Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen

1Department of Pathology, New York University School of Medicine, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Mount Sinai Medical Center, 3Division of Hematology and Oncology, Hess Center for Science and Medicine, Mount Sinai Medical Center
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Dendritische cellen (DCs) scheiden IL-1β reactie op TLR8 erkenning van synthetische purine, R848, gevolgd door NLRP3 inflammasome activering met nigericine derhalve IL-1β kunnen worden gebruikt om NLRP3 inflammasome te meten. Intracellulaire cytokine kleuring, immunoblotting en ELISA worden gebruikt om NLRP3 inflammasome priming en activering van IL-1β expressie nauwkeurig te meten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fernandez, M. V., Miller, E. A., Bhardwaj, N. Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1β in Human Monocyte-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (87), e51284, doi:10.3791/51284 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ontstekingsprocessen gevolg van de secretie van interleukine (IL) -1 familie cytokinen door immuuncellen tot lokale of systemische inflammatie, weefselremodellering en reparatie en virologische controle 1, 2. Interleukine-1β is een essentieel onderdeel van de aangeboren immuunrespons en draagt ​​bij aan elimineren binnendringende ziekteverwekkers terwijl het voorkomen van de oprichting van persisterende infectie 1-5.

Inflammasoom zijn de belangrijkste signalerende platform voor de activering van interleukine 1 omzettend enzym (ICE of Caspase-1). De NLRP3 inflammasoom vereist ten minste twee signalen in DCs tot IL-1β secretie 6 veroorzaken. Pro-IL-1β eiwitexpressie wordt beperkt in rustende cellen; dus een priming signaal vereist voor IL-1β transcriptie en eiwitexpressie. Een tweede signaal gedetecteerd door NLRP3 resulteert in de vorming van multi-eiwit NLRP3 inflammasome. Het vermogen van dendritische cellen om verantwoordelijkheidd de signalen vereist voor IL-1β secretie kan worden getest met behulp van een synthetisch purine, R848, die wordt waargenomen door TLR8 in menselijke monocyten afgeleide dendritische cellen (moDCs) prime cellen, gevolgd door activering van de NLRP3 inflammasome de bacteriële toxine en kalium ionofoor, nigericine.

Monocyten afgeleide DCs zijn gemakkelijk geproduceerd in cultuur en geven significant meer cellen dan gezuiverde humane myeloïde DCs. De hier gepresenteerde methode verschilt van andere inflammasome assays die het gebruikt in vitro humane plaats van muizen afgeleide DCs waardoor voor de studie van de inflammasome in humane ziekten en infecties.

Introduction

Activering van aangeboren immuunsysteem moet adaptieve immuunreacties sturen tijdens infectie, ziekte en vaccinatie 7. Dendritische cellen zijn de meest krachtige antigeen-presenterende cellen van het aangeboren immuunsysteem; Zij zijn gespecialiseerd voor de opname van antigenen, migratie naar lymfeklieren en activatie van naïeve CD4 + en CD8 + cytolytische T-cellen 8-10. Om een ​​snelle detectie van pathogenen in staat het aangeboren immuunsysteem maakt gebruik van tal van kiembaan gecodeerde patroonherkenning receptoren (PRR) dat geconserveerde pathogeen afgeleide motieven of gastheer afgeleide markers van cel stress en schade te herkennen. Toll like receptoren (TLR's) zijn membraangebonden patroonherkenning receptoren die bepaalde extracellulaire phagocytized pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en gevaar geassocieerde moleculaire patronen (dempt) herkennen. Daarentegen knipoog like receptoren (NLRs) zijn cytosolische en reageren op een breed scala van PAMPs en DAMPs. Knikken like receptoren opnieuwpresenteren een tweede verdedigingslinie tegen pathogenen die celoppervlak en endocytische PRRs ontwijken. De interactie van pathogeen afgeleide of "gevaar" verbonden factoren TLR-liganden en NLR leidt tot een toestand van DC rijping leidt tot een verhoogde DC interactie met andere cellen en stimulering van T-cellen en natuurlijke killer cel activatie 11.

