重要です。バッチ間の低い変動性を有する高濃度のコラゲナーゼ·タイプIとIIとディスパーゼの組み合わせを使用した。また、重要な酵素消化の持続時間および酵素濃度/消化の組織重量/体積の比である。脳の微小血管の生産の最高の収率は30分、1時間、それぞれ、両方の消化中に60μg/ mlので混合ディスパーゼ/コラゲナーゼの1ミリリットル中に1脳から皮質に相当して得られた。

また、重要な細胞を汚染の排除であるS(アストロサイト、主に周皮細胞)。これらの細胞は、内皮細胞よりも速い速度で増殖し、良好な傍細胞拘束性と均一な細胞単層の確立を防止し、後者でタイトジャンクショ​​ンを確立していない。非内皮細胞が除去されている間、脳内皮細胞が微小血管に見出される他の細胞型と比較して、排出ポンプ、特にP-gpのはるかに高いレベルで発現することを考慮すると、それらは、P-gpのリガンド薬物のそれ以外の毒性濃度をより良く耐える。最初の二日間、4μg/ mlのピ​​ューロマイシンでの処理は、良好な内皮細胞の純度を得るために2μg/ mlの少なくとも2日間続いた。この選択には、細静脈、前毛細血管動脈以上の微小血管からのものと比較毛細血管内皮細胞を支持し、より緊密な単層につながることができます。また、貧しい人血漿由来ウシ血清の使用は、内皮細胞47,48の純粋培養を得ることが不可欠です。プラズマデアived血清は、平滑筋細胞および周皮細胞のために、従って、線維芽細胞に対して分裂促進性である血小板由来増殖因子(PDGF)を欠く。

我々は、マウス由来のIV型コラーゲンの混合物を有するプラスチックとフィルタの治療及びヒトフィブロネクチンは、ラットの尾から伝統的に推奨されるコラーゲンタイプIと比較して、増殖収量の2倍の増加で、重要な利点をもたらすことを観察した。細胞増殖のための重要な手がかりは、インテグリンおよび増殖因子(bFGF)の活性化などの細胞外マトリックス49によって提供される。培地の緩衝液濃度及びpHは、傍細胞気密50に積極的に影響を与えることが記載されており、我々は、少なくとも5mMのHEPES緩衝液を添加して培養物との間の良好な再現性が観察された。

挿入フィルター上の共培養設立:RBECの分化

脳内皮細胞は、BたらEENを精製し、6日間増殖し、これらはフィルター上に播種することができる。高密度細胞播種は完璧な単層を得るために重要である。 12ウェルプレートフィルター当たり160x10 3細胞の播種密度で播種後のコンフルエントな単層を24時間を得るために必要かつ十分であった。しかしながら、その環境からの一次脳毛細血管内皮細胞の単離は、それが一次細胞、および特に脳毛細血管内皮細胞は、強く、環境によって調節および誘導因子はによって産生されることが知られているように、BBB のin vitroモデルの構築におけるパラドックスである異なる周囲の細胞型。脳毛細血管内皮細胞は、単独で急速に脱分化を培養し、いくつかの特定の脳内皮マーカーを失う。このように、一次内皮細胞は、低継代(P1)で使用されるべきであり、再接続された、少なくとも部分的に、星状細胞により馴化星状細胞47,51又は媒体との共培養によるそれらの環境と。これが成立脳内皮細胞とアストロサイトのようなアストロサイト分化のための真の双方向の誘導に関与している。アストロサイトとのRBECを培養するinterendothelial TJ 52,23の強い誘導につながった。再誘導の分子機構はほとんどわかっていない、と研究は、最適な内皮細胞分化53,54を促進することができアストロサイトから分泌される特定の変調因子を特定するためにいくつかの研究室で進行中である。白血病抑制因子(LIF)を含む、脳内皮細胞によって分泌される因子は、アストロサイト分化55,56を誘導することが示されている。共培養の確立の前に、星状細胞を分化グルココルチコイド受容体アゴニストヒドロコルチゾンを含む培地と共培養馴化培地に曝露した。ヒドロコルチゾンは、脳内皮細胞の気密性 ​​を向上させることが知られており、特にラットおよびマウス57 58,59内皮細胞からBBBモデルにおいて使用される。エアコンMEDIウム3日後、内皮細胞/アストロサイトの共培養系の下部区画から回収し、後の使用のために凍結される。共培養条件培地の使用は、2日以上のための最適な傍細胞透過性と文化の間も改善再現性の3日前の内皮細胞分化の時間を減少させた。

全体的に、我々が説明するプロトコルは、0.26±0.11×10 -3センチ最高の一次電池ベースのBBBモデル22と同様/分の300オーム以上の再現性TEER·cm 2であり、平均傍細胞透過係数PE(LY)が得られる12。我々は微小血管酵素消化の提案された変調に本原稿に記載するプロトコルは、ラットの脊髄60から、およびマウス脳から内皮細胞に拡張することができる。

分子·機能解析

加えてTJ誘導のために、星状細胞はまた、脳内皮細胞における61 P-gpのような排出トランスポーターの発現に寄与する。我々は、実際にBBBモデルにおける排出トランスポーターP-gpの発現を示し、我々は、生化学的アプローチを用いて、P-gp排出ポンプ局在化、および機能的アッセイを用いてP-gpの活性の極性を示す。 GLT-1の発現は、微小血管の基底膜画分に検出されたが、培養されたRBECでは検出されなかった。私たちは、GLT-1がダウンウエスタンブロット分析によって検出可能なin vivo条件下 、結果的にはないと比較して、当社のRBEC培養でレギュレートされたと仮定した。過剰なグルタミン酸が神経毒性であり、 生体内で、GLT-1は、先端区画(血液循環)に基礎コンパートメント(実質)からのグルタミン酸流出を担当しています。星状細胞培養物においては、GLT-1発現は非常に低いままであり、媒体62,63にグルタミン酸を添加することによって誘導される。

またをconfこのようなLRP1、LDLRとのTfRなどの頂端膜に流入輸送体の発現をIRM。のTfRとLDLRの機能は、以前に体外 BBBモデル64 ウシで示すように、単層の反管腔側に腔側からTF-Cy3およびDiLDLの結合実験および輸送に実証された。興味深いことに、星状細胞からの脂質の要件が65,66は、さらに、インビトロで含む、星状細胞および脳内皮細胞との間の生理学的なクロストークを確認する脳毛細血管内皮細胞上のLDLRの発現を増加させることが示されている我々は、蛍光色素で搬送を例示するために選択したようなCy3及びDIIを使用する蛍光分光分析は、ほとんどの実験室で提供され、 体外BBBモデルで検証するために有用であることを証明できることを考えるととして。しかしながら、蛍光の定量化は、放射能よりもはるかに感度が低いと有意なデータを得るための実験の数の増加を必要とする。理想的には、TFおよびLDLは通常、このような結合/取り込み及び輸送実験のための(ヨウ素125)の放射性標識である。

また、CCL2リリースとBBBの開放によって明らかにされるように提案されたプロトコルを用いて得られた分化した内皮細胞単層は、TNF-αによって誘導される炎症に反応することを示している。 CCL2(MCP-1)およびその受容体CCR2が、多発性硬化症などのCNS ​​病理に関与している、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)67、CNS外傷68とは、神経炎症条件下69,70の下でCNSへの白血球遊走メディエーターとして知られている。 BBBの開口部がCCL2濃度が上(頂端)と下位(基礎)の区画の両方の間で平衡化することができるため、テストのプロトコルでは、我々のCCL2偏分泌に結論付けることはできません。その結果、我々は明らかに、24時間( 図5A)で、頂端区画内にRBECによって生成CCL2の量を過小評価しています。

一般概要とin vitroモデル BBBの制限:人間の比較に対するインビトロおよびげっ歯類に対するI Nビボ

in vitroでのBBB通路に有効であることが証明され、多くの有望な中枢神経系薬は、多くの場合、ヒト以外の種から単離された細胞に基づいて体外 BBBモデル預け予測可能性の欠如のために臨床試験に失敗しました。それはタンパク質ネットワーク、シグナル伝達、トランスポーターと受容体の機構的な側面を研究することになると我々の知る限り、 生体外 BBBモデルは、おそらくより予測となる。 in vitroで研究するためにあらゆるメカニズム、経路またはターゲットは、同じ動物種との相補的な環境合図(他の細胞型、化学物質、蛋白質)によるその調節のために特徴づけられ、 その場での研究するために結合する必要がある、および可能な場合は、下記の誘発の制限、注意して、ヒトから分離された微小血管内皮細胞を用いた。

in vitroでのBBBモデルは、ボディの規制から分離自律システムとして見られることがありますが、まだ主要なin vivoでの特性や環境の合図による規制の可能性に恵まれている。内皮細胞単層は、神経グリア血管部(NGVU)の重要な構成要素の数を欠き、血液及び身体調節から単離されているので、インビトロ BBBモデルは「理想的な」は、まだ71,72,73提案されていない。周皮細胞のニューロン17,18又は74,16又はプラスチックコーティングまたは内皮に基づいて、最も一般的で、「最も簡単な製「 インビトロ BBBモデルにおける細胞増殖に用いられる培地および血清に用いられる細胞外マトリックスの種々の成分の欠如アストロサイトに分化した細胞は、タンパク質の発現を調節することができるiのN in vivo 状況75との比較。これらのモデルは、 生体内で表示された多くのトランスポーターを発現し、すべてではなくてもよい。いくつかの場合において、トランスポートパラメータは、第離された微小血管( インビボ状況に最も近い)で確認した後、細胞培養系76,61において研究。

分子生物学的研究が可能となった同じ種から単離された微小血管と低通過内皮細胞培養における遺伝子およびタンパク質の発現特性評価、異なる種の間で、最も頻繁にそのようなげっ歯類(マウスおよびラット)またはin牛や豚からの小動物から人間77,78,75,15との比較。 in vivoおよびin vitroの脳の微小血管内皮細胞におけるトランスクリプトームの間の比較は、示差的に発現され、最も頻繁にインビトロで有意にダウンレギュレートされた多数の遺伝子転写物を示した。などのTfRやPRなどの流入輸送体をコードする転写小胞輸送に関与oteinsは主に細胞内のエンドサイトーシスおよび小胞輸送の一般的な減少を示唆して、培養された脳内皮細胞において下方制御されています。純度(ピューロマイシン処理)及びヒドロコルチゾンを用いた治療の面で培養操作は、より「 インビボ様」遺伝子発現プロファイル77を復元するのに役立ち得る。トランスクリプトームの研究はまた、さらに体外 BBBモデル75 内の齧歯類に基づいて、ヒトにおける薬剤の取り込みに予測を複雑にし、種間の重要な相違点を明らかにした。ヒト内皮細胞とアストロサイトの共培養を含むインビトロ BBBモデルは、15に記載されている。関連するが、それらは、死後のヒト組織への調節のアクセスを必要と異質性は、年齢、疾患、およびおそらく医学的に依存してヒト脳内皮細胞の品質/特性の中にあるように、これらのモデルは、定期的に実施するのがより困難であるtreatmenドナーのT。努力はよりよい生理的、解剖学的およびin vivoでの BBBの機能特性を再現新しいin vitroモデルを開発するために行われなければならない。 3セル型を含む共培養物は、非常に限定的であり、日常的に実施が困難で表示される。現在までに、最も複雑な生体外 BBBモデルはアストロサイトと血管様組織を含み、血流75,79,80,81,82を模倣媒体の流れを含んでダイナミックなin vitroモデル(DIV-BBB)です83,84,85。脳の内皮細胞は流れにさらされると、生成された剪断応力は、例えば、細胞分裂、分化、移動およびアポトーシス80内皮細胞生理学に関与する別の遺伝子の発現を調節する細胞表面でmechanotransducersを活性化する。 インビボ、せん断応力血流によって生成されるの確立を許可する細胞接触、で有糸分裂停止を担当してい血管80内の内皮細胞単層。正常なヒト脳微小血管内皮細胞のゲノムおよびプロテオーム解析は、BBB内皮生理学84のせん断応力の影響を示した。せん断応力は、CYP450によって媒介75,86、酸化は75酵素および細胞生存、内皮細胞接着度が高く、排出ポンプの誘導およびトランス75、グルコース代謝の調節のより良好な分極に関与する発現を増加させることによって、傍細胞透過性の調節オクルディンとZO-1 87,75,80、結果的に高いTEERのような細胞間の接合部の要素をコードする遺伝子の約1,500 - 2,000Ω·cm 2で、 生体内で知られているに最も近い79,80パラメータ

バイオテクノロジー及び製薬産業、医薬品のルーチンのスクリーニング、あるいはハイスループットスクリーニング(HTS)および動物実験を削減する努力において、主導セットアップするのに日常的により難しいままで脳内皮細胞の初代培養物の交換に使用される異なる細胞株の開発。ほとんどの場合、脳内皮細胞の初代培養物は、プラスミドDNAのトランスフェクションにより、またはレトロウイルスベクター用いて感染88,89,75のいずれかによって、不死化遺伝子(SV40又はポリオーマウイルスラージT抗原またはアデノウイルスE1A)で形質導入した。 88,75などRBE4、GP8/3.9、GPNT、RBEC1、TR-BBBSまたはrBCEC4ラット細胞株などの脳由来の内皮細胞株が開発されてきたいくつかの、b.End3マウス細胞株90,75、PBMEC/C1 - 2ブタ細胞株87,75、およびhCMEC/D3ヒト細胞株89,75。他のモデルは、マディン·ダービーイヌ腎臓(MDCK)またはたCaco2細胞株12,75などの非脳由来の細胞に基づいている。異なるヒト脳血管内皮細胞株の中で、hCMEC/D3は広く引用されていますDと2005 91,92年の設立以来、BBBのモデルとして改良された。初代培養細胞株に存在利点と制限などである。彼らは、初代培養よりも扱いやすい延長寿命を持って、十分に特徴付けされており、大規模な実験間の再現性を可能にします。しかしながら、細胞株は、組織特異的機能を失う環境規制を失い、 インビボ75、89中の細胞とは全く異なる分子表現型を獲得することができる。具体的には、単層の細胞株から現在減少し圧迫感、低TEERおよびshowポータープロファイル変動75,89を生成しました。このように、一次細胞での動物実験や研究は、多くの場合、その複雑さにもかかわらず、好ましい。

Acknowledgments

VECT-HORUSへの財政支援は、フォンユニークInterministériel(FUI / MEDULプロジェクト)から承認され、通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ(ANR、TIMPAD、VECtoBrain、VEC2Brain、ADHOCとPREVENTAD共同プロジェクト)からとUMR7259の実験室ホルスVEC​​Tする。 UMR7259研究所もCNRSからエクスマルセイユ大学からの財政支援を認めるものです。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

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References

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