Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Bioengineering

חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

1, 1, 2

1Department of Pulmonary Diseases, Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center, 2Department of Physiology, Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE
     

    Summary

    פרוטוקול זה מסוקר Cell-מצע חשמלי עכבת חישה, שיטה להקליט ולנתח את ספקטרום העכבה של תאי חסיד לכימות של התקשרות סלולרי, התפשטות, תנועתיות, ותגובות תאיות לגירויים תרופתיים ורעילים. זיהוי של חדירות האנדותל והערכה של קשרים בין תאים ותא מצע מודגשים.

    Date Published: 3/28/2014, Issue 85; doi: 10.3791/51300

    Cite this Article

    Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility. J. Vis. Exp. (85), e51300, doi:10.3791/51300 (2014).

    Abstract

    Cell-מצע חשמלי עכבת חישה (ECIS) היא מערכת מדידת עכבה במבחנה לכמת את התנהגותם של תאים בתוך שכבות תאים חסיד. לשם כך, תאים גדלים בתאי תרבות מיוחדים על גבי אלקטרודות זהב יריבה, מעגליות. זרם חילופין קטן מתמיד מוחל בין האלקטרודות ואת הפוטנציאל על פני נמדד. תכונות הבידוד של קרום התא ליצור התנגדות לזרימת הזרם החשמלית וכתוצאה מכך פוטנציאל חשמלי גדל בין האלקטרודות. מדידת עכבה סלולרית באופן זה מאפשרת הלימוד האוטומטי של קובץ מצורף תא, צמיחה, מורפולוגיה, פונקציה, ותנועתיות. למרות שמדידת ECIS עצמו היא פשוט וקל ללמידה, התאוריה הבסיסית היא מורכבת והבחירה של ההגדרות הנכונות וניתוח ופרשנות של נתונים נכונים היא לא מובן מאליו. עם זאת, פרוטוקול ברור המתאר את הצעדים הבודדים מניסיוניעיצוב להכנה, מימוש, וניתוח של הניסוי אינו זמין. במאמר זה את עיקרון המדידה הבסיסי, כמו גם יישומים אפשריים, שיקולים ניסיוניים, יתרונות ומגבלות של מערכת ECIS הם דנו. מדריך מסופק לחקר מצורף תא, הפצה והתפשטות; כימות של התנהגות תא בשכבה ומחוברות, בכל קשור לתפקוד מחסום, תנועתיות תא, איכות של הידבקויות תאי תאים ותא מצע; וכימות של ריפוי פצע ו תגובות תאיות לגירויי vasoactive. נציג תוצאות נדונות מבוססות על כלי הדם אנושיים (MVEC) ותאי האנדותל וריד טבור אנושיים (HUVEC), אך חלות על כל התאים הגדלים חסיד.

    Introduction

    ΩΩΩHere אנו מציגים Cell-מצע חשמלי עכבת חישה, המכונה ECIS, שיטה מסוימת כדי למדוד ולנתח את ספקטרום העכבה של תאים חסיד בתרבות 1. מטרת פרוטוקול זה היא להציע מדריך בדרך כלל ישים עבור השימוש בסוג מסוים של מבחני סלולריים עכבה מבוססת ולספק פרוטוקולים לחלק מפונקציות מפתח מהמספר הולך וגדל ללא הרף של יישומים. הדגש יהיה על הלימוד של התפשטות תאים, תפקוד מחסום, צמתים תא, ותנועתיות תא.

    מאז ECIS והמודל הקשורים אליו כדי להמיר את נתוני ספקטרוסקופיה העכבה בפרמטרים רלוונטיים מבחינה ביולוגית הוצג בצורתו הנוכחית לקהילה המדעית על ידי Giaever וKeese ב1991 2, זה פעמים רבות המכונה מערכת למדידת Teer (טראנס אפיתל התנגדות חשמלית), וזה לא מדויק. ההבדלים נראים בהתחלה שולי, אבלחשובים לפרשנות הנתונים. למדידות Teer קלאסיות, תאים גדלים על מסננים חדירים לאפיין מנגנוני הובלת paracellular, הנשלטים על ידי צמתים הדוקים אפיתל או צמתים adherens אנדותל 3. בדרך כלל, שתי אלקטרודות ממוקמות מעל ומתחת למסנן משמשות להחלת זרם ישר (DC) לזרום על פני שכבת התאים ושתי אלקטרודות אחרות כדי למדוד את הירידה במתח וכתוצאה מכך 4. ההתנגדות החשמלית מחושבת לפי חוק אוהם, המאפשר תיאור מספרי של האיכות של גדר התא.

    ECIS כדלקמן העיקרון הבסיסי הזה ומרחיב אותו. במערכת ECIS, תאים גדלים על, אלקטרודות זהב מעגליות מנוגדות אשר מוטבעות בחלקו התחתון של מנות תרבית תאים מיוחדות. מספר אלקטרודות לתרבות גם הוא משתנה, תלוי ביישום ויש לי אלקטרודות בקוטר סטנדרטי של 250 מיקרומטר, במקרים מסוימים האלקטרודה נגדית גדולה יותרמשמש כדי להשלים את המעגל. ECIS משתמש בזרם קבוע חילופין (AC) של μA 1 עם תדר נתון במקום זרם ישר. העכבה מחושבת מהשינויים המקביל במתח (בmV) בין האלקטרודות. ECIS מציע את האפשרות למדוד את העכבה על פני טווח של תדרים כדי ללמוד מאפייני תדירות תלויים סלולריים, שבו יש מספר יתרונות על פני Teer, ויוסברו בפירוט במאמר זה. ראשית, מדידת עכבה מורכבת מאפשרת להפריד את העכבה הכללית להתנגדות מחסום תא וקיבול תא. בנוסף, על ידי לקיחת נתונים בתדרים מרובים והחלת מודל מתמטי, אפשר להבחין בין עכבת junctional (אטימות של אנשי קשר תאי תאים) ועכבה שנגרמה על ידי אינטראקציות תא מצע (מרחק של קרום של תאי בסיס למטריקס בסיס), כמו גם התרומה של קיבול קרום תא. שנית, ניתן להעריך התפשטות תאים ותנועתיות, שכן התאים נמצא בקשר ישיר עם אלקטרודות. שלישית, מצע ואלקטרודות דקים מספיק כדי לאפשר לשדה בהיר ומיקרוסקופ לעומת שלב.

    בסיס של מדידות עכבה: העכבה המורכבת

    הבסיס למדידת העכבה החשמלית של אובייקטים ביולוגיים (למשל תאים) הוא חוק אוהם, עיקרון בסיסי אלקטרו טכני, המתאר את הקשר בין ההתנגדות (R), זרם (אני) ומתח (U) במעגל חשמלי בכל זמן נתון (t).
    החלים במעגל DC: R (t) = U (t) / אני (לא)

    כאשר עובדים במערכת AC, מתח וזרם שונה לא רק במשרעת שלהם, אלא גם בשלב שלהם (φ). עכשיו, התנגדות היא כבר לא מספיק כדי לתאר את היחסים הללו. במקום זאת, העכבה המורכבת (Z) או ברוב המקרים סדר הגודל של העכבה (| Z |) נמצא בשימוש, המכיל את ההתנגדות שתוארה קודם לכן ohmic תוספת reactance (X), אשר מחדשתירררוצים מAC לזרום דרך קבלים וסלילי הנהיגה פאזה בין המתח ו5 הנוכחיים.
    החלים במעגל AC: | Z (ו) | = √ (R 2 + X (ו) 2)
    φ = arctan (X / R)

    בעת ביצוע מדידות עכבה על תאים שלמים, בשל המאפיינים של הממברנה שלהם, תאים לפעול כחיבור מקביל של נגדים וקבלים. כאן, התנגדות מייצגת את ההתנגדות לזרימת זרם, ואילו קיבול (C) מתאר את ההפרדה של נשאים חשמליים בדו שכבתי הבידוד של קרום התא, שגורם לקיטוב של התא. כך X נשלט על ידי מאפייני קיבולי של קרום התא.
    X (f) ≈ (ו Cell C * Pi * 2) -1

    מאז X הוא תדירות תלויה, וריאציה של תדירות המדידה מאפשרת חקר תכונות תפקודיות ומבניות שונות של התא. צעדי המכשיר ECIS שני R ו-X, המאפשר חישובמ| Z |, C ו-φ.

    כימות שכבות תאים שלמים עם ספקטרוסקופיה עכבה: המעגל השקול החשמלי.

    כפי שהוסבר בעבר, כאשר תא הוא הביא לתוך שדה חשמלי, זה מראה מאפיינים של רכיבים אלקטרוניים פסיביים. אם עכשיו, במקום תא בודד, שכבת תאים שלמה גדלה על גבי אלקטרודות שיושלם עם תרבית תאים בינוני הוא נחקר, המודל הפשוט של הנגד וקבל צריך להיות מורחב לכל מערכת חשמל. במעגל מקביל זה מה שנקרא, התנגדות של מדיום התרבות (R Med), כמו גם קיבול (C Electr) והתנגדות (R Electr) המאפיין את האינטראקציה אלקטרודה / אלקטרוליט צריך להילקח בחשבון 3,6.

    ניתן למצוא דוגמא פשוטה, כללית של מעגל שווה ערך כזה לשכבת תאי חסיד גדל באיור 1. היתרון של כזה מתמטיpproach לתאר מערכת ביולוגית הוא שיכולים להיות כרצונך מודעה מעודן מעגלים אלה והותאמו לשאלות הניסוי הספציפיות, למשל על ידי שוקל עכבה שנגרמה על ידי האברונים התוך תאי או להבחין השפעות של תאי תאים (R Junc) והידבקויות תא מצע (R Sub) ב7,8 עכבה הכולל. עם זאת, במטרה לדוגמנות תמיד צריכה להיות להשתמש במספר הקטן ביותר של גורמים המתארים את כל התכונות של ספקטרום העכבה נמדד כדי לאפשר מתאמים משמעותיים.

    איור 1
    איור 1. סכמטי של מערכת ECIS מעגל שווה ערך נציג לשכבת גידול תאים חסיד.) חתך של תרבות ECIS כן. התאים גדלים על גבי האלקטרודה חישה ודלפק ומחדש מכוסה במדיום לתרבות. אלקטרודות מחוברות למגבר נעילה ובאות AC מיושמת באמצעות הנגד MΩ 1 כדי ליצור מקור זרם קבוע. ניתן להוסיף גירויים ישירות למדיום התרבות בכל נקודה בזמן. ב ') צעדי ECIS הסכום של כל התרומות בודדות לעכבה. התנגדות של מדיום התרבות (R Med), כמו גם עכבה שנגרם על ידי ממשק אלקטרודה / אלקטרוליט, שהוא בפשטות שהוצגה כשילוב מקביל של הנגד (R Electr) וקבלים (C Electr), וגם את התכונות חשמליות של קרום התא, שתואר על ידי חיבור מקביל של התנגדות (Cell R) וקיבול (C ממ), כל צריכים להילקח בחשבון. תא R הוא משתנה, שכן הוא תלוי בחדירות התא לכיוון הנוכחי. המעגל השקול ניתן להאריך וכרצונך מודעה מעודן. כדוגמא junctional (R Junc) כמועמידות גם subendothelial כ( R Sub) נוספו למעגל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    פרמטרים עכבה ומשמעותם הביולוגיות

    שני פרמטרים ישירים ביותר הנגזרים ממדידות עכבה הם התנגדות וקיבול של תאים. התנגדות מייצגת איכות ותפקוד של המחסום הנייד ולכן לוקחת בחשבון את ההתנגדות כלפי para-וזרימה נוכחית טרנס סלולארי. קיבוליות מספקת מדד כולל של כיסוי האלקטרודה. התכונה הייחודית של ECIS היא כי בעזרת מעגלים מקבילים ודוגמנות פרמטרים הגלובליים אלה מספקים תובנות על נכסים רבים יותר סלולריים, ובכלל זה הידבקויות תאי תאים ותא מצע, אשר יידונו בהמשך מאמר זה.

    לפני שמתחיל: conside הניסוייתמנות

    הגדרת מדידה - ההתקנה מורכבת מכמה רכיבים נפרדים: מכשיר ECIS עם אלקטרוניקה מדידה; מחשב עבור רכישת נתונים, בעל מערך ל8 - או מערכת 96 היטב; מערכי ECIS ותרבית התאים של בחירה. בעל המערך חייב להיות ממוקם באינקובטור ומחובר למכשיר ECIS מחוץ לחממה. המחשב צריך להיות מצויד עם תוכנת ECIS (14th 1.2.123.0 פברואר 2013), ומחובר למכשיר ECIS.

    מבחר מגוון - יש מגוון גדל ברציפות של מערכי ECIS, תוכננו עבור יישומים מרובים. המערכים סטנדרטיים הם 8W1E ומערכי 8W10E, אשר מורכבים של 8 בארות תרבות (מסומן על ידי W) הכוללות אלקטרודות 1 או 10 מדידה (מסומן על ידי E), בהתאמה. האלקטרודה נגדית גדולה משלימה את המעגל, אבל העכבה שלה היא למעשה זניחה במדידה בפועל -6. בעל המערך 8 היטב הסטנדרטי יכול לארח שניrrays, וכתוצאה ממספר כולל של 16 בארות תרבות. אלקטרודות הזהב הן 50 ננומטר עבים, שמסומן עם סרט בידוד ורכוב על או מצע ברור אופטי Lexan פוליקרבונט או מעגלים מודפסים (PCB). מערכי PCB הם חזקים יותר ועלות יעילה. השקופיות שקופות מאפשרות לאור ומיקרוסקופיה immunofluorescence מה יש לקחת בחשבון הוא שמערך 1E משפר תנודות באות העמידות נגרמת על ידי תנועות תא ונחוץ ללימודי ריפוי פצע. בנוסף, אלקטרודות יחידה לאפשר התאמה של אותות חשמליים ואופטיים. במערכי האלקטרודה הרב, האות היא בממוצע על פני כמה אלקטרודות, אשר בשל אזור המדידה המוגבר כוללת יותר תאים במדידה, מגביל הטיה של הנתונים על ידי חיסון וצמיחה של התאים לא אחידים ומפחיתה טשטוש של האות עקב תא תנועות. לכן, מערכי האלקטרודה הרב שימושיים ללמוד התפשטות תאים והיווצרות מכשול. לידמערכים סטנדרטיים יש מערכים מיוחדים זמינים עבור היישום של מאמץ הגזירה 9, ללמוד chemotaxis 10, נדידת תאים, והפצה כמו גם צלחות 96 היטב להקרנות תפוקה גבוהה. לסיכום, המערך לשמש תלוי מאוד על שאלה מדעית וסוג תא ויש לבחור ונבדק בקפידה.

    תדירות מדידה - הדוגמנות של Rb אלפא (ראה ניתוח נתונים) דורשת מדידות רבת תדר (MFT). אחרת עכבה ניתן למדוד לאורך זמן בתדר אחד לסוג תא מסוים (SFT), עם היתרון שנתונים ניתן לאסוף ברזולוציה הטמפורלית גבוהה יותר. ניתן למצוא את תדירות המדידה רגישה ביותר לסוג תא מסוים על ידי סריקות תדר. בעת התוויית עכבת בהתאמה התנגדות לעומת תדירות בגרף את תדירות יומן-log שבו ההבדל בין התאים חופשיים ואלקטרודה מכוסה תא הוא הגדולים ביותר הוא התדר שבו התאים לחסום tהוא הנוכחי בצורה היעילה ביותר. במקרה של תאי האנדותל (EC) בתדר זה בכ 4 קילוהרץ.

    צפיפות זריעה - כמו בכל רגילה צפיפות זריעת ניסוי מבוסס תאים תלויה בבעיה המדעית. כאשר לומדים הידבקות והפצה או היווצרות מכשול, צריכים להיות שנזרעו תאי האנדותל עם צפיפות גבוהה של 40,000-60,000 תאים / 2 סנטימטר כדי להבטיח מחוברות, מחסום יציב לאחר 48 שעות. אם המוקד של הניסוי הוא, על התרבות, צריכים להיות שנזרעו תאי האנדותל עם צפיפות נמוכה של כ 2,000-10,000 תאים / 2 סנטימטר.

    Protocol

    1. הכנה של מערכת המדידה

    1. Prewarm בעל המערך בחממה ל37 מעלות צלזיוס לפני שמתחיל את הניסוי כדי למנוע התעבות.
    2. מלא ארון מים של החממה עם מים מזוקקים כדי למנוע ייבוש של הבארות.
    3. לבצע את כל המניפולציות על תאים ומערכים בזרימה למינרית בתנאים סטריליים.

    2. הכנת מערכים וההרכבה של תאים

    הערה: מערכי ECIS צריכים לנקות והתייצבו לפני ניסוי כדי למנוע סחיפת אלקטרודה, כדי לשפר את שחזור ויחס אות לרעש להיטב היטב. לכן שתי אפשרויות זמינות: א) טיפול מקדים של האלקטרודות עם L-ציסטאין ו-B) פונקצית ייצוב ECIS.

    אפשרות א ': L-ציסטאין מומלץ כטיפול המקדים העקבי ביותר, אבל אולי בכמה מקרים מיוחדים אינטראקציה עם coatin חלבוןgs על האלקטרודות. הכרכים שהוצגו משמשים למערכי 8 היטב סטנדרטיים.

    1. הוסף 200 μl / גם L-ציסטאין 10 מ"מ. ציסטאין מנקה ומשנה את פני השטח האלקטרודה מתן קיבול האלקטרודה גבוה ושחזור.
    2. דגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT).
    3. לשטוף פעמיים 500 μl / היטב עם מים טהורים לחלוטין (סוג 1). אל תשתמשו במאגרי פוספט, אשר יכול להפריע לספיחה של חלבונים מסוימים. כמו כן להימנע מפתרונות המכיל סרום לפני הציפוי, שכן משטח הזהב יהיה לספוג מקרומולקולות הראשונה הביאה במגע.
    4. מעיל עם ג'לטין 1% 200 μl / גם חם.
    5. דגירה 30 דקות ב 37 ° C.
    6. הסר ג'לטין, אבל אל תיתן לי יבש פני השטח. זה יכול לגרום נזק לאלקטרודות.
    7. שטפי פעם עם מים טהורים לחלוטין (סוג 1).
    8. להוסיף 400 בינוני μl / גם מלא תרבית תאים (המכיל סרום, אנטיביוטיקה וכל גורמי הגדילה).
    9. מערך שקופיות לבעל מערךד לוודא כי המערך ממוקם כך שרפידות כיכר זהב תשע הם פנו כראוי על ידי סיכות פוגו קפיץ ויד בורג ההתאמה לתקן הדוקה. תיזהר עם מערכים שקופים, יכולה בקלות להיפגע שכבת הזהב.
    10. פתח את תוכנת מדידה ועיתונות ההתקנה אחרי עזיבה בסעיף "איסוף נתונים" כדי לבצע מדידת עכבה מהירה של כל אחד גם בודד. הערכים שהתקבלו הם בסיס המדידה ויהיה באופן אוטומטי להיות מאוחסן ב" הערות ".
    11. הסימון גם יקבע באופן אוטומטי את הסוג של מערכי ECIS בשימוש. ודא מערכים שנבחרו בסעיף "ובכן התצורה".
    12. תרשים המערך נדלק ירוק לבארות מחוברים כראוי ואדומים לבארות מחוברות ריקות או שגויות. ובכל זאת, תמיד לוודא כי המערכים הונחו כראוי בבעל.
      הערה: יש לי מערכי 8W1E ECIS אם ניקוי וציפוי היו מוצלחים acapacitance של כ -5 nF ומערכי 8W10E של 50 NF, שתוצאתה בהתנגדות בסיסית של כ -2,000 ו200 Ω, בהתאמה.
    13. הסר את המערך מבעל.
    14. תאי זרע כהשעית תא בודדת ב400 בינוני תרבית תאי μl / גם מלא.

    אפשרות ב ': פונקצית ייצוב ECIS יכולה לשמש כתחליף או בשילוב עם טיפול L-ציסטאין ואם בעיות עם נדידת האלקטרודה או הבדלים גדולים בהתנגדות וקיבול ל היטב היטב להתרחש.

    1. בצע טיפול ציסטאין (אופציונלי) ואלקטרודות precoat עם חלבון (אופציונלי).
    2. הוסף 200 μl / טוב של מדיום להשלים היטב כל אחד ולמקם את המערך בבעל המערך.
    3. תוכנת מדידה פתוחה ולחץ על התקנה ואחרי עזיבה לברר את המערך מחוברת כראוי ולמדוד Z הראשוני, R, ו-C
    4. לייצב את האלקטרודות על ידי לחיצה (CA. 3 mA), בתדירות גבוהה (64 קילוהרץ) דופק כדי לנקות את האלקטרודות.
    5. בדקו אלקטרודות שוב. הקיבול צריך להיות מוגבר וערכי התנגדות צריכים להיות בטווח דומה.
    6. אם ערכי קיבול והתנגדות הם עדיין אינו משביעת רצון, חזור על ההתייצבות.
    7. הסר את המערך מהמחזיק ולחסן תאים.

    3. הגדרת מדידת תוכנה ורכישת נתונים

    1. הנח את המערך בבעל המערך כמתואר בעבר.
    2. תוכנת מדידה פתוחה ולחץ על כפתור ההתקנה בסעיף "איסוף נתונים" כדי לחבר את תוכנת ECIS למכשיר ECIS ולהפעיל עוד ובדקו.
    3. ודא מערכים שנבחרו בסעיף "ובכן התצורה".
    4. בחר את הבארות להימדד "ובכן Configuratסעיף יון ".
    5. בחר את מצב המדידה מהאפשרויות "איסוף נתונים":
      1. לסדרת זמן בתדירות קבועה, בחר תדר יחיד. / שעה (SFT), ובוחר את תדירות המדידה מתפריט הנפתח.
      2. למדידה של כיסוי אלקטרודה ודוגמנות של Rb, ואלפא, בחר תדר מרובה. / שעה (MFT). מכשיר ECIS יהיה למדוד באופן אוטומטי בכל התדרים הזמינים.
      3. לmicromotion (ראה ניתוח נתונים) בחר ראפיד זמן איסוף (RTC) ולהתאים את תדירות מדידה ותדירות דגימה. הנה הפתרון הזמני הסטנדרטי הוא דגימה אחת לשנייה (1 הרץ), אך תדר דגימה יכול גם להיות מוגבר כדי לעקוב אחר שינויים מהירים בעכבה עד 25 הרץ (עבור Z-תטא). הערה חשובה: במצב RTC רק טוב אחת נמדדת.
        הערה: אם micromotion צריך להימדד בכמה בארות בהמשך, עבור אל עזרה> פריטי סרגל כלים מומחה הצג / תפריט> ACQuire> Multi-ובכן RTC. לציין את מגבלת הזמן (שעות) בסעיף נתוני אסוף; ECIS החברה ימדוד את הבארות שנבחרו לפי סדר מספרים. לאחר תחילת מדידת התוכנה תבקש ממך לציין את מספרם של מחזורים. הזן את הערך עבור תדירות המדידה צריכה להיות חוזרת ונשנית.
    6. לSFT ו MFT, בחר את הזמן Interval (sec) בין מידות או אם הנתונים צריכים להיות רכש מהר ככל האפשר להשאיר אפשרות זו מסומנת.
      הערה: כדי להשיג נתונים מכשיר ECIS משתמש רבב כדי לעבור מאחד למשנהו גם עם שיעור מינימום SFT רכישת 0.25 שניות ו7.5 שניות לMFT. כלומר המרווח תלוי במספר בארות ותדרים שנבחרו. למדידות בתאים מתרבים איטיים או הקלטה פשוטה של ​​התנגדות לעומת זמן, השתמשו במרווחים של 600 שניות או יותר.
    7. לחץ על התחל, תן שם לקובץ ובחר מיקום לאחסון נתונים.
      הערה: גודל קובץ לא צריך להיות יחסי ציבורoblem, שכן נתוני ECIS נשמרים בסוג של פורמט טקסט רגיל הנקרא *. ABP, שאף פעם לא עולה על כמה מאה מגה בייט אפילו עם כל תדרי המדידה ומספר הבארות שנבחרו.
    8. תפסיק להפעיל על ידי לחיצה על סיום.

    4. שינוי בינוני ומניפולציה סלולרי

    1. הפסקה לעיתונות, זה יהיה להפסיק את רכישת נתונים, אך ימשיך לנהל את השעון הניסיוני.
    2. הסר את המערך מהמחזיק ולטפל בו תחת ספסל זרימה למינרית (כלומר שינוי בינוני).
    3. הנח מערך אחורי בבעל וגם לחץ על בדקו את החיבור או על חדש ניסוי להמשיך רכישת נתונים. תוכנת המדידה תציב סימן זמן בערכת הנתונים.

    5. חריף גירוי במהלך רכישת נתונים

    הערה: אפשרות שנייה היא כדי לתפעל את התאים במהלך רכישת נתונים כדי לעקוב אחר שינויים מיידיים. זה רק אפשרי; כאשר דגימות לא צריכה להיות סטרילי במהלך נוסף של הניסוי.

    1. מוסיף את הגירוי ישירות אל הבאר ולוודא לערבב זהיר עם פיפטה μl 200.
    2. זמן מארק להצביע באופן ידני על ידי לחיצה על מארק ולהוסיף תגובה.

    6. חשמל פציעה

    הערה: מציאת ההגדרות הנכונות עבור סוג התא המשמש היא מפתח לפציעתם חשמלית. אם פצעתי קצר מדי זה יכול לגרום להסרת מספקת של תאים, ואילו אם הפציעה ארוכה מדי ו / או מחוספס זה יכול לגרום נזק אלקטרודות (במיוחד במערכים השקופים). לכן, כמה פולסים קצרים פציעתם מומלצים. לתרבויות HUVEC שני פולסים פציעה ארוכה 10-20 שניות של 5 וולט ב 60 קילוהרץ כל אחד כבר נמצאו אופטימליים באמצעות 1600R ECIS. באופן כללי מומלץ להשתמש בתדרים גבוהים> 20 קילוהרץ כדי לשמור על שדות גבוהים אחידים על פני התאים וכדי למנוע נזק לאלקטרודות.

    1. בצע פצע during מדידת ECIS פעילה.
    2. אפשר פצע / התקנת electroporate, לאחר מכן לחץ על פצע ולמלא את הזמן (שניות) במתח, בסופו (V עבור 1,600 R) או שוטף (μA לZ ו-Z-תטא) ותדירות (Hz). ערכי ברירת המחדל המוצגות מבוססים על הסוג של מערך ומכשיר ECIS.
    3. בחר את הבארות לפצוע בסעיף "ובכן התצורה". רק הבארות נבדקות יהיו פצועה.
    4. לאפשר עיכוב עד שעה ולמלא את זמן ההשהיה כדי להפעיל את פונקציית פצע עיכוב. פונקציה זו ניתן לעצור בכל עת על ידי לחיצה על עצור או החלים פצע באופן ידני. רק פקודה אחת העיכוב יכולה להיות פעילה בכל פעם.
    5. לחץ הפעל ולחץ על אישור בחלון הקופץ להתחיל פצע.
    6. ודא שאות ההתנגדות יורדת ל העכבה לאחר קיזוז פציעה, אחרת תחזור על הפציעה.

    7. ניתוח נתונים

  • ייצוג נתונים ויצוא.
    1. מדידה על סיום או על נתוני עומס מוגדר באמצעות קובץ -> Open.
    2. בחר בארות שיוצגו מחלון "ובכן התצורה". בארות בודדות קבוצה להציג את הממוצע.
    3. בחר בפרמטר שיוצג מהעליון סרגל הכלים (Z, R או C).
    4. סוג הגרף בחר מסרגל הכלים העליונים (ט = זמן, F = תדר, כתם 3D = מפל).
    5. הגדר גרף קיזוז ומגוון עם המחוונים מתחת לחלון הגרף או למלא את הערכים המדויקים בבקרה הצמודה.
    6. בחר מ" זמן סדרת אפשרויות "הבסיסיות בסעיף" נתח "כדי לבצע סטיית תקן, ריצה ממוצעת או נורמליזציה של נתונים.
    7. הפעל מומחה סרגל כלים בתפריט העזרה ליותר פעולות מתקדמות כמו עלילת Nyuist והפיכה פורייה.
    8. השתמש "אפשרויות תצוגה" בסעיף "נתח" להגדיר range של x ו-y צירים ויצוא גרף.
    9. יצוא נתונים נבחרים לקובץ Excel באמצעות קובץ -> יצוא נתוני -> לאקסל (נבחרת) ולהשתמש בתוכנות צד שלישית שבה נקטה בניתוח מעמיק, סטטיסטיקה וייצוג במידת הצורך.
  • דוגמנות של Rb ואלפא.
    הערה: לדוגמנות מומלץ להשתמש בתא ללא, בינוני מילא היטב כנקודת התייחסות.
    1. מדידת MFT סיום או ערכת נתונים MFT עומס.
    2. אם גם התייחסות נטולת תא הוא עיתונות זמינה גם מצא כדי לבחור את ערך ההתייחסות או הגדר כדי לבחור את נקודת הזמן פנוי התא באופן ידני מ" תדר. סריקת דוגמנות "בסעיף" ניתוח "באופן אוטומטי.
    3. אם אין התייחסות ללא תא, לייבא ערך ייחוס ממערכת נתונים אחר. פתח את ערכת נתונים ההתייחסות (לוודא שאותו המערך והבינוני היה בשימוש), ולהשתמש בחיפוש או הגדר כדי לבחור את ערך ההתייחסות.לאחר מכן נווט לנתונים שנמדדו ולקבל עיתונות.
    4. אם אין נתונים התייחסות תא ללא להגדיר שימוש זמין ברירת המחדל של היצרן.
    5. דגם לחץ כדי להתחיל את החישובים. דוגמנות עשויה להימשך מספר דקות תלויות בגודל של ערכת הנתונים.
  • חישוב micromotion.
    הערה: חישוב זה אינו חלק מתוכנת המדידה, אך ניתן לבצע עם כל תוכנת עיבוד אותות.
    1. לסיים את מדידת RTC או לטעון ערכת נתונים RTC.
    2. לנרמל את הנתונים שנקבעו על ידי ההתנגדות בממוצע של כל התקופה.
    3. לשבור נתונים שנקבעו למקטעים באורך של נקודות 256 הנתונים ולנקות את כל מגזר על ידי חלון Hanning.
    4. הפעל שינוי 256 נקודה פורייה וספקטרום תדירות ממוצעת המתקבל לספקטרום כוח 129 נקודה חד צדדי כדי למזער את הרעש אקראי ומשופר האות הביולוגית.
    5. תדירות מזימה נגד המשרעת בגרף יומן יומן ולהחילנכון ליניארי כיכר הפחות.
    6. שיפוע המתאים ליניארי הוא מדד לרעש הכולל באות ובכך micromotion של התאים.
  • Representative Results

    הגדרת ניסוי היא פשוט למדי והמדידה עצמו באופן אוטומטי לחלוטין, אבל כמו שקורה לעתים קרובות, ניתוח ופרשנות של נתונים נכונים הם קריטיים. במקטע נתוני נציג מדריך מסופק לפרשנות של הפרמטרים החשובים ביותר הניתנים על ידי ספקטרוסקופיה עכבה עם ECIS. זה יהיה מועיל כדי להחליט לאיזה סוג של בעיה מדעית מדידת ECIS יכולה להיות שימושית ואשר אמורים להיות מוקלטים פרמטרים.

    קריאה מתוך ניסיוני אופייני בדרך כלל ניתן לחלק בצמיחה בשלב לאחר חיסון תא ורמת שלב כאשר תאים מגיעים למפגש. כל אחד מהשלבים הללו מניב מידע על נכסים סלולריים שונים. מדידת נציג מוצגת באיור 2 ומחולקת לארבעה שלבי משנה לנתח הידבקות תא), הפצה והתפשטות; ב ') הקמת גדר EC התבגרות; C נדידת תאים) לאחר הדור של חשמלאל פצע; ו-D) התגובה התאית לגירוי עם תרומבין סוכן vasoactive. דימויים שלב בניגוד ו immunofluorescence נרכשו ישירות מהאלקטרודה המדידה במהלך שלבי המשנה השונים על מנת להמחיש את הקשר בין כיסוי אלקטרודה, מצב תא, ואות עכבה מוקלטת.

    הדבקה, הפצה והתפשטות

    לכל סוג תא עקומת ההידבקות וצמיחה האופיינית שלה, שניתן להשפיע על ידי שינוי צפיפות זריעה, ציפוי עם חלבוני מטריצת חוץ תאיים או גירויים אחרים. אחד הקשיים העיקריים ללמוד תהליכים אלה הוא להבדיל בין ההידבקות, הפצה והפצה. וגנר ואח' 11. נתן תיאור מפורט לשימוש בשילוב של התנגדות וקיבול להבחין בין הפרמטרים הללו ובאיור 3 זה הופך להיות ברור כיצד התנגדות וקיבול יכולים להשלים אחד את השני. חשוב ליהמחקר של הידבקות וההתפשטות להבין את ההשפעה של תדירות המדידה, כי כאן השדה החשמלי גורם לקיטוב של קרום התא של התאים בתרחיף 8, מה שמאלץ את הזרם לזרום באופן בלעדי סביב התאים. כאשר התאים לצרף הם מתחילים להגביל את הזרימה הנוכחית על ידי המשתרע על ירידות האלקטרודה וקבול בצורה ליניארית עם אחוז של שטח פתוח על האלקטרודה (אזור השבר). לפיכך, הדבקה, הפצה והתפשטות ניתן לכמת הטובים ביותר, בעת הקלטת קיבול בתדירות גבוהה יותר מאשר 40 קילוהרץ (איור 3), שבו הירידה בקיבול היא ישירה פרופורציונלית לכיסוי האלקטרודה. לחלופין התנגדות בתדירות המדידה רגישה ביותר שלה היא מדד ישיר לבידול וההתבגרות של תאים לתוך מחסום מחוברות (איור 3 א). בנוסף לאזור השבר, וגנר ואח'. הציג שני האחריםפרמטרים לכמת הידבקות וכיסוי אלקטרודה: t 1/2 (קיבול חצי לכל היותר), המהווה את הזמן עד 50% מאלקטרודה מכוסה בתאים (איור 3B, הכנסה), ושיפוע העקום הקיבול (ים, לא מוצג) כשיעור התא מתפשט והתפשטות.

    התנגדות כמדד לאיכות מחסום

    התנגדות היא חלק מהעכבה שמתאר איכות מחסום ותפקוד הטוב ביותר, משום שהיא מזניחה את רכיבי קיבולי מהקרום, אלקטרודה ובינוני. כאן משמשת חדירות איכות גדר טווח ולא, שכן חדירות היא לפי הגדרה תלויה רק ​​באנשי קשר תא תא. עם זאת התנגדות נקבעת על ידי היכולת של תאים ותאי תאי האינטראקציות ותא המטריצה ​​שלהם כדי לחסום את הזרימה הנוכחית. יש סוגים שונים בהתאם לכך תא (שיבוטים ומעברים) את ערכיהם הספציפיים התנגדות (איור 4 א). למרות התנגדות נותנת הרבה קליאהרעיון RER אודות מכשול התא, אות העכבה תמיד צריכה להילקח בחשבון.

    דוגמנות של Rb ואלפא

    תוכנת ECIS נמלי תכונה מסוימת, את היכולת למודל שני פרמטרים, אשר מבדילים בין הידבקויות תאי תאים ותא מטריצה ​​(4B דמויות ו4 ג). Rb (בס"מ 2 אוהם x), הוא ההתנגדות של אנשי קשר תאי תאים לזרימת זרם ובכך מדד ההופכי של חדירות קלאסיות. Rb גבוה מרמז חדירות נמוכות לכיוון זרימת הזרם. אלפא (בx אוהם 0.5 סנטימטר), הוא מדד לתרומות עכבה הנובעות מצומת התא-אלקטרודה. המודל לכמת קשר תאי תאים ותא מטריצה ​​הוצג 1991 על ידי Giaever וKeese והוא מבוסס על ההנחה שהתאים עגולים, חפצי דיסק בצורה שקרום בידוד, ירחף מעל האלקטרודה ומלאות בניצוח אלקטרוליט 2 .בידוד רכושו של קרום התא משאיר רק שלושה מסלולים לנוכחיים: א) בין פני השטח הגחון של התאים ואלקטרודה, ב) בין אנשי קשר תאי תאים, וג) דרך התאים (רק סביר להניח שכאשר נעשה שימוש בתדירות גבוהה מדידה ). ניתן למצוא גזירה והסבר מפורטים יותר בעיתונים של Lo et al 3,12.

    Micromotion

    הוכח כי תנודות קטנות באות ההתנגדות (איור 4 א) הן תוצאה של תנועות עדינות, אקראיות תא בשכבות תאים ומחוברות, כמו גם תאים נעו לסירוגין את האלקטרודה בתרבויות דלילות 2. היבט זה של נתונים בזמן ECIS כמובן שתוארו על ידי Lo ומול et al. 13,14 הוא לעתים קרובות התעלם וטוב ביותר שנראה בעת המדידה עם 1E מערכים ובתדר רגיש ביותר כדי להסביר את סעיף ונתיבים שוטפים subcellular. החישוב של תא זה נגרם רעש (micromotion) אינו חלק של הדואר תוכנה סטנדרטית מדידה, אם כי בגרסה החדשה ביותר טרנספורמציה פורייה מהיר (FFT) משולבת. הקלטת נתונים RTC עם תדר דגימה של 1 הרץ עבור שעה 1 ב 4 קילוהרץ מספקת רזולוציה מספיקה לחישוב micromotion EC. חישוב זה מספק ערך אחד ויחיד והוא יכול לשמש באופן ישיר לניתוח סטטיסטי. ניתן למצוא דיון מורחב על השימוש בניתוח תדר עבור micromotion מקום אחר 15. לחלופין לFFT ניתן להשתמש באסטרטגיות ניתוח אחרות, כמו שונות של המרווחים. השונות היא רגישות יותר כלפי שינויים קטנים בmicromotion, אלא בגלל רגישות זו ההשוואה של ניסויים בודדים הופכת להיות קשה. המדרונות של ספקטרום הכוח הם מדידה חזקה יותר של micromotion (איור 4D). כאן השטח מתחת לעקומה ניתן לראות את כמות micromotion או רעש התאים ליצור. לפיכך, תלול המדרון של ספקטרום הכוח קטן יותר השטח מתחת לעקומהוקטן יותר micromotion.

    assay ריפוי פצע חשמלי

    ללמוד הגירה של תאים, פצעים בדרך כלל מכאניים מיושמים על ידי גירוד תאים מצלחת התרבות עם טיפים פיפטה, מגרדי תאים או בולים ספציפיים ולעקוב remigration מיקרוסקופי 16. בשיטה זו יש חסרון הברור שהגודל של השריטה משתנה ובדרך כלל הוא גדול מדי כדי להזניח את ההשפעה של התפשטות תאים בתהליך ריפוי פצע. פונקצית פציעתם של ECIS משתמשת במתח גבוה, דופק בתדירות גבוה כדי לקבל האלקטרודה חופשית תא ולאחר מכן כדלקמן remigration של תאי שכנים כדי להחליף את תאי המוות (איור 5 א). יתרונה של שיטה זו על פני אוטומטית סטנדרטית, מבחני שריטה עבודה אינטנסיבית הוא שECIS מייצר פצע שחזור מאוד בקוטר מדויק של 250 מיקרומטר, שסוגר בתוך כמה שעות, כדי ללמוד הגירה טהורה. יתר על כן, את הדופק החשמלי לעשותes לא תסיר את ציפוי חלבון ומטריצה ​​תאית מופרשת. בהנחה שהתאים remigrate על האלקטרודה מכל הצדדים, שיעור ההגירה יכול בקלות להיות מחושב על ידי חלוקת רדיוס פצע על ידי הזמן הנדרש לסגירת פצע 17. כחלופה לפציעתם חשמל, לאחרונה שיטת הגדר החשמלית שנקרא הוצגה (לא מוצג). פולסים הנוכחיים הנה גבוהים למנוע התקשרות והגירה של תאים על האלקטרודות לאחר חיסון. התאים יגדלו סביב האלקטרודה המדידה ולהתחיל נודדים פנימה ברגע שפולסים חשמליים כבויים. היתרון של הגדר החשמלית על פציעתם החשמלית הוא שפני האלקטרודה לא שונו על ידי צמיחת תאים או הסרת תא, וזה חשוב למדידת השפעות של ציפויים שונים על נדידת תאים.

    גירוי תא

    בנוסף לחקר נדידת תאים, ספקטרוסקופיה עכבה מתאימה בצורה מושלמת ללמדוד את ההשפעות של תרופות ורעלים בתאים. איור 5 מציג ניסוי גירוי / עיכוב קלאסי, שבו תרומבין נעשה שימוש כדי לגרום להיפר חדירות במחסום EC מחוברות ידי היווצרות התכווצות ופער של תאים, אשר באה לידי ביטוי בירידה זמנית בהתנגדות . על ידי preincubation עם מעכב קינאז Rho-Y 27632 ביותר של תגובת תרומבין הוא פחת על ידי הפחתת מתח של תאי בסיס 18 וחסימת היווצרות לחץ סיבי 19. אז חוסם קינאז Rho שימש בנקודות זמן שונות לאחר בנוסף תרומבין, שהוביל להתאוששות מיידית ומוחלטת של גדר EC. כאן היתרון של מערכת מדידת עכבה רציפה ללמוד תגובות הסלולר חריפות הופך להיות ברור. בנקודת סיום מבחני רגילים (מכתים למשל immunofluorescence או מעבר מקרומולקולה), תגובה חריפה זה לחוסם שימוש תהיה קשה מאוד אם לא בלתי אפשרית לזהות ולכמת. חשוב לציין הוא שעם iמדידות mpedance החדירות ליונים מתוארת ולא כלפי מקרומולקולות. נא עיין אמן אח'. 20, שם השוואה מצוינת בין מידות ECIS ניסויים מעבר מקרומולקולה מסופקת.

    איור 2
    איור 2. מדידה מייצגת. MVEC גדלו על מערכי 8W1E ג'לטין מצופה בצפיפות זריעה נמוכה של 5,000 תאים / 2 סנטימטר והקלטת MFT בוצעה מעל 10 ימים. המדידה ממחישה את הקריאה פסקי השונים של ניסוי ECIS:) הידבקות, הפצה והתפשטות; B) היווצרות והבשלה של מחסום תא מחוברות; גירוי D) עם vasoactive; ריפוי C) פצע לאחר היישום של פצע חשמלי תרומבין סוכן. שני החיצים מצביעים בינוניים כיבוד, אשר בוצעו במרווחים של 4 ימים ולתת מושג על הרגישות של המדידות לקראת גירויים ושינויי טמפרטורה וחומציות מכאניים. התמונות בלוח העליון מתאימות למדידה ונרכשו ישירות מהאלקטרודה המדידה. תמונת שלב בניגוד משמאל מראה את תאי האנדותל 24 שעות לאחר החיסון, החל לכסות את האלקטרודה. תמונות immunofluorescence במרכז ובצביעת F-אקטין הנוכחית הימנית של שכבת האנדותל המחוברות לפני ואחרי גירוי עם תרומבין (1 U / ml). תרומבין גורם להתכווצות של תאי האנדותל על ידי היווצרות של סיבי מתח שנקרא ופתיחה הזמנית של פערים בין אנדותל (חיצים ומוסיף תמונה), לזיהוי באות ECIS על ידי ירידה בהתנגדות לבסיס. הנה רגישות של המדידה הופך להיות ברור וכיצד שינויים בשכבת התאים לתאם עם אות העכבה.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 3
    איור 3. מצורף תא והצמיחה. MVEC מאותו התורם היה זרע עם שלוש צפיפויות שונות על מערכי 8W10E ג'לטין מצופים וצמיחת תאים נרשמה בתדרים מרובים עבור 60 שעה.) ערכי התנגדות לשלושה התנאים בתדירות האופטימלית שלהם של 4 קילוהרץ למדוד היווצרות מכשול. כל שלוש צפיפויות הזריעה הוקמו מחסום ומחוברות של CA. 1,200 Ω בסוף המדידה;. שיעורי תפוצה עם זאת (מדרונות של העקומות) שונים במידה ניכרת ב ') מדידת הקיבול ב64 kHz מספקת תובנות על הידבקות ומתפשט. הידבקות היא בשלב מפנה itial בעקום הקיבול (בין 2-8 HR). הפצת, שהוא ביחס ליניארי לכיסוי אלקטרודה, מיוצג על ידי שיפוע העקום, והוא הושלם לאחר שעה 10-30 בהתאם לצפיפות הזריעה. הזמן לא נקודה 1/2 (כיסוי חצי מקסימאלי) יכול לשמש לניתוח סטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 4
    איור 4. אפיון של המחסום ומחוברות. שני תורמי MVEC עם מספרים שונים מעבר (מעבר 3 ו -6) היו זורעים על מערכי 8W1E ג'לטין מצופים ומדידת MFT בוצעה עבור 30 שעות כדי לאפיין את מחסום EC.) התנגדות מדידות מראות כי יש לו את התורם הצעיר 1 התנגדות גבוהה יותר של CA. 11,000 Ω בהשוואה לקליפורניה. 7,500 Ω של התורם המבוגר יותר 2. לפנה"ס) יכולות הדוגמנות של ECIS היה בשימוש כדי למצוא את הסיבה להתנגדות נמוכה יותר. דוגמנות חשפה Rb אינטראקציה תאי תאים דומה והצביעה על אינטראקציה של תאי מטריצה ​​מוחלשת אלפא כגורם אפשרי. ד) RTC בוצע לכמת micromotion בתוך שכבת תאי מחוברות ידי שינוי פורייה, שבו השטח מתחת לעקומה הוא פרופורציונלי לmicromotion . ניתוח של הספקטרום מראה פחות micromotion של התורם המבוגר 2 ובכך לתמוך במה שכבר ניתן להניח מאות ההתנגדות (פחות שונות). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    5 "עבור: תוכן width =" 5in "עבור: src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/>
    איור 5. נדידת תאים לאחר פציעה ואת השפעות של גירוי תרומבין חשמליים. הקלטות עכבה בוצעו ב 4 קילוהרץ עם רזולוציה של זמן מקסימאלי. תורם) MVEC 1 שימש בחלוף 3 ותורם 2 בקטע 6 על מערכי 8W1E ג'לטין מצופים ומבוגר כדי מפגש. לאחר מכן פצע חשמלי נוצר על ידי יישום של שתי 5 V פעימות ב kHz 60 עם משך זמן של 20 שניות כל אחד. התורם הצעיר 1 הראה פצע טוב יותר ריפוי יכולות המבוססות על סגירה מהירה יותר בסופו (הגירה, מדרונות של העקומות) ועמידות גבוהה יותר לאחר פציעתם בהשוואה לתורם המבוגר יותר 2. B) HUVEC גדל על מערכי 8W10E ג'לטין מצופים. על מפגש התאים כבר בסרום רעב ל1.5 שעות על ידי החלפת מדיום התרבות השלמה עם מדיום בסיסי בתוספת 1% אלבומין בסרום אדם (HSA). לנוגיל בינוני רגיל עם HSA הוא שלב קריטי, שכן מרכיבי סרום לחסום את התגובה של תרומבין. ברגע שרמת התנגדות יציבה זוהתה, תרומבין נוספו ישירות לבארות וערבב בזהירות עם טפטפת μl 200. השפעת תרומבין המקסימלי גלויה לאחר 30 דקות, המתאפיינות בירידה זמנית בהתנגדות לתחילת מחקר ובקליפורניה. התנגדות 30-50% נמוכה יותר לאחר החלמה. התאים היו preincubated או עם קינאז חוסם Y-27632 Rho ל30 דקות או חוסם נוספו 20, 30, או 40 דקות אחרי תוספת תרומבין, אשר הפחיתו את אפקט תרומבין באופן מיידי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

    Discussion

    ECIS הוא כלי מצוין להקרנה של מאפייני תא ובהתנהגות, כמו גם לכימות של ההשפעות של חומרים ידועים ובלתי ידועים. כך התאים מוחזקים בתנאי תרבות סטנדרטיים, העכבה יכולה ברציפות להיות במעקב עם רזולוציה גבוהה זמנית וקורלציה לאותות אופטיים. בדרך זו ניתן לבחור נקודת הזמן האופטימלית למניפולציות סלולריים על הבסיס של מעמד התא מורפולוגיים ופונקציונלי. למרבה הצער, ברזולוציה מדידה גבוהה זה מגיעה עם המחיר שהשינויים קטנים בטמפרטורה, pH או גירוי מכאני של תאים (שינוי בינוני) ישפיעו על האות בעל עכבה באופן מיידי.

    היישום הנוכחי מדידה הקטנה לתאים הופך את מדידת ECIS לא פולשנית, הורסות, וללא תווית, אלא כתוצאה יכולים להיות רק נמדדים מאפיינים bioelectrical פסיביים (אין פוטנציאל פעולה). תכונת מפתח היא שמספר הפרמטרים יכול להיות דר ived ממדידה אחת, המשלב מידע ממספר מבחני קלאסיים, כמו חדירות או מבחני ריפוי פצע. כאן ההיבט המעניין במיוחד הוא שנתוני מודל מתמטי יכולים לשמש כדי לחקור את השינויים בהתנגדות וקיבול ולהפנות אותם למבנים שונים סלולריים (לדוגמא תאי קשר או קרום תא). חשוב לציין הוא שספקטרוסקופיה העכבה תמיד מספקת אות בממוצע מכל התאים על האלקטרודה החישה, אשר אינו מאפשרת למחקרים על תאים בודדים וגם המודל המתמטי תקף אך ורק בשכבות תאים ומחוברות. לכן תאי האנדותל צריכים להתקיים במדינת המחוברות לפחות יום אחד לפני ששמש לדוגמנות כדי להבטיח תא הידבקויות בוגרות ותאים רדומים. באותה מידה, צריכים רק להיות מיושמים פצעי חשמל למחוברות שכבות תאים באמצעות פולסים פציעה קצרים מרובים עם תדרים גבוהים, כדי להשיג יעילות פציעה אופטימלית ולמנוע נזק של האלקטרודות.

    jove_content "> כדי לקבל את הסכום המקסימאלי של מידע ממדידת ECIS, כמו בכל assay, מספר פרמטרים כגון שילוב של מצע מערך, ציפוי וצפיפות זריעה לסוג התא הבודד צריכים להיבדק ומותאם לפני ניסוי.

    מגבלה העיקרית של ECIS היא שהמדידה אינה מספקת מידע ישיר על הרמה המולקולרית. כך מדידות ECIS הן בדרך כלל אינפורמטיבי ביותר בתחילת סדרה ניסיונית כדי לעזור לשייך בעיה מדעית עם מבנים או נכסים סלולריים ולספק קלט משמעותי לדור של השערה ניתנת לבדיקה. לכן העיצוב המודולרי של ECIS מספק ספקטרום רחב של יישומים עם האפשרות למערכים תפורים. התפתחויות המערך האחרונות מצביעות על מוקד בעתיד על הקרנות עכבת תפוקה גבוהה לשגשוג תאים ובפציעתם חשמלית ומראש של זרימת מערכים מיוחדים לסימולציה של in vivo

    ספרות נוספת
    נא להתייחס גם לדף האינטרנט לביופיסיקה יישומית (www.biophysics.com) ליישום הערות, webinars ורשימה מפורטת של פרסומים המכסים את ספקטרום ECIS כולו.

    Disclosures

    אפלייד ביופיסיקה בע"מ כיסה את דמי גישה הפתוחה, ואילו מבנה והתוכן של המאמר נשארו באחריות מלאה של הכותבים.

    Acknowledgements

    המחברים מבקשים להודות לד"ר צ'ארלס Keese, ד"ר Renken הנוצרי, הנוצרי Dehnert (Applied ביופיסיקה Inc) וד"ר אולף רדלר (ibidi GmbH) לעצתם, לעזור והדיונים פוריים במהלך תקופת ההכנה של כתב היד הזה. יתר על כן ברצוננו להודות ליאן ואן Bezu לתמיכה הטכנית מצוינת שלו.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    ECIS Zθ Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W1E PCB Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W1E Lexan Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W10E PCB Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    L-Cystein Merck Millipore 102838
    Gelatin Merck Millipore 104070
    Bovine Thrombin Merck Millipore 604980
    Albuman (Human Serum Albumin) Sanquin
    Y-27632 Tocris Biosciences 1254
    EGM-2 BulletKit  Lonza CC-3162
    Pen/Strep Lonza 17-602E

    References

    1. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, (6455), 591-592 (1993).
    2. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, (17), 7896-7900 (1991).
    3. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Cell-substrate contact: another factor may influence transepithelial electrical resistance of cell layers cultured on permeable filters. Exp. Cell Res. 250, (2), 576-580 (1999).
    4. Wegener, J., Sieber, M., Galla, H. J. Impedance analysis of epithelial and endothelial cell monolayers cultured on gold surfaces. J. Biochem. Biophys. Methods. 32, (3), 151-170 (1996).
    5. Pänke, O., Balkenhohl, T., Kafka, J., Schäfer, D., Lisdat, F. Impedance spectroscopy and biosensing. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 109, (11/2007), 195-237 (2008).
    6. Wegener, J., Zink, S., Rösen, P., Galla, H. Use of electrochemical impedance measurements to monitor beta-adrenergic stimulation of bovine aortic endothelial cells. Pflugers Arch. 437, (6), 925-934 (1999).
    7. Eker, B., Meissner, R., Bertsch, A., Mehta, K., Renaud, P. Label-free recognition of drug resistance via impedimetric screening of breast cancer cells. PloS ONE. 8, (3), (2013).
    8. Nacke, T., Anhalt, M., Frense, D., Beckmann, D. Anwendungsmöglichkeiten der Impedanzspektroskopie in der Biotechnologie (Application of the Impedance Spectroscopy in the Biotechnology). Technisches Messen. 69, (1/2002), 12-18 (2002).
    9. DePaola,, et al. Electrical impedance of cultured endothelium under fluid flow. Ann. Biomed. Eng. 29, (8), 648-656 (2001).
    10. Pietrosimone, K. M., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis. J. Vis. Exp. (62), (2012).
    11. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Exp. Cell Res. 259, (1), 158-166 (2000).
    12. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys. J. 69, (6), 2800-2807 (1995).
    13. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Monitoring motion of confluent cells in tissue culture. Exp. Cell Res. 204, (1), 102-109 (1993).
    14. Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, (8), 2625-2629 (2009).
    15. Szulcek, R., Beckers, C. M. L., et al. Localized RhoA GTPase activity regulates dynamics of endothelial monolayer integrity. Cardiovasc. Res. 99, (3), 471-482 (2013).
    16. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, (2), 329-333 (2007).
    17. Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, (6), 1554-1559 (2004).
    18. Krishnan, R., Klumpers, D. D., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 300, (1), 146-154 (2011).
    19. Van Nieuw Amerongen, P. G., van Delft, S., Ma Vermeer, M., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases. Circ. Res. 87, (4), 335-340 (2000).
    20. Aman, J., et al. Effective treatment of edema and endothelial barrier dysfunction with imatinib. Circulation. 126, (23), 2728-2738 (2012).

    Comments

    1 Comment

    The video is not working before procedure discription.
    Reply

    Posted by: Atiya S.August 31, 2015, 2:16 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter