الكهربائية الخلوي الركيزة مقاومة استشعار لتقدير حجم انتشار غشائي، الحاجز وظيفة، والحركة

1Department of Pulmonary Diseases, Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center, 2Department of Physiology, Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center
Published 3/28/2014
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

يستعرض هذا البروتوكول الكهربائية الخلوي الركيزة مقاومة الاستشعار، وهي طريقة لتسجيل وتحليل الطيف مقاومة من الخلايا الملتصقة لتقدير حجم مرفق الخلية، والانتشار، حركية، والاستجابات الخلوية للمؤثرات الدوائية والسمية. وأكد الكشف عن نفاذية البطانية وتقييم خلية خلية وخلية الركيزة الاتصالات.

Cite this Article

Copy Citation

Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility. J. Vis. Exp. (85), e51300, doi:10.3791/51300 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الكهربائية الخلوي الركيزة مقاومة الاستشعار (ECIS) هو نظام قياس مقاومة في المختبر لتحديد سلوك الخلايا داخل طبقات الخلايا الملتصقة. تحقيقا لهذه الغاية، وتزرع الخلايا في غرف خاصة الثقافة على رأس الخصم أقطاب الذهب دائرية. يتم تطبيق صغيرة بالتناوب تيار مستمر بين الأقطاب والمحتملة عبر يقاس. خصائص العزل من غشاء الخلية إنشاء المقاومة تجاه تدفق التيار الكهربائي مما أدى إلى زيادة الجهد الكهربائي بين الأقطاب. قياس مقاومة الخلوية في هذه الطريقة تسمح للدراسة الآلي للمرفق الخلية، والنمو، مورفولوجيا، وظيفة، والحركة. على الرغم من أن قياس ECIS نفسها هي واضحة وسهلة التعلم، نظرية الأساسية هي معقدة واختيار الإعدادات الصحيحة والتحليل الصحيح وتفسير البيانات ليست واضحة بذاتها. حتى الآن، وبروتوكول واضح واصفا الخطوات الفردية من التجريبيةتصميم لإعداد وتحقيق، وتحليل التجربة غير متوفر. في هذه المقالة مبدأ القياس الأساسية، فضلا عن التطبيقات الممكنة، وتناقش الاعتبارات التجريبية، ومزايا وقيود النظام ECIS. يتم توفير دليل لدراسة مرفق الخلية، ونشر وانتشار؛ الكمي للسلوك الخلية في طبقة متموجة، فيما يتعلق ظيفة الحاجز، حركية الخلية، ونوعية الخلايا خلايا والخلية الركيزة التصاقات؛ النوعي والكمي لالتئام الجروح و الاستجابات الخلوية للمؤثرات فعال في الأوعية. وتناقش نتائج ممثلة على أساس الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان (MVEC) والخلايا البطانية الوريد السري الإنسان (HUVEC)، ولكن لا ينطبق على جميع الخلايا المتنامية ملتصقة.

Introduction

ΩΩΩHere نقدم الكهربائية الخلوي الركيزة مقاومة الاستشعار، والمعروفة باسم ECIS، وهي طريقة محددة لقياس وتحليل الطيف مقاومة من الخلايا الملتصقة في الثقافة 1. والهدف من هذا البروتوكول هو تقديم دليل المطبقة عموما لاستخدام هذا نوع معين من مقاومة مقرها المقايسات الخلوية وتوفير بروتوكولات لبعض الوظائف الرئيسية من عدد متزايد باستمرار من التطبيقات. سيكون التركيز على دراسة تكاثر الخلايا، وظيفة الحاجز، تقاطعات الخلية، والحركة الخلية.

منذ أن تم عرضه ECIS ونموذج المرتبط به لتحويل البيانات مقاومة الطيفي في المعايير ذات الصلة بيولوجيا في شكلها الحالي إلى المجتمع العلمي من خلال Giaever وKeese في عام 1991 وغالبا ما يشار إليها باسم نظام لقياس طير (العابرة الظهارة المقاومة الكهربائية)، وهي ليست دقيقة. الخلافات الهامشية يبدو في البداية، ولكنمهمة لتفسير البيانات. لقياسات طير الكلاسيكية، وتزرع الخلايا على مرشحات قابلة للاختراق لتوصيف آليات النقل paracellular، التي يسيطر عليها منعطفات ضيقة الظهارية أو الملتصقة البطانية تقاطعات 3. عادة، يتم استخدام قطبين وضعه فوق وتحت التصفية لتطبيق تيار مباشر (DC) تدفق أكثر من طبقة الخلايا وقطبين أخرى لقياس انخفاض الجهد الناتج 4. يتم حساب المقاومة الكهربائية باستخدام قانون أوم، الذي يسمح لوصف العددية للجودة حاجز الخلية.

ECIS يتبع هذا المبدأ الأساسي، ويمتد ذلك. في نظام ECIS، وتزرع الخلايا على معارضته، أقطاب الذهب الدائرية التي هي جزء لا يتجزأ في الجزء السفلي من الأطباق خلية ثقافة خاصة. عدد من الأقطاب الكهربائية في الثقافة هو أيضا متغير، يعتمد على تطبيق والأقطاب ويبلغ قطرها 250 ميكرون مستوى، وفي بعض الحالات أكبر عداد كهربائييستخدم لاستكمال الدائرة. يستخدم ECIS على التيار المتردد المستمر (AC) من 1 أمبير مع تردد معين بدلا من التيار المباشر. يتم حساب مقاومة من التغييرات المقابلة في الجهد (في السيارات) بين الأقطاب. ECIS توفر إمكانية لقياس مقاومة على مجموعة من الترددات لدراسة الخصائص الخلوية تعتمد تردد، والتي لديها العديد من المزايا أكثر من طير وسيتم شرحها بالتفصيل في هذا المقال. الأولى، وقياس مقاومة معقدة تسمح فصل مقاومة الشاملة في مقاومة الجدار الخلوي والسعة الخلية. بالإضافة إلى ذلك، من خلال اتخاذ البيانات على ترددات متعددة وتطبيق نموذج رياضي، يمكن للمرء أن يفرق بين مقاومة صلي (ضيق من الاتصالات خلية خلية) ومقاومة الناجمة عن التفاعلات الخلية الركيزة (المسافة من غشاء الخلية القاعدية للمصفوفة الكامنة)، وكذلك مساهمة السعة غشاء الخلية. الثانية، تكاثر الخلايا وحركية يمكن تقييم، لأن الخليةو هي في اتصال مباشر مع الأقطاب. الثالث، والركيزة أقطاب هي رقيقة بما فيه الكفاية للسماح لحقل مشرق وعلى النقيض من المرحلة المجهري.

أساس القياسات مقاومة: مقاومة ومعقدة

أساس لقياس المعاوقة الكهربائية من الكائنات البيولوجية (مثل الخلايا) هو قانون أوم، وهو الكهربائية التقنية المبدأ الأساسي، الذي يصف العلاقة بين المقاومة (R)، التيار (I) والجهد (U) في الدائرة الكهربائية في وقت معينة (ر).
المعمول بها في العاصمة الدائرة: R (ر) = U (ر) / I (ر)

عند العمل في نظام التيار المتردد، التيار والجهد تختلف ليس فقط في السعة، ولكن أيضا في مرحلة من (φ). الآن، ومقاومة لم يعد كافيا لوصف هذه العلاقات. بدلا من ذلك، مقاومة المعقدة (Z) أو في معظم الحالات ضخامة مقاومة (| Z |) تستخدم، التي تحتوي على مقاومة أومية الموصوفة سابقا بالإضافة إلى مفاعلة (X)، والتي أعيدsults من AC تتدفق من خلال المكثفات والمحاثات قيادة مرحلة التحول بين الجهد والتيار 5.
المعمول بها في الدائرة AC: | Z (و) | = √ (R 2 + X) و (2)
φ = وظل الزاويه القوسي (X / R)

عند تنفيذ قياسات مقاومة على خلايا سليمة، ويرجع ذلك إلى خصائص الغشاء، والخلايا بمثابة اتصال موازية المقاوم ومكثف. هنا، المقاومة يمثل المعارضة لتدفق الحالية، في حين أن السعة (C) يصف الفصل بين الناقلين الكهربائية في العزل ثنائية الطبقات من غشاء الخلية الذي يسبب الاستقطاب من الخلية. وبذلك يهيمن X من خصائص بالسعة من غشاء الخلية.
X (و) ≈ (2 * بي * و * C الخليوي) -1

منذ العاشر هو تردد المعالين، اختلاف وتيرة قياس تمكن من دراسة مختلف الخصائص الوظيفية والهيكلية للخلية. التدابير جهاز ECIS كل من R و X، مما يسمح للحسابمن | Z |، C وφ.

قياس طبقات الخلية بأكملها مع مقاومة الطيفي: الدائرة يعادل الكهربائية.

كما هو موضح سابقا، عندما يتم إحضارها خلية في مجال كهربائي، لكنه يظهر خصائص المكونات الإلكترونية السلبي. إذا الآن، بدلا من خلية واحدة، يتم التحقيق فيها طبقة الخلية بأكملها نمت على رأس الأقطاب وتستكمل مع خلية ثقافة المتوسط، نموذج بسيط من المقاوم ومكثف يحتاج إلى أن تمتد إلى الشبكة الكهربائية بالكامل. في هذا ما يسمى دائرة ما يعادلها، مقاومة ثقافة المتوسط ​​(ميد R)، وكذلك السعة (C إلكترونيات) والمقاومة (R إلكترونيات) التي تميز التفاعل الكهربائي / بالكهرباء تحتاج إلى النظر فيها 3،6.

A، مثلا عامة مبسطة من هذه الدائرة ما يعادلها للحصول على طبقة الخلايا الملتصقة المتزايدة يمكن العثور عليها في الشكل 1. ميزة مثل هذا والرياضيةpproach لوصف النظام البيولوجي هو أن تلك الدوائر يمكن أن يتم تكريره بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية وتعديلها على الأسئلة التجريبية محددة، على سبيل المثال من خلال النظر في مقاومة التي تسببها العضيات الخلوية داخل أو للتمييز تأثيرات خلية خلية (R Junc) والتصاقات خلية الركيزة (R الفرعية) على 7،8 مقاومة الشاملة. مع ذلك الهدف لنمذجة ينبغي أن يكون دائما إلى استخدام أقل عدد من العناصر التي تصف جميع ملامح الطيف مقاومة قياس للسماح الارتباطات ذات مغزى.

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي للنظام ECIS وممثل الدائرة المكافئة لطبقة الخلايا المتنامية ملتصقة. أ) عبر قسم من ثقافة ECIS جيدا. الخلايا تنمو على رأس الاستشعار عن بعد ومكافحة الكهربائي وإعادة مغطاة ثقافة المتوسط. يتم توصيل الأقطاب الكهربائية إلى مكبر للصوت للانغلاق ويتم تطبيقها في إشارة AC عبر المقاوم 1 MΩ لإنشاء مصدر تيار مستمر. يمكن إضافة مؤثرات مباشرة إلى مستنبت في أي نقطة في الوقت المناسب. ب) تدابير ECIS مجموع كل المساهمات الفردية للمقاومة. المقاومة من مستنبت (R ميد)، وكذلك مقاومة الناجمة عن واجهة القطب / المنحل بالكهرباء، والذي هو البساطة كما عرضت مجموعة موازية من المقاوم (R إلكترونيات) ومكثف (C إلكترونيات)، وكذلك الخصائص الكهربائية من غشاء الخلية، التي وصفها اتصال موازية المقاومة (R الخليوي) والسعة (C م)، وكلها تحتاج إلى النظر فيها. R الخلية هو متغير، لأنه يعتمد على نفاذية الخلية نحو الحالي. حلبة يعادل يمكن تمديدها والمكرر بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. كمثال صلي (R Junc) كماوأضيفت أيضا تحت البطانة كمقاومة (R الفرعية) إلى الحلبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ومعنى مقاومة المعلمات البيولوجية

المعلمتين الأكثر مباشرة المستمدة من قياسات مقاومة هي المقاومة والسعة من الخلايا. المقاومة تمثل الجودة وظيفة من الجدار الخلوي وبالتالي يأخذ في الاعتبار المقاومة نحو شبه وتدفق التيار عبر الخلوي. يوفر السعة تدبير التغطية الشاملة القطب. ميزة مميزة من ECIS هو أنه مع مساعدة من الدوائر المكافئة ونمذجة تلك المعايير العالمية تقديم رؤى على العديد من الخصائص أكثر الخلوية، بما في ذلك خلية خلية وخلية الركيزة التصاقات، والتي سيتم مناقشتها لاحقا في هذه المقالة.

قبل البدء: conside التجريبيةحصص

الإعداد القياس - يتكون من عدة عناصر الإعداد منفصلة: جهاز ECIS مع الالكترونيات القياس؛ PC للحصول على البيانات؛ حامل مجموعة ل8 - 96 أو نظام جيدا؛ صفائف ECIS وثقافة خلية من خيار. يجب وضع حامل مجموعة في حاضنة وتوصيلها إلى الجهاز ECIS خارج الحاضنة. الكمبيوتر يحتاج إلى أن تكون مجهزة مع برنامج ECIS (1.2.123.0 14 فبراير 2013) وتوصيلها إلى الجهاز ECIS.

اختيار مجموعة - وهناك مجموعة متنوعة تزايد مستمر صفائف ECIS، والمصممة لتطبيقات متعددة. المصفوفات القياسية هي 8W1E وصفائف 8W10E، والتي تتكون من 8 آبار الثقافة (المشار إليها بواسطة W) تضم 1 أو 10 أقطاب القياس (المشار إليها بواسطة E)، على التوالي. A القطب المضاد كبيرة اكتمال الدائرة، ولكن مقاومة لها لا يكاد يذكر أساسا في القياس الفعلي 6. يمكن لل8 جيدا القياسية حامل مجموعة استضافة اثنين فيrrays، مما أدى إلى عدد 16 بئرا الثقافة. الأقطاب الذهب هي 50 نانومتر سميكة، ويرسم مع فيلم العازلة والتي شنت على إما واضحة بصريا يكسان الركيزة البولي أو لوحة الدوائر المطبوعة (PCB). صفائف PCB هي أكثر قوة وفعالية من حيث التكلفة. الشرائح شفافة تسمح للضوء والمناعي المجهري. ما يجب النظر هو أن مجموعة 1E يعزز التقلبات في إشارة المقاومة التي تسببها الاقتراحات خلية وهناك حاجة لدراسات التئام الجروح. بالإضافة إلى ذلك، واحد أقطاب تسمح ارتباط الإشارات الكهربائية والبصرية. في القطب صفائف متعددة، وبلغ متوسط ​​إشارة على مدى عدة أقطاب، الذي يشمل نظرا لزيادة منطقة القياس المزيد من الخلايا في القياس، ويحد من التحيز البيانات بواسطة التلقيح متفاوتة ونمو الخلايا ويقلل من وضوح للإشارة إلى الخلية بسبب الاقتراحات. وبالتالي، فإن القطب صفائف متعددة هي مفيدة لدراسة تكاثر الخلايا وتشكيل حاجز. قربالمصفوفات القياسية وهناك المصفوفات الخاصة المتاحة لتطبيق إجهاد القص لدراسة الكيميائي 10، الهجرة الخلية، وانتشار وكذلك لوحات 96 جيدا للعروض إنتاجية عالية. على أن تبرم، مجموعة ليتم استخدامها وتعتمد بشدة على مسألة علمية ونوع من الخلايا وينبغي اختيار بعناية واختبارها.

تردد القياس - النمذجة من الروبيديوم وألفا (انظر تحليل البيانات) يتطلب قياسات متعددة التردد (MFT). خلاف ذلك يمكن قياس مقاومة على مر الزمن في واحدة نوع من الخلايا تردد معين (SFT)، مع ميزة أنه يمكن جمع البيانات مع القرار الزماني أعلى. تردد القياس الأكثر حساسية لنوع خلية معينة يمكن العثور عليها عن طريق المسح الضوئي التردد. عندما بالتآمر على التوالي مقاومة المقاومة مقابل تردد في رسم بياني وتيرة تسجيل السجل حيث الفرق بين خالية من الخلايا والقطب المغطاة خلية هي أكبر هو التردد حيث منع خلايا تيانه الحالية أكثر فعالية. في حالة الخلايا البطانية (EC) هذا التردد هو في حوالي 4 كيلو هرتز.

كثافة البذر - كما هو الحال في كل خلية مقرها كثافة البذر التجربة العادية يعتمد على المشكلة العلمية. عند دراسة التصاق ونشر أو تشكيل حاجز، ينبغي المصنفة الخلايا البطانية مع كثافة عالية من 40،000-60،000 خلية / سم 2 لضمان متموجة، حاجز مستقرة بعد 48 ساعة. إذا كان التركيز التجربة على الانتشار، ينبغي المصنفة الخلايا البطانية ذات الكثافة المنخفضة من حوالي 2،000-10،000 خلية / سم 2.

Protocol

1. إعداد نظام القياس

  1. Prewarm صاحب مجموعة في حاضنة إلى 37 درجة مئوية قبل البدء في التجربة لمنع التكثيف.
  2. ملء النعش المياه في حاضنة مع الماء المقطر لتجنب جفاف الآبار.
  3. أداء جميع التلاعبات على الخلايا والمصفوفات في مجلس الوزراء تدفق الصفحي تحت ظروف معقمة.

2. إعداد صالحة وتلقيح خلايا

ملاحظة: صفائف ECIS تحتاج إلى تنظيفها واستقرت قبل تجربة لمنع الانجراف الكهربائي، لتحسين جيد إلى جيد التكاثر ونسبة الإشارة إلى الضوضاء. لذا خياران المتاحة: أ) المعالجة من الأقطاب الكهربائية مع L-السيستين وباء) وظيفة استقرار ECIS.

الخيار A: ينصح L-السيستين مثل المعالجة أكثر اتساقا، ولكن في بعض الحالات قد تتفاعل مع بروتين خاص coatinع على الأقطاب. وتستخدم وحدات التخزين المقدمة للمعيار 8 صفائف جيدا.

  1. إضافة 200 ميكرولتر / جيد 10 ملي L-السيستين. السيستين ينظف ويعدل سطح القطب الكهربائي وتوفير السعة العالية واستنساخه.
  2. احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. يغسل مرتين 500 ميكرولتر / جيدا بالماء النقي فائقة (نوع 1). لا تستخدم مخازن الفوسفات، والتي يمكن أن تتداخل مع امتصاص بعض البروتينات. أيضا تجنب الحلول التي تحتوي على المصل قبل الطلاء، منذ سطح الذهب سوف كثف الجزيئات الأولى جلبت على اتصال.
  4. معطف مع 200 ميكرولتر / دافئ جيدا 1٪ الجيلاتين.
  5. احتضان 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. إزالة الجيلاتين، ولكن لا تدع سطح جاف. هذا يمكن أن تلحق الضرر الأقطاب.
  7. يغسل مرة واحدة مع الماء نقي للغاية (نوع 1).
  8. إضافة 400 ميكرولتر / كاملة جيدا مستنبت الخلية (التي تحتوي على المصل والمضادات الحيوية وكلها عوامل النمو).
  9. مجموعة الشريحة في مجموعة حامل لد التأكد من أن يتم وضع مجموعة من هذا القبيل أن تسعة منصات الذهب مربع يتم الاتصال بشكل صحيح من قبل دبابيس بوجو بنابض والمسمار التكيف الإصلاح ناحية ضيقة. كن حذرا مع صفائف شفافة، ويمكن بسهولة أن تتلف طبقة الذهب.
  10. فتح برنامج الإعداد القياس والصحافة تليها تحقق في المقطع "جمع البيانات" لإجراء قياس مقاومة سريعة من كل بئر على حدة. القيم الناتجة هي الأساس والقياس تلقائيا خزنها في "تعليقات".
  11. فإن الاختيار أيضا تلقائيا تحديد نوع صفائف ECIS المستخدمة. التحقق من صفائف مختارة في قسم "حسنا التكوين".
  12. المخطط مجموعة تضيء الأخضر للآبار متصلة بشكل صحيح والأحمر للآبار متصلة فارغة أو غير صحيحة. لا يزال، دائما التأكد من أن وضعت صفائف بشكل صحيح في حامل.
    ملاحظة: إذا كان التنظيف والطلاء الناجح صفائف 8W1E ECIS يكون ميلانapacitance من حوالي 5 طراز NF وصفائف 8W10E من 50 NF، مما يؤدي الى مقاومة خط الأساس من حوالي 2،000 و 200 Ω، على التوالي.
  13. إزالة مجموعة من حامل.
  14. خلايا البذور كما تعليق خلية واحدة في 400 ميكرولتر / كاملة جيدا خلية ثقافة المتوسط.

الخيار باء: يمكن استخدام الدالة استقرار ECIS كبديل أو بالاشتراك مع العلاج-L السيستين وإذا كانت المشاكل مع الانجراف القطب أو اختلافات كبيرة في جيدا جيدا لمقاومة والسعة تحدث.

  1. أداء العلاج السيستين (اختياري) وأقطاب precoat مع البروتين (اختياري).
  2. إضافة 200 ميكرولتر / جيد من المتوسطة كاملة إلى كل بئر ووضع مجموعة في حامل الصفيف.
  3. يتم توصيل البرمجيات مفتوحة القياس والصحافة الإعداد تليها تحقق للتأكد من مجموعة بشكل صحيح وقياس الأولي Z، R، وC.
  4. استقرار الأقطاب عن طريق الضغط (كاليفورنيا. 3 مللي أمبير)، ذات تردد عال (64 كيلو هرتز) نبض لتنظيف الأقطاب.
  5. تحقق الأقطاب مرة أخرى. ينبغي زيادة السعة وينبغي أن تكون القيم المقاومة في مجموعة مقارنة.
  6. إذا السعة والمقاومة القيم لا تزال غير مرضية، كرر الاستقرار.
  7. إزالة مجموعة من حامل وتلقيح الخلايا.

3. إعداد البرامج وقياس الحصول على البيانات

  1. وضع مجموعة في حامل مجموعة كما هو موضح من قبل.
  2. البرمجيات مفتوحة القياس واضغط على زر الإعداد في المقطع "جمع البيانات" للربط بين البرامج ECIS في الصك ECIS وتشغيل أخرى تحقق جيدا.
  3. التحقق من صفائف مختارة في قسم "حسنا التكوين".
  4. تحديد الآبار التي يتم قياسها في "حسنا Configuratالقسم أيون ".
  5. تحديد وضع القياس من "جمع البيانات" خيارات:
    1. لسلسلة زمنية على تردد ثابت، حدد التكرار واحدة. / الوقت (SFT) واختيار تردد القياس من القائمة المنسدلة.
    2. لقياس التغطية القطب والنمذجة من الروبيديوم وألفا، حدد التكرار متعددة. / الوقت (MFT). سيقوم الجهاز تلقائيا ECIS قياس في جميع الترددات المتاحة.
    3. لmicromotion (انظر تحليل البيانات) حدد وقت اجمع السريع (RTC) وضبط التردد وقياس تردد أخذ العينات. هنا القرار الزماني هو معيار عينة واحدة لكل ثانية (1 هرتز)، ولكن يمكن أيضا أن تكون زيادة تواتر أخذ العينات لتتبع التغيرات السريعة في مقاومة ما يصل الى 25 هرتز (للZ-ثيتا). ملاحظة هامة: في وضع RTC يقاس فقط بئر واحد.
      ملاحظة: إذا micromotion بحاجة إلى أن يقاس في العديد من الآبار في وقت لاحق، انتقل إلى مساعدة> عناصر شريط الأدوات عرض الخبير / القائمة> ACQuire> متعدد حسنا RTC. تحديد الحد الزمني (ساعة) في قسم البيانات اجمع؛ سوف ECIS الآن قياس آبار مختارة في الترتيب العددي. بعد بدء قياس البرنامج سوف يطلب لتحديد أعداد دورات. أدخل القيمة لعدد المرات التي يحتاج القياس إلى أن يتكرر.
  6. لSFT وMFT، حدد الوقت الفاصل الزمني (ثانية) بين القياسات أو إذا كان بحاجة إلى البيانات التي سيتم الحصول عليها في أسرع وقت ممكن ترك هذا الخيار دون رادع.
    ملاحظة: للحصول على البيانات يستخدم الجهاز ECIS معدد للتبديل من بئر واحد إلى آخر مع الحد الأدنى من معدل اقتناء SFT 0.25 ثانية و 7.5 ثانية لMFT. وهذا يعني أن الفاصل الزمني يعتمد على عدد من الآبار والترددات المحددة. لإجراء قياسات على الخلايا المتكاثرة بطيئة أو تسجيل بسيطة من المقاومة مقابل الوقت، استخدم فترات من 600 ثانية أو أكثر.
  7. ابدأ الصحافة، اسم الملف وحدد موقع لتخزين البيانات.
    ملاحظة: يجب أن لا يكون حجم الملف العلاقات العامةoblem، حيث يتم حفظ البيانات ECIS في نوع من تنسيق نص عادي يسمى *. برنامج الجسر الأكاديمي، الذي لا يتجاوز عدة مئات ميغابايت حتى مع جميع الترددات القياس وعدد من الآبار المحددة.
  8. إيقاف تشغيل عن طريق الضغط على إنهاء.

4. متوسطة التغيير والتلاعب الخليوي

  1. الصحافة وقفة، وهذا سوف يتوقف الحصول على البيانات، ولكن لا تزال لتشغيل على مدار الساعة التجريبية.
  2. إزالة مجموعة من حامل والتلاعب به تحت مقاعد البدلاء تدفق الصفحي (أي تغيير المتوسطة).
  3. وضع مجموعة مرة أخرى في حامل وإما انقر فوق التحقق من اتصال أو استئناف تجربة لمواصلة الحصول على البيانات. برنامج القياس ووضع علامة الساعة في مجموعة البيانات.

5. تحفيز الحاد خلال الحصول على البيانات

ملاحظة: الخيار الثاني هو لمعالجة الخلايا خلال الحصول على البيانات لمتابعة تغييرات فورية. هذا ممكن فقطوعندما عينات لا يحتاج إلى أن يكون العقيمة في سياق مزيد من التجربة.

  1. إضافة التحفيز مباشرة إلى البئر والتأكد من مزج دقيق مع 200 ميكرولتر ماصة.
  2. الوقت علامة تشير يدويا عن طريق الضغط على الأقسام وإضافة تعليق.

6. إصابة الكهربائية

ملاحظة: العثور على الضبط الصحيح لنوع من الخلايا المستخدمة هي مفتاح للإصابة الكهربائية. إذا جرح قصيرة جدا وهذا يمكن أن يؤدي إلى إزالة كافية من الخلايا، في حين إذا جرح طويل جدا و / أو خشنة هذا يمكن أن تلحق الضرر الأقطاب (وخاصة على صفائف شفافة). لذلك، ينصح العديد من البقول جرح قصيرة. للثقافات HUVEC اثنين من 10-20 ثانية البقول إصابة طويلة من 5 فولت عند 60 كيلوهرتز كل تم العثور الأمثل باستخدام ECIS 1600R. عموما فمن المستحسن استخدام الترددات العالية> 20 كيلو هرتز للحفاظ على حقول عالية موحدة عبر الخلايا وتجنب أي ضرر على الأقطاب.

  1. أداء اصابة الدرجي على قياس ECIS نشطة.
  2. تمكين الجرح / إعداد Electroporate، ثم انقر فوق الجرح وملء الوقت (ثانية)، والجهد الجرح (V ل1،600 R) أو الحالية (أمبير لZ وZ-ثيتا) والتردد (هرتز). تستند القيم الافتراضية المعروضة على نوع الجهاز ومجموعة ECIS.
  3. حدد الآبار إلى الجرح في قسم "حسنا التكوين". سيتم فحص الجرحى الآبار فقط.
  4. تمكين تأخير حتى الساعة وشغل في تأخير الوقت لتنشيط وظيفة تأخير الجرح. يمكن إيقاف هذه الوظيفة في أي وقت عن طريق الضغط على إيقاف أو تطبيق الجرح يدويا. واحد فقط الأمر تأخير يمكن أن تكون نشطة في كل مرة.
  5. انقر فوق موافق وتنشيط الصحافة في نافذة منبثقة لبدء اصابة.
  6. تأكد من أن يسقط إشارة المقاومة إلى مقاومة تعويض بعد جرح، كرر خلاف ذلك جرح.

7. تحليل البيانات

  • تمثيل البيانات والمصدرة.
    1. القياس النهاية أو تحميل البيانات عبر تعيين ملف -> فتح.
    2. تحديد الآبار التي سيتم عرضها من "تكوين حسنا" نافذة. الآبار الفردية إلى تقديم مجموعة من المتوسط.
    3. اختارت معلمة ليتم عرضها من شريط الأدوات العلوي (Z، R أو C).
    4. حدد نوع الرسم البياني من شريط الأدوات العلوي (T = الوقت، F = تردد، وصمة عار 3D = الشلال).
    5. تحديد الرسم البياني ويقابل مجموعة مع المتزلجون تحت نافذة الرسم البياني أو ملء القيم بالضبط في الضوابط المجاورة.
    6. اختار من الأساسية "السلاسل الزمنية خيارات" في قسم "تحليل" لأداء الانحراف المعياري، على التوالي متوسط ​​أو تطبيع البيانات.
    7. تنشيط شريط الأدوات الخبراء في القائمة تعليمات للمزيد من عمليات متقدمة مثل Nyuist المؤامرة وتحول فورييه.
    8. استخدام "خيارات العرض" في قسم "تحليل" لتعريف رانجى من س و ص محاور وتصدير الرسم البياني.
    9. تصدير بيانات مختارة في ملف إكسل عن طريق ملف -> تصدير البيانات -> لإكسل (مختارة) واستخدام البرمجيات طرف ثالث من خيار لفي تحليل متعمق والإحصاءات والتمثيل حسب الحاجة.
  • نماذج من الروبيديوم وألفا.
    ملاحظة: للحصول على النمذجة فمن المستحسن استخدام خالية من الخلايا والمتوسطة شغل كذلك المرجعية.
    1. قياس الانتهاء من MFT MFT أو تحميل مجموعة البيانات.
    2. إذا مرجعا جيدا خالية من الخلايا هو الضغط المتاحة إما البحث لتحديد القيمة المرجعية أو محدد لتحديد الخلية نقطة وقت الفراغ يدويا من "التكرار. المسح الضوئي النمذجة" في قسم "تحليل" وتلقائيا.
    3. إذا كان هناك أي إشارة خالية من الخلايا، استيراد قيمة مرجعية من مجموعة بيانات أخرى. فتح مجموعة البيانات المرجعية (تأكد من أن نفس مجموعة والمتوسطة تم استخدام) واستخدام البحث أو محدد لتحديد القيمة المرجعية.ثم انتقل إلى البيانات المقاسة واضغط عليه.
    4. إذا لم يكن هناك بيانات مرجعية خالية من الخلايا تعيين استخدام المتاح الافتراضي المصنع.
    5. الصحافة نموذج لبدء العمليات الحسابية. النمذجة قد تستغرق عدة دقائق اعتمادا على حجم مجموعة البيانات.
  • حساب micromotion.
    ملاحظة: هذا الحساب ليس جزءا من برنامج القياس، ولكن لا يمكن أن يؤديها مع أي برنامج معالجة الإشارات.
    1. الانتهاء من قياس RTC RTC أو تحميل مجموعة البيانات.
    2. تطبيع البيانات التي وضعتها المقاومة وبلغ متوسط ​​الفترة بأكملها.
    3. كسر مجموعة البيانات إلى شرائح بطول 256 نقاط البيانات وتنظيف كل جزء من خلال نافذة هانينج.
    4. تشغيل فورييه تحول 256 نقطة ومتوسط ​​الناتج تردد الأطياف إلى 129 نقطة طيف الطاقة من جانب واحد للحد من الضوضاء العشوائية وتعزيز الإشارات البيولوجية.
    5. تردد مؤامرة ضد السعة في الرسم البياني سجل سجل وتطبيقالأقل تناسب خطي مربع.
    6. المنحدر من نوبة الخطي هو مقياس الضوضاء بشكل عام في إشارة وبالتالي micromotion من الخلايا.
  • Representative Results

    إنشاء تجربة بسيطة نسبيا وقياس في حد ذاته هو التلقائي بالكامل، ولكن كما هو الحال في كثير من الأحيان، والتحليل الصحيح وتفسير البيانات ذات أهمية حاسمة. في المقطع بيانات تمثيلية يتم توفير دليل لتفسير المعلمات أهم المقدمة من مقاومة التحليل الطيفي مع ECIS. وهذا يكون من المفيد أن تقرر لأي نوع من مشكلة علمية لقياس ECIS يمكن أن تكون مفيدة، والتي يجب أن تسجل المعلمات.

    عموما يمكن تقسيمها نموذجي تجريبي قراءة التدريجي في مرحلة النمو بعد التلقيح الخلية والتخلص الهضبة عندما تصل خلايا التقاء. كل مرحلة من هذه المراحل يعطي معلومات عن خصائص الخلوية المختلفة. ويرد قياس ممثل في الشكل 2 وينقسم إلى أربعة subphases لتحليل A) التصاق الخلية، ونشر وانتشار؛ ب) تشكيل لنضوج EC الحاجز؛ C) الهجرة الخلية بعد جيل كهربائيالجرح الله؛ وD) استجابة الخلايا لتحفيز مع وكيل ثرومبين فعال في الأوعية. تم الحصول على النقيض من المرحلة المناعي والصور مباشرة من القطب قياس خلال subphases مختلفة لتوضيح العلاقة بين التغطية الكهربائي، ووضع الخلايا، وسجلت إشارة مقاومة.

    التصاق، ونشر وانتشار

    كل نوع من الخلايا له التصاق ونمو منحنى طابعه التي يمكن التلاعب بها من خلال تغيير كثافة البذر، وطلاء مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية أو المنبهات الأخرى. واحدة من صعوبات كبيرة لدراسة هذه العمليات هو أن نفرق بين التصاق، ونشر وانتشار. فيجنر وآخرون 11 أعطى وصفا مفصلا لاستخدام مزيج من المقاومة والسعة للتمييز بين تلك المعلمات في الشكل 3 ويصبح من الواضح كيف المقاومة والسعة يمكن أن تكمل بعضها البعض. فمن المهم للدراسة التصاق ونشر لفهم تأثير تردد القياس، لأنه هنا المجال الكهربائي يؤدي إلى استقطاب غشاء الخلية من الخلايا في التعليق الأمر الذي يفرض على لتدفق الحالية حصرا حول الخلايا. عندما نعلق الخلايا أنها بداية لتقييد تدفق التيار من خلال نشر أكثر من الانخفاضات الكهربائي والسعة بطريقة خطية مع نسبة منطقة مفتوحة على القطب (منطقة كسور). وبالتالي، التصاق، ونشر وانتشار يمكن قياسها كميا أفضل، عند تسجيل السعة على تردد أعلى من 40 كيلو هرتز (الشكل 3B)، حيث الانخفاض في السعة هي مباشرة يتناسب مع التغطية القطب. بدلا من المقاومة عند ترددها القياس الأكثر حساسية هو مقياس مباشر للتمايز ونضوج الخلايا في حاجز متكدسة (الشكل 3A). بالإضافة إلى منطقة كسور، فيجنر وآخرون. قدم الاثنان الآخرانالمعلمات لتحديد التصاق وتغطية القطب: ر 1/2 (نصف الحد الأقصى السعة)، وهي المرة حتى يتم تغطية 50٪ من القطب مع الخلايا (الشكل 3B، الإدراج)، والمنحدر من منحنى السعة (س، لا معروضة) حيث إن معدل انتشار الخلايا وانتشارها.

    المقاومة كمقياس لجودة حاجز

    المقاومة هي جزء من مقاومة التي تصف نوعية الحاجز وظيفة أفضل، لأنه يهمل مكونات بالسعة من الغشاء، القطب والمتوسطة. هنا يتم استخدام نوعية حاجز المدى وليس النفاذية، منذ نفاذية هو في تعريف تعتمد فقط على الاتصالات خلية خلية. المقاومة ولكن يتم تحديدها من قبل قدرة الخلايا والخلايا خلايا والخلية مصفوفة تفاعلاتها لمنع تدفق التيار. أنواع مختلفة من الخلايا وفقا لذلك (استنساخ والممرات) لديها قيم المقاومة الخاصة بها (الشكل 4A). على الرغم من المقاومة يعطي الكثير من الحريهالإندوبلازمية فكرة عن حاجز خلية، ينبغي دائما أن تؤخذ بعين الاعتبار إشارة مقاومة.

    نماذج من الروبيديوم وألفا

    برنامج ECIS تؤوي سمة خاصة، والقدرة على تصميم نموذج معلمتين، التي تميز بين خلية خلية وخلية مصفوفة التصاقات (أرقام 4B و 4 C). RB (في سم 2 × أوم)، هو المقاومة من الاتصالات خلية خلية لتدفق الحالية، وبالتالي إجراء معكوس نفاذية الكلاسيكية. عالية الروبيديوم يعني نفاذية منخفضة نحو تدفق التيار. ألفا (في سم x 0.5 أوم)، هو مقياس للمساهمات مقاومة الناشئة عن تقاطعات خلية القطب. وقدم النموذج لتحديد خلية خلية وخلية مصفوفة الاتصالات 1991 Giaever وKeese ويقوم على افتراض أن خلايا دائرية، القرص على شكل الكائنات التي لها غشاء العزل، تحوم فوق القطب وتمتلئ إجراء بالكهرباء 2 . الالعازلة ممتلكات غشاء الخلية يترك ثلاثة مسارات فقط للتيار: أ) بين السطح البطني للخلايا والقطب، ب) بين الاتصالات خلية خلية، وج) من خلال الخلايا (مرجح فقط عند استخدام تردد قياس عالية ). A الاشتقاق أكثر تفصيلا وتوضيحا يمكن العثور عليها في أوراق لو وآخرون 3،12.

    Micromotion

    وقد تبين أن تقلبات صغيرة في إشارة المقاومة (الشكل 4A) ومن المقرر أن خفية والحركات خلية عشوائي في طبقات الخلايا متموجة وكذلك خلايا تتحرك داخل وخارج القطب في الثقافات متفرق 2. هذا الجانب من ECIS البيانات في الوقت بالطبع وصفها لو ومقابل وآخرون. 13،14 غالبا ما يتم تجاهله وأفضل ينظر عند قياس مع صفائف 1E على التردد والأكثر حساسية لحساب الفقرة والتحت خلوية المسارات الحالية. تسبب في حساب هذه الخلية الضوضاء (micromotion) ليست جزءا من اله قياس البرمجيات القياسية، على الرغم من أن في أحدث نسخة تم دمج تحويل فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس). تسجيل البيانات RTC مع تواتر أخذ العينات من 1 هرتز لمدة 1 ساعة على 4 كيلو هرتز ينص القرار كافية لحساب المفوضية الأوروبية micromotion. يوفر هذا الحساب قيمة واحدة واحدة، ويمكن استخدامها مباشرة لأغراض التحليل الإحصائي. ويمكن الاطلاع على مناقشة تمديد على استخدام تحليل التردد لmicromotion مكان آخر 15. بدلا من أن الاتحاد الفرنسي للتنس تحليل استراتيجيات أخرى يمكن استخدامها، مثل التباين من الزيادات. الفرق هو أكثر حساسية تجاه التغييرات الصغيرة في micromotion، ولكن بسبب هذه الحساسية يصبح المقارنة بين التجارب الفردية صعبة. المنحدرات من الطيف السلطة هي قياس أكثر قوة من micromotion (الشكل 4D). هنا المنطقة تحت منحنى يمكن اعتبار مبلغ micromotion أو الضوضاء الخلايا خلق. وبالتالي، فإن أكثر حدة المنحدر من طيف الطاقة أصغر المنطقة تحت المنحنىوأصغر micromotion.

    التئام الجروح الكهربائية مقايسة

    لدراسة هجرة الخلايا، يتم تطبيق الجروح عادة الميكانيكية التي كتبها خدش الخلايا قبالة لوحة الثقافة مع نصائح ماصة والمهمل الخلية أو الطوابع محددة ومتابعة remigration بهم مجهريا 16. هذه الطريقة لها مساوئ الواضح أن حجم الصفر يختلف وعادة ما يكون أكبر من أن تهمل تأثير انتشار الخلايا على عملية التئام الجروح. يستخدم الدالة اصابة من ECIS الجهد العالي، وارتفاع وتيرة النبض الكهربائي للحصول على خلية حرة ويلي لاحقا remigration من الخلايا المجاورة لتحل محل خلايا الموت (الشكل 5A). ميزة هذا الأسلوب الآلي على مستوى، والعمل المكثف المقايسات الصفر هو أن ECIS تنتج الجرح تكرار للغاية التي يبلغ قطرها 250 ميكرون الدقيق، الذي يغلق في غضون ساعات قليلة، لدراسة الهجرة النقي. علاوة على ذلك، نبضة كهربائية تفعلوفاق تقم بإزالة طلاء البروتين ويفرز المصفوفة خارج الخلية. في ظل افتراض أن الخلايا remigrate على القطب من جميع الجوانب، ويمكن بسهولة أن يحسب معدل الهجرة بقسمة نصف قطرها الجرح بواسطة الوقت اللازم لإغلاق الجرح 17. كبديل للإصابة الكهربائية، في الآونة الأخيرة وقدم ما يسمى طريقة السياج الكهربائي (لا يظهر). البقول الحالية المرتفعة هنا منع المرفقات وهجرة الخلايا على الأقطاب بعد التلقيح. الخلايا سوف تنمو في جميع أنحاء القطب القياس وبدء الهجرة إلى الداخل بمجرد تحول النبضات الكهربائية قبالة. الاستفادة من السياج الكهربائي على جرح الكهربائية هو أن سطح القطب لم يتم تعديلها من قبل نمو الخلايا أو إزالة الخلايا، وهو أمر مهم لقياس تأثيرات الطلاء المختلفة على الهجرة الخلية.

    تحفيز الخلايا

    بالإضافة إلى دراسة الهجرة الخلية، هي مناسبة تماما لمقاومة الطيفيقياس آثار المخدرات والسموم في الخلايا. يعرض الشكل 5B تجربة التحفيز / تثبيط الكلاسيكية، حيث كان يستخدم للحث على الثرومبين فرط النفاذية في متكدسة EC الحاجز نتيجة للانكماش الفجوة وتشكيل الخلايا، والتي كما يظهر انخفاض عابر في المقاومة . بواسطة حضن مسبق مع مثبط كيناز رو Y-27632 معظم استجابة الثرومبين يخف عن طريق خفض التوتر الخلية القاعدية 18 ومنع تشكيل الألياف الإجهاد 19. ثم تم استخدام كيناز رو مانع عند نقاط زمنية مختلفة بعد إضافة الثرومبين، مما يؤدي إلى الشفاء العاجل والكامل للحاجز EC. هنا ميزة نظام قياس مقاومة مستمرة لدراسة الاستجابات الخلوية الحادة يصبح واضحا. في المقايسات نقطة النهاية العادية (مثل تلطيخ المناعي أو جزيء مرور)، وهذا استجابة حادة لاستخدام مانع أن يكون من الصعب جدا إن لم يكن مستحيلا لكشف وتحديد. المهم هو أن نلاحظ أنه مع طقياسات mpedance يوصف نفاذية نحو الأيونات والجزيئات نحو لا. يرجى الرجوع إلى أمان وآخرون 20، حيث يتم توفير ممتازة مقارنة بين القياسات ECIS والتجارب جزيء مرور.

    الرقم 2
    الشكل 2. كانت تزرع القياس التمثيلي. MVEC على الجيلاتين المغلفة صفائف 8W1E مع كثافة البذر منخفضة من 5،000 خلية / سم 2 وأجري تسجيل MFT أكثر من 10 يوما. يوضح قياس مختلف قراءة الرافضة للتجربة ECIS: A) التصاق، ونشر وانتشار؛ ب) تشكيل ونضوج حاجز الخلية متكدسة؛ C) التئام الجروح بعد تطبيق جرح الكهربائية؛ D) مع التحفيز فعال في الأوعية وكيل الثرومبين. الأسهم تشير إلى اثنين المتوسطة المرطبات، والتي أجريت في فترات من 4 أيام وإعطاء فكرة عن حساسية تجاه المحفزات القياسات الميكانيكية والتغيرات في درجة الحرارة ودرجة الحموضة. الصور في أعلى لوحة تتوافق مع قياس وتم الحصول عليها مباشرة من القطب القياس. الصورة على النقيض من المرحلة على اليسار يبين الخلايا البطانية 24 ساعة بعد التطعيم، اعتبارا لتغطية القطب. الصور المناعي في الوسط وعلى اليمين الحاضر تلطيخ F-الأكتين طبقة البطانية متكدسة قبل وبعد التحفيز مع الثرومبين (1 يو / مل). الثرومبين يسبب انكماش الخلايا البطانية عن طريق تشكيل ما يسمى الألياف الإجهاد وفتح الثغرات عابرة بين البطانية (الأسهم وإدراج الصورة)، معترف بها في إشارة ECIS بواسطة انخفاضا في المقاومة الى الاساس. هنا حساسية القياس ويصبح من الواضح كيف يمكن للتغييرات في طبقة الخلايا ترتبط إشارة مقاومة.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 3
    الرقم 3. مرفق الخلية والنمو. MVEC من نفس المانحة والمصنف بثلاث كثافات مختلفة على الجيلاتين المغلفة صفائف 8W10E وتم تسجيل نمو الخلايا على ترددات متعددة لمدة 60 ساعة. A) المقاومة للقيم الشروط الثلاثة على التردد الأمثل لها من 4 كيلو هرتز لقياس تشكيل حاجز. أنشأت جميع الكثافات البذر ثلاثة حاجزا متموجة من كاليفورنيا. 1،200 Ω في نهاية القياس؛ معدلات الانتشار ولكن (سفوح المنحنيات) تختلف بشكل ملحوظ ب) قياس السعة في 64 كيلوهرتز يقدم رؤى على التصاق والانتشار. التصاق هو فيالمرحلة هضبة itial في منحنى السعة (ما بين 2-8 ساعة). الانتشار، والتي هي في علاقة خطية لتغطية الكهربائي، ويمثلها المنحدر من منحنى واكتمال بعد 10-30 ساعة اعتمادا على كثافة البذر. الوقت نقطة ر 1/2 (تغطية نصف الحد الأقصى) يمكن استخدامها لأغراض التحليل الإحصائي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 4
    الشكل 4. توصيف حاجز متموجة. اثنين من المانحين MVEC مع أرقام مرور مختلفة (مرور 3 و 6) والمصنفة على الجيلاتين المغلفة صفائف 8W1E وتم إجراء قياس لمدة 30 ساعة MFT لتوصيف حاجز EC. A) المقاومة تكشف القياسات التي المتبرع الأصغر 1 ديه مقاومة أعلى من كاليفورنيا. 11،000 Ω بالمقارنة مع كاليفورنيا. 7،500 Ω الجهة المانحة الأكبر سنا 2. قبل الميلاد) وقدرات النمذجة من ECIS تم استخدامها للعثور على سبب للمقاومة أقل. كشفت النمذجة قابلة للمقارنة التفاعل خلية خلية الروبيديوم وأشارت إلى ضعف الخلية مصفوفة التفاعل ألفا كسبب محتمل. D) تم تنفيذ RTC لتحديد micromotion داخل طبقة الخلايا متموجة من قبل فورييه التحول، حيث المنطقة الواقعة تحت منحنى يتناسب مع micromotion . تحليلات الأطياف يظهر micromotion أقل من الجهة المانحة الأكبر سنا 2 وبالتالي دعم ما يمكن بالفعل أن يفترض من إشارة المقاومة (أقل الفرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    5 "FO: محتوى العرض =" 5IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/>
    الرقم 5. الهجرة الخلية بعد اصابة الكهربائية وآثار التحفيز الثرومبين. أجريت التسجيلات الممانعة في 4 كيلو هرتز مع القرار الزماني القصوى. تم استخدام) MVEC المانحة 1 في مرور 3 و 2 المانحة في مرور 6 على الجيلاتين المغلفة صفائف 8W1E ونمت لالتقاء. ثم تم إنشاء الجرح الكهربائية عن طريق تطبيق اثنين من 5 الخامس البقول في 60 كيلوهرتز مع مدة 20 ثانية لكل منهما. أظهرت المانحة الأصغر 1 الجرح أفضل القدرات استنادا إلى إغلاق الجرح بشكل أسرع (الهجرة، وسفوح المنحنيات) الشفاء ومقاومة أعلى بعد اصابة في المقارنة إلى الجهة المانحة الأكبر سنا 2. B) كانت تزرع على HUVEC الجيلاتين المغلفة صفائف 8W10E. عند التقاء الخلايا تم تجويع المصل لمدة 1.5 ساعة عن طريق استبدال مستنبت كاملة مع متوسطة القاعدية بالإضافة إلى 1٪ ألبومين المصل البشري (HSA). لناسن متوسطة عادي مع HSA هو خطوة حاسمة، لأن مكونات المصل منع استجابة الثرومبين. حالما تم الكشف عن هضبة المقاومة مستقرة، وأضاف الثرومبين مباشرة إلى الآبار ومختلطة بعناية مع 200 ميكرولتر ماصة. تأثير الثرومبين القصوى مرئيا بعد 30 دقيقة، والتي تتميز بانخفاض عابرة في مقاومة خط الأساس وكاليفورنيا. انخفاض 30-50٪ المقاومة بعد الشفاء. تم preincubated الخلايا إما مع رو كيناز مانع Y-27632 لمدة 30 دقيقة أو مانع تم إضافة 20، 30، أو 40 دقيقة بعد إضافة ثرومبين، والتي تقلل من تأثير الثرومبين على الفور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم .

    Discussion

    ECIS هو أداة ممتازة لفحص خصائص الخلية والسلوك وكذلك لتقدير آثار المواد المعروفة وغير المعروفة. وبالتالي تقام الخلايا تحت الظروف القياسية الثقافة، مقاومة يمكن أن تراقب باستمرار مع القرار الزماني عالية وربطها الإشارات الضوئية. بهذه الطريقة نقطة الوقت الأمثل للتلاعب خلية يمكن اختيار على أساس الوضع الخلية المورفولوجية والوظيفية. للأسف، هذا القرار يأتي مع قياس عالية الثمن الذي تغييرات طفيفة في درجة الحرارة، ودرجة الحموضة أو التحفيز الميكانيكي للخلايا (تغيير المتوسطة) سوف تؤثر على إشارة مقاومة الفور.

    تطبيق القياس الحالي صغيرة لخلايا يجعل قياس ECIS موسع، غير تدميري، وخالية من التسمية، ولكن نتيجة لذلك فقط خصائص bioelectrical السلبي يمكن قياسها (أي إمكانات العمل). ومن السمات الرئيسية هي أن عددا من المعلمات يمكن أن يكون دير IVED من قياس واحد، والجمع بين المعلومات من عدة فحوصات الكلاسيكية، مثل النفاذية أو المقايسات التئام الجروح. هنا جانب معين للاهتمام هو أن البيانات غرار رياضيا يمكن استخدامها لاستكشاف التغيرات في المقاومة والسعة وإحالتهم إلى الهياكل الخلوية متميزة (مثل خلايا الأسماء أو غشاء الخلية). المهم هو أن نلاحظ أن مقاومة الطيفي يوفر دائما إشارة متوسط ​​من جميع الخلايا على القطب الاستشعار عن بعد، والتي لا تسمح للدراسات على الخلايا واحد وأيضا نموذج رياضي صالحة فقط في طبقات الخلايا متموجة. ولذا ينبغي أن تعقد الخلايا البطانية في ولاية متكدسة ليوم واحد على الأقل قبل استخدامها للنمذجة لضمان ناضجة الخلايا وخلايا التصاقات هادئة. وبالمثل، ينبغي أن تطبق الجروح الكهربائية فقط إلى طبقات متموجة الخلية متعددة باستخدام نبضات جرح قصيرة مع الترددات العالية، لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة وجرح منع الضرر من الأقطاب الكهربائية.

    jove_content "> للحصول على كمية ممكنة من المعلومات من قياس ECIS، كما هو الحال في كل فحص، العديد من المعلمات مثل الجمع بين مجموعة الركيزة، والطلاء وكثافة البذر لنوع من الخلايا الفردية تحتاج إلى اختبارها والأمثل أمام التجربة.

    وجود قيود كبيرة من ECIS هو أن القياس لا تقدم معلومات مباشرة على المستوى الجزيئي. وبالتالي قياسات ECIS وعادة ما تكون أكبر قدر من المعلومات في بداية سلسلة التجريبية للمساعدة في ربط مشكلة علمية مع الهياكل الخلوية أو خصائص وتوفير مدخلات هامة لتوليد فرضية قابلة للاختبار. وبالتالي فإن تصميم وحدات من ECIS يوفر مجموعة واسعة من التطبيقات مع إمكانية مصممة خصيصا المصفوفات. تشير آخر التطورات مجموعة التركيز في المستقبل على إنتاجية عالية مقاومة للعروض تكاثر الخلايا وجرح الكهربائية وتقدم صفائف تدفق خاصة لمحاكاة في الجسم الحي

    مزيد من الأدب
    يرجى الرجوع أيضا إلى صفحة ويب الفيزياء الحيوية التطبيقية (www.biophysics.com) لتطبيق مذكرات، ندوات وقائمة مفصلة من المطبوعات التي تغطي الطيف ECIS بأكمله.

    Disclosures

    تغطية التطبيقية الفيزياء الحيوية شركة الرسوم النفاذ المفتوح، في حين بقيت هيكل ومحتوى المادة المسؤولية الكاملة للمؤلفين.

    Acknowledgements

    فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور تشارلز Keese، الدكتور كريستيان Renken، كريستيان Dehnert (التطبيقية الفيزياء الحيوية وشركة)، والدكتور أولف Radler (ibidi شركة محدودة) لنصائحهم، ومساعدة ومناقشات مثمرة خلال إعداد هذه المخطوطة. مزيد نود أن نشكر يان فان بيزو لدعمه فنية ممتازة.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    ECIS Zθ Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W1E PCB Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W1E Lexan Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W10E PCB Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    L-Cystein Merck Millipore 102838
    Gelatin Merck Millipore 104070
    Bovine Thrombin Merck Millipore 604980
    Albuman (Human Serum Albumin) Sanquin
    Y-27632 Tocris Biosciences 1254
    EGM-2 BulletKit  Lonza CC-3162
    Pen/Strep Lonza 17-602E

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, (6455), 591-592 (1993).
    2. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, (17), 7896-7900 (1991).
    3. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Cell-substrate contact: another factor may influence transepithelial electrical resistance of cell layers cultured on permeable filters. Exp. Cell Res. 250, (2), 576-580 (1999).
    4. Wegener, J., Sieber, M., Galla, H. J. Impedance analysis of epithelial and endothelial cell monolayers cultured on gold surfaces. J. Biochem. Biophys. Methods. 32, (3), 151-170 (1996).
    5. Pänke, O., Balkenhohl, T., Kafka, J., Schäfer, D., Lisdat, F. Impedance spectroscopy and biosensing. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 109, (11/2007), 195-237 (2008).
    6. Wegener, J., Zink, S., Rösen, P., Galla, H. Use of electrochemical impedance measurements to monitor beta-adrenergic stimulation of bovine aortic endothelial cells. Pflugers Arch. 437, (6), 925-934 (1999).
    7. Eker, B., Meissner, R., Bertsch, A., Mehta, K., Renaud, P. Label-free recognition of drug resistance via impedimetric screening of breast cancer cells. PloS ONE. 8, (3), (2013).
    8. Nacke, T., Anhalt, M., Frense, D., Beckmann, D. Anwendungsmöglichkeiten der Impedanzspektroskopie in der Biotechnologie (Application of the Impedance Spectroscopy in the Biotechnology). Technisches Messen. 69, (1/2002), 12-18 (2002).
    9. DePaola,, et al. Electrical impedance of cultured endothelium under fluid flow. Ann. Biomed. Eng. 29, (8), 648-656 (2001).
    10. Pietrosimone, K. M., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis. J. Vis. Exp. (62), (2012).
    11. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Exp. Cell Res. 259, (1), 158-166 (2000).
    12. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys. J. 69, (6), 2800-2807 (1995).
    13. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Monitoring motion of confluent cells in tissue culture. Exp. Cell Res. 204, (1), 102-109 (1993).
    14. Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, (8), 2625-2629 (2009).
    15. Szulcek, R., Beckers, C. M. L., et al. Localized RhoA GTPase activity regulates dynamics of endothelial monolayer integrity. Cardiovasc. Res. 99, (3), 471-482 (2013).
    16. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, (2), 329-333 (2007).
    17. Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, (6), 1554-1559 (2004).
    18. Krishnan, R., Klumpers, D. D., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 300, (1), 146-154 (2011).
    19. Van Nieuw Amerongen, P. G., van Delft, S., Ma Vermeer, M., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases. Circ. Res. 87, (4), 335-340 (2000).
    20. Aman, J., et al. Effective treatment of edema and endothelial barrier dysfunction with imatinib. Circulation. 126, (23), 2728-2738 (2012).

    Comments

    1 Comment

    1. The video is not working before procedure discription.

      Reply
      Posted by: Atiya S.
      August 31, 2015 - 2:16 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats