सक्रियण और मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं में आईएल 1β का प्रयोग NLRP3 inflammasome गतिविधि की माप

1Department of Pathology, New York University School of Medicine, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Mount Sinai Medical Center, 3Division of Hematology and Oncology, Hess Center for Science and Medicine, Mount Sinai Medical Center
Immunology and Infection

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Summary

वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) nigericin साथ NLRP3 inflammasome सक्रियण द्वारा पीछा सिंथेटिक प्यूरीन, R848 के TLR8 मान्यता, के जवाब में आईएल 1β छिपाना, इसलिए, आईएल 1β NLRP3 inflammasome गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Intracellular साइटोकाइन धुंधला हो जाना, immunoblotting, और एलिसा सही आईएल 1β अभिव्यक्ति के माध्यम से NLRP3 भड़काना inflammasome और सक्रियण को मापने के लिए किया जाता है.

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Fernandez, M. V., Miller, E. A., Bhardwaj, N. Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1β in Human Monocyte-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (87), e51284, doi:10.3791/51284 (2014).

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Abstract

इंटरल्युकिन का स्राव (आईएल) से उत्पन्न सूजन प्रक्रियाओं -1 प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा परिवार साइटोकिन्स स्थानीय या प्रणालीगत सूजन, ऊतक remodeling और मरम्मत, और virologic नियंत्रण 1, 2 के लिए नेतृत्व. इंटरल्युकिन 1β सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक अनिवार्य तत्व है और लगातार संक्रमण 1-5 की स्थापना को रोकने जबकि रोगजनकों हमलावर को खत्म करने के लिए योगदान देता है.

Inflammasomes 1 परिवर्तित एंजाइम (बर्फ या कस्पासे 1) इंटरल्यूकिन के क्रियान्वयन के लिए महत्वपूर्ण संकेत मंच हैं. NLRP3 inflammasome आईएल 1β स्राव 6 पैदा करने के लिए DCs में कम से कम दो संकेतों की आवश्यकता है. समर्थक आईएल 1β प्रोटीन अभिव्यक्ति कोशिकाओं आराम में सीमित है; इसलिए एक भड़काना संकेत आईएल 1β प्रतिलेखन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है. बहु - प्रोटीन NLRP3 inflammasome के गठन में NLRP3 परिणामों से लगा एक दूसरा संकेत. जिम्मेदारी को वृक्ष के समान कोशिकाओं की क्षमताआईएल 1β स्राव के लिए आवश्यक संकेतों को डी बैक्टीरियल विष के साथ NLRP3 inflammasome के सक्रियण द्वारा पीछा प्रधानमंत्री कोशिकाओं को वृक्ष के समान कोशिकाओं (moDCs) व्युत्पन्न मानव monocyte में TLR8 द्वारा महसूस किया जाता है जो एक कृत्रिम प्यूरीन, R848, का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है पोटेशियम ionophore, nigericin.

Monocyte व्युत्पन्न DCs आसानी संस्कृति में उत्पादित और विशुद्ध मानव माइलॉयड DCs की तुलना में काफी अधिक कोशिकाओं को प्रदान कर रहे हैं. यह बजाय व्युत्पन्न माउस की, DCs इस प्रकार मानव रोग और संक्रमण में inflammasome के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, इन विट्रो मानव में उपयोग करता है में यहाँ प्रस्तुत विधि अन्य inflammasome assays से अलग है.

Introduction

सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के सक्रियण संक्रमण, बीमारी, और टीकाकरण के दौरान 7 अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संचालित करने के लिए आवश्यक है. वृक्ष के समान कोशिकाओं सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं को पेश सबसे शक्तिशाली प्रतिजन होते हैं; वे एंटीजन का तेज, लिम्फ नोड्स में प्रवास, और भोले सीडी 4 + और ​​cytolytic सीडी 8 + टी कोशिकाओं 8-10 के क्रियान्वयन के लिए विशेष कर रहे हैं. तेजी से रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए सक्षम करने के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रणाली संरक्षित रोगज़नक़ व्युत्पन्न रूपांकनों या सेल तनाव और नुकसान का मेजबान व्युत्पन्न मार्करों मानते हैं कि कई germline इनकोडिंग पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRR) का इस्तेमाल करता है. रिसेप्टर्स (TLRs) की तरह टोल कुछ बाह्य phagocytized रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) और खतरे जुड़े आणविक पैटर्न (damps) समझते हैं कि झिल्ली बाध्य पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स हैं. रिसेप्टर्स (NLRs) की तरह विपरीत इशारा करके साइटोसोलिक हैं और PAMPs और damps की एक विविध रेंज का जवाब. रिसेप्टर्स पुन मंजूरीकोशिका की सतह और endocytic PRRs बचने कि रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की एक दूसरी पंक्ति मौजूद. व्युत्पन्न रोगज़नक़, या "खतरे" की बातचीत, जुड़े TLR और NLR ligands के साथ कारकों अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं और टी सेल और प्राकृतिक हत्यारा सेल सक्रियण 11 की पदोन्नति के साथ वृद्धि हुई डीसी बातचीत में जिसके परिणामस्वरूप डीसी परिपक्वता का एक राज्य की ओर जाता है.

इंटरल्युकिन 1β संक्रमण के खिलाफ मेजबान बचाव का एक महत्वपूर्ण घटक है. एक सूक्ष्मजीव की मान्यता पर, अत्यधिक proinflammatory साइटोकाइन, आईएल 1β, secreted है और एक chemo attractant और सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं के उत्प्रेरक के रूप में कार्य करता है. में vivo आईएल 1β बुखार और भड़काऊ साइटोकाइन सहित तीव्र चरण प्रतिक्रिया के लिए काफी हद तक जिम्मेदार है संश्लेषण 12.

अधिकांश NLRs ligand संवेदन, जन्मदिन है कि एक केंद्रीय न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी डोमेन (Nacht) में कार्य करने के लिए सोचा है कि एक सी टर्मिनल leucine संपन्न दोहराने डोमेन होते हैंNLRP3 oligomerization, और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के माध्यम से बहाव के लक्ष्यों को संकेत पारगमन mediates कि एक एन टर्मिनल प्रेरक डोमेन (NLRP3 में PYD) के लिए rtant. NLRP3 प्रोटीन सबसे अधिक तीव्रता का अध्ययन inflammasome जटिल परिभाषित करता है. इस प्रोटीन NLR परिवार का एक सदस्य है और NLRP3, (भी ए एस सी के रूप में जाना जाता है) एडाप्टर प्रोटीन PYCARD, और बर्फ से बना एक बहु आणविक प्रोटीन जटिल बनाने की क्षमता है. Inflammasome सक्रियण पर PYCARD NLRP3 एन टर्मिनल डोमेन को बांधता है और कस्पासे सक्रियण और भर्ती डोमेन (कार्ड) डोमेन के माध्यम से बर्फ रंगरूटों. इंटरल्युकिन -1 परिवर्तित एंजाइम शुरू में अपनी एन टर्मिनस पर एक कार्ड आकृति युक्त zymogen के रूप में उत्पन्न होता है. दो बर्फ अणुओं लाने में inflammasome गठन परिणाम पर्याप्त करीब उनके autocatalytic सक्रियण प्रेरित करने के लिए. inflammasome जटिल यह साइटोकाइन परिपक्व करने के लिए cytoplasmic समर्थक आईएल 1β कन्वर्ट करने के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार बर्फ को सक्रिय करने के लिए आवश्यक है.

आईएल के सफल स्राव-1β DCs में दो अलग और स्वतंत्र खतरे का संकेत है की संवेदन की आवश्यकता है. सबसे पहले, PAMPs, damps, या साइटोकाइन संकेतन (TNFα या आईएल 1β) की TLR संवेदन cytoplasmic समर्थक आईएल 1β प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक upregulation का कारण बनता है. एक दूसरा, अक्सर अलग, संकेत बर्फ परिपक्वता के अपस्ट्रीम inflammasome जटिल गठन के लिए आवश्यक है. संकेत उत्तेजक कुछ inflammasome बैक्टीरियल झिल्ली ताकना (जैसे nigericin के रूप में) के गठन जहर, (जैसे मोनोसोडियम यूरेट क्रिस्टल, MSU के रूप में) lysosomal में खलल न डालें क्रिस्टल, और बाह्य एटीपी शामिल हैं. इन विविध activators द्वारा inflammasome सक्रियण NLRP3 के लिए अग्रणी नदी के ऊपर तंत्र स्पष्ट नहीं है. Inflammasome गठन का संकेत नदी के ऊपर जांच के अध्ययन ऐसे hypokalemia के शामिल होने या प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के रूप में intracellular घटनाओं, परोक्ष रूप से inflammasome 13-28 सक्रिय करने का प्रस्ताव है कि.

NLRP3 inflammasome के विभिन्न वायरल activators बीच ख प्रदान करता है जो इन्फ्लूएंजा, हैआईएल 1β स्राव 3, 29-33 के लिए आवश्यक प्राथमिक और माध्यमिक संकेत अन्य संगठनों के. माउस NLRP3 पीटकर मॉडल का उपयोग कर यह DCs में आईएल 1β स्राव 32 NLRP3 निर्भर है कि पाया गया था. इसके अतिरिक्त, NLRP3 पीटा चूहों संक्रमण की साइट के लिए कम leukocytes आकर्षित किया है और उच्च मृत्यु दर 2, 5 का अनुभव किया. दो हाल के कागजात इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण के दौरान NLRP3 inflammasome सक्रियण के लिए एक तंत्र का सुझाव; पहला, एक दूसरा संकेत द्वारा पीछा cytoplasmic समर्थक आईएल 1β अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए TLR7 या TLR8 (प्रत्युत्तर देना सेल की TLR अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है) द्वारा या अन्य TLRs द्वारा खानेवाला बैक्टीरिया की संवेदन के माध्यम से वायरल शाही सेना, NLRP3 की सक्रियता की मान्यता के माध्यम से भड़काना ट्रांस Golgi नेटवर्क 33, 34 पर वायरल आयन चैनल प्रोटीन M2 द्वारा inflammasome गठन. बाद के चरण में, NLRP3 inflammasome के ट्रिगर intracellular आयनिक की अशांति से पूरा होता है <उन्हें> inflammasome के लिए फार्म का एक संकेत के रूप में NLPR3 द्वारा महसूस किया, बस, जो आरओएस उत्पादन के लिए अग्रणी परिवेश. हालांकि, इन्फ्लूएंजा संक्रमण के दौरान बर्फ गतिविधि का inflammasome सक्रियण नदी के ऊपर की सटीक व्यवस्था अभी भी अस्पष्ट बनी हुई है.

इस काम के लिए एक अच्छी तरह से inflammasome के सक्रियण द्वारा पीछा R848 साथ TLR8 बंधाव के जवाब में स्थित डीसी अंतर्निहित मार्ग आईएल 1β स्राव की आगे की जांच के लिए एक आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि मानव moDCs में NLRP3 inflammasome के अध्ययन के लिए मूल्यवान एक तकनीक का वर्णन NLRP3 के ज्ञात उत्प्रेरक, nigericin. इस विधि के बदलाव सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ प्रयोग किया है, लेकिन सीमित नहीं किया जा सकता है: monocytes, मैक्रोफेज, अन्य डीसी सबसेट, और उपकला कोशिकाओं.

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Protocol

आचार वक्तव्य: अनुसंधान के नमूने प्राप्त और दानदाताओं की सहमति के साथ अनुसंधान के लिए जमा हो जाती है. सभी नमूनों कोडित या उपयोग करने से पहले गुमनाम जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल हमारे संस्थागत समीक्षा बोर्ड के दिशा निर्देशों के बाद.

1. Monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं में मानव परिधीय रक्त monocytes की भिन्नता.

नोट: मानव Buffy कोट मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं (PBMCs) के स्रोत के रूप में सेवा और न्यूयॉर्क रक्त केंद्र (न्यूयॉर्क, एनवाई) से प्राप्त किया गया. रक्त दाताओं स्वस्थ स्वयंसेवकों हैं. 5 दिन प्रक्रिया ऊतक संस्कृति पर मानव परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) का चढ़ाना के साथ शुरू होता है 35,36 बोतल. प्रकाशित प्रोटोकॉल से उल्लेखनीय अंतर निम्नलिखित हैं:

  1. 10 सेमी polystyrene टिशू कल्चर प्लेट कुप्पी प्रति 2x10 8 PBMCs की कुल पालन के बजाय एक फिल्टर टोपी के साथ 225 सेमी 2 गैर ज्वरकारक polystyrene टिशू कल्चर बोतल का प्रयोग करेंएस (58 सेमी 2) (चरण 1).
  2. 5% जमा मानव सीरम (PHS, 30 मिलीग्राम) के साथ मीडिया की तैयारी में 500 मिलीलीटर RPMI 1640 + एल glutamine, 5 एमएल 1 एम HEPES बफर, और 1.4 मिलीलीटर 50 मिलीग्राम / एमएल gentamicin (5% PHS मीडिया) निस्पंदन द्वारा पीछा के माध्यम से एक 20 माइक्रोन फिल्टर. 50 मिलीलीटर 5% PHS मीडिया सेमी 225 प्रति 2 टिशू कल्चर कुप्पी की कुल जोड़ें.
  3. 25 एमएल ताजा RPMI 1640 के साथ पालन कोशिकाओं तीन बार धोएं. प्रत्येक धोने के दौरान 5 सेकंड के लिए सख्ती से हिला और गैर पक्षपाती कोशिकाओं (चरण 4) aspirate.
  4. दिन PBMCs शुरू में चरण में चढ़ाया जाता है के रूप में 100 आइयू / μl 0 दिन, 2 पर कुप्पी (कदम 3) के अनुसार जीएम-CSF, और 4. दिन 0 से 400 / आइयू μl आईएल -4 और 380 μl के 190 μl जोड़ें परिभाषित किया गया है 1 (चरण 8).
  5. 1x10 6 कोशिकाओं / एमएल (15 चरण) के एक एकाग्रता में हार्वेस्ट दिन 5 moDCs.
  6. उनके आराम कर राज्य में तुरंत moDCs का प्रयोग करें. कदम 17-22 प्रदर्शन कभी नहीं कर रहे हैं. नोट: नमूने अच्छे परिणाम के लिए जितनी जल्दी हो सके इकट्ठा करने के बाद कार्रवाई की जानी चाहिए.
  7. एक concentra पर विभाज्य moDCs2x10 5 कोशिकाओं के tion / अच्छी तरह से एक साथ 96 दौर तली प्लेट (पश्चिमी धब्बा, एलिसा, FACS) या एक पाली एल lysine इलाज chamberslide (माइक्रोस्कोपी) पर प्रयोग के लिए में (1x10 6 कोशिकाओं / एमएल के 200 μl / अच्छी तरह से) . नोट: पूरी unstimulated (नकारात्मक नियंत्रण) सक्रियण द्वारा पीछा किया ही, केवल सक्रियण, और भड़काना भड़काना,: कम से कम 4 शर्तों रहे हैं. स्थितियां अगर वांछित मंदक R848 के लिए नियंत्रण और nigericin शामिल करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है. नीचे की ओर परख आईसीएस है, तो डुप्लिकेट निर्धारण नियंत्रण के लिए आवश्यक हैं.

2. Inflammasome भड़काना - सिग्नल 1

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार DMSO में lyophilized R848 Reconstitute. RPMI 1640 के साथ आरटी पर काम कर रहे शेयर पतला.
  2. 18 घंटे के लिए कुओं उपयुक्त एक 10 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता में R848 जोड़ें. जगह 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं और 5% सीओ 2.

3 NLRP3 inflammasome सक्रिय कर रहा है -. सिग्नल2

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार इथेनॉल में lyophilized nigericin Reconstitute. उपयुक्त परिस्थितियों को जोड़ने से पहले RPMI 1640 के साथ आरटी पर काम कर रहे शेयर पतला.
  2. एक 20 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता में nigericin जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लौटने और 5% सीओ 2 से 6 घंटे के लिए. नहीं धोने कदम भड़काना के बीच और सक्रियण के दौरान हो. नोट: आईएल 1β का स्राव ए, monensin, dinitrophenol, या कार्बोनिल साइनाइड chlorophenylhydrazone 37, 38 brefeldin, कैल्शियम ionophores की उपस्थिति की वृद्धि हुई है. यह आईएल 1β के स्राव में परिवर्तन के बाद से inflammasome भड़काना या गतिविधि का विश्लेषण इसलिए, जब इन स्रावी inhibitors के अलावा सिफारिश नहीं कर रहे.

4. आईएल 1SS नमूना संग्रह

  1. 3 मिनट के लिए 974 XG पर कोशिकाओं और supernatants साथ थाली अपकेंद्रित्र.
  2. सेल गोली परेशान बिना, सतह पर तैरनेवाला aspirate और के रूप में करने के लिए स्थानांतरणeparate दौर supernatants से cytokine स्राव को मापने के क्रम में थाली तली. नोट: Supernatants अस्थायी रूप से -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या जा सकता है -80 लंबी अवधि के भंडारण के लिए डिग्री सेल्सियस.
  3. सेलुलर नमूनों से किसी भी बाह्य आईएल 1β दूर करने के लिए 3 मिनट के लिए 974 XG पर 1x पीबीएस के 200 μl के साथ सेलुलर छर्रों तीन बार धोएं. नोट: एक 96 अच्छी तरह से थाली से सेल छर्रों धोने नमूना परेशान नहीं करने के लिए इतनी के रूप में, एक संग्रह बिन में तेज थाली उलटा द्वारा धोने को हटा दें.

5. सेलुलर और सतह पर तैरनेवाला नमूनों से आईएल 1SS मापने

  1. Intracellular Cytokine धुंधला (आईसीएस): आईसीएस प्रोटोकॉल 39, 40 के नीचे वर्णित है. नोट: नीचे की ओर परख माइक्रोस्कोपी है अगर कोशिकाओं को निलंबित नहीं है. सभी washes और आकांक्षाओं (डाउनस्ट्रीम परख के आधार पर) सेल परत / गोली परेशान बिना किया जाना चाहिए.
    1. उचित कुओं में 5% PHS मीडिया के 100 μl जोड़ें. जोड़नाउचित मात्रा (लगभग 1 μl/2x10 5 कोशिकाओं, या 1 μl / अच्छी तरह से) के fluorescently α-CD11c और α-CD14 लेबल (phenotype मार्करों, क्लोन बी ly6 और MφP9, क्रमशः) या निर्धारण नियंत्रण पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को अंधेरे में आरटी.
    2. 3 मिनट के लिए 974 XG पर 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
    3. अंधेरे में आरटी पर 20 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​के 100 μl जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें.
    4. प्वाइंट रोकें: 1x पीबीएस में 4 डिग्री सीओ / एन में 3 मिनट और दुकान के लिए 974 XG पर 100 μl 1x पीबीएस के साथ धोएं.
    5. 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को permeabilization बफर के 100 μl जोड़ें. नोट: permeabilization बफर 0.3% ट्राइटन X-100 के साथ 1x पीबीएस से बना है, और 1% गोजातीय सीरम albumin (BSA) permeabilization के लिए है. नीचे की ओर परख माइक्रोस्कोपी है जब पक्षपाती कोशिकाओं को परेशान मत करो.
    6. उचित α-आईएल 1β-FITC की मात्रा (लगभग 62 एनजी antibody/2x10 5 कोशिकाओं, लगभग या 2.5 μl / अच्छी तरह से) (क्लोन 8516) या के लिए निर्धारण नियंत्रण जोड़ें37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में 2 घंटे
    7. अंधेरे में 3 मिनट के लिए 974 XG पर permeabilization बफर के 200 μl के साथ कोशिकाओं तीन बार धोएं.
    8. वैकल्पिक: DAPI के साथ दाग, mountant जोड़ने, और एक गिलास स्लाइड के शीर्ष पर धीरे coverslip जगह. माइक्रोस्कोपी छवियों पर कब्जा करने से पहले ओ / एन इलाज करने mountant अनुमति दें.
    9. FACs या माइक्रोस्कोपी द्वारा डेटा मोल. नोट: FACs या माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण करते समय उचित धुंधला करने के लिए हर हालत के लिए निर्धारण की तुलना करें.
      1. FACs: एक समय में एक नमूना मोल. MoDC आबादी समर्थक आईएल 1β धुंधला विश्लेषण करने से पहले कोशिकाओं - CD11c + CD14 पर gating द्वारा पीछा जीवित कोशिकाओं, पर FSC / एसएससी गेट सेट करें.
      2. माइक्रोस्कोपी: सकारात्मक धुंधला नमूना का उपयोग कर जोखिम समय सेट - R848 इलाज किया. समर्थक आईएल 1β व्यक्त moDCs + का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए - DAPI + समर्थक आईएल 1β + और ​​DAPI + समर्थक आईएल 1β का प्रयोग करें.
  2. एसडीएस पृष्ठ: immunoblotting समर्थक आईएल 1β पता लगाने के लिए किया जाता है. नोट: नीचे वर्णित तकनीक मानक immunoblotting तकनीक, ढाल 4-20% polyacrylamide जेल, और फ्लोरोसेंट या chemiluminescent पता लगाने के 41, 42 को जोड़ती है.
    1. सीधे lysis बफर (5 μl सेल बफर के साथ 1:1 गिराए द्वारा पीछा β-mercaptoethanol/950 μl Laemmli नमूना बफर) denaturing 10 μl में lyse कोशिकाओं. 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों को lysate स्थानांतरण.
    2. 100 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक सूखी थाली पर हीट lysate
    3. तरल मात्रा ध्यान केंद्रित करने के लिए 1 मिनट के लिए एक minicentrifuge पर 20,800 XG पर lysate स्पिन. बिंदु रोकें: नमूने लघु अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर किया जा सकता है.
    4. Polyacrylamide जेल पर कुल मात्रा लोड करें. डाई सामने जेल के नीचे बंद चलाता है जब तक लगभग 1 घंटा, या के लिए जेल बॉक्स के माध्यम से 140 वी चलाएँ.
    5. एक PVDF Immobilon-सीए membr पर polyacrylamide जेल से प्रोटीन स्थानांतरण100 वी. ब्लॉक Tris खारा बफर 5% BSA के साथ झिल्ली / 0.1% बीच 20 (टीबीएस टी) 1 घंटे के लिए 90 मिनट के लिए ane. नोट: PVDF Immobilon-सीए फ्लोरोसेंट का पता लगाने के साथ प्रयोग के लिए सबसे अच्छा है. अन्य पता लगाने की तकनीक पृष्ठभूमि अनुपात संकेत बढ़ाने के लिए के लिए एक अलग संरचना के साथ एक झिल्ली की सिफारिश की है.
    6. 5% बीएसए / टीबीएस आयकर के 10 एमएल में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी पतला. मिलाते हुए, जबकि 1 घंटे के लिए आरटी पर माध्यमिक एंटीबॉडी मिलाते और जब 4 डिग्री सीओ / एन में प्राथमिक एंटीबॉडी incubations प्रदर्शन करना.
    7. प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी incubations और फिर माध्यमिक incubations और इमेजिंग के बीच के बीच मिलाते हुए, जबकि 5 मिनट के लिए टीबीएस आयकर साथ झिल्ली 3 बार धोएं. नोट: बैंड फ्लोरोसेंट या chemiluminescent पता लगाने का उपयोग कर पाया जा सकता है. पता लगाने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें.
  3. एलिसा: भंडारण के लिए जमे हुए हैं कि नमूनों के विश्लेषण से पहले आरटी को संतुलित करने की जरूरत है. सतह पर तैरनेवाला CONDENS मजबूत करने के लिए एक अपकेंद्रित्र में नमूने स्पिनसमझना. आईएल 1β की माप के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें. नोट: इस प्रोटोकॉल में आईएल 1β विशेष रूप से मापा जाता है; हालांकि, TNFα, आईएल -6, और immunomodulatory साइटोकाइन आईएल -10 का एक साथ माप उपयुक्त परिस्थितियों primed गया देती है.

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Representative Results

इन तकनीकों में R848 के साथ भड़काना TLR8 उपाय. CD11c + moDCs - समर्थक आईएल 1β के लिए intracellular साइटोकाइन धुंधला CD14 से माइक्रोस्कोपी और FACS readouts के लिए अनुमति देता है. दोनों तकनीकों एक primed गैर, या विश्राम, सेल नियंत्रण के साथ ही एक निर्धारण नियंत्रण (आंकड़े 1 और 2) के सापेक्ष मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. समर्थक आईएल 1β + धुंधला कोशिकाओं का प्रतिशत मंझला फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) प्रदान करने के लिए इस आबादी का ज्यामितीय मंझला से गुणा किया जाता है. एमएफआई सकारात्मक धुंधला कोशिकाओं में मौजूद समर्थक आईएल 1β की राशि के बराबर है.

तो ऐसे β-ट्यूबिलिन या β-actin के रूप में एक आंतरिक सेलुलर नियंत्रण, (चित्रा 3) के सापेक्ष मात्रा निर्धारित है जो सेल lysate, से immunoblotting उपायों समर्थक आईएल 1β. Nigericin इलाज कोशिकाओं में समर्थक आईएल 1β के लिए immunoblotting समर्थक आईएल 1β में कमी उजागर करना चाहिए. यह एक से पूरित हैएलिसा द्वारा मापा supernatants में आईएल 1β, में समवर्ती वृद्धि केवल R848 में nigericin शर्तों द्वारा पीछा (आंकड़े 3 और 4). अन्य सभी शर्तों कोई बाह्य आईएल 1β वर्तमान में परिणाम चाहिए. ऐसे TNFα, आईएल 10, और आईएल -6 के रूप में अन्य भड़काऊ साइटोकिन्स, के एक साथ उपाय, कि nigericin आईएल 1β के स्राव के कारण में विशिष्ट है सुनिश्चित करते हैं. भड़काना का स्तर समय (चित्रा 3) और खुराक (चित्रा 4) के आश्रित, primed R848 में intracellular समर्थक आईएल 1β और बाह्य आईएल 1β (और साथ ही TNFα, आईएल 10 की डिग्री में परिलक्षित एक प्रतिक्रिया है, और सभी R848 में आईएल -6) स्राव (चित्रा 4) शर्तों का इलाज किया.

चित्रा 1
चित्रा 1. Cytoplasmic समर्थक आईएल 1β एफ ने पता लगाया है कम cytometry. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. Cytoplasmic समर्थक आईएल 1β माइक्रोस्कोपी से पता चला है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. Cytoplasmic समर्थक आईएल 1β एसडीएस पृष्ठ से पता चला है.res.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. स्रावित आईएल 1β एलिसा ने पता लगाया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

भड़काऊ साइटोकिन्स वायरल संक्रमण से लड़ने के लिए सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया स्टीयरिंग में अभिन्न हैं. स्रावित आईएल 1β इन्फ्लूएंजा संक्रमण 3, 43, 44 के दौरान वृद्धि दर्ज की गई है. इन साइटोकिन्स मानव वृक्ष के समान कोशिकाओं में वायरल मान्यता के जवाब में कार्रवाई कर रहे हैं जिसके द्वारा सटीक तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं. माइलॉयड डीसी अलगाव किट महंगी और समय लेने वाली हैं. अलगाव किट और एफ ए सी छँटाई अनजाने मई तनाव या कोशिकाओं को सक्रिय करें. इसके अतिरिक्त, प्रयोग के लिए अलग कक्षों की अपर्याप्त राशि वहाँ अक्सर है. सौभाग्य से, मानव moDCs के जीव विज्ञान बारीकी मॉडल है कि इन विट्रो 45, 46 में प्राथमिक मानव माइलॉयड DCs की. दोनों प्रकार के सेल परिपक्व आईएल 1β स्राव को प्राप्त करने के लिए, दो संकेतों, TLR भड़काना और NLRP3 सक्रिय आवश्यकता होती है. इसलिए, moDCs उपलब्ध कराने और सस्ती और सरल डीसी मॉडल सेल प्रकार का अध्ययन करने और शर्त कोआतंकवाद मानव स्वास्थ्य और रोग में NLRP3 inflammasome की प्रासंगिकता और भूमिका को समझते हैं.

आईएल 1β यहाँ वर्णित विधियों के उपयोग का पता लगाने के विषाणु आरएनए संक्रमण सहित भड़काऊ जुड़े विकृतियों के साथ बीमारियों का अध्ययन करने के लिए विभिन्न सरल और प्रभावी immunoassays प्रदान करता है; विशेष रूप से, कैसे R848 के जवाब में और उत्तेजना nigericin तरीकों की एक किस्म में आईएल 1β मापने के लिए. (जैसे पाली (मैं: सी) और LPS) अन्य TLR agonists और (जैसे एटीपी और MSU के रूप में) NLRP3 inflammasome activators अन्य रोग विकृतियों के संदर्भ में उत्तेजना पर इस गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, उत्तेजना बार और शर्तों को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. अभिकर्मक जोखिम बार और सांद्रता भी अन्य प्रकार की कोशिकाओं और प्रजातियों में इस्तेमाल के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित जब समायोजित करने की आवश्यकता होगी.

सभी शर्तों को तीन प्रतियों में चलाया जाना चाहिए और प्रतिक्रिया गुणवत्ता नियंत्रण के प्रयोजनों के लिए सावधानी से तौला; के लिए यह सामान्य बात हैअस्तित्व के लिए महान दाता परिवर्तनशीलता. Monocyte व्युत्पन्न DCs एक सेल प्रकार, नहीं एक सेल लाइन कर रहे हैं, और विविधता एक moDC संस्कृति के भीतर मौजूद है.

भड़काना समर्थक आईएल 1β और R848-primed हालत को आराम moDCs की तुलना के लिए ICS के साथ की पुष्टि की जा सकती है. आराम moDCs सकारात्मक धुंधला में परिणाम नहीं किया जाना चाहिए. भड़काना भी समर्थक आईएल 1β की अभिव्यक्ति के लिए immunoblotting द्वारा मान्य किया जा सकता है. Proinflammatory साइटोकिन्स TNFα, आईएल -6 के स्राव, और आईएल 1β की न्यूनतम स्राव के साथ immunomodulatory साइटोकाइन आईएल -10 में सफल R848 भड़काना परिणाम. Inflammasome सक्रिय कोशिकाओं एक और TNFα, आईएल -6 में वृद्धि हुई है, और आईएल -10 स्राव नहीं दिखाना चाहिए लेकिन unactivated कोशिकाओं की तुलना में secreted आईएल 1β सांद्रता में वृद्धि करनी होगी.

समर्थक आईएल 1β निष्क्रिय परिगलित कोशिका मृत्यु के दौरान जारी किया जा सकता है इसलिए bioavailability assays के ब्याज की हो सकती है. वैकल्पिक रूप से, immunoblotting supernatan पर प्रदर्शन किया जा सकता हैसक्रिय आईएल 1β स्रावित साइटोकाइन का रूप है यह सुनिश्चित करने के लिए secreted आईएल 1β की आणविक भार निर्धारित करने के लिए टीएस; अग्रदूत 31 केडीए है जबकि परिपक्व आईएल 1β 17 केडीए है. Supernatants से आईएल 1β मापने के लिए, सेल एकाग्रता सीमा का पता लगाने के ऊपर एक सकारात्मक संकेत प्राप्त करने के लिए समायोजित करना होगा. कस्पासे 1 सक्रियण भी inflammasome सक्रियण निर्धारित करने के तरीकों की एक किस्म के माध्यम से मापा जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष है.

Acknowledgements

लेखक अपने समर्थन और प्रतिक्रिया के लिए ओलिवर Manches, पीएच.डी., Davor Frleta, पीएच.डी., और Meagan ओ 'ब्रायन, एमडी स्वीकार करना चाहते हैं. इस शोध एलर्जी और संक्रामक रोग के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित और एनआईएच स्वास्थ्य संबंधी रिसर्च (AI089030) और RO1 (AI081848 में विविधता को बढ़ावा देने के लिए व्यक्तिगत predoctoral फैलोशिप (F31) के लिए रुथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार अनुदान से वित्त पोषण के साथ पूरा किया गया ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IL-4 R&D
GM-CSF Genzyme NDC 58468-0180-2 We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine Cellgro 10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells New York Blood Center PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12 well tissue culture plates Sigma-Aldrich 3516
96 well round bottom tissue culture plates Sigma-Aldrich 3799
α-IL-1β-FITC R&D IC201F
FITC isotype control Miltenyi Biotec 130-092-213
α-β-Tubulin Santa Cruz SC-9014
α-IL-1β R&D mab201
PVDF Immobilon-FL membrane Millipore IPFL00010
gradient 4-12% polycrylamide gel Bio Rad 161-1159
Laemmli sample buffer Bio Rad 161-0737
BSA Equitech Bio Inc 30% solution sterile/filtered
PFA Electron Microscopy Sciences 15710 16% solution
Human inflammatory cytokine bead array kit BD 551811
Nigericin Invivogen tlrl-nig
R848 3M Corp.
α-CD14 BD 340436
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
TBS On site stock room
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs Thermo Scientific 159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units Thermo Scientific 569-0020
HEPES Invitrogen 15630080
Goat α-mouse IRDye 800CW Licor 926-32210
Donkey α-rabbit IRDye 680RD Licor 926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder Thermo Scientific 26634
Tris Glycine SDS 10x Bio Rad 1610732
Tris Glycine 10x Bio Rad 161-0734
Methanol - 4 L Fisher Scientific A433P-4
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide BD Falcon 354108
Poly-L-Lysine Sigma P4707

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References

  1. Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
  2. Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
  3. Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
  4. Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
  5. Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
  6. Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
  7. Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. (2013).
  8. Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
  9. Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
  10. Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
  11. Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
  12. Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
  13. Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
  14. Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
  15. Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
  16. Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. (2012).
  17. Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
  18. Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
  19. Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
  20. Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
  21. Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
  22. Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
  23. Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
  24. Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
  25. Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
  26. Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
  27. Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
  28. Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
  29. Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
  30. Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
  31. Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
  32. Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
  33. Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
  34. Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
  35. O'Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
  36. Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
  37. Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
  38. Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
  39. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
  40. He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
  41. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
  42. Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
  43. Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
  44. Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
  45. Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
  46. Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).

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