Interleukine-1β is een cruciaal onderdeel van de afweer tegen infecties. Bij herkenning van een micro-organisme, de zeer pro-inflammatoire cytokine IL-1β, wordt uitgescheiden en functioneert als een chemo attractant en activator van aangeboren en adaptieve immuunsysteem cellen. In vivo IL-1β is grotendeels verantwoordelijk voor de acute fase respons waaronder koorts en inflammatoire cytokine synthese 12.

De meeste NLRs bevatten C-terminale leucine rich repeat domein waarvan wordt gedacht dat functioneert ligand detectie, een centrale nucleotide bindend domein (NACHT) die important voor NLRP3 oligomerization, en een N-klem effector domein (PYD in NLRP3) dat signaaltransductie bemiddelt naar stroomafwaartse doelwitten via eiwit-eiwit interacties. De NLRP3 eiwit bepaalt de meest intensief bestudeerde inflammasome complex. Dit eiwit is een lid van de familie NLR en heeft de mogelijkheid om een ​​multi moleculaire eiwitcomplex samengesteld NLRP3, de adaptor eiwit PYCARD (ook bekend als ASC) en ICE vormen. Bij inflammasoom activering PYCARD bindt aan NLRP3 N terminale domeinen en werft ICE via caspaseactivering en werving domein (CARD) domeinen. Interleukine-1 omzettend enzym wordt aanvankelijk geproduceerd als een zymogeen dat een CARD motief aan zijn N-terminus. Inflammasoom formatie resultaten in het brengen van twee ICE moleculen dicht genoeg bij hun autokatalytisch activering induceren. Inflammasome complex is noodzakelijk voor het activeren ICE waardoor deze cytoplasmatische pro-IL-1β omzetten cytokine rijpen.

Succesvolle secretie van IL-1β in DCs vereist sensing van twee verschillende en onafhankelijke gevaar signalen. Eerste, TLR sensing van PAMPs, DAMPs of cytokine signaling (TNF of IL-1β) veroorzaakt een verhoogde expressie van cytoplasma pro-IL-1β eiwit expressie. Een tweede, vaak verschillend, signaal nodig inflammasome complexvorming vóór ICE rijping. Enkele inflammasoom stimulerende signalen omvatten bacteriële porie vormende toxinen (zoals nigericine), lysosomale verstoren kristallen (zoals monosodium uraat kristallen, MSU) en extracellulair ATP. De upstream-mechanisme dat leidt tot inflammasome activering NLRP3 door deze diverse activatoren is onduidelijk. Onderzoeken naar signalering stroomopwaarts van inflammasome formatie stelt dat intracellulaire gebeurtenissen, zoals inductie van hypokaliëmie of reactive oxygen species (ROS) indirect activeren inflammasome 13-28.

Onder de verschillende virale activatoren van de NLRP3 inflammasome is influenza, waarbij b voorzietOTH de primaire en secundaire signaal dat nodig is voor IL-1β secretie 3, 29-33. Gebruik makend van muis NLRP3 knockout modellen werd gevonden dat IL-1β secretie DCs NLRP3 afhankelijk 32. Bovendien NLRP3 knockout muizen minder aangetrokken leukocyten naar de plaats van infectie en ervaren hogere mortaliteit 2, 5. Twee recente papers suggereren een mechanisme voor NLRP3 inflammasome activatie tijdens Influenza virus infectie; eerste, priming door herkenning van viraal RNA door TLR7 en TLR8 (afhankelijk TLR expressie van de reagerende cel) of door detectie van commensale bacteriën door andere TLRs cytoplasmatische pro-IL-1β expressie te induceren, gevolgd door een tweede signaal, activering van NLRP3 inflammasoom vorming door virale ionkanaal eiwit M2 op het trans Golgi netwerk 33, 34. In de laatste stap, activering van de NLRP3 inflammasome wordt bewerkstelligd door verstoring van de intracellulaire ionische <em> milieu leidt tot ROS productie, die eenvoudig, gedetecteerd door NLPR3 als signaal naar de inflammasome vormen. De precieze mechanisme van activatie inflammasome stroomopwaarts van ICE activiteit gedurende Influenza infectie nog steeds onduidelijk.

Dit werk beschrijft een techniek voor het bestuderen van de waardevolle NLRP3 inflammasome in menselijke moDCs die kan worden gebruikt als een basis voor verder onderzoek van de pathway DC gebaseerd IL-1β secretie in reactie op TLR8 ligatie met R848 gevolgd door activering van de inflammasome door een goed bekende activator van NLRP3, nigericine. Variaties van deze werkwijze kan worden gebruikt met andere celtypen waaronder, maar niet beperkt tot: monocyten, macrofagen, andere DC subsets en epitheelcellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethiek Verklaring: Onderzoek monsters worden verkregen en opgeslagen voor onderzoek met toestemming van donoren. Alle monsters worden gecodeerd of geanonimiseerd vóór gebruik. Dit protocol volgt de richtlijnen van onze Institutional Review Board.

1. Differentiatie van de humane perifere bloed monocyten in monocyten afgeleide dendritische cellen.

Opmerking: menselijke buffy coats dienen als bron van menselijke perifere bloedcellen (PBMC) en werden verkregen van New York Blood Center (New York, NY). Bloeddonoren zijn gezonde vrijwilligers. De 5 dagen procedure begint met de beplating van humane perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) op weefselkweek kolven 35,36. Opmerkelijke verschillen van de gepubliceerde protocollen zijn:

  1. Gebruik 225 cm 2 pyrogeenvrij polystyreen weefselkweekflessen met een filter dop tot een totaal van 2x10 8 PBMC per fles houden in plaats van 10 cm polystyreen weefselkweekplaats (58 cm2) (stap 1).
  2. Bereid medium met 5% gemengd menselijk serum (PHS, 30 ml) in 500 ml RPMI-1640 + L-glutamine, 5 ml 1 M HEPES buffer en 1,4 ml 50 mg / ml Gentamicine (5% PHS media) gevolgd door filtratie door een 20 um filter. Voeg een totaal van 50 ml 5% PHS media per 225 cm 2 weefselkweek kolf.
  3. Was gehandeld cellen drie keer met 25 ml vers RPMI-1640. Schud krachtig gedurende 5 seconden tijdens elke wasbeurt en zuig niet hechtende cellen (stap 4).
  4. Voeg 190 ul van 400 IE / ul IL-4 en 380 pl van 100 IE / ul GM-CSF per fles (stap 3) op dag 0, 2 en 4. Dag 0 wordt gedefinieerd als de dag PBMC's eerst worden uitgeplaat in stap 1 (stap 8).
  5. Harvest dag 5 moDCs bij een concentratie van 1x10 6 cellen / ml (stap 15).
  6. Gebruik moDCs onmiddellijk in hun rusttoestand. Stappen 17-22 zijn nooit uitgevoerd. Opmerking: De monsters moeten zo snel mogelijk na afname worden verwerkt voor de beste resultaten.
  7. Aliquot moDCs bij een concentratietie van 2x10 5 cellen / putje (200 ul / putje van de 1x10 6 cellen / ml) in een 96 putjes met ronde bodem plaat (Western blot, ELISA, FACS) of op een poly-L-lysine behandelde chamberslide (microscopie) voor experimenten . Let op: Er zijn dan minstens 4 voorwaarden: Geheel gestimuleerde (negatieve controle), priming, alleen op de activering en priming gevolgd door activering. Voorwaarden kan worden uitgebreid tot verdunner controles voor R848 en nigericine omvatten indien gewenst. Als de stroomafwaartse assay ICS, duplicaten nodig voor isotype controles.

. 2 Het voorbereiden van de inflammasome - Signaal 1

  1. Reconstitueer gevriesdroogd R848 in DMSO volgens de instructies van de fabrikant. Verdunnen werkvoorraad bij RT met RPMI-1640.
  2. Voeg R848 bij een 10 uM uiteindelijke concentratie te putten voor 18 hr eigenen. Plaats cellen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.

3 activeren NLRP3 inflammasome -. Signal2

  1. Reconstitueer gevriesdroogd nigericine in ethanol volgens de instructies van de fabrikant. Verdun werkvoorraad bij KT met RPMI-1640 voor het toevoegen aan de passende voorwaarden.
  2. Voeg nigericine op 20 uM eindconcentratie en terug naar de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 6 uur. Geen wasstappen plaatsvinden tussen priming en tijdens de activering. Opmerking: Afscheiding van IL-1β wordt verhoogd door de aanwezigheid van calcium ionoforen, brefeldine A, monensine, dinitrofenol of carbonyl cyanide chlorophenylhydrazone 37, 38. Derhalve wordt toevoeging van deze secretoire remmers niet aanbevolen bij het analyseren inflammasome priming of activiteit omdat afscheiding van IL-1β zal veranderen.

4. IL-1ß Sample Collection

  1. Centrifugeer de plaat met cellen en bovenstaande vloeistoffen bij 974 xg gedurende 3 minuten.
  2. Zonder de celpellet, zuig de supernatant en transfer alseparate ronde bodem plaat om cytokineafscheiding meten van de bovenstaande vloeistoffen. Opmerking: Supernatanten tijdelijk bij -20 ° C worden opgeslagen of -80 ° C voor lange termijn opslag.
  3. Was de cellulaire pellets driemaal met 200 ul van 1 x PBS bij 974 xg gedurende 3 min elk extracellulair IL-1β van de cellulaire monsters te verwijderen. Opmerking: Bij het wassen cel pellets uit een 96 wells plaat, verwijder de was door een snelle plaat inversie in een opvangbak, zodat het monster niet storen.

5. Meten IL-1ß Van cellulaire en Supernatantmosters

  1. Intracellulaire Cytokine kleuring (ICS): De ICS-protocol is onder 39, 40 beschreven. Let op: niet de cellen niet op te schorten indien de downstream-test is microscopie. Alle wassingen en wensen moet gebeuren zonder de cellaag / pellet (afhankelijk van de stroomafwaartse assay).
    1. Voeg 100 ul van 5% PHS media in geschikte putjes. Toevoegengeschikte (ongeveer 1 μl/2x10 5 cellen of 1 gl / putje) van fluorescent gelabelde α-CD11c en α-CD14 (fenotype markers, kloon B-Ly6 en MφP9, respectievelijk) of isotype controle met betrekking tot de cellen gedurende 10 minuten bij RT in het donker.
    2. Was driemaal met 1 x PBS bij 974 xg gedurende 3 minuten.
    3. Fixeer de cellen door toevoeging van 100 pl 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    4. Pauze Point: Wassen met 100 ul 1x PBS bij 974 xg gedurende 3 min en bewaar bij 4 ° CO / N in 1x PBS.
    5. Voeg 100 ul permeabilisatie buffer cellen gedurende 30 minuten. Opmerking: permeabilisatie buffer bestaat uit 1x PBS met 0,3% Triton X-100 en 1% runderserumalbumine (BSA) voor permeabilisatie. Niet storen hechtende cellen als downstream test is microscopie.
    6. Voeg het juiste volume (ongeveer 62 ng antibody/2x10 5 cellen, of ongeveer 2,5 gl / putje) van α-IL-1β-FITC (kloon 8516) of isotype controle voor2 uur in een incubator bij 37 ° C.
    7. Was de cellen drie maal met 200 ul permeabilisatie buffer bij 974 xg gedurende 3 minuten in het donker.
    8. Optioneel: Vlek met DAPI, voeg inbedmiddel en plaats dekglaasje voorzichtig op een glasplaatje. Laat inbedmiddel te genezen O / N voor het vastleggen van microscopie beelden.
    9. Het verwerven van de gegevens door FACS of microscopie. Opmerking: Vergelijk de isotype voor elke voorwaarde om de juiste vlekken bij het analyseren door FACS of microscopie.
      1. FACs: Bemachtig een monster per keer. Stel de FSC / SSC hek aan de levende cellen, gevolgd door gating op CD11c + CD14 - cellen voor het analyseren van de MoDC bevolking pro-IL-1β kleuring.
      2. Microscopie: Stel de belichtingstijd met behulp van de positieve kleuring monster - R848 behandeld. Gebruik DAPI + pro-IL-1β + en DAPI + pro-IL-1β - het percentage pro-IL-1β + expressie moDCs bepalen.
  2. SDS-Pagina: immunoblotting uitgevoerd pro-IL-1β detecteren. Opmerking: De hieronder beschreven techniek is samengesteld uit standaard immunoblotting techniek, gradiënt 4-20% polyacrylamide gel, en fluorescente of chemiluminescente detectie 41, 42.
    1. Lyse cellen direct in 10 pl denaturerende lysis buffer (5 ul β-mercaptoethanol/950 pl Laemmli monsterbuffer, gevolgd door verdunning 1:1 met cellysis buffer). Transfer lysaat 1,5 ml Eppendorf buisjes.
    2. Warmte lysaat op een droge plaat gedurende 10 minuten bij 100 ° C.
    3. Spin lysaat bij 20.800 xg een minicentrifuge gedurende 1 min naar het vloeistofvolume concentreren. Pauze punt: monsters bij -20 ° C worden ingevroren voor korte termijn opslag.
    4. Laad het totale volume op de polyacrylamidegel. Ren 140 V door de gel doos voor ongeveer 1 uur, of totdat de kleurstof voorkant loopt uit de bodem van de gel.
    5. Breng het eiwit uit de polyacrylamidegel op een PVDF Immobilon-FL membrane gedurende 90 minuten bij 100 V. Blok het membraan met 5% BSA in Tris gebufferde zoutoplossing / 0,1% Tween-20 (TBS-T) gedurende 1 uur. Opmerking: PVDF Immobilon-FL is het beste voor gebruik met fluorescerende detectie. Een membraan met een andere samenstelling wordt aanbevolen voor andere detectietechnieken om het signaal te verhogen tot achtergrond verhouding.
    6. Verdun primaire en secundaire antilichamen in 10 ml van 5% BSA / TBS-T. Voer primair antilichaam incubatie bij 4 ° CO / N onder schudden en secundair antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder schudden.
    7. Was het membraan 3 maal met TBS-T gedurende 5 minuten onder schudden tussen primaire en secundaire antilichaam incubatie en weer tussen secundaire incubatie en beeldvorming. Opmerking: Banden kunnen worden gedetecteerd met fluorescente of chemiluminescente detectie. Volg de instructies van de fabrikant voor de detectie.
  3. ELISA: Monsters die voor opslag worden ingevroren moeten in evenwicht te RT voor de analyse. Spin down monsters in een centrifuge om supernatant condens consoliderenatie. De instructies van de fabrikant voor het meten van IL-1β. Opmerking: In dit protocol IL-1β wordt specifiek gemeten; Gelijktijdige meting van TNFa, IL-6, en immuunmodulerende cytokine IL-10 waarborgen de juiste voorwaarden worden gevuld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze technieken meten TLR8 priming met R848. Intracellulaire cytokine kleuring voor pro-IL-1β zorgt voor microscopie en FACS uitlezingen van CD14 - CD11c + moDCs. Beide technieken kunnen worden gekwantificeerd ten opzichte van een niet-geprimede of rusten, celcontrole en een isotype controle (figuren 1 en 2). Percentage van pro-IL-1β + kleuring cellen wordt vermenigvuldigd met het geometrische gemiddelde van de populatie het gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) te verschaffen. De MFI is vergelijkbaar met de hoeveelheid pro-IL-1β in de positieve kleuring cellen.

Immunoblotting maatregelen pro-IL-1β van cellysaat, die vervolgens wordt gekwantificeerd ten opzichte van een interne cellulaire controle, zoals β-tubuline en β-actine (Figuur 3). Immunoblotting voor pro-IL-1β in nigericine behandelde cellen zou een daling pro-IL-1β onthullen. Dit wordt aangevuld door eengelijktijdige toename van IL-1β in supernatanten gemeten door ELISA, alleen R848 gevolgd door nigericine omstandigheden (Figuren 3 en 4). Alle andere voorwaarden moeten resulteren in geen extracellulaire IL-1β aanwezig. Gelijktijdige meting van andere inflammatoire cytokinen, zoals TNFa, IL-10 en IL-6, zodat nigericine specifiek is waardoor de uitscheiding van IL-1β. Het niveau van priming tijd (figuur 3) en dosis (Figuur 4) afhankelijke, een antwoord terug in de mate van intracellulaire pro-IL-1β in R848 primer en extracellulaire IL-1β (en TNFa, IL-10, en IL-6) secretie in elke R848 behandelde omstandigheden (figuur 4).

Figuur 1
Figuur 1. Cytoplasmisch pro-IL-1β wordt gedetecteerd door f laag cytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Cytoplasmatische pro-IL-1β wordt gedetecteerd door microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Cytoplasmisch pro-IL-1β wordt gedetecteerd door SDS-PAGE.res.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Uitgescheiden IL-1β wordt gedetecteerd door ELISA. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Inflammatoire cytokines zijn integraal in het sturen van het aangeboren en adaptieve immuunrespons tegen virale infecties te bestrijden. Afgescheiden IL-1β is aangetoond verhogen tijdens Influenza infectie 3, 43, 44. Het precieze mechanisme waardoor deze cytokinen worden verwerkt in reactie op virale erkenning humane dendritische cellen niet volledig begrepen. Myeloïde DC isolatie kits zijn duur en tijdrovend. Isolatie kits en FAC sortering kan onbedoeld stress of activeren van de cellen. Daarnaast is er vaak onvoldoende hoeveelheid geïsoleerde cellen voor experimenten. Gelukkig is de biologie van de menselijke moDCs nauw modellen die van primaire humane myeloïde DCs in vitro 45, 46. Beide celtypen vereisen twee signalen, TLR priming en NLRP3 activerende, aan volwassen IL-1β secretie bereiken. Daarom moDCs bieden en soort betaalbare en eenvoudige DC model cel te bestuderen en inzetter begrijpen de relevantie en de rol van de NLRP3 inflammasome in de menselijke gezondheid en ziekte.

De detectie van IL-1β gebruikmaking van de hier beschreven werkwijzen levert diverse eenvoudige en doeltreffende immunoassays om ziekten geassocieerd met inflammatoire ziekten, waaronder virale RNA infectie te bestuderen; specifiek, hoe IL-1β meten op verschillende manieren reactie op R848 en nigericine stimulatie. Andere TLR-agonisten (bijvoorbeeld Poly (I: C) en LPS) en NLRP3 inflammasome activatoren (zoals ATP en MSU) kunnen worden gebruikt om deze activiteit te meten bij stimulatie in het kader van andere ziekten pathologieën; echter, kan het nodig zijn stimulatie en de omstandigheden worden aangepast. Blootstelling reagens tijden en concentraties zou ook aangepast moeten worden bij het wijzigen van dit protocol voor gebruik in andere celtypes en soorten.

Alle voorwaarden moeten worden uitgevoerd in drievoud en van de respons zorgvuldig afgewogen behoeve van de kwaliteitscontrole; Het is gebruikelijkgrote donor variabiliteit te bestaan. Monocyten afgeleide DC's zijn een soort cel, niet een cellijn, en heterogeniteit bestaat binnen een MoDC cultuur.

Priming kan worden bevestigd met ICS voor pro-IL-1β en het vergelijken van rust moDCs de R848-primer conditie. Rusten moDCs mag niet leiden tot positieve kleuring. Priming kan ook worden gevalideerd door immunoblotting voor de expressie van pro-IL-1β. Succesvolle R848 priming leidt tot de uitscheiding van pro-inflammatoire cytokines TNFa, IL-6, en immuunmodulerende cytokine IL-10 met minimale afscheiding van IL-1β. Inflammasoom geactiveerde cellen zou geen verdere toename van TNFa, IL-6 en IL-10 secretie vertonen maar een toename van uitgescheiden IL-1β concentraties heeft dan ongeactiveerde cellen.

Pro-IL-1β passief mag worden vrijgegeven tijdens necrotische celdood daarom biologische assays interessant kunnen zijn. Als alternatief kan immunoblotting worden uitgevoerd op supernatants het molecuulgewicht van uitgescheiden IL-1β bepalen inzake actief IL-1β is de vorm van het cytokine; mature IL-1β is 17 kDa, terwijl de voorloper is 31 kDa. Om IL-1β van supernatanten te meten zal celconcentratie moeten worden aangepast om een ​​positief signaal boven de detectielimiet te bereiken. Caspase-1 activering kan ook worden gemeten via verschillende methoden om inflammasome activatie bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgements

De auteurs willen graag Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., en Meagan O'Brien, MD erkennen voor hun steun en feedback. Dit onderzoek werd gesteund door het Nationale Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekte en aangevuld met financiering van NIH verleent Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards voor Individuele predoctorale beurzen (F31) om diversiteit in Health-Related Research (AI089030) en RO1 (AI081848 bevorderen ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IL-4 R&D
GM-CSF Genzyme NDC 58468-0180-2 We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine Cellgro 10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells New York Blood Center PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12 well tissue culture plates Sigma-Aldrich 3516
96 well round bottom tissue culture plates Sigma-Aldrich 3799
α-IL-1β-FITC R&D IC201F
FITC isotype control Miltenyi Biotec 130-092-213
α-β-Tubulin Santa Cruz SC-9014
α-IL-1β R&D mab201
PVDF Immobilon-FL membrane Millipore IPFL00010
gradient 4-12% polycrylamide gel Bio Rad 161-1159
Laemmli sample buffer Bio Rad 161-0737
BSA Equitech Bio Inc 30% solution sterile/filtered
PFA Electron Microscopy Sciences 15710 16% solution
Human inflammatory cytokine bead array kit BD 551811
Nigericin Invivogen tlrl-nig
R848 3M Corp.
α-CD14 BD 340436
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
TBS On site stock room
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs Thermo Scientific 159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units Thermo Scientific 569-0020
HEPES Invitrogen 15630080
Goat α-mouse IRDye 800CW Licor 926-32210
Donkey α-rabbit IRDye 680RD Licor 926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder Thermo Scientific 26634
Tris Glycine SDS 10x Bio Rad 1610732
Tris Glycine 10x Bio Rad 161-0734
Methanol - 4 L Fisher Scientific A433P-4
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide BD Falcon 354108
Poly-L-Lysine Sigma P4707

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
  2. Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
  3. Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
  4. Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
  5. Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
  6. Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
  7. Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. (2013).
  8. Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
  9. Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
  10. Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
  11. Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
  12. Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
  13. Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
  14. Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
  15. Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
  16. Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. (2012).
  17. Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
  18. Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
  19. Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
  20. Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
  21. Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
  22. Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
  23. Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
  24. Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
  25. Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
  26. Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
  27. Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
  28. Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
  29. Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
  30. Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
  31. Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
  32. Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
  33. Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
  34. Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
  35. O'Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
  36. Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
  37. Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
  38. Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
  39. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
  40. He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
  41. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
  42. Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
  43. Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
  44. Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
  45. Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
  46. Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics