Isolering af CA1 Nuclear berigede Fraktioner fra hippocampusskiver at studieaktivitet-afhængige kerneimport af Synapto-nukleare Messenger Proteiner

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi giver en detaljeret protokol for induktion af langsigtede potensering i CA1-området i hippocampus og den efterfølgende isolering af nukleare berigede fraktioner fra tetanized område af skive. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at bestemme aktiviteten afhængig kerneprotein import i cellulære modeller for indlæring og hukommelse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins. J. Vis. Exp. (90), e51310, doi:10.3791/51310 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Studer aktivitet afhængig proteinekspression subcellulær translokation eller phosphorylering er vigtigt at forstå de underliggende cellulære mekanismer af synaptisk plasticitet. Langsigtet (LTP) og på lang sigt depression (LTD) induceret i akutte hippocampusskiver er bredt accepteret som cellulære modeller for indlæring og hukommelse. Der er mange undersøgelser, der bruger levende celle billedbehandling eller immunhistokemi tilgange til at visualisere aktivitet afhængige protein dynamik. Men disse metoder er afhængige af egnetheden af ​​antistoffer til immuncytokemi eller overekspression af fluorescens-mærkede proteiner i enkelte neuroner. Immunoblotting af proteiner er en alternativ metode yde uafhængig bekræftelse af resultaterne. Den første begrænsende faktor i fremstilling af subcellulære fraktioner fra individuelle tetanized hippocampusskiver er den lave mængde materiale. Andet behandlingsproceduren er afgørende, fordi selv meget korte og små manipulationer af living skiver kan fremkalde aktivering af visse signalleringskaskader. Her beskriver vi en optimeret arbejdsgang med henblik på at opnå en tilstrækkelig mængde nukleart fraktion af tilstrækkelig renhed fra CA1-regionen af ​​akutte hippocampale skiver fra rottehjerne. Som et repræsentativt eksempel, viser vi, at ERK1 / 2 phosphorylerede form af synapto-kerneprotein messenger Jacob translokerer aktivt til kernen efter induktion af LTP og kan påvises i et nukleart fraktion fra CA1 neuroner.

Introduction

Synaptic N-methyl-D-aspartat-receptorer (NMDARs) spiller en afgørende rolle i synaptisk plasticitet og celle overlevelse signalering mens aktivering af ekstrasynaptiske NMDARs kan udløse neurodegeneration og celledød. Disse ændringer afhænger af stramt kontrolleret / reguleret aktivitet afhængig genekspression og derfor kræver konstant kommunikation mellem aktiverede synapser eller dendritter og kernen 7. MAP-kinaser ERK1 / 2 er downstream effektorer af synaptiske NMDARs signalering og er involveret i NMDAR-aktiverings-induceret genekspression, mens signalering via ekstrasynaptiske NMDAR har ingen eller en hæmmende virkning på ERK1 / 2-aktivitet 8,11.

Der er antallet af proteiner, som har vist sig at shuttle mellem distale dendritter og kernen. Mange af disse proteiner indeholder kernelokaliseringssignalet og aktivt transporteres langs mikrotubuli i en dynein og importin-afhængig måde til kernen 6,9. Interestingly, nogle af disse budbringere kun transit til kernen som svar på specifikke synaptiske stimuli. For eksempel er retrograd transport af cyklisk AMP-responselement bindingsprotein 2 (CREB2) induceret ved kemisk LTD men ikke LTP 12. Lokaliseret NMDAR-afhængige synaptisk stimulering driver CREB-reguleret transkriptionel coaktivator (CRTC1) ind i kernen, en translokation proces, som er involveret i en langsigtet hippocampus plasticitet 4. Det blev for nyligt vist, at proteinet messenger Jakob translokerer til kernen efter både synaptisk og ekstrasynaptiske NMDAR aktivering og regulerer CREB afhængig gentranskription 5. Synaptic eller ekstrasynaptiske oprindelse af signalet er kodet i en posttranslationel modifikation af Jakob. Synaptisk aktivitet inducerer ERK1 / 2 afhængig phosphorylering af Jacob på et afgørende serin ved position 180 (pJacobS 180), som er en forudsætning for den efterfølgende translokation til kernen i den primære hippocampus kultur. Derudover er jegn CA1 neuroner i akutte hippocampale skiver pJacobS 180 translokerer til kernen efter Schaffer sikkerhed LTP men ikke LTD 1,10. pS180 Jacob fører til en forøget ekspression af plasticitet gener og denne genekspression feeds tilbage til synaptisk funktion. I skarp kontrast Jacob der translokerer til kernen efter ekstrasynaptiske NMDARs aktivering ikke er phosphoryleret ved Ser180 og kan være forbundet med forskellige protein-kompleks i kernen forårsager "CREB slukket" og en tilbagetrækning af synaptiske kontakter 10.

Mest offentliggjorte undersøgelser om det nukleare import af synapto-kerneprotein messenger have været gjort i dissocierede neuronale primære kulturer. Derfor vil det være interessant at se, om sådanne fund kan gengives i fysiologisk mere relevant forhold og anvendelse hippocampusskiver hvor neuronal tilslutningsmuligheder og funktion er meget bedre bevaret. Her præsenterer vi en optimeret protokol til vurdering af LTP-degige kernetranslokation af protein budbringere ved immunblotting. Denne metode er også egnet til at analysere aktivitet afhængig phosphorylering af proteiner i en rå nukleare fraktion. Specifikt den nuværende protokol indebærer udarbejdelse af akutte CA1 hippocampus skiver, induktion og registrering af LTP. Dernæst CA1 region mikroskopisk dissekeret for at isolere det stimulerede område. Vi kombineres og modificeres protokollen for nuklear isolation fra CellLytic Nuclear Extraction Kit med ændringer af Zhao og hans kolleger 17. Den optimerede procedure omfatter lyse af dissekerede CA1- regioner i hypotonisk buffer tillader celle hævelse og frigivelse af kerner. Cellelyse og kerner morfologi kan bestemmes ved mikroskopisk undersøgelse. Nuklear berigelse opnås ved en kort centrifugering. Immunblotting analyse med antistoffer mod Neun og NSE2 specifikke markører for nukleare eller cytosoliske fraktioner viser, at denne fremgangsmåde kan anvendes som en hurtigog reproducerbar protokol til at isolere disse subcellulære fraktioner og til at studere meget labile posttranslationelle modifikationer som proteinphosphorylering. Desuden er denne metode fordelagtigt for små vævsprøver stammer fra dissekerede CA1 regioner hippocampusskiver og kan anvendes i kombination til immunohistokemi hippocampusskiver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af akut hippocampusskiver fra voksen rottehjerne

  1. Bedøver rotter med isofluran. ADVARSEL: Udfør proceduren ved hjælp af en lukket exicator ikke inhalere isofluran. Sørg for, at dyret er helt bedøvet.
  2. Halshugge rotter hurtigt isolere hjernen, og nedsænkes i forcarboniseret (95% O2 / 5% CO 2 gasblanding) iskold Gey opløsning (sammensætning i mM: 130 NaCI, 4,9 KCI, 1,5 CaCl2 · 2H 2 O 0,3 MgSO4 · 2H 2 O 11 MgCl2 · 6H 2 O 0,23 KH 2PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O 5 Glucose · H2O, 25 HEPES, 22 NaHCO3, pH 7,32) 30 min 1,2,10,16.
  3. Fjern lillehjernen og en del af den entorhinale cortex. Adskil kortikale halvkugle med en mid-sagittal snit, og derefter placere hver halvkugle ned på sin mediale overflade. Derefter gøreen 50-70 ° snit (50-70 ° tværgående) langs ryggens kant af hver halvkugle 13,14.
  4. Lim hver halvkugle med nyslået overflade på udskæring platform sektionering systemet. Platformen bør være omfattet af precarbogenated iskold Gey løsning.
  5. Skær 350 um 50-70 ° tværgående skiver fra anterior til posterior side ved hjælp af et vibratom justeres for at minimere z-aksen svingning. Den hippocampale dannelse, subicular og entorhinal cortex, samt cortex, der er placeret dorsolaterale til hippocampus vil være en del af de skiver, der anvendes til forsøg 13,14.
  6. Overførsel hippocampusskiver til en U-form og neddykket typen inkubator og inkuberes i mindst 2 timer ved 32 ° C med carbogenated kunstig cerebrospinalvæske (ACSF indeholdende i mM: 110 NaCI, 2,5 KCI, 2,5 CaCl2 · 2H 2 O 1.5 magnesiumsulfat 4 · 2H 2 O 1,24 KH 2PO 4, 10 Glucose · H2OO, 27,4 NaHCO3, pH 7,3) 1,2,10,16.

2. Placering af elektroder, Baseline Optagelse, og induktion af LTP

  1. Overfør hippocampale skive til en nedsænket typen optagelse kammer monteret under et mikroskop. Perfundere (6-7 ml / min) med carbogenated ACSF i mindst 30 minutter ved 32 ° C.
  2. Forbered glaskapillar mikroelektroder fyldt med ACSF (tip modstanden er 3-5 MQ).
  3. Placer en glasmikroelektroder fyldt med ACSF i CA1 Schaffer-sikkerhed fibre til stimulering og i CA1-stratum radiatum til fEPSP optagelse 1,2,10 (figur 2). Afstanden mellem elektroderne skal være omkring 300 um.
  4. Evoke feltet Excitatoriske postsynaptiske potentialer (fEPSPs) ved stimulering af Schaffer-sikkerhedsstillelse fibre med bifasisk rektangulære strømpulser (200 ms / polaritet) i en række på 3-4 V.
  5. Udfør den maksimale stimulering prøve ved måling InPut-output relationer og definere den stimulering styrke som 40% af den maksimale fEPSP skråninger opnåede værdier og holde det konstant gennem hele eksperimentet.
  6. Begynd baseline optagelse i mindst 15 minutter efter at det maksimale stimulation test. Mål svarene til at teste stimuli hvert minut under hele forsøget. Udfør baseline optagelser med lavfrekvent stimulation.
  7. Optag baseline i mindst 30 minutter.
  8. For sent-LTP induktion anvende højfrekvente 100 Hz tetanization bestående af tre 1 sek stimulustog ved 100 Hz med en 5 min intertrain interval. For at øge området for stimulering inden CA1 område 5 uM bicucullin kan vaskes i 2 min før tetanization og bør vaskes umiddelbart efter sidste tetanization.

3. Indsamling af Skiver efter induktion af LTP og lynfrysning

  1. Stop LTP optagelse 2 min eller 30 min efter tre tog i tetanisk stimulering inducerende Late-LTP.
  2. Saml hver skive i et 1,5 ml rør og opbevares ved -80 ° C.

4. Isolering af nukleare berigede fraktioner fra CA1-regionen i hippocampus

  1. Tag 1,5 ml Eppendorf-rør med de frosne skiver fra -80 ° C og holde dem på is.
  2. Tilsæt 0,5 ml frisk kold TBS-buffer indeholdende protease (PI) og phosphatase (PS) hæmmere, ind i røret. Inkuber i 2-3 min og overføre til et stereomikroskop. ADVARSEL: Brug beskyttelseshandsker og en kittel, mens du arbejder med PI og PS.
  3. Skær CA1-stratum pyramidale region af hippocampus under anvendelse af to nåle. Brug en nål til at holde skive under stereomikroskop, og den anden nål til at skære CA1-området.
  4. Saml det dissekerede CA1-regioner fra 5 skiver (for hver gruppe) til en ny 1,5 ml rør indeholdende 50 pi lysisbuffer (1x hypotonisk lysis buffer indeholdende i mm: 10 HEPES, 1,5 MgCl2, 10 KCI, pH 7,9, med PI og PS). Bemærk, at denne mængde af materiale vil være tilstrækkeligt til at køre 2-3 immunblots.
  5. Homogeniseres indsamlet væv ved forsigtig pipettering op og ned. Brug en 200 pi pipette. Inkubér lysatet på is i 5-7 min for at tillade cellerne at svulme.
  6. Tag 2 pi af lysatet falde på mikroskopisk objektglas, og visualisere ekspandering af cellerne under et lysfelt mikroskop. Med korrekt hævelse af cellerne kernerne vises som runde intakte strukturer.
  7. Saml 20 ul prøve i et frisk 1,5 ml rør som "homogenisat fraktion«. Tilføj 8 pi denaturering 4x SDS prøve buffer.
  8. Centrifuger de resterende lysater ved 11.000 rpm i 1 min.
  9. Indsamle forsigtigt supernatanten fra toppen (cytosol fraktion), stansfer ind i et nyt rør, og der tilsættes 20 ul 4x prøvebuffer.
  10. Resuspender pellet i 60 pi af hypotonisk buffer, og der tilsættes 20 ul 4x prøvepuffer. Denne fraktion betegnes som et "atom fraktion '.
  11. Homogenat cytosoliske og nukleare berigede fraktioner kan opbevares ved -20 ° C eller -80 ° C til senere immunblotting.

5. semikvantitativ Immunoblotting til Synapto-kerneproteiner

  1. Defreeze prøverne og kog dem i 5 min ved 95 ° C.
  2. Tag 5 mikroliter fra hver fraktion og bestemme koncentrationen protein ved amidosort test eller BCA test.
  3. Load samme mængde protein prøver fra homogenatet, cytoplasmatiske og nukleare berigede fraktioner på SDS-PAGE. Prøver fra kontrol og LTP skiver skal placeres på samme gel til direkte sammenligning.
  4. Udfør en standard western-blotting-procedure (våd overførsel anbefales).
  5. Probe membranerne med than antistof valg. Efterfølgende samme blots (eller samme prøver sideløbende) kan probes med et cytoplasmatisk markør - neuron specifik enolase2 (NSE2) og nuklear markør - Neun og en actin antistof som en belastning kontrol.

6. Dataanalyse

  1. Effektivitet af LTP induktion kan analyseres ved Clampfit software. Den gennemsnitlige hældning af baseline optagelser blev sammenlignet med skråninger efter tetanization ved hjælp af to-vejs ANOVA, p <0,05 blev betragtet som signifikant forskellige. De fEPSP hældning værdier blev afbildet i diagrammerne som middelværdi ± SEM
  2. Til kvantificering af immunblots, scanne enten det autoradiografiske film og analysere den integrerede tæthed af proteinbånd ved ImageJ eller fluorescens bands med et Licor system. Værdier af immunoreaktive bånd skal normaliseres til lastning og blotting kontrol. Til sammenligning af kontrollen og LTP grupper en nonparametrical Mann-Whitney U-test kan anvendes.
Navn på bufferen Reagens Koncentration (mM) Beløb Kommentarer / Beskrivelse
Gey opløsning (pH: 7,3 ~ 7,4) NaCl 130 7,6 g sterilfiltrering
1000 ml KCI 4.9 0,37 g
CaCl2 · 2H 2 O 1.5 0,22 g
MgSO4 · 2H 2 O 0,3 0,0739 g
MgCl2 · 6H 2 O 11 2,24 g
KH 2 PO4 0,23 0,0313 g
Na 2 HPO 4 · 7H 2 O 0.8 0,2145 g
Glucose · H2O 5 0,9909 g
HEPES 25 5,96 g
NaHCO3 22 1,85 g
ACSF (pH: 7,3 ~ 7,4) NaCl 110 6,428 g sterilfiltrering
1000 ml KCI 2.5 0,1865 g
CaCl2 · 2H 2 O 2.5 0,368 g
MgSO4 · 2H 2 O 1.5 0,370 g
KH 2 PO4 1.24 0,169 g
Glucose · H2O 10 1,9817 g
NaHCO3 27.4 2,3 g
1x Hypotonisk puffer (pH: 7,9) HEPES 10 0,23 g
100 ml MgCl2 · 6H 2 O 1.5 0,0304 g
KCI 10 0,07455 g

Tabel 1. buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tidligere vist, at synapto-kerneprotein messenger Jakob akkumuleres i kernen efter induktionen af LTP, men ikke LTD 1. Desuden translokation Jakobs efter synaptisk stimulering kræver aktivering af MAPK ERK1 / 2 og phosphorylering af Jakob ved Ser180 (figur 1). Phosphoryleret Jacob translokerer til kernen i en importin-afhængig måde, og phosphoryleret tilstand kan bevares i længere perioder ved association med det mellemliggende filamenter αinternexin 15 (figur 1). Phospho-state Jakobs er vigtig for ekspressionen af ​​aktivitet-afhængige gener og celle overlevelse. Interessant aktivering af ekstrasynaptiske NMDARs driver også Jakob ind i kernen, men i dette tilfælde Jakob ikke phosphoryleret ved Ser180 og dets kerneakkumulation inducerer CREB 'slukket' 5,10. De ovenfor beskrevne resultater blev opnået ved protocols etableret i vores seneste undersøgelse (se Karpova et al. 10 for nærmere beskrivelse af modellen).

For at bevise, at Jakob translokerer i kernen efter induktion af LTP, vi induceret og måles induktion af Schaffer sikkerhed fEPSP potensering i akutte hippocampusskiver og isoleres efterfølgende neuronale kerner fra CA1 neuroner (figur 2 og 3). Vi sammenlignede to forskellige tidspunkter efter anvendelse af højfrekvent stimulering (2 minutter og 30 minutter) og registreres induktionen af LTP for hver skive, der efterfølgende blev behandlet for nuklear isolation og western blotting (figur 2 og 3). Berigelse af den neuronale nukleare markør neun kan ses i den nukleare fraktion fremstillet fra dissekeret CA1-regionen, mens cytosolisk markør neuron specifik enolase2 (NSE) er hovedsagelig til stede i supernatanten fraktion opnået efter centrifugering af lyseret calen (figur 4A). Specificiteten af pS180 Jacob antistof er tidligere blevet karakteriseret (for detaljer se Karpova et al. 10). pS180 Jacob niveauer forblev uændret i alt CA1 protein homogenater og i den nukleare fraktion 2 minutter efter tetanization (figur 4B), men vi fandt en signifikant stigning i pJacobS 180 immunreaktivitet 30 minutter efter induktion af LTP (figur 4C), hvilket bekræfter, at Jacob translokere til kernen i denne cellulære plasticitet model er phosphoryleret i Ser180.

Figur 1
Figur 1. Jakob phosphoryleret S180 koder det synaptiske oprindelse NMDARs signaler. Tetaniske stimulering af hippocampale Schaffer collaterale fibre resulterer i aktivering af synaptiske NMDARs og efterfølgende aktivering af MAPKERK1 / 2 signaleringskaskade. Aktiveret ERK1 / 2 binder til og phosphorylerer Jakob ved serin 180 og Jacob-ERK1 / 2 kompleks translokerer til kernen, og dette korrelerer med øget CREB aktivitet og aktivering af plasticitet relateret genekspression.

Figur 2
Figur 2. Udstyr og værktøjer, der anvendes til LTP induktion og dissekere CA1 region fra hippocampusskiver. A) Vibratome anvendt til fremstilling af akutte hippocampusskiver (1 - Vibratome) B1-2) Elektrofysiologi og billedbehandling opsætningen (2 - Microscope, 3 - mikromanipulator og perfusion system 4 - omkodning elektrode; 5 - Stimulation elektrode; 6 - Vand objektiv ; 7 - Slice holder med hippocampus skive) c) materialer anvendt til dissektion af CA1 region fra hippocampusskiver (8. Stereomicroscope; 9 - insulinsprøjte med nåle; 10 - Små kirurgiske saks; 11 - Skalpel, 12 - Plastic Pasteur-pipette, 13 - tynd spatel, 14-100 mm plast dyrkningsskål fyldt med is-vand, og 40 mm plast dyrkningsskål bruges til dissektion af skiver.

Figur 3
Figur 3. Cartoon demonstrerer den eksperimentelle procedure. Tallene angiver trin i protokollen. 2,1-2,8) En akut hippocampus skive i neddykket kammer med glas elektroder placeret i stratum radiatum til potensering af Schaffer sikkerhedsstillelse-CA1 synapser. Det indsatte repræsenterer prøve fEPSP analoge spor, den vandrette bjælke angiver 5 ms og den lodrette linje angiver 0,5 mV. 3.3) Skiverne blev opsamlet i 1,5 ml rør efterLTP optagelse og hurtigt nedfrosset. 4.3) Dissektion af CA1-region fra voksne rotte hippocampale skiver. 4,4-4,5) CA1 regioner homogeniseret i hypotonisk lyseringspuffer, som forårsager osmotiske hævelse af celler og frigivelse af cellekerner. 4.8) Centrifugering af lysater ved 11.000 rpm i 1 min. 4.10) Indsamling af de cytoplasmatiske og nukleare berigede fraktioner til immunblotting. 5.3) Loading af cytoplasmatiske og nukleare berigede fraktioner på SDS-PAGE og efterfølgende standard western-blotting.

Figur 4
Figur 4. Induktion af CA1 LTP fører til ophobning af pJacS180 i kernen. A) Immunblot til homogenatet, cytosoliske og nukleare berigede fraktioner af CA1 lysat probet med cytosol og nukleare markører. B) Immunoblotanalyse af pJac-S180 niveau i homogenat 2 min og 30 min efter INDUktion af tetanization. C) Immunoblotanalyse af pJacS180 niveau i nukleare fraktion 2 min og min efter tetanization. Disse resultater er en del af kvantificering graf offentliggjort i Karpova m.fl. 10. Disse repræsentative immunblots er ikke inkluderet i den oprindelige meddelelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De er beskrevet i ovennævnte protokol trin giver vejledning, hvordan man forbereder hippocampus akut skåret fra unge eller voksne rotter, fremkalde og optage LTP, hurtigt dissekere stimuleret område skive, og forberede nukleare fraktion for at studere aktivitet afhængige protein dynamik. Denne fremgangsmåde stammer fra en kombination af flere forskellige metoder, der anvendes uafhængigt af hinanden. Vi optimeret et workflow og giver tilstrækkelig detaljeret for begynderen at oprette deres egne eksperimenter til at studere den subcellulære omfordeling af proteiner ved induktion af LTP. Som et eksempel vil vi vise, at den sene form af LTP inducerer den nukleare ophobning af S180 phosphoryleret Jakob. For at skelne mellem phosphorylering af en allerede eksisterende nukleare pulje af et givet protein og omplantning af dets phosphorylerede form efter synaptisk aktivitet, kan denne tilgang kombineres med styring for totalt indhold af protein af interesse i den nukleare fraktion. Desuden, Testing prøver end forskellige tidspunkter efter LTP induktion kan være meget indsigtsfulde for at studere tidsforløbet af protein aktivering / inaktivering eller nukleare omsætning.

Under forberedelsen af ​​nukleare berigede fraktioner fra stimulerede skiver der er flere metodiske problemer, der skal løses. Først, for at øge antallet af stimulerede neuroner i CA1-regionen og mængden af ​​materiale, immunoblotting anvender vi 5 uM GABAA receptor blocker biccuculine under tetanization. Biccuculine har vist sig at forbedre excitatoriske postsynaptiske potentialer 3.

For det andet, bevarelse af skiver efter induktion af LTP ved hurtig nedfrysning er et afgørende skridt for vellykkede eksperimenter, fordi den mekaniske håndtering af skiver kan fremkalde forskellige typer af aktiviteter, der direkte korrelerer med ændringer i protein modifikationer. For at afkorte den procedure, så meget som muligt, anvender vi en metalstang anbragt på tøris. Slices kan overføres i en dråbe ACSF hjælp plast en Pasteur-pipette og nedfryses inden for en meget få sekunder, når de anbringes på forud afkølet metal.

Den tredje afgørende skridt er berigelsen af ​​kerner i CA1 lysater. Vi anbefaler at overvåge celle hævelse under lup og finde den mest optimale tidspunkt. Nogle gange, når homogenisering af væv ikke blev gjort ordentligt, cellerester stadig i prøverne. Derefter kernepellet kan resuspenderes i lysepuffer igen, vasket i nogle få minutter og derefter centrifugeret for at få en renere kernefraktionen.

Samlet denne protokol kan bidrage til yderligere at explorer rolle forskellige synapto-nukleare messenger proteiner i synaptisk plasticitet. Den samme fremgangsmåde kan anvendes ikke kun til en høj frekvens stimulering induceret LTP men alle andre former for synaptisk plasticitet ligesom LTD, theta-burst LTP, kortvarige plasticitetsmodeller, og andre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
CED 1401 AD/DA converter Cambridge Electronics Design, UK
Stereomicroscope Leica S4E, Germany
Vibrotome Leica VT1000S, Germany
Isolated pulse stimulator A-M Systems, USA Model 2100
Centrifuge Thermo Scientific
SDS-PAGE system Biorad
Cooler Julabo
Bright field Microscope Nikon Eclipse TS100
Cell culture incubator Thermo Electron Corporation
Micromanipulator Luigs & Neumann, SM-5, Germany
Blotting chamber and electric power supplier Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA
Submerged type recording chamber custom made
U-shape and submerged type incubator  custom made
Small surgical scissors
Scalpel
Thin spatula
Plastic Pasteur pipette
Plastic culture dish 
Bunsen beaker
Syringe
Reagents
NaCl Roth Art.-Nr.3957.1 ≥99.5%, p.a., ACS, ISO
KCl Roth Art.-Nr.6781.1 ≥99.5%, p.a., ACS, ISO
CaCl2·2H2O Merck 1.02382.0500 pro analysis
MgSO4·2H2O Merck 5886.05 pro analysis
MgCl2·6H2O AppliChem CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 for molecular biology
KH2PO4 Merck 12034.025 for molecular biology
Na2HPO4·2H2O Merck 1.06574.1000 extra pure
Glucose·H2O Roth Art.-Nr.6887.1 for molecular biology
HEPES Roth Art.-Nr.9105.4 PUFFERAN, ≥99.5%, p.a.
NaHCO3 Merck 1.06329.1000 pro analysis
Protease inhibitor cocktail Roche
Phosphostop Roche
Bicuculline Tocris Bioscience
Isoflurane Baxter
Antibodies
Primary antibodies Company Catalog Number Species
pJac-s180 Biogenes rabbit (diluted 1:100)
NeuN Milipore MAB377 mouse (diluted 1:1,000)
NSE Cell Signaling D20H2 rabbit (diluted 1:1,000)
Beta-actin Sigma A-5441 mouse (diluted 1:5,000)
Secondary antibodies Company Catalog Number Species
IgG HRP conjugated DAKO goat anti-mouse (1:5,000)
IgG HRP conjugated NEB goat anti-rabbit (1:5,000)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6, (2), e17276 (2011).
  2. Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neuroscience. 169, (4), 1520-1526 (2010).
  3. Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8, (3), 289-298 (1998).
  4. Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150, (1), 207-221 (2012).
  5. Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6, (2), e34 (2008).
  6. Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31, (45), 16045-16048 (2011).
  7. Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11, (10), 682-696 (2010).
  8. Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
  9. Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32, (7), 392-401 (2009).
  10. Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152, (5), 1119-1133 (2013).
  11. Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
  12. Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, (44), 17175-17180 (2008).
  13. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130, (1), 19-32 (2003).
  14. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neuroscience. 131, (3), 601-610 (2005).
  15. Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45, (5), 715-726 (2005).
  16. Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98, (2), 145-154 (2000).
  17. Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25, (30), 7032-7039 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics