Etablering af en
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Medicine
 

Summary

Formålet med den foreliggende undersøgelse var at validere reproducerbarheden af en in vitro BBB model involverer en rotte syngen co-kultur af endothelceller og astrocytter. Endotelcellen monolag præsenteret høj TEER og lav LY permeabilitet. Ekspression af specifikke TJ proteiner blev funktionelle reaktioner på betændelse og funktionalitet af transportører og receptorer vurderes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Blod-hjerne barrieren (BBB) ​​regulerer specifikt molekylære og cellulære flux mellem blodet og nervevævet. Vores mål var at udvikle og karakterisere en meget reproducerbar rotte syngen in vitro model for BBB hjælp co-kulturer af primære rotte hjerne endotelceller (RBEC) og astrocytter til at undersøge receptorer involveret i transcytose over endotel cellemonolaget. Astrocytter blev isoleret ved mekanisk dissektion efter trypsinfordøjelse og blev frosset til senere co-kultur. RBEC blev isoleret fra 5 uger gamle rotte cortex. Hjernerne blev renset af meninges og hvid substans, og mekanisk dissocieret efter enzymatisk nedbrydning. Derefter blev vævet homogenatet centrifugeret i okseserumalbumin at adskille fartøjets fragmenter fra nervevæv. Fragmenterne fartøjets undergik en anden enzymatisk fordøjelse til frie endotelceller fra deres ekstracellulære matrix. De resterende kontaminerende celler, såsom pericytter blev further elimineres ved udpladning af mikrokar fragmenter puromycin-holdige medium. De blev derefter passeret på filtre til co-kultur med astrocytter dyrket på bunden af ​​brøndene. RBEC udtrykte høje niveauer af tight junction (TJ) proteiner såsom occludin, claudin-5 og ZO-1 med en typisk lokalisering ved cellekanterne. Den transendothelial elektriske modstand (TEER) af hjernens endotel monolag, der angiver tæthed TJs nåede 300 ohm · cm2 i gennemsnit. De endotelpermeabilitet koefficienter (PE) for lucifer gul (LY) var meget reproducerbar med et gennemsnit på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Brain endotelceller organiseret i monolag udtrykte efflux-transporteren P-glycoprotein (P-gp), viste en polariseret transport af rhodamin 123, en ligand for P-gp, og viste specifik transport af transferrin-Cy3 og DiILDL tværs af endothelcelle monolag. Afslutningsvis giver vi en protokol til opsætning af en in vitroBBB model, der er meget reproducerbar på grund af kvalitetssikring metoder, og det er velegnet til forskning på BBB transportører og receptorer.

Introduction

Mange lægemidler, der er udviklet til behandling af centralnervesystemet (CNS) lidelser er ude af stand til at nå hjernen parenkym i terapeutisk relevante koncentrationer. BBB beskytter hjernen nervevæv fra udsving i plasma sammensætning, patogene midler og fastholder homeostase hjerneparenkymet ved at begrænse ikke-specifik flux af ioner, peptider, proteiner og endda celler ind og ud af hjernen 1.

BBB egenskaber induceres og vedligeholdes af intim nærhed og cross-talk mellem de specialiserede klasse hjerne mikrokardannelse endotelceller og tilstødende elementer i neuro-glia-kar-enhed (NGVU) såsom neuroner, gliaceller (mere præcist astrocyte ende-fod), og pericytes ensheathed i basalmembranen, der hovedsagelig består af collagen type IV, fibronektin, laminin og proteoglycaner 2,3. Pericytes dækker cirka 22-32% af endotel på kapillær niveau og spiller en vigtigrolle i reguleringen af ​​endotel proliferation, angiogenese og inflammatoriske processer. Endotelceller udgør et kontinuerligt ark, der dækker den indvendige overflade af kapillærerne. De er indbyrdes forbundet ved TJs, der danner et bælte-lignende struktur på den apikale region, og som bidrager til celle polarisering. Astrocytter regulere BBB egenskaber og er kilder af vigtige regulatoriske faktorer, såsom TGF-β, GDNF, bFGF og IL-6. Astrocytter med mangelfuld GFAP ufuldstændig funktionalitet er ikke i stand til at regulere BBB egenskaber 4. Neuroner er ikke direkte involveret strukturelt i dannelsen af BBB, men også regulere vigtige aspekter af protein-ekspression og BBB-funktioner 5.

For yderligere at studere strukturen, fysiologi og patologi BBB blev in vitro modeller af BBB udviklet som forskning værktøjer. Brain endotelceller er blevet udvundet fra forskellige arter for at gennemføre in vitro BBB-modeller baseretpå lavpassage primære kulturer fra kvæg 6,7, svin 8,9, rotte 10,11,12, mus 13 og også menneskelig 14,15. Disse modeller er kendt for at efterligne in vivo BBB, især når co-dyrket med gliaceller fra rotte eller murine og / eller pericytter 16,12 og / eller neurale progenitor celleafledte astrocytter 17 og / eller neuroner 18. De "i lab" modeller er ofte fremstillet af gnavere, fordi de tillader in vitro / in vivo-forsøg og sammenligninger og / eller undersøgelse af hjernens endotelceller fremstillet af transgene modeller 19.

Nyudviklet in vitro BBB-modeller er også blevet designet til at hjælpe med at forudsige hjerneoptagelse af potentielle CNS lægemiddelkandidater inden in vivo-test 15,20,21,3,6,22,11,23. In vitro BBB modeller er normalt bruges til at sammenligne transport af stoffer med: i) kendte indtrængen i CNS eller med low gennemtrængelighed over BBB, og ingen centrale virkninger, og ii) den tilsyneladende Pe af de samme stoffer målt i dyremodeller af samme art. De lægemidler, der let passerer BBB er for det meste lipofile og krydse hjernens endotel cellemembraner ved lipidmedieret fri diffusion (koffein, carbamazepin, osv.). De negativt transporterede stoffer som digoxin, verapamil eller cyclosporin A er aktivt ekstruderet af hjernen endotel effluxtransportører såsom P-gp. Men mange af de nyudviklede terapeutiske molekyler er biopharmaceuticals, såsom rekombinante proteiner, siRNAs eller monoklonale antistoffer. De fleste af dem ikke krydse BBB skyldes: i) der ikke findes specifikke transportører, og ii) det tætpakkede lag af endothelceller, som forhindrer højmolekylære molekyler fra undergår paracellulær passage. Med disse grænser, "trojanske hest" strategier er blevet gennemført ved hjælp af vektorer (antistoffer, peptider) mod kendte receptorer på BBB, der er involveret in receptormedieret transport eller transcytose (RMT), såsom transferrin (Tf)-receptor (TFR), insulinreceptoren (IR) eller medlemmer af LDL-receptoren (LDLR)-relateret receptor familien (LDLR, LRP1). Sådanne receptorer er blevet fundet på isolerede hjerne kapillærer og BBB in vivo 24,25. Transkriptionelle profiler til disse receptorer, især dem på LDLR familien, blev analyseret og sammenlignet mellem hjernens endotelceller og hjerne endotelceller co-dyrket med astrocytter eller i hjernens kapillærer direkte efter deres udvinding fra hjerne 26. Pardridge 24 åbnede felt med OX-26-antistof mod transferrin-receptor (TFR), efterfulgt af antistoffer mod insulin-receptoren og insulin-vækstfaktor receptor 27,28. Med disse antistofbaserede vektorer har ArmaGen Technologies udviklet en BBB molekylær trojansk hest platform teknologi til at levere lægemidler, herunder proteiner, over BBB 29. Denlitteratur er rig på data, der viser LRP1 udtryk i hjernens endotelceller og dens rolle som en stærk endocytic / scavenger receptoren. Western blot-analyse antydede, at LRP1 udtrykkes i fraktioner beriget med hjerne kapillærer og rottehjerne endotelceller 30. Firmaer som Angiochem target LRP1 med peptid vektorer afledt fra aprotinin, der fremmer en effektiv medicin tilstrømning over BBB 31. Dog er LRP1 også involveret i aktiv transport af Ap og dets udstrømning / clearance fra hjerneparenkymet til blod 32. Sådanne data indebærer LRP1 i et tovejs transport over BBB, afhængigt af dets ligander. biOasis udvikler Transcend teknologi ved hjælp af et protein melanotransferrin til transport af biologiske lægemidler, såsom lysosomale enzymer og antistoffer over BBB 33 mens VECT-HORUS udvikler peptid vektorer, der er målrettet LDLR 34. Der er data tyder på, at LRP og LDLR kan anvendes til at transportere different molekyler, såsom lysosomale enzymer 35,36 eller nanopartikel komplekser over BBB 37.

Vores område af interesse er drug delivery til CNS hjælp vektormolekyler og vektoriseret lægemiddelkandidater-kandidater til behandling af CNS-sygdomme. Især drug delivery over BBB skal betragtes inden for rammerne af neuroinflammation, en proces, der kan variere i sin udstrækning, men det er nok fælles for alle CNS-læsioner og sygdomme, herunder encephalitis, dissemineret sklerose, Alzheimers sygdom osv. Neuroinflammation er forbundet med BBB betændelse og potentielt med ændringer i BBB fysiologi og permeabilitet overvejer at paracellulære og transcellulær transport kan forstærkes i patologiske tilstande 38,39,40,41,42,43. For eksempel, TNF-α, nappe og andre cytokiner modulerer inflammation og forsøg med in vitro BBB modeller har vist, at de kan ændre den paracellulære egenskaber the endotelcelle monolag 38,39,40 og TNF-α fører også til en stigning i transcellulær transport af LDL 41 holotransferrin 42 og lactoferrin 43.

Vores mål var at udvikle og karakterisere en optimeret og meget reproducerbar rotte syngen BBB model ved hjælp af co-kulturer af primære hjerne endotelceller og astrocytter. Vi brugte 5 uger gamle og neonatale Wistar-rotter for hjernens endotelceller produktion og astrocyt produktion hhv. En udfordring var at etablere en protokol mulighed for produktion af "ugentlig reproducerbare" BBB-modeller. For at nå dette mål blev alle trin i produktionen protokol udføres på faste dage i ugen, startende fra hjerne mikrokardannelse produktion på onsdag i den første uge. Dissektioner blev udført næsten hver uge i løbet af de sidste 3 år. For yderligere at forbedre reproducerbarheden af ​​kulturerne blev et kvalitetssikringssystem etableret. Alle reagents og kemikalier blev refereret i en database (dato for indrejse, bestand, udløb sigt osv.).

Modellen var præget efter en række kriterier, såsom endothelcelle organisation og renhed, TEER, LY permeabilitet, reaktion på pro-inflammatoriske midler, kvalitative og kvantitative udtryk for TJ proteiner, funktionalitet effluxtransportører såsom P-gp, og receptorer involveret i transcytose over endotel cellemonolaget såsom TFR eller LDLR.

Protocol

1. Produktion af rotte Astrocyter

For hvert præparat bruge 10 neonatale Wistarrotter af begge køn.

  1. Sacrifice rotterne ved at skære hovedet med en saks og overføre dem straks i en tør petriskål under en laminar flow hætte. Fjern hjerne fra kraniet uden cerebellum og overføre dem straks i en petriskål indeholdende koldt dissektion buffer: HBSS suppleret med 1% bovint serumalbumin (lavt niveau af endotoksin BSA), penicillin 100 enheder / ml og streptomycin 100 ug / ml.
  2. Skær hjerner i halve, for at adskille de 2 hjernehalvdele og overføre dem til en ren petriskål med dissektion buffer på is. Skær synsnerven og fjerne meninges under et stereomikroskop.
  3. Vask de cortikale stykker udførligt i 50 ml kold dissektion buffer.
  4. Placer kortikale stykker fra 3 hjerner ind i et 15 ml Falcon rør og dissociere ved pipettering op og ned et kuple gange med 10 ml engangspipette udstyret med en blå spids i 6 ml trypsin 0,05% - 0,02% EDTA i 5 minutter ved 37 ° C.
  5. Tilføj 24 ml DMEM suppleret med 10% FBS og følgende antibiotika, penicillin 100 enheder / ml og streptomycin 100 ug / ml, et medie navngivet glialcelle medier (GCM), og centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. FBS batches blev udvalgt og valideret til vækst og overlevelse af astrocyt cutures.
  6. Pellet resuspenderes indeholder de dissocierede celler i 10 ml GCM og plade ind i et 75 cm 2 T-kolbe (T75). Skift medium den følgende dag for at fjerne cellerester og DNA. Udskift dyrkningsmediet to gange om ugen.
  7. Efter 1 uges spredning, ryst forsigtigt gliaceller med en orbitalryster ved 60 rpm i løbet af 24 timer ved 37 ° C i GCM. Hvis T75 ikke kan placeres i en inkubator med 5% CO 2/95% luft ved 37 ° C befugtet atmosfære, supplere mediet med 5 mM HEPES. Vask cellerne to gange for at reFlyt de ikke-adhærente mikrogliaceller.
  8. Tre uger efter såning, vaskes cellerne to gange med DPBS uden calcium og magnesium. Tilsæt 3 ml varmt trypsin 0,05%-EDTA 0,02%, inkuberes ved 37 ° C, og vent, indtil cellelag er spredt (normalt 5 min). Inhibere trypsin-aktivitet ved tilsætning af 10 ml GCM overføre cellesuspensionen i et 15 ml Falcon-rør og centrifugeres ved 120 xg i 8 min.
  9. Resuspender astrocyte pellet i 90% FBS - 10% DMSO, overføre dem i kryoglas (2 x 10 6 celler pr cryovial) og gemme i flydende nitrogen.

2.. Isolering af rottehjerne mikrokar

Vores eksperimentelle procedurer er godkendt af den etiske komité i det medicinske fakultet i Marseille og i overensstemmelse med nationale og europæiske regler (EU-direktiv nr. 86/609). Blev gjort alle bestræbelser på at minimere dyrenes lidelser og mindske antallet af dyr, der anvendes.

  1. For hvert præparat og for en Experimenter, bruge 3 fem uger gamle Wistarrotter.
  2. Mandag i den første uge, forberede to T75 kolber ved overtrækning med kollagen type IV og fibronektin, både på 1 ug / cm 2 i steril kultur vand (10 ml per T75). Tillad at klæbe ved 37 ° C, indtil mikrokardannelse såning.
  3. Onsdag morgen af den første uge, aflive rotterne under en stigende flux af CO 2 for at fremkalde døsighed, tab af kropsholdning og vejrtrækning afbrydelse, derefter fulgt af en cervikal dislokation. Spray hoveder med 70% ethanol. Skær hovederne med en saks og overføre dem i en tør petriskål under en laminar flow hætte.
  4. Fjern hjerne fra kraniet uden cerebellum og synsnerven og derefter overføre dem i en petriskål afkølet på is og fyldt med koldt dissektion buffer (HBSS suppleret med 1% BSA, penicillin 100 enheder / ml og streptomycin 100 ug / ml) .
  5. Skær hjerner i halvdelen at adskille de 2 hjernehalvdele og separate midthjernen fra forEbrain. Overfør forebrains i en ren petriskål på is med dissektion buffer.
  6. Tag et par halvkugler i en ny petriskål med koldt dissektion buffer til forsigtigt at fjerne meninges fra forebrains under et stereomikroskop med N ° 5 buede pincet. Derefter rense det indre af hjernen til at fjerne dynen af ​​myelin og få en skal af cortex. Disse skridt bør ikke tage mere end 2 timer for vævs bevarelse og celleoverlevelse.
  7. Adskille cortex fra 3 hjerner i 6 ml koldt dissektion buffer i en 7 ml Dounce-homogenisator med 10 bevægelser op og ned med hver af to stempler af forskellige frirum, 71 um efterfulgt af 20 um.
  8. Opdel suspensionen for at opnå svarende til 1 cortex i 1 ml af en 50 ml Falcon-rør og centrifugeres ved 1000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten.
  9. Fordøje suspensionen fra 1 cortex med 1 ml af en enzymatisk opløsning, der indeholder en blanding af kollagenaser / dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), DNase I (35 ug / ml - 20 K enheder / ml) og gentamicin (50 ug / ml) i en ryster i 30 min ved 37 ° C.
  10. Bland 1 ml fordøje 1. cortex med 10 ml 25% BSA / HBSS 1X og adskilt ved vægtfylde afhængig centrifugering ved 3.600 x g i 15 minutter ved stuetemperatur. Overføre forsigtigt den øverste skive (myelin og hjerneparenkymet) og supernatanten til et rent 50 ml Falcon rør og gentag centrifugering. Hold den resulterende pellet indeholdende hjernen mikrokar ved 4 ° C.
  11. Kassere forsigtigt øvre skive og supernatanten. Resuspender begge resulterende pellets indeholdende hjernen mikrokar med 1 ml kold HBSS 1X og overføres til et rent 50 ml Falcon-rør.
  12. Vask mikrokar ved tilsætning af 20 ml kold HBSS 1X og centrifugeres ved 1.000 xg i 5 min. Supernatanten.
  13. Yderligere fordøje mikrokar fra 1 cortex med 1 ml af det samme enzymatiske opløsning som beskrevet i trin 2.9 i løbet af 1 time ved 37 ° C i en shAker.
  14. Derefter blandes de spaltede mikrokar fra hver af de 3 cortex i et rør, og yderligere at adskille i to 50 ml Falcon-rør for at opnå mikrokar ekstraheret fra svarende til en og en halv (1,5) cortex per rør. Der tilsættes 30 ml kold dissektion buffer og centrifuger ved 1.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
  15. Resuspender mikrokar pellet i 10 ml DMEM/F12 suppleret med 20% bovint blodpladefattigt plasmaafledt serum, basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, 2 ng / ml), heparin (100 ug / ml), gentamicin (50 ug / ml) og HEPES (2,5 mM), opkaldt endotelcelle medier (ECM) suppleret med puromycin ved 4 pg / ml.
  16. Tag de 2 coatede T75 kolber fra inkubatoren, opsug overskud af belægning og pladen mikrokar fra hvert rør i en T75 kolbe (mikrokar udvundet fra 1,5 cortex pr T75 kolbe).

3.. Oprensning og spredning af RBEC Primocultures

  1. Oprensning: onsdag til fredag, tilføje puromycin ved 4 ug / ml til dyrkningsmediet. Skift mediet på torsdag. På fredag, vaske cellerne og tilføje puromycin ved 2 ug / ml indtil mandag.
  2. Spredning: på mandag i den anden uge, vaske cellerne og tilføje insulin, transferrin og natriumselenit supplement til kulturen medier indtil kulturerne når 90% konfluens på onsdag i den anden uge.

. 4. Differentiering: Opsætning af In Vitro BBB Model

  1. Mandag i den anden uge, forberede filtre (polyethylen, 12 brønde, porestørrelse 1,0 um) ved coating med en blanding af collagen type IV og fibronektin både 0.5μg/cm 2 i steril kultur vand (500 pi blanding i det øvre kammer og 1,5 ml sterilt kultur vand i den nederste rum). Tillad at klæbe ved 37 ° C, indtil RBEC såning.
  2. Mandag i den anden uge, fem dage før etableringen af ​​co-kultur, tø astrocytterne fra kryoglas ved 37 ° C og overførseli et 15 ml Falcon med 10 ml GCM. Centrifugér suspensionen ved 120 x g i 8 minutter ved stuetemperatur.
  3. Resuspender astrocyt pelleten i GCM og plade ved en tæthed på 30 x 10 3 celler pr cm2 i 12-brønds plader.
  4. Onsdag i den anden uge, lige før dissociering af RBEC med trypsin, vaskes to gange pre-coated filter med DMEM/F12-medium. Pre-fylde kamrene med ECM: 1,5 ml i nederste rum og 0,5 ml i det øvre kammer.
  5. Onsdag i den anden uge, vaskes to gange RBEC med DPBS uden calcium og magnesium. Tilsæt 4 ml varmt trypsin 0,05% - EDTA 0,02% opløsning ved 37 ° C pr T75 kolbe i løbet af 30 sek nøjagtigt. Derefter fjernes 3,5 ml trypsin-opløsning og observere under mikroskop. Når cellen lag begynder at løsne sig fra matrixen, hjælpe dem ved forsigtigt at banke på kanten af ​​T75 kolben, indtil alle celler er flydende.
  6. Tilføj 9 ml ECM pr T75 kolbe og overføres til en 15 ml Falcon rør. Meget forsigtigt adskille cellensuspension ved at pipettere op og ned 4 gange med en 10 ml pipette udstyret med en gul spids (undgå produktion af bobler i opløsningen). Tæl cellerne i suspension (ca. 3 x 10 6 cells/T75), og straks plade på præ-coatede og fyldte filtre ved en høj tæthed (160 x 10 3 celler / filter dermed cirka 18 filters/T75) (Figur 8 ). Den følgende dag (torsdag), ændrer det dobbelte medie af øvre rum for at fjerne cellerester.
  7. Torsdag i den anden uge, dagen før etableringen af ​​co-kultur, udskifte astrocyte dyrkningsmedier med 1,5 ml af differentiering medier (ECM med hydrocortison ved 500 nm), som kan suppleres med 1/3 konditioneret medium fra den basale rum en tidligere co-kultur (3 dages kontakt mellem endothelceller og astrocytter).
  8. Fredag ​​i den anden uge er defineret som dag 0 af differentiering; erstatte dyrkningsmediet fra filtrene contalingen den RBEC med differentiering medier. Overfør RBEC filtrene i brøndene indeholdende astrocytter. Under disse betingelser, har in vitro-modeller differentiere og udtrykke junction-relaterede proteiner inden for 3 dage.
  9. Modellerne beholde deres optimale differentiering i 3 dage mere, mellem mandag og onsdag i den tredje uge.

Representative Results

Produktion Protocol
Protokollen kan opdeles i tre faser, der svarer til større ændringer i dyrkningsmedier sammensætning: (a) rensning af endotelceller fra mikrokar (b) spredning, og (c) differentiering på filtre (12-brønds plader polyethylen med en porøsitet på 1 um) i co-kultur med astrocytter. De forskellige trin i produktionsprocessen protokollen blev tildelt til bestemte dage i ugen for at øge reproducerbarheden af de primære cellekulturer (Figur 1). På onsdag i den første uge, derfor 9 dage før etableringen af co-kultur-systemet blev mikrokar isoleret (figur 2A). Til oprensning endotelceller blev kulturerne holdt i nærvær af faldende koncentrationer af puromycin i 5 dage. De fleste kontaminerende celler (hovedsagelig pericytter) blev elimineret, og væksten af ​​endotelceller var langsommere uden ændring af deres fænotype. Spindel-shaped celler vokse ud af de kapillære fragmenter isoleret fra rottehjerne grå stof (figur 2B). På mandag i den anden uge blev rotte-astrocytter udpladet på bunden af ​​12-brønds plader. Onsdag RBEC blev tilsat til den luminale rum af filtrene. High density podning på 160 x 10 3 celler / cm 2 (figur 2C) hjælper til at undgå huller i periferien af filteret (Figur 2D) og frembringer en homogen differentiering af endotele cellemonolaget. Cellerne viser typiske aflange spindelformet morfologi, justeres i længderetningen, og dannelse af en ensartet monolag. Torsdag astrocyte dyrkningsmedium blev ændret til differentieringen medium konditioneret med den tidligere co-kultur medier (Figur 2E). Fredag ​​RBEC på filtre blev dyrket i dyrkningsmedium indeholdende 500 nM hydrocortison, og filtrene blev overført til 12-brønds plader indeholdende astrocytter. På den tredje uge eksperimenter were udført mellem mandag og onsdag.

RBEC Karakterisering og afgørende elementer af monolag Permeabilitet
Den RBEC var karakteriseret ved immunfarvning af endotel og BBB markører samt ved målinger af TEER, gennemtrængelighed LY og funktionalitet effluxtransportører såsom P-gp.

RBEC opnået ved puromycin oprensningsmetode (figur 1 og 2) voksede i ikke-overlappende kontinuerlige monolag der udstillede væksthæmning ved sammenløb og vises stramt apposed, fusiform og spindel formet morfologi. RBEC kulturer udtrykt typiske markører af endotelceller: de viste positiv immunfarvning for blodplade-endotelcelle-adhæsionsmolekyle (figur 3A CD31/PECAM) og ekspression af von Willebrand faktor (figur 3B). Uden puromycin behandling, er RBECs hurtigt invaderet af pericytes detekteres af desmin immunosTaining (figur 3C). Glial fibrillært surt protein (GFAP) udtrykkes af astrocytter (Figur 3D) er en vigtig markør for differentiering astrocytter. Med højt antal passager, astrocytter mister deres evne til at inducere differentiering af endotelceller. Af denne grund blev astrocyt kulturer standardiseret for deres tid af kultur og kun undergik en passage.

Dyrkning RBEC med medier suppleret med hydrocortison, efterfulgt af co-kultur med astrocytter og konditioneret medium fra det nedre kammer af tidligere co-kulturer førte til stærk induktion af interendothelial tjs i forhold til RBEC dyrket alene. De celler udtrykte claudin-5, ZO-1 og occludin proteiner, som blev lokaliseret ved celle-celle-kryds, som vist ved immunfluorescens (figur 4B-D) og viste, ved western blot-analyse for ZO-1 og occludin proteiner (Figur 4E ). Den morfologiske fordeling på cell-til-celle-kontakter i en lynlås-lignende konfiguration afspejler (a) tætheden af ​​monolaget, (b) cerebral oprindelse endotelceller, og (c), er karakteristisk for stærkt differentierede cerebrale endotelceller. Paracellulær permeabilitet endothellaget blev overvåget ved måling af TEER og hastigheden af ​​tilstrømningen af ​​LY (457 Da) fra det øvre til det nedre kammer af filtrene. TEER blev målt ved hjælp af en ENDOHM-12 til 12 mm kultur kopper tilsluttet en EVOM voltohmmeter. Den TEER af hjernens endotel-monolag, der angiver tæthed TJs nåede 300 ohm · cm2 i gennemsnit (filtre af plader med 12 brønde, data ikke vist). Pe for LY (Pe (LY), der anvendes som en integritetskontrol af barrieren og co-inkuberet med testede forbindelser) nåede et gennemsnit på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min (figur 4F) i løbet af en 1 års periode.

For at fremkalde betændelse i RBEC brugte vi PRo-inflammatoriske cytokin TNF-α ved 5 ng / ml i 24 timer og fulgte det inflammatoriske respons ved at måle CCL2 (MCP-1) secernering af RBEC i det øverste rum i dyrkningssystemet som fordoblet fra 120 ng / ml (ikke- behandlet kontrol) til 250 ng / ml (figur 5A). TNF-α behandling på 5 ng / ml eller 50 ng / ml for 24 hr også åbnet BBB som det fremgår af Pe (LY)-måling (figur 5B).

P-gp blev visualiseret i differentieret RBEC med immuncytokemi (figur 6A). P-gp lokalisering er kendt for at være stærkt polariseret og udtrykt i det væsentlige i den apikale membran af endotelceller 44, mens Glutamat transportør-1 (GLT-1), hovedsagelig findes i den basolaterale fraktion 45. For at vurdere omfanget af polarisering af vores dyrkede RBEC blev apikale og basolaterale proteiner adskilt fra præparater plasma membran ved hjælp saccharosedensitetsgradienter 46.. Western blot-analyse varudført for at vurdere ekspressionsniveauerne af P-gp og GLT-1 i plasma, apikale og præparater basalmembranen. Mikrokar frisk ekstraheret fra rottehjerne blev anvendt som nærmeste positive kontroller til in vivo fordelingen af disse proteiner (figur 6B). I begge mikrokar og differentierede præparater RBEC membran blev P-gp udtrykt som et bånd på 170 kDa, primært lokaliseret i F1 apikale membranfraktion (figur 6B, C). GLT-1 ekspression blev faktisk til udtryk i F3 membran fraktion af mikrokar som et bånd på 65-70 kDa basal, men blev ikke påvist i det dyrkede RBEC.

I parallelle forsøg blev den funktionelle aktivitet af P-gp i endotheliale cellemonolag testet under anvendelse af rhodamin 123 (R123) som en ligand. Det abluminale til luminale (B til A) udstrømning af R123 var 1,7 gange højere end i den modsatte retning (figur 6D). For at bevise P-gp engagement, vi brugte specifikke P-gp-hæmmere, verapamil (25 uM, 30 min forinkubation) og cyclosporin A (1 uM, 30 min forinkubation). Verapamil og cyclosporin behandling blev R123 akkumulering i RBEC steg 1,6 gange og 2 gange sammenlignet med ubehandlet kontrol (figur 6E).

Receptorer involveret i receptorfremkaldte transcytose (RMT) Mekanismer
Modellen blev yderligere karakteriseret for ekspression af forskellige receptorer potentielt er involveret i transcytosis mekanismer BBB, såsom LRP1, LDLR eller TFR (figur 7A).

Funktionelle transport udført studier med ligander for TFR og LDLR. Levende RBEC blev inkuberet med rotte transferrin mærket med CY3 (Tf-Cy3) i 180 minutter ved 37 ° C (figur 7B, C). Kvantificering af Tf-Cy3 optagelse og transport i rotten in vitro BBB modellen viste, at hældningen af kurverne faldt en smule over 2.400 picomols (Figur 7B), hvilket tyder på, at binding / optagelse var mættelig. Desuden blev mætning af binding / optagelse korreleret til akkumulering af Tf i det nedre kammer. For at bekræfte denne observation blev Tf-Cy3 inkuberet ved 1.200 picomol (stigende del af kurven) med et overskud af ikke-fluorescerende Tf på 4.800 picomol (plateau / mætning) (Figur 7C). Disse forsøg viste et fald på Tf-Cy3 akkumulering i det nedre kammer og bekræftede en mætbar mekanisme typisk af ligand-receptor-interaktion i vores in vitro BBB model.

Tilsvarende blev LDLR funktionalitet påvises ved optagelse og transport af dens ligand DiILDL tværs endotelcelle monolaget (figur 7D, E). Levende RBEC blev inkuberet med DiILDL i 30 min ved 37 ° C. Bindingen / optagelse blev ikke korreleret med ophobning af DiILDL i det nedre kammer (figur 7D). Kvantificering af DIILDL transport viste, at hældningen af ​​kurverne faldt over 2 ug, hvilket tyder på, at transporten var mættet og receptor-relateret i vores model. Natriumazid blev tilsat ved 0,05%, 15 min før DiILDL inkubation (figur 7E). Manglen på toksicitet natriumazid inkubation ved 0,05% blev vurderet ved Pe (LY)-måling (data ikke vist). Disse eksperimenter viste nedsat DiILDL akkumulering i det nedre kammer. Samlet tyder vore resultater på RMT til DiILDL i vores in vitro BBB model.

Andre in vitro BBB-modeller baseret på endotelceller fra rotte rygmarven eller Mouse Brain
Enzymatisk nedbrydning med en blanding af kollagenaser / dispase er en af ​​de vigtigste parametre til at styre i form af cellernes levedygtighed og produktion udbytte af cerebrale mikrokar. Koncentrationen af ​​enzym og mere vigtigt forholdet mellem mængden af ​​enzym i forhold til væv, nEEDS skal kalibreres præcist mellem rottehjerne, rotte rygmarv og mus hjernen. Mikrokardannelse podningstæthed og antallet af endothelceller til at nå 90% konfluens (9 dage efter mikrokardannelse såning) var forbundet og er vigtige parametre for at forbedre cellevækst, begrænser antallet af befolkningen fordobling og kvaliteten af ​​modellerne. Rotte rygmarv mikrokar blev produceret med den samme protokol, som er beskrevet heri til rotte hjerne mikrokar (i form af væv beløb, 2 rygmarv, der tilnærmelsesvis svarer til 1 hjernen) for at opnå den samme mængde celler pr T75 kolbe inden for samme tidsramme . Meninges fra 5 uger gamle C57BL6 mus hjerne var vanskelige at fjerne, fordi de holder sig til cortex. En kort behandling af hjernen med dispase synes at lette fjernelse af meninges. De vigtige parametre, der bidrager til produktion af reproducerbare endotheliale cellemonolag fra rottehjerne, rotte rygmarv og musehjerne fremhæves og opsummeret iFigur 8.

Figur 1
Flowdiagram sammenfatter de vigtigste trin i in vitro BBB model forberedelse Figur 1... De forskellige trin i produktionsprocessen protokollen blev tildelt til bestemte dage i ugen for at øge reproducerbarheden af de primære endotel cellekulturer. Protokollen begynder onsdag i den første uge med mikrokardannelse produktion fra 5 uger gamle Wistar-rotter.

Figur 2
Figur 2. Fasekontrast mikrofotografier af RBEC, astrocytter og co-kultur-systemet. (A) 5 uger gamle Wistar rotte mikrokardannelse fragmenter på tidspunktet for plating ud.(B) Tre dage gamle RBEC kulturer behandlet i 2 dage med P-gp-substrat puromycin ved 4 pg / ml. (C) Pure sammenflydende endotel monolag på dag 1 efter udpladning på Milliporefiltre af en 12 brønds plade belagt med collagen type IV og fibronektin. (D) ensartethed cellemonolaget i periferien af indsatsen filter. (E) Confluent astrocyte kultur på dagen for etableringen af co-kultur viser karakteriserede honeycomb morfologi. (F) Ordning repræsenterer co-kultur Systemet med lokalisering af mikrofotografierne i C, D og E.

Figur 3
Fig. 3. Karakterisering af RBEC kulturer ved immunfluorescens mikroskopi. (A) Brain endotelceller udtrykker blodplade-endotelcelleadhæsionsmolekyle PECAM/CD31 på celle-grænsen, (B) von Willebrand-faktor (VWF) viser et relativt punktformet farvning, lysere og mere aggregeret i nogle celler end andre, og koncentreret i perinukleære zone. (C) Uden puromycin behandling af RBEC kulturer er pericytes detekteres med en positiv immunfarvning for desmin (i grønt), og har karakteristiske små runde kerner. (D) Astrocytes udtrykker gliafibrillært surt protein (GFAP). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Fig. 4. Immunocytokemisk karakterisering af rotte in vitro BBB modellen og paracellulær permeabilitetLY tværs af endotelmonolaget. Cellemonolaget blev immunfarvet med (A) vimentin at afsløre en sammenflydende hjerne endotelcelle farves med ikke-overlappende morfologi og typisk spindel formede celler med endotel morfologi og ekspressionen af tight junction-proteiner (B) claudin-5 , (C) ZO-1 og (D) occludin, også påvises ved western blot for ZO-1 og occludin proteiner (E). (F) monolag tæthed i 12-brønds BBB modellen blev vurderet ved at måle transporten af lucifer gul (LY-CH dilithiumsalt), en lille hydrofilt molekyle (MW 457 Da) er kendt for at blive tilbageholdt af BBB. Kort fortalt blev LY inkuberet i det øverste rum i dyrkningssystemet i kontakt med cerebrale endotelceller i 60 min ved 37 ° C. Efter dette tidspunkt blev mediet af det nedre kammer opsamles og fluorescens blev kvantificeret ved fluorimetrisk analyse med spectrofluorimetis med excitation ved 430 nm og emission ved 535 nm. Resultaterne er udtrykt i permeabilitet eller Pe i 10 -3 cm / min. Barrieren anses gennemtrængelig eller åben, når Pe fra LY er over 0.6x10 -3 cm / min. Under hver 1 time eksperiment blev gennemsnitlige ryddet volumen afsættes mod tiden, og den beregnes ved lineær regressionsanalyse skråning. Hældningen af ​​clearance kurven for kontrol filtre med collagen type IV-fibronectincoating blev betegnet PSF og hældningen af ​​regnskabsafslutningen kurven for filtre med hjernen endotel cellemonolagene blev betegnet PST. PS værdien for endotelmonolaget (PSE) blev beregnet ud fra: Klik her for at se en større version af dette tal.

Ligning 1

PSE værdier blev divideret med arealet af porskellige membran (1,1 cm2 Milliporefiltre af 12-brønds plader), og resultatet var permeabilitetskoefficienten (Pe) med et gennemsnit på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Resultaterne er præsenteret med et lodret punktdiagram repræsentation for n = 90 analyser (gennemsnit af n = 3 til n = 6 monolag pr assay).

Figur 5
Fig. 5. In vitro BBB model respons på behandling med pro-inflammatorisk middel TNF-α. Dyrkningsmedierne fra kulturen blev erstattet lige før TNF-α behandling på 5 ng / ml i det øvre kammer til 6 timer, 12 timer og 24 timer. CCL2 frigivelse ved RBEC blev kvantificeret i det øvre kammer ved hjælp af ELISA-assay i sammenligning med ikke-behandlet kontrol. Bemærk, at MCP-1-niveauer øges lidt som en funktion af tiden, Selv i de ikke-behandlede brønde. Integritet af endotelcelle barriere målt ved endotel Pe for LY Pe (LY) viste en stigning i monolag permeabilitet ved 24 timers behandling med TNF-α ved 5 ng / ml eller 50 ng / ml i området på 0,62 ± 0,02 x 10 - 3 cm / min og 0,7 ± 0,01 x 10 -3 cm / min, sammenlignet med kontrol på 0,33 ± 0,03 x 10 -3 cm / min (Students t-test, p <0,05).

Figur 6
Figur 6. Funktionalitet af P-gp efflux transportøren og RBEC polarisering. Ekspression af efflux-transporteren P-gp i hjernens endotelceller co-dyrket med astrocytter med immuncytokemi (A) og Western blot (B & C). Cellemembranproteiner blev ekstraheret med et cellulært protein fraktioneringtion kit. Plasmamembraner blev opnået ved hypotonisk lysis og differentieret centrifugeringer for at fjerne organeller og kerner. Adskillelse af apikale og basolaterale proteiner fra plasma membraner blev opnået ved sucrosemassefyldegradient. P-gp var primært lokaliseret i den apikale fraktion (F1), mens glutamat transportør-1 (GLT-1), hovedsagelig blev lokaliseret i den basolaterale fraktion (F3). Oprensede mikrokar før udpladning blev anvendt som kontrol for in vivo lokalisering af disse proteiner. Aktivitet af P-gp blev bestemt ved at måle transport polaritet R123, en P-gp-ligand. Fluxen af 1 uM R123 blev målt i 1 time ved 37 ° C i den luminale-til-abluminale (A til B) og i den modsatte abluminale-til-luminale (B til A) retninger. Det samme eksperiment blev realiseret uden RBEC at vurdere passiv diffusion over indsatsen filter og data blev normaliseret i forhold til denne værdi for Pe (R123) beregning (se figur 5 (R123) (A til B). Verapamil (25 uM, 30 min forinkubation) og cyclosporin A (1 uM, 30 min forinkubation) blev anvendt som reference-P-gp-hæmmere. R123 akkumulering i RBEC blev målt efter 2 timer med eller uden forinkubering med P-gp-hæmmere (Students t-test, p <0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Fig. 7. Karakterisering af receptorer involveret i receptormedieret Transcytosis (RMT). (A) Den differentierede RBEC monolag blev immunfarvet med antistoffer mod lav densitet relateret lipoprotein receptor 1 (LRP1) og low density lipoprotein receptor (LDLR). Konfokal billede af RBEC probet for optagelse af DiILDL, en fluorescerende ligand LDLR og optagelse af rotte-Transferrin-Cy3, en fluorescerende ligand TFR show punktformig farvning over celleoverfladen, med nogle klynger i perinukleære region. (B) Rotte Tf-Cy3 blev tilsat til det øvre rum, som indeholder den differentierede RBEC monolag ved 75, 150, 300, 600, 1.200, 2.400 og 4.800 picomol / indsætte i 180 minutter ved 37 ° C (200 pi i det øvre kammer og 1.200 pi i det nedre kammer). Efter dette tidsrum blev Cy3 fluorescens kvantificeret i cellelysatet (200 pi PBS 0,1% Triton X100), og i det nedre kammer ved fluorimetrisk analyse med spektrofluorimeter med excitation ved 550 nm og emission ved 570 nm. Fluorescensenheder blev transformeret i picomol via en lineær arbejdsområde. (C) For mætning eksperimenter blev rotte Tf-Cy3 tilsat til den øvre rum, som indeholder den differentierede RBEC monolag 1.200 picomol / indsætte i 180 minutter ved 37 ° C med eller uden 15 min præ-inkubation med 4.800 picomol / indsæt af ikke-fluorescerende Tf. Transporten i det nedre kammer blev kvantificeret som i (B) (Student t-test, p <0,05). (D) DiILDL blev tilsat til det øvre rum, som indeholder den differentierede RBEC monolag på 1, 2, 4 og 8 pg / insert filtre i 30 minutter ved 37 ° C (200 ul i øvre kammer og 1.200 pi i det nedre kammer). Efter dette tidsrum blev Dil fluorescens kvantificeret i cellelysatet (200 pi PBS 0,1% Triton X100), og i det nedre kammer ved fluorimetrisk analyse med spektrofluorimeter med excitation ved 554 nm og emission ved 571 nm. Fluorescerendecens enheder blev transformeret i ug under anvendelse af et lineært arbejdsområde. (E) For transport blokerer forsøg blev natriumazid tilsat ved 0,05% 15 min, før inkubationen af DiILDL ved 2 ug / indsætte i 30 minutter ved 37 ° C. Transporten i det nedre kammer blev kvantificeret som i (D) (Student t-test, p <0,05). Fraværet af giftighed natriumazid inkubation ved 0,05% blev vurderet ved Pe (LY)-måling (data ikke vist). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8
Fig. 8. In vitro BBB modeller fra rotte rygmarv endotelceller eller fra musehjerne. Tabellen højlyser vigtige parametre for mikrokardannelse ekstraktion fra rottehjerne, rotte rygmarv og musehjerne. Mikrofotografier viser immunfarvning for ZO1 og occludin i endotheliale cellemonolag fremstillet ud fra rottehjerne, rotte rygmarv og musehjerne.

Discussion

Vi beskriver implementeringen af en ugentlig reproducerbar protokol til isolering og plettering af hjernens mikrokar, efter rensning og kultur RBEC og videre etablering af co-kulturer med primære rotte astrocytter til at generere en in vitro BBB model med karakteristiske BBB egenskaber.

Succesfuld oprettelse standardiseret in vitro BBB kulturer kræver optimale betingelser i de mange sekventielle trin i processen. Modellen blev (a) optimeret til at opnå den lavest paracellulære permeabilitet, som stadig er den "hellige gral" af in vitro BBB-modeller, og (b), valideret for udstrømning og RMT mekanismer.

Produktion, rensning og spredning af RBEC

Den største udfordring ved dyrkning RBEC er at opnå reproducerbarhed mellem forskellige kulturer. Standardisering af protokollen kræver høj kvalitet værktøjer til dissektion, høj kvalitet reagenser og respekt reagenser udløbsdatoer. Forsøgslederen skal være dygtige i mikro-dissektion under stereomikroskop for hurtig fjernelse af meninges og store skibe fra cortex overflade. Når hjernen isoleres og dissocieret mekanisk, en af ​​de største udfordringer er optimal enzymatisk fordøjelse af de frisk isolerede hjerne mikrokar. Typen og kvaliteten af ​​de anvendte enzymer er kritisk. En blanding af collagenaser type I og II og dispase i høj koncentration med lav variabilitet mellem batcher blev anvendt. Også vigtigt er varigheden af ​​den enzymatiske fordøjelse og forholdet mellem enzymkoncentration / vævs vægt / volumen fordøjelse. Det bedste udbytte af hjernens mikrokar produktion blev opnået med de tilsvarende af cortex fra 1 hjernen i 1 ml collagenaser / dispase bland ved 60 ug / ml i begge fordøjelser henholdsvis 30 minutter og 1 time.

Også kritisk er afskaffelsen af ​​kontaminerende celles (astrocytter og især pericytes). Disse celler formere sig ved højere hastighed end endotelceller og ikke etablere tætte forbindelser med sidstnævnte, og dermed forhindre etableringen af ​​en homogen cellemonolag med god paracellulær restrictiveness. I betragtning af, at hjernen endotelceller udtrykker meget højere niveauer af effluxpumper, navnlig P-gp, sammenlignet med de andre celletyper mikrokar de tåler bedre ellers toksiske koncentrationer af P-gp-ligand narkotika, mens ikke-endotelceller er elimineret. Puromycin behandling på 4 ug / ml for de første to dage blev efterfulgt af yderligere to dage ved 2 ug / ml for at opnå god endotelcelle renhed. Dette valg kan også favorisere kapillærendotelceller versus dem fra venules, præ-kapillære arterioler eller større mikrokar, og føre til strammere monolag. Desuden er en nødvendighed for at opnå rene kulturer af endotelceller 47,48 brugen af dårlig plasmaafledt bovint serum. Plasma-derived serum mangler blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF), som er mitogent for fibroblaster til glatte muskelceller og derfor pericytter.

Vi observerede, at behandling af plast og filtre med en blanding af collagen type IV fra mus og human fibronectin giver en betydelig fordel med en 2-fold forøgelse af proliferation udbytte i sammenligning med traditionelt anbefalede collagen type I fra rotte hale. Vigtige signaler for celleproliferation leveres af den ekstracellulære matrix, såsom integrin og vækstfaktor (bFGF) aktivering 49. Koncentration og pH af kulturen medier buffer er blevet beskrevet til at have en positiv indflydelse på paracellulær tæthed 50 og vi observerede en bedre reproducerbarhed mellem kulturer med tilføjelse af HEPES buffer på 5 mm.

Differentiering af RBEC: Co-kultur Etablering på Indsæt Filtre

Når hjernen endotelceller have b.een renset og har spredt sig i 6 dage, kan de blive belagt på filtre. Celleudpladning ved høj tæthed er afgørende for at opnå en perfekt monolag. En podningstæthed på 160x10 3 celler pr 12 brønde pladefiltre var nødvendigt og tilstrækkeligt for at opnå et sammenflydende monolag 24 timer efter såning. Men isolering af primære hjerne-endotelceller fra deres miljø er et paradoks i opbygningen af en BBB in vitro-model, da det er kendt, at primære celler, og især hjerne kapillærendotelceller, er stærkt reguleret af deres miljø og induktive faktorer produceret af de forskellige omgivende celletyper. Brain kapillærendotelceller dyrket alene hurtigt de-differentiere og løse nogle specifikke hjerne endotel markører. Således bør anvendes primære endotelceller ved lav passage (P1), og tilsluttes igen, i det mindste delvist, med deres omgivelser ved co-kultur med astrocytter eller medium konditioneret med astrocytter 47,51. Dette gældersandt for astrocyt differentiering som hjerne endotelceller og astrocytter er involveret i to-vejs-induktion. Dyrkning RBEC med astrocytter førte til stærk induktion af interendothelial TJ 52,23. De molekylære mekanismer i re-induktion fortsat er stort set ukendte, og forskning er i gang i flere laboratorier at identificere specifikke modulerende faktorer, der udskilles af astrocytter, som kan fremme en optimal endothelcelle differentiering 53,54. Faktorer, der udskilles af hjernens endotelceller inklusive leukæmi-inhibitorisk faktor (LIF) er blevet vist at inducere astrocytisk differentiering 55,56. Før co-kultur etablering blev astrocytter udsat for differentiering medium indeholdende glucocorticoidreceptoren agonist hydrocortison, og co-kultur medium. Hydrocortison er kendt for at forbedre tætheden af hjernens endotelceller og anvendes i BBB modeller især fra rotte 57 og mus 58,59 endotelceller. Den konditionerede medium er indsamlet fra det nedre kammer af endotelcelle / astrocyt co-kultur-systemet efter 3 dage og frosset til senere brug. Brugen af ​​co-kultur medium reduceret den tid af endothelcelle differentiering til 3 dage med optimal paracellulær permeabilitet for 2 dage mere og også forbedret reproducerbarhed mellem kulturer.

Samlet set protokol beskriver vi giver en reproducerbar TEER over 300 ohm · cm2 og en gennemsnitlig paracellulær permeabilitetskoefficient Pe (LY) på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, svarende til de bedste primære cellebaserede BBB modellerne 22, 12.. Protokollen beskriver vi i den foreliggende manuskript med den foreslåede graduering af mikrokardannelse enzymatisk fordøjelse kan udvides til endotelceller fra rat rygmarven 60 og fra mus hjerne.

Molekylær og funktionel karakterisering

Desudentil TJ induktion, astrocytter bidrager også til udtryk effluxtransportører såsom P-gp i hjerne endotelceller 61. Vi viser faktisk ekspression af efflux-transporteren P-gp i BBB model og vi påvise polariteten af ​​P-gp udstrømningspumpe lokalisering ved hjælp af biokemiske metoder og P-gp-aktivitet under anvendelse af et funktionelt assay. GLT-1-ekspression blev detekteret i basalmembranen fraktion af mikrokar, men blev ikke påvist i dyrkede RBEC. Vi hypotesen, at GLT-1 ned var reguleret i vores RBEC kultur i sammenligning med in vivo betingelser og derfor ikke kan påvises ved western blot analyse. Overskydende glutamat er neurotoksisk og in vivo, GLT-1 er ansvarlig for glutamat udstrømning fra det basale kammer (parenkym) til det apikale kammer (blodcirkulationen). I astrocyt kulturer GLT-1-ekspression er fortsat meget lav og fremkaldes ved tilsætning af glutamat på mellemlang 62,63.

Vi har også confIRM udtryk for tilstrømningen transportører på den apikale membran, såsom LRP1, LDLR og TFR. Funktionalitet TFR og LDLR blev demonstreret med binding og transport eksperimenter af Tf-Cy3 og DiLDL fra den luminale til den abluminale side af monolag som tidligere vist med en kvæg in vitro BBB model 64.. Interessant nok har det vist sig, at lipid krav fra astrocytter øger ekspressionen af LDLR på hjernens endotelceller 65,66 hvilket yderligere bekræfter den fysiologiske krydstale mellem astrocytter og hjerne endotelceller, herunder in vitro. Vi har valgt at eksemplificere transport med fluorescerende farvestoffer, såsom som Cy3 og Dil overvejer at spektrofluorimetrisk analyse er tilgængelig i de fleste laboratorier, og kan vise sig nyttigt at validere in vitro BBB-modeller. Men kvantificering af fluorescens er langt mindre følsomme end radioaktivitet og kræver en forøgelse i antallet af forsøg til opnåelse af signifikante data.Ideelt, Tf og LDL er normalt radioaktivt mærket (Jod 125) for sådanne binding / optagelse og transport eksperimenter.

Vi viser også, at den differentierede endothelcelle monolag opnået med den foreslåede protokol reagerer på inflammation induceret af TNF-α, som afsløret ved CCL2 frigivelse og BBB åbning. CCL2 (MCP-1) og dets receptor CCR2 er involveret i CNS-sygdomme såsom multipel sclerose, eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) 67, CNS-trauma 68 og er kendt som mediatorer af leukocytmigration i CNS under neuroinflammatoriske betingelser 69,70. Med den testede protokol, kan vi ikke konkludere på et polariseret sekretion af CCL2 fordi BBB åbning tillader CCL2 koncentration i ligevægt mellem begge øverste (apikale) og nedre (basal) rum. Derfor er vi helt klart undervurderer mængden af CCL2 produceret af RBEC i den apikale rum ved 24 timer (figur 5A).

Generelt Oversigt og begrænsninger BBB vitro-modeller: I n Vivo versus In vitro og gnaver versus Menneskelige Sammenligninger

Mange lovende CNS-lægemidler, der viste sig effektiv i BBB passage in vitro mislykkedes i kliniske forsøg på grund af manglende forudsigelighed fra in vitro BBB-modeller ofte er baseret på celler isoleret fra andre arter end mennesker. Til vor bedste viden, in vitro BBB modeller er sandsynligvis mere intelligent, når det kommer til at studere mekanistiske aspekter af protein netværk, signaltransduktion, transportører og receptorer. Hver mekanisme, gangsti eller mål, der skal undersøges in vitro skal karakteriseres for sin regulering af supplerende miljømæssige signaler (andre celletyper, kemikalier, proteiner) og kombineres til in situ undersøgelser med samme dyreart, Og når det er muligt, med mikrokar og endotelceller er isoleret fra mennesker, med de begrænsninger og forsigtighed evoked nedenfor.

In vitro BBB-modeller skal ses som selvstændige systemer, isoleret fra kroppen regulering, men stadig udstyret med store in vivo egenskaber og et potentiale for regulering af miljømæssige signaler. Nr. "ideelle" in vitro BBB model er blevet foreslået endnu 71,72,73 fordi endotelceller cellemonolag mangler en række vigtige bestanddele af neuro-glia vaskulær enhed (NGVU) og er isoleret fra blod og krop regulering. Manglen på pericytter 74,16 eller neuroner 17,18 eller de forskellige bestanddele af den ekstracellulære matrix, der anvendes til plastbelægning eller dyrkningsmediet og serum anvendes til cellevækst i de mest almindelige og "nemmeste fremstillet" in vitro BBB modeller baseret på endotel celler differentierede med astrocytter kan modulere protein udtryk in sammenligning med in vivo-situationen 75. Disse modeller kan udtrykke mange transportører, der vises in vivo, men ikke alle. I nogle tilfælde blev transport parametre først verificeret i isolerede mikrokar (tættest på in vivo-situationen), og derefter studerede i cellekultursystemer 76,61.

Molekylærbiologisk forskning har gjort det muligt karakterisering af genet og protein udtryk i isolerede mikrokar og lave passage endotel cellekulturer fra samme art og mellem forskellige arter, oftest fra små dyr såsom gnavere (mus og rotter) eller fra ko og gris i forhold til mennesker 77,78,75,15. Transkriptomisk sammenligning mellem in vivo og in vitro hjerne mikrovaskulære endotelceller viste talrige gentranskripter, som blev differentielt udtrykte og oftest betydeligt nedreguleret in vitro. Udskrifter, der koder tilstrømning transportører såsom TFR og PRoteins impliceret i vesikeludveksling hovedsageligt nedreguleret i dyrkede hjerne endotelceller, hvilket tyder på en generel nedgang i endocytose og vesikulær transport i sådanne celler. Kultur manipulation i form af renhed (puromycin behandling) og behandling med hydrocortison kan bidrage til at genoprette en mere "in vivo-lignende" genekspression profil 77. Transkriptom undersøgelser afslørede også betydelige forskelle mellem arter, der yderligere komplicerer forudsigelser om lægemiddeloptagelse hos mennesker baseret på gnaver in vitro BBB-modeller 75. In vitro BBB-modeller, der involverer co-kultur af humane endotelceller og astrocytter er blevet beskrevet 15. Selvom det er relevant, er vanskeligere at gennemføre disse modeller på en regelmæssig basis, da de kræver reguleret adgang til post mortem menneskeligt væv, og der er heterogenitet i de kvalitetskrav / egenskaber af den menneskelige hjerne endotelceller afhængigt af alder, sygdom, og eventuelt medicinsk behandlit af donorer. Indsatsen skal gøres for at udvikle nye in vitro-modeller, der bedre gengiver fysiologiske, anatomiske og funktionelle egenskaber in vivo BBB. Co-kulturer, der involverer tre celletyper er meget restriktive og synes vanskeligt at gennemføre rutinemæssigt. Til dato den mest komplekse in vitro BBB-modeller er de dynamiske in vitro modeller (DIV-BBB), som omfatter fartøj-lignende organisation med astrocytter og inkluderer en strøm af medium, der efterligner blodgennemstrømningen 75,79,80,81,82, 83,84,85. Når cerebrale endotelceller eksponeres for et flow, den genererede forskydningsspænding aktiverer mechanotransducers på celleoverfladen, som modulerer ekspressionen af forskellige gener involveret i endotelcelle fysiologi, såsom celledeling, differentiering, migration og apoptose 80. In vivo forskydningsspænding genereret af blodgennemstrømningen er ansvarlig for mitotisk anholdelse på den celle kontakt, der tillader oprettelsen af ​​enendotelcelle monolag i blodkar 80. Genomisk og proteom analyse af normale menneskelige hjerne mikrovaskulære endotelceller viste virkningen af forskydningsspænding i BBB endotel fysiologi 84. Shear stress er ansvarlig for celle overlevelse, en højere grad af endotelcelleadhæsion, udstrømningspumpe induktion og bedre polarisering af transportører 75, regulering af glukosemetabolismen 75,86, oxidation via CYP450 enzymer 75 og reguleringen af paracellulær permeabilitet ved at øge udtrykket af gener, der koder for intercellulære Junctional elementer som occludin og ZO-1 87,75,80 og dermed høj TEER omkring 1.500 - 2.000 ohm · cm2, tættest på kendte in vivo parametre 79,80

I den bioteknologiske og farmaceutiske industri, rutinemæssig screening af lægemidler eller endda high throughput screening (HTS) og indsatsen for at reducere dyreforsøg, ledettil udvikling af forskellige cellelinier, der skal anvendes i stedet for den primære kultur af cerebrale endotelceller som forbliver sværere at sætte op rutinemæssigt. I de fleste tilfælde blev primære kulturer af cerebrale endotelceller transduceret med en udødeliggørende gen (SV40 eller polyomavirus stort T-antigen-eller adenovirus E1A), enten ved transfektion af plasmid-DNA eller ved infektion ved hjælp af retrovirale vektorer 88,89,75. Adskillige endotel cellelinier af cerebral oprindelse er blevet udviklet som RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBS eller rBCEC4 rotte cellelinjer 88,75, den b.End3 musecellelinie 90,75, den PBMEC/C1 - 2 porcin cellelinje 87,75 og hCMEC/D3 humane cellelinie 89,75. Andre modeller er baseret på celler af ikke-cerebral oprindelse såsom Madin-Darby hunde nyre (MDCK) eller Caco2 cellelinier 12,75. Blandt de forskellige humane cerebrale endotelceller cellelinier har hCMEC/D3 blevet bredt cited og forbedret som en model af BBB siden sin oprettelse i 2005 91,92. Ligesom primære kulturer, cellelinjer nuværende fordele og begrænsninger. De er lettere at håndtere end primære kulturer, har en længere levetid, er velkarakteriserede og tillade reproducerbarhed mellem store eksperimenter. Dog kan cellelinjer miste vævsspecifikke funktioner, mister miljøregulering og erhverve en molekylær fænotype helt forskellig fra celler in vivo 75 89. Især monolag genereret fra cellelinier nuværende reducerede tæthed, lav TEER og show transportør profil variation 75,89. Således dyreforsøg eller studier i primære celler foretrækkes ofte på trods af deres ekstra kompleksitet.

Acknowledgments

Økonomisk støtte til VECT-HORUS er anerkendt fra Fonds Unique Interministériel (FUI / MEDUL projektet), og at vect-HORUS og UMR7259 laboratorium fra Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC og PREVENTAD samarbejdsprojekter) . Den UMR7259 laboratorium anerkender også økonomisk støtte fra CNRS og fra Aix-Marseille Université.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubin, L. L., Staddon, J. M. The cell biology of the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 22, 11-28 (1999).
  2. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 5-23 (2005).
  3. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6, (8), 650-661 (2007).
  4. Pekny, M., Stanness, K. A., Eliasson, C., Betsholtz, C., Janigro, D. Impaired induction of blood-brain barrier properties in aortic endothelial cells by astrocytes from GFAP-deficient mice. Glia. 22, (4), 390-400 (1998).
  5. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J Appl Physiol. 100, (1), 328-335 (2006).
  6. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. J Neurochem. 54, (5), 1798-1801 (1990).
  7. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicol In Vitro. 22, (3), 799-811 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. Porcine brain microvessel endothelial cells as an in vitro model to predict in vivo blood-brain barrier permeability. Drug Metab Dispos. 34, (11), 1935-1943 (2006).
  9. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Res. 1521, 1-15 (2012).
  10. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  11. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochem Int. 54, (3-4), 253-263 (2009).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71, (1), 113-128 (2011).
  13. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab Invest. 85, (6), 734-746 (2005).
  14. Josserand, V., et al. Evaluation of drug penetration into the brain: a double study by in vivo imaging with positron emission tomography and using an in vitro model of the human blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 316, (1), 79-86 (2006).
  15. Lacombe, O., et al. In vitro primary human and animal cell-based blood-brain barrier models as a screening tool in drug discovery. Mol Pharm. 8, (3), 651-663 (2011).
  16. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cell Mol Neurobiol. 27, (6), 687-694 (2007).
  17. Lippmann, E. S., Weidenfeller, C., Svendsen, C. N., Shusta, E. V. Blood-brain barrier modeling with co-cultured neural progenitor cell-derived astrocytes and neurons. J Neurochem. 119, (3), 507-520 (2011).
  18. Xue, Q., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9, (2), 174-189 (2013).
  19. Sohet, F., Daneman, R. Genetic mouse models to study blood-brain barrier development and function. Fluids Barriers CNS. 10, (1), 3 (2013).
  20. Shayan, G., Choi, Y. S., Shusta, E. V., Shuler, M. L., Lee, K. H. Murine in vitro model of the blood-brain barrier for evaluating drug transport. Eur J Pharm Sci. 42, (1-2), 148-155 (2011).
  21. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev. 36, (2-3), 165-178 (1999).
  22. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25, (1), 59-127 (2005).
  23. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-1 (2007).
  24. Pardridge, W. M., Buciak, J. L., Friden, P. M. Selective transport of an anti-transferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 259, (1), 66-70 (1991).
  25. Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. J Neurochem. 53, (2), 340-345 (1989).
  26. Gosselet, F., Candela, P., Sevin, E., Berezowski, V., Cecchelli, R., Fenart, L. Transcriptional profiles of receptors and transporters involved in brain cholesterol homeostasis at the blood-brain barrier: use of an in vitro model. Brain Res. 1249, 34-42 (2009).
  27. Pardridge, W. M. Vector-mediated drug delivery to the brain. Adv Drug Deliv Rev. 36, (2-3), 299-321 (1999).
  28. Pardridge, W. M., Boado, R. J. Reengineering biopharmaceuticals for targeted delivery across the blood-brain barrier. Methods Enzymol. 503, 269-292 (2012).
  29. Boado, R. J., Lu, J. Z., Hui, E. K., Sumbria, R. K., Pardridge, W. M. Pharmacokinetics and brain uptake in the rhesus monkey of a fusion protein of arylsulfatase a and a monoclonal antibody against the human insulin receptor. Biotechnol Bioeng. 110, (5), 1456-1465 (2013).
  30. Ito, S., Ohtsuki, S., Terasaki, T. Functional characterization of the brain-to-blood efflux clearance of human amyloid-beta peptide (1-40) across the rat blood-brain barrier. Neurosci Res. 56, (3), 246-252 (2006).
  31. Demeule, M., et al. Identification and design of peptides as a new drug delivery system for the brain. J Pharmacol Exp Ther. 324, (3), 1064-1072 (2008).
  32. Yamada, K., et al. The low density lipoprotein receptor-related protein 1 mediates uptake of amyloid beta peptides in an in vitro model of the blood-brain barrier cells. J Biol Chem. 283, (50), 34554-34562 (2008).
  33. Gabathuler, R. New protein vectors for physiological transfer of therapeutic agents to the central nervous system. Biol Aujourdhui. 206, (3), 191-203 (2012).
  34. Malcor, J. D., et al. Chemical optimization of new ligands of the low-density lipoprotein receptor as potential vectors for central nervous system targeting. J Med Chem. 55, (5), 2227-2241 (2012).
  35. Wang, D., et al. Engineering a lysosomal enzyme with a derivative of receptor-binding domain of apoE enables delivery across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (8), 2999-3004 (2013).
  36. Spencer, B. J., Verma, I. M. Targeted delivery of proteins across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, (18), 7594-7599 (2007).
  37. Kreuter, J., et al. Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier. J Drug Target. 10, (4), 317-325 (2002).
  38. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Brain endothelial cell-cell junctions: how to 'open' the blood brain barrier. Curr Neuropharmacol. 6, (3), 179-192 (2008).
  39. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68, (5), 311-323 (2002).
  40. Stephan, D., et al. TWEAK/Fn14 pathway modulates properties of a human microvascular endothelial cell model of blood brain barrier. J Neuroinflammation. 10, (9), (2013).
  41. Descamps, L., Cecchelli, R., Torpier, G. Effects of tumor necrosis factor on receptor-mediated endocytosis and barrier functions of bovine brain capillary endothelial cell monolayers. J Neuroimmunol. 74, (1-2), 173-184 (1997).
  42. Miller, F., et al. The MAP kinase pathway mediates transcytosis induced by TNF-alpha in an in vitro blood-brain barrier model. Eur J Neurosci. 22, (4), 835-844 (2005).
  43. Fillebeen, C., Dehouck, B., Benaïssa, M., Dhennin-Duthille, I., Cecchelli, R., Pierce, A. Tumor necrosis factor-alpha increases lactoferrin transcytosis through the blood-brain barrier. J Neurochem. 73, (6), 2491-2500 (1999).
  44. Zhang, Y., Schuetz, J. D., Elmquist, W. F., Miller, D. W. Plasma membrane localization of multidrug resistance-associated protein homologs in brain capillary endothelial cells. J Pharmacol Exp Ther. 311, (2), 449-455 (2004).
  45. Kane, R. L., Martínez-López, I., DeJoseph, M. R., Viña, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters (EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. A mechanism for glutamate removal. J Biol Chem. 274, (45), 31891-31895 (1999).
  46. Kannan, R., Mittur, A., Bao, Y., Tsuruo, T., Kaplowitz, N. GSH transport in immortalized mouse brain endothelial cells: evidence for apical localization of a sodium-dependent GSH transporter. J Neurochem. 73, (1), 390-399 (1999).
  47. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103, (1), 23-37 (1992).
  48. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, (2), 279-289 (2005).
  49. Tsou, R., Isik, F. F. Integrin activation is required for VEGF and FGF receptor protein presence on human microvascular endothelial cells. Mol Cell Biochem. 224, (1-2), 81-89 (2001).
  50. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. AAPS J. 12, (4), 759-770 (2010).
  51. Rubin, L. L., Sanes, J. R. Neuronal and glial cell biology. Curr Opin Neurobiol. 6, (5), 573-575 (1996).
  52. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, (1), 41-53 (2006).
  53. Deracinois, B., et al. Glial-cell-mediated re-induction of the blood-brain barrier phenotype in brain capillary endothelial cells: a differential gel electrophoresis study. Proteomics. 13, (7), 1185-1199 (2013).
  54. Haseloff, R. F., Blasig, I. E., Bauer, H. C., Bauer, H. In search of the astrocytic factor(s) modulating blood-brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 25, (1), 25-39 (2005).
  55. Mi, H., Haeberle, H., Barres, B. A. Induction of astrocyte differentiation by endothelial cells. J Neurosci. 21, (5), 1538-1547 (2001).
  56. Abbott, N. J. Astrocyte endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. J. Anat. 200, (6), 629-638 (2002).
  57. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. J Neurochem. 97, (4), 922-933 (2006).
  58. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).
  59. Förster, C., Waschke, J., Burek, M., Leers, J., Drenckhahn, D. Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific. J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).
  60. Ge, S., Pachter, J. S. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine spinal cord. J Neuroimmunol. 177, (1-2), 209-214 (2006).
  61. Berezowski, V., Landry, C., Dehouck, M. P., Cecchelli, R., Fenart, L. Contribution of glial cells and pericytes to the mRNA profiles of P-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins in an in vitro model of the blood-brain barrier. Brain Res. 1018, (1), 1-9 (2004).
  62. Duan, S., Anderson, C. M., Stein, B. A., Swanson, R. A. Glutamate induces rapid upregulation of astrocyte glutamate transport and cell-surface expression of GLAST. J Neurosci. 19, (23), 10193-10200 (1999).
  63. Gegelashvili, G., Dehnes, Y., Danbolt, N. C., Schousboe, A. The high-affinity glutamate transporters GLT1, GLAST, and EAAT4 are regulated via different signalling mechanisms. Neurochem Int. 37, (2-3), 163-170 (2000).
  64. Candela, P., et al. Physiological pathway for low-density lipoproteins across the blood-brain barrier: transcytosis through brain capillary endothelial cells in vitro. Endothelium. 15, (5-6), 254-264 (2008).
  65. Dehouck, B., Dehouck, M. P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Upregulation of the low density lipoprotein receptor at the blood-brain barrier: intercommunications between brain capillary endothelial cells and astrocytes. J Cell Biol. 126, (2), 465-473 (1994).
  66. Dehouck, B., Fenart, L., Dehouck, M. P., Pierce, A., Torpier, G., Cecchelli, R. A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the blood-brain barrier. J Cell Biol. 138, (4), 877-889 (1997).
  67. Mahad, D. J., Ransohoff, R. M. The role of MCP-1 (CCL2) and CCR2 in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Semin Immunol. 15, (1), 23-32 (2003).
  68. Glabinski, A. R., Ransohoff, R. M. Chemokines and chemokine receptors in CNS pathology. J Neurovirol. 5, (1), 3-12 (1999).
  69. Stamatovic, S. M., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 regulation of blood-brain barrier permeability. J Cereb Blood Flow Metab. 25, (5), 593-606 (2005).
  70. Semple, B. D., Kossmann, T., Morganti-Kossmann, M. C. Role of chemokines in CNS health and pathology: a focus on the CCL2/CCR2 and CXCL8/CXCR2 networks. J Cereb Blood Flow Metab. 30, (3), 459-473 (2010).
  71. Veszelka, S., Nakagawa, S., Niwa, M., Deli, M. A. Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery. Recent Pat CNS Drug Discov. 6, (2), 107-118 (2011).
  72. Patabendige, A. The value of in vitro models of the blood-brain barrier and their uses. Altern Lab Anim. 40, (6), 335-338 (2012).
  73. Ogunshola, O. O. In vitro modeling of the blood-brain barrier: simplicity versus complexity. Curr Pharm Des. 17, (26), 2755-2761 (2011).
  74. Vandenhaute, E., et al. Modelling the neurovascular unit and the blood-brain barrier with the unique function of pericytes. Curr Neurovasc Res. 8, (4), 258-269 (2011).
  75. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 14, (1), 120-136 (2013).
  76. Vernon, H., Clark, K., Bressler, J. P. In vitro models to study the blood brain barrier. Methods Mol Biol. 758, 153-168 (2011).
  77. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 28, (1), 135-148 (2008).
  78. Uchida, Y., Ohtsuki, S., Kamiie, J., Terasaki, T. Blood-brain barrier (BBB) pharmacoproteomics: reconstruction of in vivo brain distribution of 11 P-glycoprotein substrates based on the BBB transporter protein concentration, in vitro intrinsic transport activity, and unbound fraction in plasma and brain in mice. J Pharmacol Exp Ther. 339, (2), 579-588 (2011).
  79. Cucullo, L., Aumayr, B., Rapp, E., Janigro, D. Drug delivery and in vitro models of the blood-brain barrier. Curr Opin Drug Discov Devel. 8, (1), 89-99 (2005).
  80. Naik, P., Cucullo, L. In vitro blood-brain barrier models: current and perspective technologies. J Pharm Sci. 101, (4), 1337-1354 (2012).
  81. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10, (18), 3725-3731 (1999).
  82. Santaguida, S., et al. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109, (1), 1-13 (2006).
  83. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31, (2), 767-777 (2011).
  84. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, M., Marchi, V., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, (40), (2011).
  85. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. (2013).
  86. Qutub, A. A., Hunt, C. A. Glucose transport to the brain: a systems model. Brain Res Brain Res Rev. 49, (3), 595-617 (2005).
  87. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125, (1), 127-141 (2006).
  88. Roux, F., Couraud, P. O. Rat brain endothelial cell lines for the study of blood-brain barrier permeability and transport functions. Cell Mol Neurobiol. 25, (1), 41-58 (2005).
  89. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, (13), 1872-1874 (2005).
  90. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990, (1-2), 995-112 (2003).
  91. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10, (1), (2013).
  92. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J Cereb Blood Flow Metab. 28, (2), 312-328 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics