Ställa upp en
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Medicine
 

Summary

Syftet med föreliggande studie var att validera reproducerbarhet en in vitro BBB-modellen som innebär en råtta syngent co-kultur av endotelceller och astrocyter. Den endotelceller cellslager presenterade hög TEER och låg LY permeabilitet. Uttryck av specifika TJ proteiner, var funktionella svar på inflammation och funktionalitet av transportörer och receptorer utvärderas.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Blod-hjärnbarriären (BBB) ​​regleras särskilt molekylära och cellulära flöde mellan blodet och nervvävnad. Vårt mål var att utveckla och karakterisera en mycket reproducerbar rått syngena i modell av BBB vitro med hjälp av co-kulturer av primära råtthjärna endotelceller (RBEC) och astrocyter att studera receptorer som är inblandade i transcytos över endotelceller monolager. Astrocyter isolerades med mekanisk dissektion efter trypsin matsmältningen och frystes för senare co-kultur. RBEC isolerades från 5 veckor gamla rått-cortex. Hjärnorna rengöras från hjärnhinnorna och vit substans, och mekaniskt skiljas efter enzymatisk nedbrytning. Därefter fick den vävnadshomogenat centrifugerades i bovint serumalbumin för att separat kärl fragment från nervvävnad. Fartyget fragmenten genomgick en andra enzymatisk nedbrytning av fria endotelceller från deras extracellulära matrix. De återstående kontaminerande celler såsom pericyter var fTTERLIGARE elimineras genom plätering av mikrokärlsfragment i puromycin-innehållande medium. De var sedan passe på filter för samodling med astrocyter odlas på botten av brunnarna. RBEC uttryckte höga nivåer av tight junction (TJ) proteiner såsom occludin, claudin-5 och ZO-1 med en typisk lokalisering på cellgränserna. Den transendoteliala elektriska motståndet (TEER) av hjärn endothelial monolager, vilket indikerar täthet TJs nådde 300 ohm · cm 2 i genomsnitt. De endothelial permeabilitetskoefficienter (Pe) för lucifer gul (LY) var mycket reproducerbar med ett genomsnitt på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Brain endotelceller organiserade i monolager uttryckte transportproteinet P-glykoprotein (P-gp), visade en polariserad transport av rodamin 123, en ligand för P-gp, och visade särskild transport av transferrin-Cy3 och DiILDL över endotelceller monolager. Avslutningsvis ger vi ett protokoll för att inrätta en in vitroBBB-modell som är mycket reproducerbar på grund av de säkringsmetoder kvalitet, och det är lämpligt för forskning om BBB: transportörer och receptorer.

Introduction

Många läkemedel som utvecklas för behandling av centrala nervsystemet (CNS) sjukdomar inte kan nå hjärnparenkymet i terapeutiskt relevanta koncentrationer. The BBB skyddar vävnaden hjärnan nervös från fluktuationer i plasmakomposition, från patogena agens, och upprätthåller homeostas hjärnparenkymet genom att begränsa icke-specifikt flöde av joner, peptider, proteiner och även celler in i och ut ur hjärnan 1.

BBB: egenskaper induceras och underhålls av intim närhet och överhörning mellan de specialiserade klassen hjärnmikrokärls endotelceller och angränsande delar av neuro-glia-kärl-enhet (NGVU) såsom nervceller, gliaceller (mer exakt astrocyte slut fot), och pericyter ensheathed i basalmembranet, som huvudsakligen består av kollagen typ IV, fibronektin, laminin och proteoglykaner 2,3. Pericyter omfattar ca 22-32% av endotel på kapillär nivå och spela en viktigroll i regleringen av endotel spridning, angiogenes och inflammatoriska processer. Endotelceller bildar ett kontinuerligt skikt, som täcker den inre ytan hos kapillärerna. De är förbundna med varandra medelst TJs, som utgör en bandliknande struktur på den apikala region och att bidra till cell polarisering. Astrocyter reglera BBB: egenskaper och är källor av viktiga reglerande faktorer, såsom TGF-β, GDNF, bFGF och IL-6. Astrocyter med brist på GFAP med ofullständig funktionalitet inte kan reglera BBB: egenskaper 4. Nervceller är inte direkt inblandad strukturellt i bildandet av BBB men också reglerar viktiga aspekter av proteinuttryck och BBB-funktioner 5.

I syfte att ytterligare studera strukturen, fysiologi och patologi av BBB ades in vitro-modeller av BBB utvecklats som forskningsverktyg. Brain endotelceller har hämtats från olika arter för att genomföra in vitro BBB: modeller baseradepå låga passage primära kulturer från nötkreatur 6,7, svin 8,9, råtta 10,11,12, mus 13 och även mänskligt 14,15. Dessa modeller är kända för att härma in vivo-BBB, speciellt när samodlades med gliaceller från råtta eller mus och / eller pericyter 16,12, och / eller neuronala föregångarcellhärledda astrocyter 17 och / eller neuroner 18. De "i labb" modeller tillverkas ofta från gnagare eftersom de tillåter in vitro / in vivo-experiment och jämförelser och / eller studier av hjärnans endotelceller framställts av transgena modeller 19.

Nyutvecklad in vitro BBB: modeller har också utformats för att hjälpa till att förutsäga hjärnans upptag av potentiella CNS läkemedelskandidater innan in vivo-testning 15,20,21,3,6,22,11,23. In vitro BBB: modeller används vanligen för att jämföra för transport av läkemedel till: i) kända penetration in i CNS eller med low permeabilitet över BBB och inga centrala effekter, och ii) den uppenbara Pe av samma läkemedel som uppmätts i djurmodeller av samma art. De läkemedel, som lätt passerar BBB är mestadels lipofilt och korsa cellmembranen hjärna endotelceller genom lipidmedierad fri diffusion (koffein, karbamazepin, etc.). De negativt transporterade läkemedel såsom digoxin, verapamil eller cyklosporin A aktivt extruderas genom hjärnans endotelceller uttransportörer såsom P-gp. Men många av de nyutvecklade terapeutiska molekyler är bioläkemedel, såsom rekombinanta proteiner, siRNA eller monoklonala antikroppar. De flesta av dem inte passera BBB grund: i) avsaknad av specifika transportörer, och ii) den tätt packade lager av endotelceller, som förhindrar högmolekylära molekyler från att genomgå paracellulär passage. Med dessa gränser "trojansk häst" strategier har genomförts med hjälp av vektorer (antikroppar, peptider) mot kända receptorer på BBB, inblandade in receptor medierad transport eller transcytos (RMT), såsom transferrin (Tf) receptor (TfR), insulinreceptorn (IR), eller medlemmar av LDL-receptorn (LDLR) relaterad receptorfamiljen (LDLR, LRP1). Dessa receptorer har hittats på isolerade hjärn kapillärer och i BBB in vivo 24,25. Transkription profiler för dessa receptorer, i synnerhet de av LDLR familjen, analyserades och jämfördes mellan hjärnans endotelceller och hjärnans endotelceller co-odlade med astrocyter eller i hjärnans kapillärer direkt efter deras extraktion från hjärnan 26. Pardridge 24 öppnas fältet med OX-26 antikropp mot transferrinreceptorn (TfR), följt av antikroppar mot insulinreceptorn och tillväxten insulinreceptorn 27,28. Med dessa antikroppsbaserade vektorer, har ArmaGen Technologies utvecklat en BBB molekylär trojansk häst plattformsteknik för att leverera läkemedel, inklusive proteiner, hela BBB 29. Denlitteraturen är rik på data som visar LRP1 uttryck i hjärnans endotelceller och dess roll som en kraftfull endocytic / scavenger-receptorn. Western blot-analys tydde på att LRP1 uttrycks i fraktioner anrikade på hjärnkapillärerna och i råtthjäma kapillära endotelceller 30. Företag som Angiochem mål LRP1 med peptid vektorer härrörande från aprotinin som främjar en effektiv drog tillströmning över BBB 31. Dock är LRP1 också involverad i aktiv transport av A-beta och dess utflöde / avslut från hjärnparenkymet till blod 32. Sådana uppgifter innebär LRP1 i en dubbelriktad transport över BBB, beroende på dess ligander. biOasis utvecklar Transcend teknik i ett protein melanotransferrin för transport av biologiska läkemedel såsom lysosomala enzymer och antikroppar över BBB 33 medan VECT-HORUS utvecklar peptid vektorer som riktar sig mot LDLR 34. Det finns data som tyder på att LRP och LDLR kan användas för att transportera difftekniker när molekyler såsom lysosomala enzymer 35,36 eller nanopartiklar komplex över BBB 37.

Vårt intresseområde är läkemedelstillförsel till CNS med vektormolekyler och vektoriserade drogkandidater för behandling av CNS-sjukdomar. I synnerhet har läkemedelstillförsel över BBB vägas i samband med neuroinflammation, en process som kan variera i omfattning, men det är förmodligen gemensamt för alla CNS-skador och sjukdomar, bland annat hjärninflammation, multipel skleros, Alzheimers sjukdom etc. Neuroinflammation är associerad med BBB inflammation och potentiellt med förändringar i BBB fysiologi och permeabilitet med tanke på att paracellulära och transcellulär transport kan amplifieras i patologiska tillstånd 38,39,40,41,42,43. Till exempel, TNF-α, justera, och andra cytokiner modulerar inflammation, och försök med in vitro-BBB: modeller har visat att de kan förändra den paracellulära egenskaper the endotelcell-monoskikt 38,39,40 och att TNF-α leder också till en ökning av transcellulär transport av LDL 41, holotransferrin 42 och laktoferrin 43.

Vårt mål var att utveckla och karakterisera en optimerad och mycket reproducerbar rått syngena BBB-modell med co-kulturer av primära hjärn endotelceller och astrocyter. Vi använde 5 veckor gamla och neonatala Wistarråttor för produktion hjärnans endotelceller och astrocyternas produktion respektive. En utmaning var att upprätta ett protokoll som möjliggör produktion av "vecko reproducerbara" BBB-modeller. För att nå detta mål, var varje steg i produktionsprotokoll som utförs på fasta veckodagar, med början från hjärnmikrokärlsproduktion på onsdagen i första veckan. Dissektioner utfördes nästan varje vecka under de senaste 3 åren. För att ytterligare förbättra reproducerbarheten av kulturerna, var ett kvalitetssäkringssystem inrättas. Alla Reagents och kemikalier refererades i en databas (träder, lager, utgångs sikt, etc.).

Modellen karakteriserades efter ett antal kriterier, såsom endotelceller organisation och renhet, TEER, LY permeabilitet, svar på pro-inflammatoriska medel, kvalitativa och kvantitativa uttryck av TJ-proteiner, funktionalitet uttransportörer såsom P-gp, och receptorer involverade i transcytos över endotelceller cellslager såsom TfR eller LDLR.

Protocol

1. Produktion av Rat Astrocyter

För varje preparat använder 10 neonatala Wistarråttor av båda könen.

  1. Offer råttorna genom skärhuvuden med en sax och för över dem omedelbart i ett torrt petriskål under ett dragskåp med laminärt flöde. Avlägsna hjärnorna från skallen utan cerebellum och överföra dem omedelbart till en petriskål med kallt dissektion buffert: HBSS supplementerat med 1% bovint serumalbumin (låg nivå av endotoxin BSA), penicillin 100 enheter / ml och streptomycin 100 pg / ml.
  2. Skär hjärnorna på mitten, för att separera de två hjärnhalvorna och överföra dem till en ren petriskål med dissektion buffert på is. Skär synnerven och avlägsna hjärnhinnorna under ett stereomikroskop.
  3. Tvätta kortikala bitar omfattande i 50 ml kall dissektion buffert.
  4. Placera de kortikala bitar från 3 hjärnor i en 15 ml Falcon rör och avstånd genom att pipettera upp och ned en kupple gånger med 10 ml engångspipett utrustad med en blå spets i 6 ml trypsin 0,05% - EDTA 0,02% under 5 minuter vid 37 ° C.
  5. Lägg till 24 ml av DMEM kompletterat med 10% FBS och följande antibiotika, penicillin 100 enheter / ml och streptomycin 100 ^ g / ml, ett media som namnges gliacell medier (GCM) och centrifugera vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur. FBS partier valdes ut och validerats för tillväxt och överlevnad av astrocyternas cutures.
  6. Suspendera pelleten innehåller dissocierade celler i 10 ml GCM och plattan i en 75 cm 2 T-kolv (T75). Ändra mediet följande dag för att avlägsna celldebris och DNA. Ersätt odlingsmediet två gånger i veckan.
  7. Efter en vecka av proliferation, skaka försiktigt gliaceller med en orbital skakanordning vid 60 rpm under 24 h vid 37 ° C i GCM. Om T75 inte kan placeras i en inkubator med 5% CO 2/95% luft vid 37 ° C fuktad atmosfär, komplettera media med 5 mM HEPES. Tvätta cellerna två gånger med rEFlytta icke vidhäftande mikrogliaceller.
  8. Tre veckor efter sådd, tvätta cellerna två gånger med DPBS utan kalcium och magnesium. Lägg 3 ml varmt trypsin 0,05%-EDTA 0,02%, inkubera vid 37 ° C och vänta tills cellskiktet är dispergerat (vanligen 5 min). Inhibera trypsin-aktivitet genom tillsats av 10 ml av GCM, överför cellsuspensionen till ett 15 ml Falcon-rör och centrifugera vid 120 x g under 8 min.
  9. Resuspendera astrocyternas pelleten i 90% FBS - 10% DMSO, överföra dem till cryovials (2 x 10 6 celler per cryovial) och lagra i flytande kväve.

2. Isolering av råtthjäma mikrokärl

Våra experimentella procedurer är godkända av den etiska kommittén vid medicinska fakulteten Marseille och uppfyller nationella och europeiska bestämmelser (EU-direktiv nr 86/609). Alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande och minska antalet djur som används.

  1. För varje preparat och för en Experimenter, använd 3 fem veckor gamla Wistar råttor.
  2. Måndagen den första veckan, förbereda 2 T75 kolvar genom beläggning med kollagen typ IV och fibronektin, både vid 1 mikrogram / ​​cm 2 i sterilt kultur vatten (10 ml per T75). Tillåt att vidhäfta vid 37 ° C tills mikrokärls sådd.
  3. Onsdag morgon den första veckan, avliva råttorna i en ökande flöde av CO2 för att framkalla sömnighet, förlust av kroppshållning och andning avbrott, sedan följt av en cervikal dislokation. Spraya huvudena med 70% etanol. Skär huvudena med en sax och överföra dem till en torr petriskål under ett dragskåp med laminärt flöde.
  4. Avlägsna hjärnorna från skallen utan cerebellum och synnerverna och därefter överföras i en petriskål kyldes på is och fylldes med kallt dissektion buffert (HBSS supplementerat med 1% BSA, penicillin 100 enheter / ml och streptomycin 100 pg / ml) .
  5. Skär hjärnorna på mitten för att separera de två hjärnhalvorna och separat mitthjärnan från förebrain. Överför framhjärnorna i en ren petriskål på is med dissektion buffert.
  6. Ta ett par halvklot i en ny petriskål med kallt dissektion buffert för att försiktigt ta bort hjärnhinnorna från framhjärnorna under ett stereomikroskop med N ° 5 böjda pincett. Sedan rengör insidan av hjärnan för att ta bort täcket av myelin och erhållande av ett skal av cortex. Dessa åtgärder bör inte ta mer än 2 timmar för vävnads bevarande och cellöverlevnad.
  7. Dissociera cortex från 3 hjärnor i 6 ml kallt dissektion buffert i en 7 ml Dounce homogenisator med 10 upp och ner slag med vardera 2 pestles av olika godkännanden, 71 um följt av 20 um.
  8. Dela upp suspensionen för att erhålla motsvarande 1 cortex i en ml av en 50 ml Falcon-rör och centrifugera vid 1000 xg under 5 min vid rumstemperatur. Kasta bort supernatanten.
  9. Digerera suspension från en cortex med 1 ml av en enzymlösning som innehåller en blandning av kollagenas / dispas (60 | ig / ml R11; 0,3 U / ml), DNas typ I (35 ^ g / ml - 20 K enheter / ml) och gentamicin (50 ug / ml) i en skakanordning under 30 min vid 37 ° C.
  10. Blanda 1 ml smälta från 1 cortex med 10 ml 25% BSA / HBSS 1X och separat genom densitetsberoende centrifugering vid 3600 xg under 15 min vid RT. Försiktigt överföra den övre skivan (myelin och hjärnparenkymet) och supernatanten i en ren 50 ml Falcon rör och upprepa centrifugering. Håll den resulterande pelleten innehållande hjärnmikrokärl vid 4 ° C.
  11. Försiktigt kassera den övre skivan och supernatanten. Resuspendera båda resulte pellets innehåller hjärnan mikrokärl med 1 ml kall HBSS 1X och överför till en ren 50 ml Falcon rör.
  12. Tvätta mikrokärl genom tillsats av 20 ml kall HBSS 1X och centrifugera vid 1000 xg under 5 min. Kasta bort supernatanten.
  13. Ytterligare smälta mikrokärl från 1 cortex med 1 ml av samma enzymatisk lösning som beskrivs i steg 2,9 under 1 timme vid 37 ° C i en shaker.
  14. Sedan blanda de uppdelade mikrokärl från var och en av de 3 cortex i ett rör och ytterligare dela upp i två 50 ml Falcon-rör för att erhålla mikrokärl utvinns ur motsvarande en och en halv (1,5) cortex per rör. Tillsätt 30 ml kallt dissektion buffert och centrifugera vid 1000 xg under 5 min vid rumstemperatur.
  15. Resuspendera mikrokärls pelleten i 10 ml av DMEM/F12 kompletterat med 20% bovint blodplättsfattig plasma härlett serum, basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF, 2 ng / ml), heparin (100 pg / ml), gentamicin (50 pg / ml) och HEPES (2,5 mM), som namnges endotelcell media (ECM) kompletterat med puromycin vid 4 ug / ml.
  16. Ta de två belagda T75 kolvar från inkubatorn, aspirera överskottet av beläggning och platta de mikrokärl från varje rör i en T75 kolv (mikrokärl extraherade från 1,5 cortex per T75 kolv).

3. Rening och spridning av RBEC Primocultures

  1. Rening: onsdag till fredag, lägga puromycin vid 4 ^ g / ml till odlingsmediet. Ändra mediet på torsdagen. På fredag, tvätta cellerna och lägga puromycin på 2 mikrogram / ml till måndag.
  2. Proliferation: på måndagen i den andra veckan, tvätta cellerna och lägga insulin, transferrin och natriumselenit tillägg till odlingsmedia tills kulturerna når 90% sammanflödet på onsdagen i den andra veckan.

. 4 Differentiering: Inställning av in vitro BBB-modell

  1. Måndagen i den andra veckan, förbereda filter (polyeten, 12 brunnar, porstorlek 1,0 mikrometer) genom beläggning med en blandning av kollagen typ IV och fibronektin både 0.5μg/cm 2 i sterilt kultur vatten (500 l av blandningen i det övre facket och 1,5 ml sterilt odlingsvatten i den undre avdelningen). Tillåt att vidhäfta vid 37 ° C tills RBEC sådd.
  2. Måndagen i den andra veckan, fem dagar före inrättandet av co-kultur, tina de astrocyter från cryovials vid 37 ° C och överföringi ett 15 ml Falcon med 10 ml GCM. Centrifugera suspensionen vid 120 x g under 8 min vid rumstemperatur.
  3. Resuspendera astrocyt pelleten i GCM och platta vid en densitet av 30 x 10 3 celler per cm 2 i 12-brunnsplattor.
  4. Onsdagen i den andra veckan, strax före dissociation av RBEC med trypsin, tvätta två gånger pre-belagda filter med DMEM/F12-medium. Pre-fylla kamrarna med ECM: 1,5 ml i nedre facket och 0,5 ml i det övre facket.
  5. Onsdagen i den andra veckan, tvätta två gånger RBEC med DPBS utan kalcium och magnesium. Tillsätt 4 ml varmt trypsin 0.05% - EDTA 0,02% lösning vid 37 ° C per T75 kolv under 30 sekunder exakt. Ta sedan bort 3,5 ml av trypsinlösning och observera under mikroskop. När cellskikt börjar lossna från matrisen, hjälpa dem genom att knacka försiktigt kanten av T75 kolv till dess att alla celler är flytande.
  6. Lägg till 9 ml ECM per T75 kolv och överför till en 15 ml Falcon rör. Mycket försiktigt dissociera cellsuspension genom pipettering upp och ned fyra gånger med en 10 ml pipett utrustad med en gul spets (undvika produktion av bubblor i lösningen). Räkna celler i suspension (approximativt 3 x 10 6 cells/T75) och omedelbart plattan på förbelagda och förfyllda filter vid en hög densitet (160 x 10 3 celler / filter därmed cirka 18 filters/T75) (Figur 8 ). Följande dag (torsdag), ändrar dubbelt mediet den övre kammaren för att avlägsna celldebris.
  7. Torsdag i den andra veckan, dagen före inrättandet av co-kultur, byt astrocyternas odlingsmedia med 1,5 ml av differentiering media (ECM med hydrokortison vid 500 nM) som kan kompletteras med 1/3 konditionerat medium från basala facket av ett tidigare samodling (3 dagar av kontakt mellan endotelceller och astrocyter).
  8. Fredagen den andra veckan definieras som dagen 0 av differentiering; ersätta odlingsmedia från filter containing den RBEC med differentieringsmedia. Överför RBEC filter i brunnarna innehåller astrocyter. Under dessa betingelser in vitro-modeller differentiera och uttrycka kopplingsrelaterade proteiner inom tre dagar.
  9. Modellerna håller optimal differentiering under ytterligare 3 dagar, från måndag till onsdag i den tredje veckan.

Representative Results

Produktion protokoll
Protokollet kan delas in i tre faser motsvarar viktiga förändringar i odlingsmedia sammansättning: (a) rening av endotelceller från mikrokärl, (b) spridning, och (c) differentiering på filter (12-hålsplattor polyeten med en porositet 1 mikrometer) i samodling med astrocyter. De olika stegen i produktionsprocessen protokollet har tilldelats specifika dagar i veckan för att öka reproducerbarheten hos de primära cellkulturer (Figur 1). På onsdagen i första veckan, därav 9 dagar före inrättandet av samodlingssystemet ades mikrokärl isolerades (Figur 2A). För att rena endotelceller ades kulturerna hålls i närvaro av minskande koncentrationer av puromycin i 5 dagar. De flesta kontaminerande celler (främst pericyter) eliminerades och tillväxt av endotelceller var långsammare utan ändring av deras fenotyp. Spindel-shaped celler växer ut ur kapillär fragment som isolerats från råtthjärna grå materia (Figur 2B). På måndagen i den andra veckan, var rått astrocyter pläterade på botten av 12-brunnsplattor. Onsdag, RBEC tillsattes till den luminala utrymmet av filtren. Högdensitets ympning vid 160 x 10 3 celler / cm 2 (figur 2C) hjälper till att undvika luckor vid periferin av filtret (figur 2D) och alstrar en homogen differentiering av den endoteliala cellmonoskiktet. Cellerna visar den typiska långsträckta spolformad morfologi, justera i längsled, och bildar en enhetlig monolager. Torsdag, astrocyternas odlingsmedium byttes för differentiermediet rade med den tidigare co-odlingsmedia (Figur 2E). Fredag, RBEC på filter odlades i odlingsmedium innehållande 500 nM hydrokortison och filtren överfördes till 12-brunnsplattor innehållande astrocyter. På den tredje veckan, experiment were utförs mellan måndag och onsdag.

RBEC Karakterisering och Fastställande Elements of Monolayer permeabilitet
Den RBEC karakteriserades av immunfärgning av endotel och BBB markörer samt genom mätningar av TEER, permeabilitet LY och funktionalitet uttransportörer såsom P-gp.

RBEC erhållits genom puromycin reningsmetoden (figur 1 och 2) växte i icke-överlappande kontinuerliga monoskikt som uppvisade tillväxthämning vid konfluens och visas tätt apposed, fusiform och spindelformad morfologi. RBEC kulturer uttryckte typiska markörer för endotelceller: de visade positivt immunfärgning för trombocyter endotelcellsadhesion molekyl (figur 3A, CD31/PECAM) och uttryck av von Willebrands faktor (Figur 3B). Utan puromycin behandling, är RBECs snabbt invaderade av pericyter upptäckts av desmin Immunosrätthålla (Figur 3C). Gliafibrillärt surt protein (GFAP) uttrycks av astrocyter (Figur 3D) är en viktig differentiering markör för astrocyter. Med hög passagenummer, astrocyter förlorar sin förmåga att inducera differentiering av endotelceller. Därför var astrocyternas kulturer standardiserat för sin tid för kultur och endast genomgick en passage.

Odling RBEC med media kompletterade med hydrokortison, följt av samodling med astrocyter och med konditionerat medium från den undre avdelningen av tidigare samkulturer lett till kraftig induktion av interendothelial TJs i jämförelse med RBEC odlades ensam. Cellerna uttryckte claudin-5, ZO-1 och occludin proteiner, som var lokaliserade vid cell-cellföreningspunkter, såsom visas genom immunofluorescens (Fig. 4B-D) och som framträder vid Western blot-analys för ZO-1 och occludin proteiner (Figur 4E ). Den morfologiska fördelning på cell-till-cell-kontakter i ett blixtlåsliknande konfiguration speglar (a) tätheten hos monoskikt, (b) cerebral ursprunget hos de kapillära endotelceller, och (c) är kännetecknande för mycket differentierade cerebrala endotelceller. Paracellulär permeabilitet endotelskiktet övervakades genom mätning av TEER och hastigheten för inflöde av LY (457 Da) från den övre till den undre avdelningen av filtren. TEER mättes med användning av en ENDOHM-12 för 12 mm odlings kopparna anslutna till en EVOM voltohmmeter. Den TEER av hjärn endoteliala monoskikt, vilket indikerar tätheten hos TJs nådde 300 ohm-cm 2 i genomsnitt (filter av 12-brunnsplattor, data ej visade). Den Pe för LY (Pe (LY), som används som en integritetskontroll av barriären och saminkuberades med testade föreningarna) nådde ett genomsnitt på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min (Figur 4F) över en period 1 år.

För att inducera inflammation RBEC använde vi pro-inflammatoriska cytokinen TNF-α på 5 ng / ml för 24 timmar, och följde det inflammatoriska svaret genom att mäta CCL2 (MCP-1) utsöndring av RBEC i det övre facket i odlingssystem som fördubblades från 120 ng / ml (icke- behandlad kontroll) till 250 ng / ml (figur 5A). TNF-α behandling vid 5 ng / ml eller 50 ng / ml för 24 timmar öppnade också BBB som avslöjades av Pe (LY) mätning (Figur 5B).

P-gp visualiserades i differentierad RBEC genom immuncytokemi (figur 6A). P-gp lokalisering är känd för att vara mycket polariserad och uttrycks i huvudsak i det apikala membranet av endotelceller 44 medan glutamat transportör-1 (GLT-1) finns främst i den basolateral fraktionen 45. För att bedöma omfattningen av polariseringen av vår odlade RBEC ades apikala och basolaterala proteiner separeras från plasma membranpreparat med hjälp av sackaros densitetsgradienter 46. Western blot-analys varutföras för att bedöma expressionsnivåer av P-gp och GLT-1 i plasma, apikal-och basalmembranpreparat. Mikrokärl nyligen extraherade från råtthjäma användes som närmaste positiva kontroller för distributionen in vivo av dessa proteiner (figur 6B). I båda mikrokärl och differentierade RBEC membranpreparat, var P-gp, uttryckt som ett band av 170 kDa, huvudsakligen lokaliserad i F1 apikala membranfraktionen (Figur 6B, C). GLT-1 uttryck faktiskt uttryck i F3 basalmembranfraktionen av mikrokärl som ett band på 65-70 kDa, men upptäcktes inte i den odlade RBEC.

I parallella experiment var den funktionella aktiviteten av P-gp i endotelcell-monoskikt testades med användning av rodamin 123 (R123) som en ligand. Den abluminala att luminala (B till A) utflödet av R123 var 1,7 gånger högre än i motsatt riktning (figur 6D). För att bevisa P-gp engagemang, använde vi specifika P-gp-hämmare, verapamil (25 ^ M, 30 min förinkubering) och cyklosporin A (1 ^ M, 30 min förinkubering). Med verapamil och cyklosporin behandling, var R123 ackumulering i RBEC ökade 1,6 gånger och 2 gånger, jämfört med obehandlad kontroll (figur 6E).

Receptorer involverade i receptor medierad transcytos (RMT) Mekanismer
Modellen kännetecknas vidare för uttryck av olika receptorer potentiellt involverade i transcytos mekanismer på BBB, t.ex. LRP1, LDLR eller TfR (Figur 7A).

Funktionella transportstudier utfördes med ligander för TfR och LDLR. Live RBEC inkuberades med rått transferrin märkt med CY3 (Tf-Cy3) under 180 min vid 37 ° C (figur 7B, C). Kvantifiering av Tf-Cy3 upptag och transport i råtta in vitro BBB-modellen visade att lutningen på kurvorna minskade något mer än 2.400 picomols (Figur 7B), vilket tyder på att bindande / upptag var mätt. Dessutom var mättning av bindning / upptag korrelerad med ackumuleringen av Tf i den undre avdelningen. För att bekräfta denna observation var Tf-Cy3 inkuberas vid 1.200 pikomol (stigande delen av kurvan) med ett överskott av icke-fluorescerande Tf vid 4.800 picomol (platå / mättnad) (Figur 7C). Dessa experiment visade en minskning av Tf-Cy3 ackumulering i det nedre facket och bekräftade en mättningsmekanism typisk för ligand-receptor interaktion i vår in vitro BBB-modellen.

På samma sätt var LDLR funktionalitet visas av upptag och transport av dess ligand DiILDL över endotelceller monolager (Figur 7D, E). Live RBEC inkuberades med DiILDL under 30 min vid 37 ° C. Den bindning / upptag var inte korrelerad med ackumuleringen av DiILDL i den undre avdelningen (Figur 7D). Kvantifiering av DiilDL transport visade att lutningen på kurvorna minskade än 2 mikrogram, vilket tyder på att transporten var mättningsbar och receptor-relaterade i vår modell. Natriumazid tillsattes vid 0,05%, 15 min före DiILDL inkubation (Figur 7E). Frånvaron av toxicitet natriumazid inkubation vid 0,05% bedömdes genom Pe (LY)-mätning (data ej visade). Dessa experiment visade minskade DiILDL ackumulering i den undre avdelningen. Sammantaget våra resultat tyder RMT för DiILDL i vår in vitro BBB-modellen.

Andra in vitro BBB: Modeller baserade på endotelceller från råtta ryggmärgen eller mus hjärnans
Enzymatisk spjälkning med en blandning av kollagenaser / dispas är en av de viktigaste parametrarna för att kontrollera när det gäller cellernas livskraft och produktionsutbyte av cerebral mikrokärl. Koncentrationen av enzymet och mer viktigt är förhållandet mellan den mängd av enzym i förhållande till vävnaden, nEEDS kalibreras exakt mellan råtthjärna, råtta ryggmärg och möss hjärna. Microvessel seedning densitet och antal endotelceller för att nå 90% sammanflödet (9 dagar efter mikrokärls sådd) var kopplade och är viktiga parametrar för att förbättra celltillväxt, begränsar antalet populationsfördubblingstid och kvaliteten på modellerna. Råttryggmärg mikrokärl producerades med samma protokoll som det som beskrivs häri för råtthjärnmikrokärl (i termer av vävnads belopp, 2 ryggmärg som ungefär motsvarar en hjärna) för att erhålla samma mängd celler per T75-kolv i samma tidsskala . Hjärnhinnorna från 5 veckor gamla C57BL6 möss hjärna var svåra att eliminera, eftersom de håller sig till hjärnbarken. En kort behandling av hjärnan med dispas verkar för att underlätta avlägsnandet av hjärnhinnorna. De viktiga parametrar som bidrar till produktionen av reproducerbara endoteliala cellmonoskikt från råtthjärna, råttryggmärg och mushjärna markeras och sammanfattas iFigur 8.

Figur 1
Figur 1. Flödesschema sammanfattning av de viktigaste stegen i vitro BBB-modellen beredning i. De olika stegen i produktionsprotokoll tilldelades till vissa dagar i veckan för att öka reproducerbarheten av de primära endothelial cellkulturer. Protokollet inleds på onsdagen i första veckan, med mikrokärls produktion från 5 veckor gamla Wistar råttor.

Figur 2
Figur 2. Faskontrast mikrofotografier av RBEC, astrocyter och samodlingssystemet. (A) 5 veckor gamla Wistar råtta mikrokärlsfragment vid tidpunkten för plätering ut.(B) Tre dagar gamla RBEC kulturer behandlade i 2 dagar med P-gp-substrat puromycin vid 4 mikrogram / ​​ml. (C) Rena konfluenta endothelial monolager på dag 1 efter plätering på Millipore filter med en 12 hålsplatta belagd med kollagen typ IV och fibronektin. (D) Homogenitet av encellsskiktet vid periferin av insatsfilter. (E) Confluent astrocyternas kultur på dagen för inrättandet av samarbetskulturen visar karakteriserade honeycomb morfologi. (F) Scheme representerar co-kultur System med lokalisering av mikrofotografierna i C, D och E.

Figur 3
Figur 3. Karakterisering av RBEC kulturer genom immunfluorescensmikroskopi. (A) Brain endotelceller uttrycka plätt endotelcelladhesionsmolekyl PECAM/CD31 vid cell kant, (B) von Willebrands faktor (VWF) visar en relativt punktformig färgning, ljusare och mer aggregerad i vissa celler än andra, och koncentreras i den perinukleära zonen. (C) Utan puromycin behandling av RBEC kulturer, är pericyter upptäcks med en positiv immunfärgning för desmin (i grönt) och har karaktäristiska små runda kärnor. (D) Astrocyter uttrycker gliafibrillärt surt protein (GFAP). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Immuncytokemiska karakterisering av råtta in vitro BBB-modellen och den paracellulära permeabilitetLY tvärs den endoteliala monoskiktet. Cellmonoskiktet var immunfärgades med (A) vimentin att avslöja en konfluent hjärna endotelial cellmonoskiktet med icke-överlappande morfologi och typisk spindelformade celler med endotelial morfologi och expression av tight junction proteiner (B) claudin-5 , (C) ZO-1 och (D) occludin, också detekteras genom western blöt för ZO-1 och occludin proteiner (E). (F) Monolayer täthet i 12-brunnars BBB modell utvärderades genom att mäta transporten av lucifer gul (LY-CH, dilitiumsalt), en liten hydrofil molekyl (MW 457 Da) känd för att behållas av BBB. Kortfattat, LY inkuberades i den övre avdelningen av odlingssystemet i kontakt med cerebrala endotelialceller för 60 min vid 37 ° C. Efter denna tidsperiod avlägsnades mediet den undre avdelningen uppsamlades och fluorescensen kvantifierades genom fluorometrisk analys med en spectrofluorimeter med excitation vid 430 nm och emission vid 535 nm. Resultaten uttrycks i permeabilitet eller Pe i 10 -3 cm / min. Barriären anses permeabel eller öppen när Pe från LY är ovanför 0.6x10 -3 cm / min. Under varje 1 timme experiment den genomsnittliga rensas volymen avsätts mot tiden och lutningen beräknas genom linjär regressionsanalys. Lutningen av kurvan clearance för kontrollfilter med kollagen typ IV-fibronektin beläggning betecknades PSF och lutningen hos kurvan clearance för filter med hjärn endotelial cellmono betecknades PST. PS värdet för endothelial monolager (PSE) beräknades från: Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Ekvation 1

PSE värdena dividerat med det område av porgående membran (1,1 cm 2 för Millipore-filter av 12-brunnsplattor) och resultatet var permeabilitetskoefficienten (PE) med ett genomsnitt på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Resultaten presenteras med en vertikal spridningsdiagram representation för N = 90 analyser (medelvärde n = 3 till n = 6 monoskikt per analys).

Figur 5
Figur 5. In vitro BBB modell svar på behandling med det pro-inflammatoriska medlet TNF-α. Odlingsmedierna från odlingssystemet ersattes strax före TNF-α behandling vid 5 ng / ml i den övre avdelningen för 6 tim, 12 tim och 24 tim. CCL2 frisättning av RBEC kvantifierades i det övre facket genom ELISA-analys jämfört med obehandlad kontroll. Observera att MCP-1-nivåerna ökar något som funktion av tiden, Även i de icke-behandlade brunnar. Integriteten för den endoteliala cellbarriären mäts genom endotelceller Pe för LY Pe (LY) visade en ökning av monoskikt permeabilitet av 24 h behandling med TNF-α vid 5 ng / ml eller 50 ng / ml i intervallet från 0,62 ± 0,02 x 10 - 3 cm / min och 0,7 ± 0,01 x 10 -3 cm / min, jämfört med kontrollen vid 0.33 ± 0,03 x 10 -3 cm / min (Students t-test, p <0,05).

Figur 6
Figur 6. Funktionalitet av P-gp effluxtransportören och RBEC polarisering. Redovisning av transportproteinet P-gp i hjärnans endotelceller co-odlade med astrocyter genom immuncytokemi (A) och western blot (B & C). Cellmembran proteiner extraherades med en cellulär proteinfraktionetion kit. Plasmamembran erhölls genom hypoton lys och differentialcentrifuge att eliminera organeller och kärnor. Separation av apikala och basolaterala proteiner från plasmamembran erhölls genom sackarosdensitetsgradient. P-gp huvudsakligen lokaliserad i den apikala fraktion (F1) medan Glutamat transportör-1 (GLT-1) var huvudsakligen lokaliserad i det basolaterala fraktionen (F3). Renade mikrokärl före plätering användes som kontroll för lokaliseringen av dessa proteiner in vivo. Aktivitet hos P-gp bestämdes genom att mäta transporten polaritet R123, en P-gp-ligand. Flödet av en iM R123 mättes under 1 h vid 37 ° C i den luminala till abluminala (A till B) och i de motsatta abluminala-till-luminal (B till A) riktningar. Samma experiment genomfördes utan RBEC att bedöma passiv diffusion över insatsfilter och data normaliserades i förhållande till detta värde för Pe (R123) beräkning (se figur 5 (R123) (A till B). Verapamil (25 | iM, 30 min förinkubering) och cyklosporin A (1 | iM, 30 min förinkubering) användes som referens P-gp-hämmare. R123 ackumulering i RBEC mättes efter 2 timmar med eller utan förinkubering med P-gp-hämmare (Students t-test, p <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7. Karakterisering av receptorer som är involverade i receptormedierad Transcytosis (RMT). (A) Den differentierade RBEC monoskiktet immunfärgades med antikroppar mot den låga densiteten relaterade lipoprotein receptor 1 (LRP1) och lågdensitetslipoprotein-receptor (LDLR). Confocal avbild RBEC sonde för upptag av DiILDL, en fluorescerande ligand av LDLR och för upptag av rått-Transferrin-Cy3, en fluorescerande ligand av TfR show punktformig färgning över cellytan, med viss klustring i det perinukleära området. (B) Råtta Tf-Cy3 sattes till den övre avdelningen som innehåller den differentierade RBEC monoskikt vid 75, 150, 300, 600, 1200, 2400 och 4800 pikomol / insats för 180 min vid 37 ° C (200 mikroliter i den övre avdelningen och 1200 | il i den undre avdelningen). Efter denna tid tillsattes Cy3 fluorescens kvantifieras i cellysatet (200 | il av PBS 0,1% Triton X 100) och i den undre avdelningen genom fluorimetrisk analys med en spektrofluorimeter med excitation vid 550 nm och emission vid 570 nm.. Fluorescensenheter transformerades i pikomol som använder ett linjärt arbetsområde. (C) För mättnadsförsök, var råtta Tf-Cy3 sattes till den övre avdelningen innehållande den differentierade RBEC monoskikt vid 1200 pikomol / insats för 180 min vid 37 ° C med eller utan 15 min pre-inkubation med 4.800 pikomol / insats av icke-fluorescerande Tf. Transporten i den undre avdelningen kvantifierades såsom i (B) (Students t-test, p <0,05). (D) DiILDL sattes till den övre avdelningen innehållande den differentierade RBEC monoskikt vid 1, 2, 4 och 8 | ig / insert filter under 30 min vid 37 ° C (200 ^ il i den övre avdelningen och 1200 | il i den undre avdelningen). Efter denna tid tillsattes Dil fluorescens kvantifieras i cellysatet (200 | il av PBS 0,1% Triton X 100) och i den undre avdelningen genom fluorimetrisk analys med en spektrofluorimeter med excitation vid 554 nm och emission vid 571 nm. Fluorescensenheter transformerades i ^ g med användning av ett linjärt arbetsområde. (E) För transport blockerande experiment natriumazid sattes vid 0,05% 15 min före inkubation av DiILDL vid 2 | ig / infoga under 30 min vid 37 ° C. Transporten i den undre avdelningen kvantifierades såsom i (D) (Students t-test, p <0,05). Frånvaron av toxicitet natriumazid inkubation vid 0,05% bedömdes av Pe (LY) mätning (data visas ej). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8. In vitro BBB: modeller från råttryggmärgs endotelceller eller från mushjärna. Tabellen högalyser viktiga parametrar för mikrokärls extraktion från råtthjärna, råtta ryggmärg och mus hjärna. Mikrofotografier visar immunfärgning för ZO1 och occludin i endothelial cellmonoskikt framställda från råtthjärna, råtta ryggmärg och mus hjärna.

Discussion

Vi beskriver genomförandet av en vecko reproducerbar protokoll för isolering och plätering av hjärnmikrokärl, efter rening och kultur RBEC och vidare inrätta samkulturer med primär rått astrocyter att generera en in vitro BBB-modell med karaktäristiska BBB: egenskaper.

Framgångsrikt upprättandet standardiserade in vitro-BBB: kulturer kräver optimala förhållanden i de multipla sekventiella steg av processen. Modellen (a) optimeras för att erhålla lägsta paracellulära permeabilitet, vilket fortfarande är den "heliga graal" av in vitro BBB: modeller, och (b) validerats för utflöde och RMT mekanismer.

Produktion, rening och spridning av RBEC

Den största utmaningen vid odling RBEC är att uppnå reproducerbarhet mellan olika kulturer. Standardisering av protokollet kräver högkvalitativa verktyg för disavsnitt, högkvalitativa reagenser och för reagensutgångsdatum. Försöksledaren måste vara skicklig i mikro-dissektion i stereomikroskop för snabb borttagning av hjärnhinnor och stora fartyg från cortex ytan. När hjärnan är isolerade och mekaniskt dissocierade, en av de stora utmaningarna är den optimala enzymatisk nedbrytning av de nyligen isolerade hjärnmikrokärl. Den typ och kvalitet av de enzymer som används är kritisk. En blandning av kollagenaser typ I och II och dispas vid hög koncentration med låg variabilitet mellan batcher användes. Viktigt är också varaktigheten av enzymatisk spjälkning och förhållandet mellan enzymkoncentrationen / vävnad vikt / volym av matsmältningen. Det bästa utbytet av hjärnmikrokärls produktion erhölls med motsvarigheten av cortex från en hjärna i en ml av kollagenaser / dispas blanda vid 60 | ig / ml under både spjälkningar, respektive 30 minuter och 1 timme.

Också kritiska är att eliminera kontaminerande cells (astrocyter och främst pericyter). Dessa celler förökar sig med högre hastighet än endotelceller och inte etablera tight junctions med det senare, vilket förhindrar upprättandet av en homogen cellmonolager med god paracellulär restriktivitet. Med tanke på att hjärnans endotelceller uttrycker mycket högre nivåer av effluxpumpar, speciellt P-gp, jämfört med andra celltyper som finns i mikrokärl, bättre de tolererar de annars toxiska koncentrationer av P-gp ligand droger, medan icke-endotelceller elimineras. Puromycin behandling på 4 mikrogram / ml för de första två dagarna följdes av ytterligare två dagar till 2 mikrogram / ml för att erhålla god endotelceller renhet. Detta val kan också gynna kapillärendotelceller kontra de från venoler, pre-kapillär arterioler eller större mikrokärl, och leda till stramare monolager. Dessutom är en nödvändighet för att erhålla rena kulturer av endotelceller 47,48 användningen av plasma-härlett bovint serum. Plasman-derived serum saknar platelet-derived growth factor (PDGF), vilket är mitogen för fibroblaster, för glatta muskelceller och därmed för pericyter.

Vi konstaterade att behandlingen av plast och filter med en blandning av kollagen typ IV från möss och mänskliga fibronektin ger en betydande fördel, med en 2-faldig ökning av spridningen avkastning jämfört med traditionellt rekommenderat kollagen typ I från råtta svans. Viktiga signaler för cellproliferation tillhandahålls av den extracellulära matrisen såsom grin och tillväxtfaktor (bFGF) aktivering 49. Buffert koncentration och pH i odlingsmedia har beskrivits för att positivt påverka paracellulär täthet 50 och vi observerade en bättre reproducerbarhet mellan kulturer med tillägg av HEPES buffert vid 5 mM.

Differentiering av RBEC: Co-kultur Etablering på Infoga Filter

När hjärnans endotelceller har been renat och frodats under 6 dagar, kan de pläterade på filter. Cell plätering med hög densitet är avgörande för att få en perfekt monolager. En såddtäthet av 160x10 3 celler per 12-brunnars platta filter var nödvändig och tillräcklig för att erhålla ett sammanflytande monoskikt 24 h efter sådd. Emellertid är isoleringen av primära hjärn kapillär endotelceller från sin omgivning en paradox i konstruktionen av en BBB in vitro-modell som det är känt att primära celler, och i synnerhet hjärnkapillära endotelceller, starkt regleras av deras miljö och induktiva faktorer som produceras av de olika omgivande celltyper. Brain kapillärendotelceller odlade ensam snabbt de-differentiera och förlorar vissa specifika hjärn endothelial markörer. Sålunda bör primära endotelceller utnyttjas vid låg passage (P1) och anslutas på nytt, åtminstone delvis, med sin omgivning genom samodling med astrocyter eller medium konditionerat av astrocyter 47,51. Detta gällersant för astrocyternas differentiering som hjärn endotelceller och astrocyter är involverade i tvåvägs induktion. Odling RBEC med astrocyter ledde till kraftig induktion av interendothelial TJ 52,23. De molekylära mekanismerna för re-induktion fortfarande till stor del okända, och forskning pågår på flera laboratorier för att identifiera specifika modulerande faktorer som utsöndras av astrocyterna, som kan främja optimal endotelceller differentiering 53,54. Faktorer som utsöndras av hjärnans endotelceller inklusive leukemi hämmande faktor (LIF) har visats inducera astrocytisk differentiering 55,56. Före samodling etablering var astrocyter exponerades för differentiering medium innehållande glukokortikoid-receptoragonist hydrokortison och samodling konditionerat medium. Hydrokortison är känt för att förbättra tätheten hos hjärnan endotelceller och används i BBB: modeller speciellt från råtta 57 och mus 58,59 endotelceller. Den rade medium samlas in från den undre avdelningen av endotelcell / astrocyt samodlingssystemet efter 3 dagar och frystes för senare användning. Användningen av co-kultur medium reducerade tiden för endotelceller differentiering till 3 dagar med optimal paracellulär permeabilitet för ytterligare 2 dagar och även förbättrad reproducerbarhet mellan kulturer.

Sammantaget protokollet beskriver vi ger en reproducerbar TEER över 300 ohm-cm 2 och en genomsnittlig paracellulär permeabilitetskoefficienten Pe (LY) av 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, som liknar de bästa primära cellbaserade BBB: modellerna 22, 12. Protokollet som vi beskriver i föreliggande manuskript med den föreslagna moduleringen av mikrokärls enzymatisk nedbrytning kan utökas till endotelceller från råttryggmärg 60 och från möss hjärnan.

Molekylär och funktionell karakterisering

DessutomTJ induktion, astrocyter också bidrar till uttrycket av uttransportörer såsom P-gp i hjärnans endotelceller 61. Vi visar faktiskt expression av transportproteinet P-gp i BBB-modellen och vi visar polariteten på P-gp-effluxpump lokalisering med hjälp av biokemiska metoder, och av P-gp-aktivitet med användning av en funktionell analys. GLT-1 uttryck detekterades i basalmembranfraktionen av mikrokärl, men detekterades inte i odlade RBEC. Vår hypotes är att GLT-1 var ned reglerad i vår RBEC kultur jämfört med in vivo-förhållanden och därför inte upptäckas genom Western blot-analys. Överskott av glutamat är neurotoxisk och in vivo, är GLT-1 ansvarar för glutamat efflux från basalrummet (parenkym) till det apikala facket (blodcirkulationen). I astrocyternas kulturerna förblir GLT-1 uttryck mycket låg och induceras genom tillsats av glutamat i mediet 62,63.

Vi conf ocksåirm expressionen av tillströmning transportörer vid den apikala membran såsom LRP1, LDLR och TfR. Funktionalitet för TfR och LDLR demonstrerades med bindning och transport experiment Tf-Cy3 och DiLDL från luminala till abluminala sidan av monolager som tidigare visats med ett nötkreatur in vitro BBB-modell 64. Intressant nog har det visat sig att lipid krav från astrocyter ökar expressionen av LDLR på hjärnans kapillära endotelceller 65,66 ytterligare bekräftar den fysiologiska överhörning mellan astrocyter och hjärna endotelceller, inklusive in vitro. Vi har valt att exemplifiera transport med fluorescerande färgämnen såsom som Cy3 och Dil tanke på att spektrofluorimetrisk analys finns i de flesta laboratorier, och kan vara användbar för att validera in vitro BBB: modeller. Emellertid är kvantifiering av fluorescens långt mindre känslig än radioaktiviteten och kräver en ökning av antalet försök för att erhålla signifikanta data.Helst Tf och LDL är oftast radioaktivt märkt (Jod 125) för sådan bindning / upptag och transportexperiment.

Vi visar också att den differentierade endotelceller cellslager som erhålls med det föreslagna protokollet svarar på inflammation induceras av TNF-α, som avslöjades av CCL2 release och BBB öppning. CCL2 (MCP-1) och dess receptor CCR2 är involverade i CNS-sjukdomar såsom multipel skleros, experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) 67, CNS-trauma 68 och är kända som förmedlare av leukocytmigration in i CNS i neuroinflammatoriska förhållanden 69,70. Med den testade protokoll, kan vi inte sluta på en polariserad utsöndring av CCL2 eftersom BBB öppning gör att CCL2 koncentrationen till jämvikt mellan de båda övre (apikala) och lägre (basala) fack. Följaktligen underskattar vi tydligt hur mycket CCL2 produceras av RBEC i apikala facket vid 24 tim (Figur 5A).

Allmän översikt och begränsningar BBB In Vitro Models: I n Vivo kontra in vitro och Gnagare kontra mänskliga Jämförelser

Många lovande CNS-läkemedel som visat sig effektiva i BBB passage in vitro misslyckades i kliniska prövningar på grund av bristande förutsägbarhet från in vitro BBB: modeller ofta baserade på celler som isolerats från andra arter än människa. Så vitt vi känner till har in vitro BBB: modeller är förmodligen mer prediktiva när det gäller att studera mekanistiska aspekter av proteinnätverk, signaltransduktion, transportörer och receptorer. Varje mekanism, väg eller mål som ska studeras in vitro måste karakteriseras för sin reglering av kompletterande miljö ledtrådar (andra celltyper, kemikalier, proteiner) och kombineras i studier situ med samma djurarter, Och när det är möjligt, med mikrokärl och endotelceller som isolerats från människor, med de begränsningar och försiktighet frammanade nedan.

In vitro BBB: modeller måste ses som autonoma system, isolerade från kroppen reglering, men ändå begåvad med stora vivo egenskaper i och en potential för reglering av miljö-stickrepliker. Nr "ideal" in vitro BBB modell har föreslagits ännu 71,72,73 eftersom endoteliala cellmonoskikt saknar ett antal viktiga beståndsdelar i det neuro-glia kärlenhet (NGVU) och är isolerade från blod och kroppsregleringen. Avsaknaden av pericyter 74,16 eller nervceller 17,18 eller de olika beståndsdelarna i den extracellulära matrisen som används för plastbeläggning eller odlingsmediet och serum som används för celltillväxt i de vanligaste och "lättast gjort" in vitro BBB: modeller baserade på endotel celler differentieras med astrocyter kan modulera proteinuttryck in jämförelse med situationen in vivo-75. Dessa modeller kan uttrycka många transportörer som visas in vivo, men inte alla. I vissa fall har transportparametrar först verifieras i isolerade mikrokärl (närmast vivo-situationen i), och sedan studeras i cellkultursystem 76,61.

Molekylärbiologisk forskning har gjort det möjligt karakterisering av gen-och proteinuttryck i isolerade mikrokärl och låga passage endothelial cellkulturer från samma art och mellan olika arter, oftast från små djur som gnagare (möss och råttor) eller från ko och gris i jämförelse till människor 77,78,75,15. Transcriptomic jämförelse mellan in vivo och in vitro hjärnan mikrovaskulära endotelceller uppvisade talrika gentranskript som var differentiellt uttryckta och oftast betydligt nedregleras in vitro. Transkript som kodar tillströmning transportörer såsom TfR och proteins inblandade i vesikler människohandel främst nedregleras i odlade hjärn endotelceller, vilket tyder på en allmän minskning av endocytos och vesikulär transport i sådana celler. Kultur manipulation när det gäller renhet (puromycin behandling) och behandling med hydrokortison kan hjälpa till att återställa en mer "in vivo-liknande" genuttryck profilen 77. Transcriptomic studier visade också viktiga skillnader mellan arter som ytterligare försvårar förutsägelser om läkemedelsupptag hos människa baserat på gnagare in vitro BBB: modellerna 75. In vitro BBB: modeller som inbegriper sam-kultur av humana endotelceller och astrocyter har beskrivits 15. Även om det är relevant, dessa modeller är svårare att genomföra regelbundet eftersom de kräver reglerad tillgång till obduktion mänsklig vävnad och det finns olikheter i kvalitet / egenskaper av den mänskliga hjärnan endotelceller beroende på ålder, sjukdomar, och eventuellt medicinsk treatment av givarna. Insatser måste göras för att utveckla nya in vitro-modeller som bättre återger den fysiologiska, anatomiska och funktionella egenskaper in vivo BBB. Samkulturer involverar typer tre-cell är mycket restriktiva och verkar svårt att genomföra rutinmässigt. Hittills har de mest komplexa in vitro BBB: modeller är de dynamiska in vitro modeller (DIV-BBB) som omfattar fartyg liknande organisation med astrocyter och inkluderar ett flöde av medium som efterliknar blodflödet 75,79,80,81,82, 83,84,85. När cerebrala endotelceller exponeras för ett flöde, aktiverar den genererade skjuvspänning mechanotransducers vid cellytan, vilka modulerar uttrycket av involverade i endotelial cellfysiologi, såsom celldelning, differentiering, migration och apoptos 80 olika gener. In vivo skjuvspänning alstras av blodflödet är ansvarig för mitotiskt stillestånd vid cellkontakt, som tillåter upprättandet av ettendotelial cellmonoskiktet i blodkärl 80. Genomisk och proteomik analys av normala mänskliga hjärnan mikrovaskulära endotelceller visade effekterna av skjuvspänningen i BBB endothelial fysiologi 84. Shear stress är ansvarig för cellöverlevnad, en högre grad av endotelcellsadhesion, effluxpump induktion och bättre polarisering av transportörer 75, reglering av glukosmetabolismen 75,86, oxidation medierad av CYP450 enzymer 75 och regleringen av paracellulära permeabilitet genom att öka uttrycket av gener som kodar för inter junctionala element som occludin och ZO-1 87,75,80 och därmed hög TEER omkring 1,500 - 2,000 ohm-cm 2, närmast känd in vivo parametrar 79,80

Inom bioteknik-och läkemedelsindustrin, rutinmässig screening av droger eller till och med hög throughput screening (HTS) och insatser för att minska djurförsök, leddetill utvecklingen av olika cellinjer som skall användas som ersättning för primärkulturen av cerebrala endotelceller som förblir svårare att ställa upp rutinmässigt. I de flesta fall var primärkulturer av cerebrala endotelceller transduceras med en immortaliserande genen (SV40 eller polyomavirus stor T-antigen eller adenovirus E1A), antingen genom transfektion av plasmid DNA eller genom infektion med hjälp av retrovirala vektorer 88,89,75. Flera endothelial cellinjer av cerebral ursprung har utvecklats såsom RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs eller rBCEC4 råtta cellinjer 88,75, den b.End3 muscellinje 90,75, den PBMEC/C1 - 2 porcin cellinje 87,75 och hCMEC/D3 human cellinje 89,75. Andra modeller är baserade på celler från icke-cerebrala ursprung såsom Madin-Darby canine kidney (MDCK) eller Caco2 cellinjer 12,75. Bland de olika humana cerebrala endothelial cell-linjer har hCMEC/D3 varit allmänt citerad och förbättras som en modell för BBB sedan starten 2005 91,92. Som primära kulturer, cellinjer nuvarande fördelar och begränsningar. De är lättare att hantera än primära kulturer, har en längre livslängd, är väl karakteriserade och möjliggöra reproducerbarhet mellan storskaliga experiment. Däremot kan cellinjer förlora vävnadsspecifika funktioner, förlorar miljölagstiftningen och skaffa en molekylär fenotyp helt annat än celler in vivo 75, 89. Särskilt monolager genereras från cellinjer närvarande reducerad täthet, låg Teer och visa transportör profilen variation 75,89. Således djurförsök eller studier i primära celler är ofta att föredra trots deras extra komplexitet.

Acknowledgments

Ekonomiskt stöd till VECT-Horus är erkänt från Fonds Unique Interministériel (FUI / MEDUL-projektet) samt att vect-HORUS och UMR7259 laboratoriet från Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC och PREVENTAD samarbetsprojekt) . Den UMR7259 laboratoriet erkänner också ekonomiskt stöd från CNRS och från Aix-Marseille Université.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubin, L. L., Staddon, J. M. The cell biology of the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 22, 11-28 (1999).
  2. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 5-23 (2005).
  3. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6, (8), 650-661 (2007).
  4. Pekny, M., Stanness, K. A., Eliasson, C., Betsholtz, C., Janigro, D. Impaired induction of blood-brain barrier properties in aortic endothelial cells by astrocytes from GFAP-deficient mice. Glia. 22, (4), 390-400 (1998).
  5. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J Appl Physiol. 100, (1), 328-335 (2006).
  6. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. J Neurochem. 54, (5), 1798-1801 (1990).
  7. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicol In Vitro. 22, (3), 799-811 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. Porcine brain microvessel endothelial cells as an in vitro model to predict in vivo blood-brain barrier permeability. Drug Metab Dispos. 34, (11), 1935-1943 (2006).
  9. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Res. 1521, 1-15 (2012).
  10. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  11. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochem Int. 54, (3-4), 253-263 (2009).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71, (1), 113-128 (2011).
  13. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab Invest. 85, (6), 734-746 (2005).
  14. Josserand, V., et al. Evaluation of drug penetration into the brain: a double study by in vivo imaging with positron emission tomography and using an in vitro model of the human blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 316, (1), 79-86 (2006).
  15. Lacombe, O., et al. In vitro primary human and animal cell-based blood-brain barrier models as a screening tool in drug discovery. Mol Pharm. 8, (3), 651-663 (2011).
  16. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cell Mol Neurobiol. 27, (6), 687-694 (2007).
  17. Lippmann, E. S., Weidenfeller, C., Svendsen, C. N., Shusta, E. V. Blood-brain barrier modeling with co-cultured neural progenitor cell-derived astrocytes and neurons. J Neurochem. 119, (3), 507-520 (2011).
  18. Xue, Q., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9, (2), 174-189 (2013).
  19. Sohet, F., Daneman, R. Genetic mouse models to study blood-brain barrier development and function. Fluids Barriers CNS. 10, (1), 3 (2013).
  20. Shayan, G., Choi, Y. S., Shusta, E. V., Shuler, M. L., Lee, K. H. Murine in vitro model of the blood-brain barrier for evaluating drug transport. Eur J Pharm Sci. 42, (1-2), 148-155 (2011).
  21. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev. 36, (2-3), 165-178 (1999).
  22. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25, (1), 59-127 (2005).
  23. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-1 (2007).
  24. Pardridge, W. M., Buciak, J. L., Friden, P. M. Selective transport of an anti-transferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 259, (1), 66-70 (1991).
  25. Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. J Neurochem. 53, (2), 340-345 (1989).
  26. Gosselet, F., Candela, P., Sevin, E., Berezowski, V., Cecchelli, R., Fenart, L. Transcriptional profiles of receptors and transporters involved in brain cholesterol homeostasis at the blood-brain barrier: use of an in vitro model. Brain Res. 1249, 34-42 (2009).
  27. Pardridge, W. M. Vector-mediated drug delivery to the brain. Adv Drug Deliv Rev. 36, (2-3), 299-321 (1999).
  28. Pardridge, W. M., Boado, R. J. Reengineering biopharmaceuticals for targeted delivery across the blood-brain barrier. Methods Enzymol. 503, 269-292 (2012).
  29. Boado, R. J., Lu, J. Z., Hui, E. K., Sumbria, R. K., Pardridge, W. M. Pharmacokinetics and brain uptake in the rhesus monkey of a fusion protein of arylsulfatase a and a monoclonal antibody against the human insulin receptor. Biotechnol Bioeng. 110, (5), 1456-1465 (2013).
  30. Ito, S., Ohtsuki, S., Terasaki, T. Functional characterization of the brain-to-blood efflux clearance of human amyloid-beta peptide (1-40) across the rat blood-brain barrier. Neurosci Res. 56, (3), 246-252 (2006).
  31. Demeule, M., et al. Identification and design of peptides as a new drug delivery system for the brain. J Pharmacol Exp Ther. 324, (3), 1064-1072 (2008).
  32. Yamada, K., et al. The low density lipoprotein receptor-related protein 1 mediates uptake of amyloid beta peptides in an in vitro model of the blood-brain barrier cells. J Biol Chem. 283, (50), 34554-34562 (2008).
  33. Gabathuler, R. New protein vectors for physiological transfer of therapeutic agents to the central nervous system. Biol Aujourdhui. 206, (3), 191-203 (2012).
  34. Malcor, J. D., et al. Chemical optimization of new ligands of the low-density lipoprotein receptor as potential vectors for central nervous system targeting. J Med Chem. 55, (5), 2227-2241 (2012).
  35. Wang, D., et al. Engineering a lysosomal enzyme with a derivative of receptor-binding domain of apoE enables delivery across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (8), 2999-3004 (2013).
  36. Spencer, B. J., Verma, I. M. Targeted delivery of proteins across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, (18), 7594-7599 (2007).
  37. Kreuter, J., et al. Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier. J Drug Target. 10, (4), 317-325 (2002).
  38. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Brain endothelial cell-cell junctions: how to 'open' the blood brain barrier. Curr Neuropharmacol. 6, (3), 179-192 (2008).
  39. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68, (5), 311-323 (2002).
  40. Stephan, D., et al. TWEAK/Fn14 pathway modulates properties of a human microvascular endothelial cell model of blood brain barrier. J Neuroinflammation. 10, (9), (2013).
  41. Descamps, L., Cecchelli, R., Torpier, G. Effects of tumor necrosis factor on receptor-mediated endocytosis and barrier functions of bovine brain capillary endothelial cell monolayers. J Neuroimmunol. 74, (1-2), 173-184 (1997).
  42. Miller, F., et al. The MAP kinase pathway mediates transcytosis induced by TNF-alpha in an in vitro blood-brain barrier model. Eur J Neurosci. 22, (4), 835-844 (2005).
  43. Fillebeen, C., Dehouck, B., Benaïssa, M., Dhennin-Duthille, I., Cecchelli, R., Pierce, A. Tumor necrosis factor-alpha increases lactoferrin transcytosis through the blood-brain barrier. J Neurochem. 73, (6), 2491-2500 (1999).
  44. Zhang, Y., Schuetz, J. D., Elmquist, W. F., Miller, D. W. Plasma membrane localization of multidrug resistance-associated protein homologs in brain capillary endothelial cells. J Pharmacol Exp Ther. 311, (2), 449-455 (2004).
  45. Kane, R. L., Martínez-López, I., DeJoseph, M. R., Viña, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters (EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. A mechanism for glutamate removal. J Biol Chem. 274, (45), 31891-31895 (1999).
  46. Kannan, R., Mittur, A., Bao, Y., Tsuruo, T., Kaplowitz, N. GSH transport in immortalized mouse brain endothelial cells: evidence for apical localization of a sodium-dependent GSH transporter. J Neurochem. 73, (1), 390-399 (1999).
  47. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103, (1), 23-37 (1992).
  48. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, (2), 279-289 (2005).
  49. Tsou, R., Isik, F. F. Integrin activation is required for VEGF and FGF receptor protein presence on human microvascular endothelial cells. Mol Cell Biochem. 224, (1-2), 81-89 (2001).
  50. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. AAPS J. 12, (4), 759-770 (2010).
  51. Rubin, L. L., Sanes, J. R. Neuronal and glial cell biology. Curr Opin Neurobiol. 6, (5), 573-575 (1996).
  52. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, (1), 41-53 (2006).
  53. Deracinois, B., et al. Glial-cell-mediated re-induction of the blood-brain barrier phenotype in brain capillary endothelial cells: a differential gel electrophoresis study. Proteomics. 13, (7), 1185-1199 (2013).
  54. Haseloff, R. F., Blasig, I. E., Bauer, H. C., Bauer, H. In search of the astrocytic factor(s) modulating blood-brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 25, (1), 25-39 (2005).
  55. Mi, H., Haeberle, H., Barres, B. A. Induction of astrocyte differentiation by endothelial cells. J Neurosci. 21, (5), 1538-1547 (2001).
  56. Abbott, N. J. Astrocyte endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. J. Anat. 200, (6), 629-638 (2002).
  57. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. J Neurochem. 97, (4), 922-933 (2006).
  58. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).
  59. Förster, C., Waschke, J., Burek, M., Leers, J., Drenckhahn, D. Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific. J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).
  60. Ge, S., Pachter, J. S. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine spinal cord. J Neuroimmunol. 177, (1-2), 209-214 (2006).
  61. Berezowski, V., Landry, C., Dehouck, M. P., Cecchelli, R., Fenart, L. Contribution of glial cells and pericytes to the mRNA profiles of P-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins in an in vitro model of the blood-brain barrier. Brain Res. 1018, (1), 1-9 (2004).
  62. Duan, S., Anderson, C. M., Stein, B. A., Swanson, R. A. Glutamate induces rapid upregulation of astrocyte glutamate transport and cell-surface expression of GLAST. J Neurosci. 19, (23), 10193-10200 (1999).
  63. Gegelashvili, G., Dehnes, Y., Danbolt, N. C., Schousboe, A. The high-affinity glutamate transporters GLT1, GLAST, and EAAT4 are regulated via different signalling mechanisms. Neurochem Int. 37, (2-3), 163-170 (2000).
  64. Candela, P., et al. Physiological pathway for low-density lipoproteins across the blood-brain barrier: transcytosis through brain capillary endothelial cells in vitro. Endothelium. 15, (5-6), 254-264 (2008).
  65. Dehouck, B., Dehouck, M. P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Upregulation of the low density lipoprotein receptor at the blood-brain barrier: intercommunications between brain capillary endothelial cells and astrocytes. J Cell Biol. 126, (2), 465-473 (1994).
  66. Dehouck, B., Fenart, L., Dehouck, M. P., Pierce, A., Torpier, G., Cecchelli, R. A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the blood-brain barrier. J Cell Biol. 138, (4), 877-889 (1997).
  67. Mahad, D. J., Ransohoff, R. M. The role of MCP-1 (CCL2) and CCR2 in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Semin Immunol. 15, (1), 23-32 (2003).
  68. Glabinski, A. R., Ransohoff, R. M. Chemokines and chemokine receptors in CNS pathology. J Neurovirol. 5, (1), 3-12 (1999).
  69. Stamatovic, S. M., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 regulation of blood-brain barrier permeability. J Cereb Blood Flow Metab. 25, (5), 593-606 (2005).
  70. Semple, B. D., Kossmann, T., Morganti-Kossmann, M. C. Role of chemokines in CNS health and pathology: a focus on the CCL2/CCR2 and CXCL8/CXCR2 networks. J Cereb Blood Flow Metab. 30, (3), 459-473 (2010).
  71. Veszelka, S., Nakagawa, S., Niwa, M., Deli, M. A. Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery. Recent Pat CNS Drug Discov. 6, (2), 107-118 (2011).
  72. Patabendige, A. The value of in vitro models of the blood-brain barrier and their uses. Altern Lab Anim. 40, (6), 335-338 (2012).
  73. Ogunshola, O. O. In vitro modeling of the blood-brain barrier: simplicity versus complexity. Curr Pharm Des. 17, (26), 2755-2761 (2011).
  74. Vandenhaute, E., et al. Modelling the neurovascular unit and the blood-brain barrier with the unique function of pericytes. Curr Neurovasc Res. 8, (4), 258-269 (2011).
  75. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 14, (1), 120-136 (2013).
  76. Vernon, H., Clark, K., Bressler, J. P. In vitro models to study the blood brain barrier. Methods Mol Biol. 758, 153-168 (2011).
  77. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 28, (1), 135-148 (2008).
  78. Uchida, Y., Ohtsuki, S., Kamiie, J., Terasaki, T. Blood-brain barrier (BBB) pharmacoproteomics: reconstruction of in vivo brain distribution of 11 P-glycoprotein substrates based on the BBB transporter protein concentration, in vitro intrinsic transport activity, and unbound fraction in plasma and brain in mice. J Pharmacol Exp Ther. 339, (2), 579-588 (2011).
  79. Cucullo, L., Aumayr, B., Rapp, E., Janigro, D. Drug delivery and in vitro models of the blood-brain barrier. Curr Opin Drug Discov Devel. 8, (1), 89-99 (2005).
  80. Naik, P., Cucullo, L. In vitro blood-brain barrier models: current and perspective technologies. J Pharm Sci. 101, (4), 1337-1354 (2012).
  81. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10, (18), 3725-3731 (1999).
  82. Santaguida, S., et al. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109, (1), 1-13 (2006).
  83. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31, (2), 767-777 (2011).
  84. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, M., Marchi, V., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, (40), (2011).
  85. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. (2013).
  86. Qutub, A. A., Hunt, C. A. Glucose transport to the brain: a systems model. Brain Res Brain Res Rev. 49, (3), 595-617 (2005).
  87. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125, (1), 127-141 (2006).
  88. Roux, F., Couraud, P. O. Rat brain endothelial cell lines for the study of blood-brain barrier permeability and transport functions. Cell Mol Neurobiol. 25, (1), 41-58 (2005).
  89. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, (13), 1872-1874 (2005).
  90. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990, (1-2), 995-112 (2003).
  91. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10, (1), (2013).
  92. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J Cereb Blood Flow Metab. 28, (2), 312-328 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics