Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

Bioengineering

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Summary

Gewebezüchtungen Fibroblasten-nativen Matrix ist eine aufstrebende Werkzeug, um eine Stroma-Substrat, das epitheliale Zellproliferation und Differenzierung unterstützt generieren. Hier wird ein Protokoll gemäß dieser Methode die Auswirkung verschiedener stromalen Zelltypen auf Tumor Zellbiologie Beurteilung vorgelegt.

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Ng, Y. Z., South, A. P. Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion. J. Vis. Exp. (85), e51321, doi:10.3791/51321 (2014).

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Abstract

3D organotypischen Kulturen von Epithelzellen auf einer Matrix mit mesenchymalen Zellen eingebettet sind weit verbreitet, um epitheliale Zelldifferenzierung und-invasion zu studieren. Rattenschwanz Kollagen Typ I und / oder Matrix von Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Zellen abgeleitet wurden traditionell als Substrate eingesetzt, um die Matrix oder Stroma-Mikroumgebung, in die mesenchymalen Zellen (in der Regel Fibroblasten) bevölkert modellieren. Obwohl Versuche mit solchen Matrizen sind sehr informativ, kann argumentiert werden, dass wegen eines überwiegenden Vorhandensein eines einzelnen Proteins (wie in Typ-I-Collagen) oder einem hohen Gehalt an Basalmembran-Komponenten und Wachstumsfaktoren (wie z. B. in einer Matrix aus der Maus stamm Sarkom-Zellen), sind diese Substrate nicht spiegeln die besten Beitrag zum Matrix-Zusammensetzung durch die Stromazellen selbst gemacht. Um Mutter Matrizen durch primäre dermale Fibroblasten von Patienten mit einem Tumor isoliert anfällig, genetische Blasenstörung (rezessiven dystrophischen hergestellt studierenEpidermolysis bullosa) haben wir einen bestehenden nativen Matrix-Protokoll, um die Tumorzellinvasion studieren angepasst. Fibroblasten induziert werden, ihre eigene Matrix über einen längeren Zeitraum in Kultur produzieren. Diese nativen Matrix wird dann von der Kulturschale abgelöst und Epithelzellen auf sie ausgesät bevor das gesamte Co-Kultur wird die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche erhöht. Zelluläre Differenzierung und / oder Invasion kann dann über die Zeit beurteilt werden. Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit, epitheliale-mesenchymale Zellwechselwirkungen in einer 3D Umgebung, ohne die Notwendigkeit für eine synthetische oder Fremdmatrix mit dem einzigen Nachteil, dass die längere Zeit erforderlich, um die native Matrix zu beurteilen. Die Anwendung dieser Technik beschreiben wir die Fähigkeit eines einzelnen Moleküls von Fibroblasten, Kollagen VII, um die Tumorzellinvasion hemmen beurteilen.

Introduction

Die Verwendung von Biomaterial in 3D-Gewebekultur Forschern ermöglicht, das Verhalten der Zelle im Labor unter physiologischen Bedingungen eher zu einer in vivo-Umgebung als der eines mit 2D Haftung und einem Kunststoffsubstrat rekapituliert studieren. Insbesondere große Fortschritte in der Modellierung mehrschichtigen Epithelien mit der Annahme der 3D-Kulturmethoden an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche 1-4 gemacht. Solche Techniken getreu nachahmen Keratinozyten-Differenzierung und Tumorzellinvasion ermöglicht größere Flexibilität und Treue für Forscher untersuchen diese Prozesse. Die Wahl der Biomaterial-Substrat, um die Umwelt zu imitieren Stromatumoren wurde in erster Linie die Verwendung von Kollagen Typ I, Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Matrix-und de-epidermized Dermis beteiligt. Zum Beispiel haben Krebs assoziierten Fibroblasten gezeigt, in Richtung der Krebsinvasion 5, Initiierung und Progression über Epithel-Stroma-Wechselwirkungen beitragen 6,7 wohinn in solchen Substraten gewachsen.

Der Goldstandard für die Nachahmung der Stroma-Umgebung, in der Haut, die größten und am häufigsten untersuchten geschichteten Epithelien mit solchen Techniken wird betrachtet, um de-epidermized werden menschlichen Dermis (DED). Vorbereitung des DED beinhaltet die Entfernung der Epidermis über Trypsinierung oder physische Abgrenzung von menschlichen kadaver Haut 3,4. Jedoch kann der Zugriff auf solche Haut sehr schwierig für Laboratorien nicht mit klinischen Einrichtungen zugeordnet sind, und erkrankten Dermis ist fast unmöglich zu erzielen. Als Alternative, Labors verwenden häufig eine Kombination aus Typ I-Kollagen (aus Rattenschwänzen isoliert) und / oder Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Matrix.

Nach der Entdeckung im Jahr 1927 von 8 Nageotte diesem Kollagen kann leicht mit Essigsäure und Salzfällung isoliert werden, wurde ihre Anwendung auf Gewebekultur anschließend von Huzel Pionierla und Kollegen 9. Collagen Beschichtung erwies sich als überlegen zu Glas für die Zellkultur von 29 Stämmen und Gewebeexplantaten wie von Ehrmann und Gey 9 verhört zu sein. Derzeit ist der Haupttyp von Kollagen in der Gewebekultur verwendet, die aus Rattenschwanzsehnen isoliert und wird üblicherweise von kommerziellen Quellen gekauft werden. Allerdings ist der Nachteil für treue Substrat Reprise, dass der Rattenschwanz Kollagen ist nicht identisch mit dem menschlichen Kollagen oder die menschlichen Dermis, wobei Typ I und III Kollagen als Hauptbestandteile vorhanden sind, und isolierten Rattenschwanz Kollagen ist immer fragmentiert.

Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Matrix ist eine gallertartige Proteingemisch durch kultivierte Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Zellen 10 abgesondert. Die Hauptbestandteile sind Laminin, Kollagen Typ IV, Heparinsulfat-Proteoglykan, Entactin und Nidogen und die genauen Verhältnisse von diesen Proteinen wird von Charge zu Charge variieren. Abgesehen von strukturellen ProProteine ​​enthält diese Matrix auch signifikante Mengen an Wachstumsfaktoren, wie den transformierenden Wachstumsfaktor β, epidermaler Wachstumsfaktor, insulinähnlichen Wachstumsfaktor 1, Rinder-Fibroblasten-Wachstumsfaktor und von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor, Zellverhalten 11,12 verändern würde. Zeigt auf die schiere Komplexität des Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Matrix, wurden insgesamt 1.851 Proteine ​​in einer aktuellen Studie 13 Proteom identifiziert. Angesichts der reichen und komplexen Natur dieser Matrix ist Vorsicht wurde bei der Auslegung und Vergleich verschiedener Experimente mit dem Einsatz von IT-11 beraten.

Unsere Labors haben ein großes Interesse in der genetischen Hauterkrankungen, insbesondere solche mit einer Prädisposition zur Entwicklung von kutanen Plattenepithelkarzinomen (Cscc) 14. Im Fall der rezessiven dystrophischen Epidermolysis bullosa (RDEB), einer schweren Erkrankung mit Blasenbildung Keimbahnmutationen im COL7A1-Gen 18. Im Verlauf der Studie konnten wir den Tumor fördernden Eigenschaften von Hautfibroblasten in Kollagen eingebettet I / Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Matrix und untersucht Möglichkeiten zur Bewertung von zelleigenen, nativen Matrix beurteilen. Um dies zu erreichen, modifizierten wir eine vorherige Technik aus dem Labor von Lucie Germain arbeitet auf der menschlichen Haut Äquivalente 19,20. Germain Technik konnte die menschliche Haut mit gut organisierten Basalmembran mit primären humanen Keratinozyten und Fibroblasten-Kulturen in Abwesenheit von einem synthetischen Gerüst oder Kadaver rekonstruieren.

In diesem Beitrag werden die verwendet, um die Haut-Tumor Stroma-Mikroumgebung (native Matrix) rekapitulieren Schritte von primären stromalen Fibroblasten in vitro direkt abgeleitet werden beschrieben 18. Ureinwohner Matrizen pdurch langfristige Kultur von Fibroblasten roduced wurden als dermales Äquivalent zum Assay für Cscc Zellinvasion verwendet. Wir mit nativen Matrix entweder aus der extrazellulären Matrix durch RDEB Fibroblasten (bei Typ-VII-Kollagen (C7)-Mangel) oder von Fibroblasten RDEB retroviral mit einem Kollagen-Typ-VII zum Ausdruck zu konstruieren und zeigen die tiefgreifende Wirkung einer einzelnen Kollagen auf Tumor transduzierten abgesondert abgeleitet präsentieren Daten Zellinvasion.

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Protocol

Diese Studie wurde gemäß der Deklaration von Helsinki Grundsätze durchgeführt und wurde von den zuständigen Ethikkommissionen genehmigt.

1. Herstellung von Medien und Reagenzien

  1. Vorbereitung der 200x von L-Ascorbinsäure-2-Phosphat-Lager
    1. Man löst 29 mg L-Ascorbinsäure-2-phosphat pro 5 ml modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) Lösung nach Dulbecco und filtriert über 0,22 um-Membranfilter. Shop als 0,25 ml Aliquots in sterile -20 ° C
    2. Zugabe von 0,25 ml Aliquot 200x L-Ascorbinsäure-2-phosphat zu jedem Lager 50 ml Fibroblasten-Medium (DMEM mit 1% L-Glutamin und 10% fötalem Rinderserum) am Tag erforderlich ist, für eine Endkonzentration von 0,1 mM L -Ascorbinsäure-2-phosphat.
  2. Herstellung von Keratinozyten-Wachstumsmedium
    1. Isolierung und Kultivierung von primären Keratinozyten SCC zuvor 21 beschrieben. Herstellung von Keratinozyten-Wachstumsmedium beschrieben,darin auch.
    2. Kurz gesagt, bereiten die Medien wie folgt:
      300 ml DMEM und 100 ml Ham F-12 mit 10% FBS
      0,4 mg / ml Hydrocortison
      5 mg / ml Insulin
      10 ng / ml EGF
      5 mg / ml Transferrin
      8,4 ng / ml Choleratoxin
      13 ng / ml liothyronine
      1x Penicillin-Streptomycin-Lösung

2. In-vitro-Konstruktion von Fibroblasten-Mutter Matrix in L-Ascorbinsäure-2-Phosphat ergänzten Medium

  1. Saatgut 200000 Fibroblasten pro Well in 6-Well-Platten (20000 Zellen / cm 2) in Fibroblastenmedium mit L-Ascorbinsäure-2-Phosphat ergänzt. Nachspeise alle 2-3 Tage mit 2-5 ml Medium. (Anmerkung: Refeeding Frequenz und Lautstärke eingestellt werden, um die individuellen Bedürfnisse der verschiedenen Zellen angepasst werden Siehe "Diskussionen".).
  2. Eine dicke Schicht von Zellen in der extrazellulären Matrix eingebettet wird am Ende von 6 Wochen mit bloßem Auge (bilden
  3. Lassen Sie die native Matrix Schwimmer und renovieren für 5 Tage, verändernden Medien alle 2-3 Tage. Aufgrund Zugfestigkeit und Grenz Umbau in der Matrix wird die Matrix drastisch schrumpfen und sich verringert, um eine kleinere, aber dicker nativen Matrix, und ist bereit, für Invasionsassay verwendet werden.

3. Invasion Assay mit Tumor SCC Keratinozyten

  1. Nehmen Sie den nativen Matrix vorsichtig mit stumpfen Pinzette und Transfer zum Nylon Netz. Einmal auf dem Nylon-Netz, verteilt die Matrix vorsichtig, um so flach wie möglich mit einer 1 ml Mikropipette liegenSpitze und stumpfe Pinzette.
  2. Vorbereitung der sterilen klonalen Zylinder durch Bestreichen einer kleinen Menge von steriler Vaseline an einem Ende.
  3. Legen Sie die klonalen Zylinder auf dem nativen Matrix, mit der Vaseline Seite nach unten. Dies ist, um eine dichte Abdichtung zwischen der Matrix und den nativen klonalen Ringe gewährleisten.
  4. Hinzufügen Cscc Zellen an die klonale Zylinder (250.000 Zellen in 100 ul Keratinozyten-Wachstumsmedium).
  5. Entfernen Sie die klonalen Zylinder nach 6 Stunden, wenn die Cscc Zellen haben sich auf dem nativen Matrix besiedelt.
  6. Heben Sie die Nylon-Netz mit dem nativen Matrix und Cscc Zellen an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche auf gebogenen Edelstahl-Drahtgewebe-Unterstützung.
  7. In Keratinozyten mit Ascorbinsäure ergänzt Wachstumsmedien, bis die Medien-Ebene den Boden des nativen Matrix berührt.
  8. Ändern Medien alle 2-3 Tage und die Ernte bei 7 und 14 Tage nach der Aussaat von Cscc Zellen.

4. Die Ernte der Kulturen und 3D-Vorbereitung für Histologie

  1. Fix in 4% paraformaldehyde über Nacht bei Raumtemperatur.
  2. Halbierung der Proben und einbetten in Wachs für Formalin-fixierten Paraffin eingebettete Blöcke, mit der Schnittfläche nach außen.
  3. Alternativ in OCT eingebettet werden die Proben halbiert und Snap-freeze sofort in flüssigem Stickstoff gefrorenes Frischgewebeblöcke.
  4. 4 um-Schnitte geschnitten auf Mikrotom und Entwachsen (falls erforderlich). Färben mit Standard Hämatoxylin und Eosin. Um die Cscc Zellen sichtbar, monoklonalen Maus-Antikörper gegen Keratin 14 (LL001, in-house) in Immunhistologie Färbung verwendet werden.

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Representative Results

Diese Technik eröffnet die Möglichkeit der Prüfung und Vergleich der invasive Verhalten von Tumorzellen (in diesem Fall Cscc) unter verschiedenen 3D Stromazellen Umgebungen. Mit dieser Technik kann nicht nur C7-defizienten nativen Matrizen, die die Haut RDEB Umwelt rekapituliert erzeugt werden, sondern auch zusätzliche Matrizen, die genetisch zu über-express C7 18 konstruiert wurden. Wie in Abbildung 2 zu sehen, Verletzung der RDEB Cscc Keratinozyten war in C7-Überexpression nativen Matrizen deutlich verzögert im Vergleich zum C7-defizienten RDEB Kontrolle. Dieses Eindringen wird durch histologische Standardmethoden, bei denen die Gele fixiert, in Paraffinblöcke eingebettet und dann geschnitten und immunhistochemisch visualisiert. Empfohlene Antikörper für die Färbung verwenden, sind anti-Keratin 14 (LL001) für Cscc Zellen und anti-Vimentin (V9) für Fibroblasten.

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Fig. 1 ist. Workflow von Generation des Fibroblasten-nativen Matrix und der Tumorinvasion-Assay. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
2. Keratin 14 (LL001) Färbung der Cscc Invasion in die Muttermatrix aus Steuer RDEB C7 in Fibroblasten-Mangel abgeleitet (ai & bi) oder in Fibroblasten RDEB Überexpression in voller Länge C7 Ausdruck (aii und bii), zeigt deutlich, dass die Re-Expression von C7 in der extrazellulären Matrix können Cscc Keratinozyten-Invasion zu verzögern. Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt (in blau) und Fibroblasten mit Vimentin (grün) in bi-und bii.

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Discussion

Aufgrund der Natur des Experiments kann die Gesamtzeit für die Durchführung notwendig bis zu zwei Monaten. Während dieser Zeit müssen größter Sorgfalt und sterile Gewebekulturpraktiken eingesetzt werden, um mikrobielle Kontamination zu verhindern.

Abgesehen von ihrer Rolle als Cofaktor bei der Synthese von Hydroxyprolin und Hydroxylysin von Kollagenen, Kollagen stimuliert Ascorbinsäure spezifischen mRNA-Expression in Fibroblasten 22. Die Ascorbinsäure der Wahl ist hier die stabilere L-Ascorbinsäure-2-phosphat-23. Rückführung wird dreimal pro Woche empfohlen aber unweigerlich von den Zellen untersucht werden. Die ersten Fibroblasten-Kulturen mehr Nährstoffe verbrauchen als die Wochen vergehen, und häufiger Rückführung mit größeren Volumina Medien sinnvoll sein. Es ist wichtig, sanft zu sein beim Medienwechsel und darauf zu Störungen während der nativen Matrixproduktion auf die Zellschicht zu minimieren.

Die Matrix sollte sichtbar werden üblicherweise nach 2 Wochen, insbesondere um den Umfang des Bohrlochs. Selten wird die Matrix selbst ohne mechanische Störung zu befreien. Dies ist eine Reflexion der inneren Umbau der Matrix und der Zugfestigkeit, die die Matrix nach innen zieht, sondern kann auch ein Zeichen, dass der Umfang des natürlichen Matrix während der Medienwechsel gestört werden.

Beim Loslassen und die Befreiung der Matrix Zellschicht von der Platte, muss man darauf achten, nicht um Löcher durch die Matrix stecken können. Kleine stumpfen Schaber Zelle kann auch anstelle von 1 ml Mikropipettenspitzen verwendet werden. Platzierung des frei nativen Matrix auf einer Nylon-Netz ersten (wobei Sie auf die native Matrix flach) sorgt für viel einfacher Handhabung und anschließenden Aufhebung zu dem Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche.

Dieses Protokoll ist die erste zu beschreiben,Die Verwendung von nativen Fibroblasten dermale Matrix als Substrat, um die Mikroumgebung in der Tumorzellassays, um zu modellieren, um eine genauere und physiologisch relevante Daten zu erhalten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

APS wird von Debra International und der British Skin Foundation. University of Dundee Partnerschaft PhD-Programm - Yzn wird von A * STAR unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960
DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate Life Technologies 11995-073
100x Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15070
Vaseline VWR PROL28908.290
Clonal cylinders Sigma Z370789
Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk Millipore NY1H02500
Bent stainless steel wire mesh support Made in house Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates

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References

  1. Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211, (4486), 1052-1054 (1981).
  2. Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159, (2), 536-539 (1985).
  3. Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81, (1 Suppl), 28-33 (1983).
  4. Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24, (4), 357-362 (1979).
  5. Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9, (12), 1392-1400 (2007).
  6. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, (7015), 332-337 (2004).
  7. Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17, (2), 135-147 (2010).
  8. Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56, (4), 558-569 (1954).
  9. Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16, (6), 1375-1403 (1956).
  10. Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, (2), 312-318 (1986).
  11. Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202, (1), 1-8 (1992).
  12. BD Biosciences - Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. Available from: http://SPC-356230 Rev 5.0 Forthcoming.
  13. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10, (9), 1886-1890 (2010).
  14. Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. Forthcoming.
  15. Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269, (32), 20256-20262 (1994).
  16. Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90, (3), 1032-1036 (1992).
  17. Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89, (3), 974-980 (1992).
  18. Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72, (14), 3522-3534 (2012).
  19. Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
  20. Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73, (11), 1751-1757 (2002).
  21. Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
  22. Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58, (6), 553-559 (1985).
  23. Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138, (1), 8-16 (1988).

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