सभ्य कोशिकाओं में अंतर और बाह्य एस्कोर्बेट के निर्धारण के लिए एक तेजी से और विशिष्ट Microplate परख

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

एस्कोर्बेट ही हाल के वर्षों में प्रकाश में आए हैं, जिनमें से कई सेलुलर चयापचय में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. यहाँ हम एक मध्यम throughput, सेल संस्कृति में दोनों अंतर और बाह्य एस्कॉर्बेट के निर्धारण के लिए विशिष्ट और सस्ती microplate परख का वर्णन.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lane, D. J., Lawen, A. A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (86), e51322, doi:10.3791/51322 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

विटामिन सी (एस्कॉर्बेट) केवल हाल के वर्षों में प्रकाश में आए हैं, जिनमें से कई सेलुलर चयापचय में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. मस्तिष्क एस्कॉर्बेट homeostasis के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है कि एक रिश्ता - उदाहरण के लिए, मस्तिष्क के भीतर, एस्कॉर्बेट न्यूरॉन्स और पड़ोसी astrocytes के बीच एस्कॉर्बेट साइकिल चलाना शामिल है कि एक neuroprotective और neuromodulatory ढंग से काम करता है. इसके अतिरिक्त, उभरते सबूत जोरदार एस्कॉर्बेट प्रतिष्ठित मान्यता प्राप्त है की तुलना में सेलुलर और प्रणालीगत लोहे के चयापचय को विनियमित करने में एक बहुत विस्तृत भूमिका है कि पता चलता है. सामान्य और नियंत्रण मुक्त सेलुलर और जीवधारी शरीर क्रिया विज्ञान में एस्कॉर्बेट का अभिन्न भूमिका की बढ़ती मान्यता अत्यधिक महंगा विशेषज्ञ उपकरणों की आवश्यकता के बिना क्रियान्वित किया जा सकता है कि मध्यम throughput और उच्च संवेदनशीलता विश्लेषणात्मक तकनीकों की एक श्रृंखला की मांग करती है. यहाँ हम एक मध्यम प्रवाह के लिए स्पष्ट निर्देश, बो के निर्धारण के लिए विशिष्ट और अपेक्षाकृत सस्ती microplate परख प्रदानसेल संस्कृति में वें अंतर और बाह्य एस्कॉर्बेट.

Introduction

1928 से 1934 के 1 को प्रकाशित पत्र में एस्कॉर्बिक अम्ल (विटामिन सी), और लंबे समय से मांग अल्बर्ट Szent-Györgyi द्वारा "विरोधी स्कर्वीजनक कारक", और दूसरों के रूप में अपनी पहचान की रासायनिक प्रकृति की खोज के इतिहास में मील का पत्थर घटनाओं थे जैव रसायन की. दरअसल, इन खोजों, Szent-Györgyi 1937 में फिजियोलॉजी या चिकित्सा के नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया जा रहा है. पौधे और पशु शरीर क्रिया विज्ञान में एस्कॉर्बेट के लिए भूमिकाओं का कभी विस्तार सूट, साथ ही मानव स्वास्थ्य के लिए योगदान सक्रिय वैज्ञानिक के विषयों होना जारी जांच और विवाद.

एल एस्कोर्बेट एक प्रचुर मात्रा में शारीरिक reductant है और स्तनधारी प्रणालियों में cofactor एंजाइम, और कोलेजन hydroxylation, carnitine और norepinephrine जैवसंश्लेषण, tyrosine चयापचय और पेप्टाइड हार्मोन amidation 2 से जुड़े कई अच्छी तरह से परिभाषित एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के लिए योगदान. दिलचस्प, बढ़ते evidence एस्कॉर्बेट ऐसे hydroxylation में शामिल prolyl और asparaginyl hydroxylases के रूप में अन्य आयरन निर्भर dioxygenases, उत्तेजक और hypoxia-inducible कारक (HIFs) 1α और 2α 3 की लक्षित करने में एक भूमिका निभाता है पता चलता है. एक ताजा रिपोर्ट एस्कॉर्बेट परमाणु hydroxylases, Jumonji सी (JmjC) डोमेन प्रोटीन उत्तेजक में अपनी गतिविधि के माध्यम से chromatin demethylation को प्रभावित करने के माध्यम से टी सेल परिपक्वता में एक भूमिका निभाता है पता चलता है कि; जो बाद की पूरी गतिविधि 4 के लिए एस्कॉर्बेट की आवश्यकता दिखाई देते हैं. दरअसल, एस्कॉर्बेट द्वारा इस तरह के एंजाइम की उत्तेजना HIF और कोलेजन hydroxylases की एस्कॉर्बेट से उत्तेजना के लिए एक समान तंत्र द्वारा घटित होता है. अन्य शास्त्रीय प्रभाव के अलावा, एस्कॉर्बेट एक पानी में घुलनशील चेन तोड़ने कट्टरपंथी मेहतर के रूप में 5 सेलुलर ऑक्सीकरण को रोकना अथवा उसे कम करना करने के लिए और प्लाज्मा झिल्ली की रीसाइक्लिंग के लिए महत्वपूर्ण योगदान α-tocopherol डब्ल्यू, 6 α-tocopheroxyl कट्टरपंथी की कमी के माध्यम से (विटामिन ई)hich झिल्ली लिपिड peroxidation 7 के खिलाफ की रक्षा करने में महत्वपूर्ण है. सबसे स्तनधारियों डी ग्लूकोज से एस्कॉर्बेट की नए सिरे से यकृत संश्लेषण करने में सक्षम हैं, हालांकि महत्वपूर्ण बात है,, उच्च primates, गिनी सूअरों और कुछ चमगादड़ विटामिन 8 की आहार स्रोतों पर निर्भर हैं. इस GULO जीन की निष्क्रियता की वजह से है, अप्रभावित स्तनधारियों में जो की orthologues 9-13 oxidase एंजाइम, γ-gulono-लैक्टोन सांकेतिक शब्दों में बदलना. इस एंजाइम ग्लूकोज 13 से एस्कॉर्बेट biosynthesis में अंतिम प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है.

इंसानों में आंतों लुमेन से ट्रांसपोर्टर की मध्यस्थता अवशोषण के बाद, एस्कॉर्बेट संचार प्रणाली से पूरे शरीर में वितरित किया जाता है. विटामिन आमतौर पर (सांद्रता आम तौर पर प्रचलित प्लाज्मा एकाग्रता के समान हैं जिसमें एरिथ्रोसाइट्स की उल्लेखनीय अपवाद के साथ) intracellularly millimolar सांद्रता पर और micromolar सान्द्र में अपनी कम के रूप में पाया जाता हैसबसे बाह्य तरल पदार्थ 14,15 में entrations (जैसे 50-200 माइक्रोन).

शारीरिक शर्तों के तहत, एस्कॉर्बेट आमतौर पर Ascorbyl मुक्त कणों को एक प्रतिवर्ती एक इलेक्ट्रॉन ऑक्सीकरण की प्रक्रिया से गुजरते (AFR; भी monodehydroascorbate या semidehydroascorbate के रूप में जाना जाता है). AFR वापस एस्कॉर्बेट को अपनी तेजी से एक इलेक्ट्रॉन एंजाइमी कमी के अभाव में, एक अपेक्षाकृत स्थिर कट्टरपंथी 16 है, वहीं दो AFRs एक एस्कॉर्बेट और एक dehydroascorbate (डीएचए) 9,13,17 को dismutate आगे कर सकते हैं. सेल के इंटीरियर के भीतर, एस्कॉर्बेट, DHA के दो इलेक्ट्रॉन ऑक्सीकरण उत्पाद, तेजी से glutathione-और NAD (पी) एच निर्भर एंजाइमी और गैर एंजाइमी प्रतिक्रियाओं 13 से वापस एस्कॉर्बेट को कम किया जा सकता है.

यह प्रतिष्ठित लोहे के चयापचय में एस्कॉर्बेट की ही महत्वपूर्ण भूमिका गैर heme लोहे 18 के आहार अवशोषण को प्रोत्साहित करने के लिए है कि स्वीकार कर लिया है, वहीं हम और दूसरों के सबूत प्रदान की हैtrongly कि एस्कॉर्बेट सुझाव इस धातु के चयापचय में एक बहुत विस्तृत भूमिका निभाता है. सबसे पहले, एस्कॉर्बेट-परिपूर्ण कोशिकाओं द्वारा जारी की है कि एस्कॉर्बेट कोशिकाओं 19,20 द्वारा गैर transferrin जाने वाली लोहे की तेज नियमन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और बहुत हाल ही में सबूत एस्कॉर्बेट भी transferrin जाने वाली लोहे की तेज modulates इंगित करता है कि प्रतीत होता है कोशिकाओं 21 से, जिनमें से बाद के एक प्रमुख शारीरिक लौह तेज मार्ग 22 से मेल खाती है.

एस्कोर्बेट स्तनधारियों 23,24 में सामान्य केंद्रीय तंत्रिका तंत्र समारोह के लिए आवश्यक है. साथ में अधिवृक्क प्रांतस्था, पिट्यूटरी ग्रंथि, थाइमस, रेटिना और पीत - पिण्ड के साथ, मस्तिष्क शरीर के अन्य ऊतकों 23,25-27 को एस्कॉर्बेट रिश्तेदार की उच्च सांद्रता शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, astrocytes 28,29 और न्यूरॉन कोशिकाओं की तरह ग्लूटामेट 30 दोनों के लिए जोखिम जहां ascorbat बाह्य अंतरिक्ष में एस्कॉर्बेट की रिहाई को ट्रिगर करने के लिए जाना जाता हैई ग्लूटामेट प्रेरित neuronal शिथिलता 31 के खिलाफ न्यूरॉन्स की रक्षा में मदद करने के लिए सोचा है. Astrocytes से ग्लूटामेट प्रेरित एस्कॉर्बेट रिहाई की सटीक व्यवस्था अज्ञात है, हम हाल ही में astrocyte ग्लूटामेट और एस्पार्टेट ट्रांसपोर्टर (GLAST द्वारा ग्लूटामेट तेज की वजह से सूजन सेल की भागीदारी का संकेत सबूत प्रदान की है, यह भी जाना जाता है उत्तेजक अमीनो एसिड ट्रांसपोर्टर isoform 1 [EAAT1 ] मानव में) और इस तरह एस्कॉर्बेट 32 के रूप में छोटे कार्बनिक anions को पारगम्य हैं कि मात्रा के प्रति संवेदनशील osmolyte और आयनों चैनल (VSOACs) के फलस्वरूप सक्रियण. VSOAC गठन में शामिल प्लाज्मा झिल्ली conduits के आणविक पहचान 33,34 पहचाना जा रह है.

कई assays, spectrophotometric fluorometric और chromatographic assays 35,36 में शामिल हैं जो जैविक नमूने में एस्कॉर्बेट के निर्धारण के लिए विकसित किया गया है, विशिष्टता, संवेदनशीलता, interferenc में ज्यादा परिवर्तनशीलता हैरासायनिक contaminants, प्रभावी रैखिक सीमा और समापन बिंदु analyte की स्थिरता से ई. इसके अतिरिक्त, परख के चुनाव को प्रभावित करने वाले अन्य महत्वपूर्ण कारकों तेज़ी, उपयोग की आसानी और इस तरह के एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) उपकरण के रूप में अपेक्षाकृत विशेष उपकरणों के लिए उपयोग कर रहे हैं.

यहाँ हम सभ्य कोशिकाओं में intracellular एस्कॉर्बेट का दृढ़ संकल्प है, साथ ही संवर्धित कोशिकाओं से एस्कॉर्बेट-तपका के निर्धारण के लिए एक अलग परख के लिए एक सरल और अति विशिष्ट वर्णमिति microplate परख उपस्थित थे. उत्तरार्द्ध परख के कारण सोडियम निर्भर एस्कॉर्बेट ट्रांसपोर्टरों (SVCTs) द्वारा जारी एस्कॉर्बेट के तेजी से फिर से तेज करने के लिए कोशिकाओं से एस्कॉर्बेट रिहाई के मूल्यवान समझना की समस्या को दरकिनार करना है. इन तरीकों के दोनों हमारे पिछले प्रकाशनों 19,20,32,37,38 में से कुछ में दिखाई दिया है, यद्यपि यह पांडुलिपि निर्देश और उनके प्रभावी क्रियान्वयन के लिए दिशा निर्देशों का एक स्पष्ट सेट प्रदान करता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. संवर्धित कोशिकाओं में intracellular एस्कोर्बेट निर्धारण करें

  1. सेल संस्कृति और कटाई
    1. मानक संस्कृति प्रक्रियाओं 19-21,32,38 का उपयोग निलंबन (जैसे मानव erythroleukemia, K562) या पक्षपाती कोशिकाओं (जैसे प्राथमिक astrocytes) बढ़ें. नोट: कोशिकाओं, एस्कॉर्बेट होते एस्कॉर्बेट या तो एस्कॉर्बेट या DHA 33,39 रूप से संवर्धित कोशिकाओं को लोड करने के लिए सुनिश्चित.
  2. एक एस्कॉर्बेट युक्त सेलुलर निकालने बनाएँ
    1. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) धोया निलंबन या बहुत ठंडा सेल Permeabilization बफर [CPB के 450 μl के साथ पक्षपाती कोशिकाओं का एक उचित संख्या सेते हैं; पीबीएस में 0.1% (w / v) सैपोनिन; 4 डिग्री सेल्सियस]. नोट: अनुभव से अंत उपयोगकर्ता द्वारा (नीचे देखें) परख के रैखिक सीमा के भीतर एक absorbance मूल्य प्राप्त करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं. नोट: ऊतक के अर्क भी (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें) का उपयोग किया जा सकता है.
    2. हिलाओ10 मिनट के लिए बर्फ पर ते कोशिकाओं को पूरी तरह से सेलुलर सेल सुनिश्चित करने के लिए.
    3. एक प्रशीतित microcentrifuge (4 डिग्री सेल्सियस) में 5 मिनट के लिए 16,000 × छ पर कच्चे lysate के centrifugation द्वारा सेलुलर मलबे को हटाने के द्वारा एक स्पष्ट एस्कॉर्बेट युक्त intracellular निकालने बनाएँ.
    4. ध्यान से प्रत्येक नमूने से 4 x 100 μl aliquots हटाने और अच्छी तरह से केवल या 25 μl / अच्छी तरह से 45.5 यू के पीबीएस ('ए ओ ") का 25 μl / या तो होता है कि एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे की थाली में वेल्स की एक क्षैतिज अनुक्रम को जोड़ने / मिलीलीटर पीबीएस ("+ एओ") में एल एस्कॉर्बेट-oxidase (एओ) के शेयर समाधान. नोट: इस (नीचे देखें) मानकों की तैयारी के साथ समानांतर में किया जाना चाहिए.
  3. एस्कोर्बेट मानक वक्र निर्माण (प्रत्येक परख के लिए नए सिरे से निर्माण किया जाना चाहिए)
    1. ठंडा पीबीएस में 10 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड का एक शेयर समाधान तैयार करें. नोट: spectrophotometrically एक 1 के साथ एक क्वार्ट्ज क्युवेट का उपयोग एस्कॉर्बेट की एकाग्रता सत्यापित करें265 एनएम (विलुप्त होने गुणांक = 14.5 मिमी -1 सेमी -1) 40 सेमी पथ लंबाई.
    2. ध्यान से 0 और 20 माइक्रोन के बीच एस्कॉर्बेट मानकों की एक श्रृंखला तैयार करते हैं.
    3. कदम 1.2.4 के साथ समानांतर में, ध्यान से प्रत्येक मानक से 4 × 100 μl aliquots हटाने और पीबीएस ('ए ओ ") या एक के 25 μl / अच्छी तरह से होता है कि एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे की थाली में वेल्स की एक क्षैतिज अनुक्रम को जोड़ने पीबीएस में एओ ("+ एओ") की 45.5 यू / एमएल शेयर समाधान. नोट: ऊपर एस्कॉर्बेट मानकों के 100 μl एस्कॉर्बेट की 0-2 nmole शामिल होंगे. कृपया ध्यान दें, ए ओ के उद्देश्य कमी ferricyanide को गैर एस्कॉर्बेट reductants के योगदान के लिए नियंत्रित करने के लिए है.
  4. Intracellular एस्कॉर्बेट निर्धारण करें - चरण 1: चुनिंदा एस्कॉर्बेट हटाने और मात्रात्मक ferricyanide साथ एस्कॉर्बेट oxidize
    1. Orbitally पन्नी में थाली कवर द्वारा अंधेरे में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 550 rpm पर 96 अच्छी तरह से थाली मिश्रण. नोट: टीउसके कदम DHA के लिए "+ एओ" कुओं में सभी एस्कॉर्बेट oxidize चाहिए. "ए ओ" कुओं अप्रभावित होना चाहिए.
    2. सभी कुओं को पीबीएस में (यहाँ "ferricyanide" के रूप में संदर्भित) 3.5 मिमी पोटेशियम ferricyanide के 50 μl जोड़ें. अंतिम [ferricyanide] = 1 मिमी. नोट: एक multipipettor का प्रयोग करें.
    3. Orbitally अंधेरे में एक और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 550 rpm पर थाली मिश्रण. नोट: यह चरण ऑक्सीकरण एस्कॉर्बेट का 1 अणु प्रति कम ferricyanide के 2 अणुओं की एक stoichiometric अनुपात में एस्कॉर्बेट द्वारा ferrocyanide को ferricyanide की कमी में परिणाम चाहिए.
    4. इसके तत्काल बाद 50% (v / v) एसिटिक एसिड और 30% (w / v) Trichloroacetic एसिड (टीसीए) युक्त एक नया निर्माण समाधान के 25 μl जोड़ें. नोट: एक multipipettor का प्रयोग करें.
  5. Intracellular एस्कॉर्बेट निर्धारण करें - चरण 2: quantitate ferrocyanide की राशि 37 का गठन
    1. ई के लिए ferrocyanide दृढ़ संकल्प समाधान 37 की 100 μl जोड़ेंअच्छी तरह से ach. नोट: एक काम समाधान उपयोग करने से पहले तुरंत किया जाना चाहिए: 3 एम ना एसीटेट (6.0 पीएच) के 2 मिलीलीटर; हिमनदों एसिटिक एसिड (~ 17.4 एम एसिटिक एसिड) के 0.5 मिलीलीटर; 0.2 एम साइट्रिक एसिड के 2 मिलीलीटर; 0.1 एम एसिटिक एसिड में 3.3 मिमी FeCl 3 के 2 मिलीलीटर; 30 मिमी ferene एस के 1 मिलीलीटर. इस काम कर समाधान की अंतिम मात्रा 7.5 मिलीग्राम होना चाहिए.
    2. Orbitally कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 550 rpm पर अंधेरे में थाली मिश्रण.
    3. 593 एनएम पर कुओं की absorbance के मूल्यों को पढ़ने (यानी Fe (द्वितीय) (ferene-एस) 3 जटिल के absorbance अधिकतम).
    4. (1.3 चरण देख प्रत्येक नमूने के लिए - 'ए ओ' कुओं और फिर एस्कॉर्बेट मानक वक्र से interpolating शुरू में इसी से '+ एओ' वेल्स के लिए एक 593 एनएम मूल्यों घटाकर मिलियन कोशिकाओं प्रति nmoles एस्कॉर्बेट रूप में intracellular एस्कॉर्बेट की राशि की गणना ). मानक वक्र का निर्माण करते हैं, ascorb की राशि के खिलाफ एक मानक के लिए यह "अंतर मूल्य" साजिशअच्छी तरह से प्रति खा लिया.

संवर्धित कोशिकाओं से एस्कोर्बेट-तपका के 2. निर्धारण

  1. सेल संस्कृति और कटाई
    1. (1.1 कदम देखें) के रूप में ऊपर निलंबन या पक्षपाती कोशिकाओं को विकसित. नोट: अच्छे परिणाम के लिए निलंबन और पक्षपाती कोशिकाओं के साथ एक 24 अच्छी तरह से बेनी प्रारूप में नीचे परख ले.
    2. Resuspend निलंबन कोशिकाओं, या के साथ या कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना, पूर्व गर्म HEPES बफर खारा समाधान के 400 μl के साथ, पक्षपाती कोशिकाओं उपरिशायी, और 5 मिमी डी ग्लूकोज युक्त, कुओं में (HBS / डी पीएच 7.3, 37 डिग्री सेल्सियस) 24 अच्छी तरह से थाली की. जांच की जा करने के लिए प्रत्येक 24 अच्छी तरह से थाली पर निर्दिष्ट सेल मुक्त वेल्स को HBS / डी का एक ही मात्रा में जोड़ें. नोट: बाद (नीचे देखें) आधारभूत प्रतिक्रिया के लिए सेल मुक्त नियंत्रण के रूप में काम करेगा.

3. विमोचन एस्कोर्बेट की मात्रा का निर्धारण

  1. निम्नलिखित स्टॉक समाधान पहले से तैयार रहना चाहिए: 120यू / मिलीलीटर ए ओ HBS / डी (ताजा तैयार) में; 2.4 मिमी Ferene-S HBS / डी में; 120 माइक्रोन FeCl 3 और HBS / डी (अधिक केंद्रित शेयर समाधान से तुरंत तैयार) में 600 माइक्रोन ना साइट्रेट.
  2. Ferrireduction प्रतिक्रिया (प्रति अच्छी तरह से अंतिम मात्रा 600 μl होना चाहिए) शुरू करने के लिए, पहले से ही HBS / डी के 400 μl युक्त व्यक्ति वेल्स को अभिकर्मकों की निम्न मात्रा में जोड़ें:
    1. तीन प्रतियों में कुओं बनती को एओ (120 यू / एमएल) या HBS / डी के 50 μl जोड़ें. अंतिम एओ एकाग्रता 10 यू / एमएल होना चाहिए. नोट: लेबल के रूप में कुओं बनती "- ए ओ" और "+ एओ".
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोमल कक्षीय मिश्रण के साथ प्लेटें मिक्स
    3. सभी कुओं को 2.4 मिमी ferene एस के 50 μl जोड़ें. अंतिम ferene एस एकाग्रता 200 माइक्रोन होना चाहिए. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ऊपर के रूप में प्लेटें मिक्स
    4. हौसले से तैयार 120 माइक्रोन फेरिक साइट्रेट की 50 μl जोड़ें. अंतिम लोहा और साइट्रेट सांद्रता 10 माइक्रोन लोहे और 50 माइक्रोन साइट्रेट होना चाहिए. अच्छी तरह से मिलाएं.
    5. तीन तीन प्रतियों नियंत्रण कुओं में, overlying मध्यम aspirate और 0.1% सैपोनिन युक्त 600 μl HBS / डी जोड़ें. नोट: ये (नीचे देखें) समानांतर में आयोजित किए जाने की एक लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) रिलीज परख के लिए "100% सेल lysis" नियंत्रण के रूप में काम करेगा.
    6. 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 60 मिनट के लिए सेते
    7. एस्कॉर्बेट-तपका परख के अंत में, तेजी से अच्छी तरह से प्रत्येक से 500 μl aspirate और उचित रूप से एक 24 अच्छी तरह से थाली में कुओं लेबल को जोड़ने. नोट: निलंबन की कोशिकाओं के लिए, शुरू में 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को हटाने
    8. एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए सतह पर तैरनेवाला के 300 μl aliquots जोड़ें और फिर 593 एनएम पर पढ़ा.

    कोशिकी एस्कोर्बेट के 4. निर्धारण

    1. 593 एनएम पर कुओं की absorbance के मूल्यों को पढ़ा.
    2. Intracellular एस्कॉर्बेट के निर्धारण के लिए के रूप में वर्णित मिलीग्राम प्रोटीन प्रति (या मिलियन कोशिकाओं प्रति) nmoles एस्कॉर्बेट के रूप में बाह्य एस्कॉर्बेट की राशि की गणनाचरण 1.5.4 में. नोट: एस्कॉर्बेट रिहाई intracellular एस्कॉर्बेट द्वारा ही सीमित नहीं है, इसलिए है कि अंत उपयोगकर्ता की स्थिति का अनुकूलन करना चाहिए.

    LDH रिलीज के 5. निर्धारण

    1. प्रत्येक नमूने से कोशिकी समाधान के शेष 200 μl के साथ सेलुलर सेल की सीमा निर्धारित करने के लिए एक LDH रिहाई परख 32,41 आचरण. नोट: कुल प्रकाशित करने योग्य LDH का एक% के रूप में की गणना. 0.1% सैपोनिन के साथ इलाज किया गया है कि नमूनों से प्रकाशित करने योग्य LDH निर्धारित करते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

संवर्धित निलंबन कोशिकाओं में intracellular एस्कोर्बेट का निर्धारण

पहली परख (चित्रा 1) में, intracellular एस्कॉर्बेट एक पहले प्रकाशित प्रक्रिया 37 से ferrocyanide की अत्यधिक संवेदनशील दृढ़ संकल्प का उपयोग, ferrocyanide को ferricyanide की (यानी ए ओ के प्रति संवेदनशील) में कमी एस्कॉर्बेट विशिष्ट निम्न, निर्धारित किया जाता है. एस्कॉर्बेट का पता लगाने ferrocyanide द्वारा लौह लोहे को फेरिक की कमी के बाद ferrocyanide को ferricyanide की एस्कॉर्बेट पर निर्भर कमी, द्वारा उत्पन्न होता है कि लौह लोहे की वर्णमिति केलेशन पर आधारित है. कुछ द्विसंयोजक धातु आयनों (जैसे घन 2 +, सह 2 + और ​​Zn 2 +) के supraphysiological सांद्रता संभवतः ferene-S द्वारा केलेशन के लिए लौह लोहे के साथ प्रतिस्पर्धा द्वारा हस्तक्षेप कर सकते हैं, उचित सावधानियों इस तरह की स्थितियों 37 के तहत लिया जाना चाहिए.

आंकड़ा2 एस्कॉर्बेट मानकों 0-20 माइक्रोन का एक सेट के लिए एक विशिष्ट मानक वक्र से पता चलता है (या 96 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 0-2 nmole एस्कॉर्बेट, "प्रोटोकॉल" में कदम 6.5 देखें.). इस आंकड़े में नहीं दिखाया गया है हालांकि, linearity (यानी एक शुद्ध ~ 1.6 की एक 593 एनएम) ~ 80 माइक्रोन का एक नमूना एस्कॉर्बेट एकाग्रता से मेल खाती है, अच्छी तरह से प्रति 8 nmole एस्कॉर्बेट अप करने के लिए बनाए रखा है. परख सफलतापूर्वक अच्छी तरह से प्रति 0.25 nmole एस्कॉर्बेट (2.5 माइक्रोन नमूना एस्कॉर्बेट एकाग्रता) नीचे एस्कॉर्बेट स्तर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

K562 कोशिकाओं के तेजी से बाह्य DHA से intracellular एस्कॉर्बेट जमा है, लेकिन नहीं एस्कॉर्बेट (चित्रा 3 देखें, लेन और Lawen 2008 19 से अनुमति के साथ reproduced). इस प्रतिनिधि प्रयोग में, पीबीएस धोया K562 कोशिकाओं (4 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल) एस्कॉर्बेट (एएससी) या तो की 500 माइक्रोन के साथ पीबीएस में incubated रहे थे, DHA, DHA + 50 माइक्रोन cytochalasin बी (डीएचए + सीबी), ए एस सी + 5 मिमी ferricyanide (एअनुसूचित जाति / FIC) या ए एस सी + 50 यू / मिलीलीटर ए ओ 30 मिनट के लिए (ए एस सी / ए ओ) 37 डिग्री सेल्सियस पर "प्रोटोकॉल" में वर्णित के रूप में intracellular एस्कॉर्बेट निर्धारित किया गया था.

K562 कोशिकाओं द्वारा DHA तेज सुविधाजनक ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर (भरमार) की मध्यस्थता परिवहन के द्वारा होता है (चित्रा 4 देखें, लेन और Lawen 2009 42 से अनुमति के साथ reproduced). इस प्रतिनिधि प्रयोग में DHA तेज में gluts की भागीदारी का आकलन करने के लिए, K562 कोशिकाओं में वृद्धि cytochalasin बी की सांद्रता (सीबी) या 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 0.5% इथेनॉल युक्त एमबीएस में भंग dihydrocytochalasin बी (एच 2 सीबी) के साथ incubated रहे थे पूर्व एक ही माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 400 माइक्रोन DHA (छवि 4 ए) के साथ ऊष्मायन के लिए. कोशिकाओं तो बहुत ठंडा एमबीएस के 100 खंडों में तीन बार धोया गया और "प्रोटोकॉल" में वर्णित के रूप में उनके intracellular एस्कॉर्बेट निर्धारित की. सीबी और एच 2 सीबी दोनों micromolar पर चलता - फिरता प्रक्रियाओं को बाधित करते हुए यह नोट करना महत्वपूर्ण हैसांद्रता (1-100 माइक्रोन), सिंगल, डबल बांड की मौजूदगी से एच 2 सीबी से अलग है जो केवल सीबी,, कम micromolar सांद्रता (1-10 माइक्रोन) 43 में भरमार निर्भर परिवहन को रोकता है. DHA तेज एक आईसी 50 <2.5 माइक्रोन के साथ सीबी द्वारा inhibitable था, लेकिन एच 2 सीबी द्वारा inhibitable नहीं था इसलिए, DHA तेज शायद भरमार मध्यस्थता परिवहन 38 से होता है. हे मिथाइल-D-ग्लूकोज (3 OMG) या गैर भरमार परिवहनीय ग्लूकोज stereoisomer एल - - वैकल्पिक रूप से, 4B चित्रा में, धोया कोशिकाओं की भरमार परिवहनीय, लेकिन गैर metabolizable ग्लूकोज अनुरूप 3 बढ़ती सांद्रता से अवगत कराया गया फिर परिणाम केवल भरमार परिवहनीय ग्लूकोज अनुरूप की उपस्थिति में होता intracellular एस्कॉर्बेट संचय के निषेध के रूप में DHA आयात में भरमार भागीदारी का संकेत पिछले पैनल ए में के रूप में DHA के साथ ऊष्मायन के लिए ग्लूकोज.

Determinaपक्षपाती कोशिकाओं से एस्कोर्बेट-तपका की tion

दूसरी परख में, सभ्य कोशिकाओं से एस्कॉर्बेट-तपका की दर निर्धारित की जा सकती है. कोशिकाओं से एस्कॉर्बेट की रिहाई कोशिकाओं 19,20 द्वारा गैर transferrin जाने वाली लोहे की एस्कॉर्बेट विनियमित सेलुलर तेज के लिए महत्वपूर्ण हो गया लगता है के रूप में इस विशिष्ट परख महत्वपूर्ण है. गैर transferrin जाने वाली लोहे की तेज ऐसी hemochromatoses 22, साथ ही स्तनधारी मस्तिष्क 22 में astrocyte न्यूरॉन लोहा विनिमय और homeostasis के रूप में लोहे अधिभार विकारों के pathophysiology के लिए प्रासंगिक माना जाता है. दरअसल, हम हाल ही में प्रमुख उत्तेजक neurotransmitter, एल ग्लूटामेट, GLAST और ख्यात VSOACs 32 से एस्कॉर्बेट की रिहाई हो सके कि बाद के सेलुलर सूजन द्वारा एल ग्लूटामेट तेज पर निर्भर करता है कि एक तरह से astrocytes से एस्कॉर्बेट की रिहाई हो सके कि पता चला है. सादृश्य, एस्कॉर्बेट आर मेंएस्कॉर्बेट लोड astrocytes से elease उत्तेजक अमीनो एसिड, एल एस्पार्टेट, लेकिन नहीं गैर उत्तेजक अमीनो एसिड एल glutamine द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. इस आशय एस्कॉर्बेट की उत्तेजना (एए) एस्पार्टेट (बंद हलकों) द्वारा जारी है और glutamine के प्राथमिक संस्कृतियों से (खुला हलकों) के लिए खुराक प्रतिक्रिया घटता दिखाता है, जो (लेन और Lawen 2012 में 32 से अनुमति के साथ reproduced) चित्रा 5 में दिखाया गया है एस्कॉर्बेट लोड माउस astrocytes.

यह इस एस्कॉर्बेट-तपका परख intracellular एस्कॉर्बेट के निर्धारण के लिए प्रदान की परख से कैसे अलग है पर चर्चा करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रमुख अंतर यह है कि समाधान में शेष एस्कॉर्बेट के स्तर intracellular एस्कॉर्बेट दृढ़ संकल्प विधि के लिए मामला है, के रूप में एक निश्चित समय बिंदु के अंत में आयोजित एक रासायनिक प्रतिक्रिया द्वारा निर्धारित नहीं है कि इस तथ्य में निहित है. इसके बजाय, एक "reductive हस्ताक्षर" संचित हैजिसमें अवधि के दौरान एस्कॉर्बेट कोशिकाओं से जारी है. इस reductive हस्ताक्षर एक बड़ी बाह्य और झिल्ली impermeant के रूप में लौह लोहे की तेजी केलेशन द्वारा पीछा कोशिकी फेरिक साइट्रेट की एस्कॉर्बेट पर निर्भर कमी के रूप में कब्जा कर लिया है [Fe (द्वितीय) (ferene-एस) 3] 4 - कुली . Ferene एस परख से कम समय के पाठ्यक्रम पर इसी झिल्ली impermeant माना जा सकता है. इस वर्णजनीय परिसर के स्तर को फिर एक समापन बिंदु माप के रूप में निर्धारित किया जा सकता है. इस कुली की ही एओ के प्रति संवेदनशील स्तर को निर्धारित कर रहे हैं, परख कोशिकी एल एस्कॉर्बेट के निर्धारण के लिए विशिष्टता के एक उच्च डिग्री प्रदान करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. के लिए प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम दिखा आरेख प्रवाहintracellular एस्कॉर्बेट का निर्धारण.

चित्रा 2
चित्रा 2 एस्कॉर्बेट मानकों 0-20 माइक्रोन का एक सेट के लिए एक विशिष्ट मानक वक्र.. (या 96 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 0-2 nmole एस्कॉर्बेट;. "प्रोटोकॉल" में कदम 6.5 देखें) त्रुटि सलाखों के रूप में नहीं दिखाया जाता है वे प्रतीकों के कब्जे सीमा के भीतर हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. K562 कोशिकाओं के तेजी से बाह्य DHA से intracellular एस्कॉर्बेट जमा है, लेकिन नहीं एस्कॉर्बेट. पीबीएस धोया K562 कोशिकाओं (4 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल) 500 माइक्रोन ओ के साथ पीबीएस में incubated रहे थेF या तो एस्कॉर्बेट (एएससी), DHA, DHA + 50 माइक्रोन cytochalasin बी (डीएचए + सीबी), ए एस सी + 5 मिमी ferricyanide (ए एस सी / FIC) या ए एस सी + 50 यू / मिलीलीटर एओ (ए एस सी / ए ओ) 37 डिग्री पर 30 मिनट के लिए सी. "प्रोटोकॉल" में वर्णित के रूप में intracellular एस्कॉर्बेट निर्धारित किया गया था. परिणाम दिखाया तीन व्यक्ति प्रयोगों (+ एसडी) के साधन हैं. * Intracellular एस्कॉर्बेट एकाग्रता K562 कोशिकाओं (यानी ~ 1.6 μl/106 कोशिकाओं) 19,20 के लिए एक पूर्व निर्धारित intracellular पानी अंतरिक्ष का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था. यह आंकड़ा लेन और Lawen 2008 19 से अनुमति के साथ reproduced किया गया है.

चित्रा 4
K562 कोशिकाओं द्वारा चित्रा 4. DHA तेज सुविधाजनक ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर (भरमार) द्वारा होता परिवहन की मध्यस्थता. + 10% RPMI में 6-8 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल (के लिए बड़ा हो गया था कि K562 कोशिकाओं37 डिग्री सेल्सियस पर वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम, 5% सीओ 2 और 95% हवा एमबीएस के साथ तीन बार धोया शुरू में थे. या dihydrocytochalasin बी Mops बफर खारा में भंग (एच 2 सीबी) (एमबीएस, 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 15 मिमी MOPS-ना +, पीएच 7.3, धोया कोशिकाओं तो cytochalasin बी की सांद्रता (सिग्मा सीबी) में वृद्धि से अवगत कराया गया ) से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 400 माइक्रोन DHA के साथ ऊष्मायन के लिए 0.5% इथेनॉल युक्त (ए). कोशिकाओं तो ठंड एमबीएस के 100 खंडों में तीन बार धोया गया और "प्रोटोकॉल" में वर्णित के रूप में उनके intracellular एस्कॉर्बेट निर्धारित की. DHA तेज सीबी द्वारा inhibitable, लेकिन नहीं एच 2 सीबी था, DHA तेज भरमार मध्यस्थता परिवहन के द्वारा होता है. वैकल्पिक रूप से, (बी) में, धोया कोशिकाओं की बढ़ती सांद्रता के संपर्क में थे भरमार परिवहनीय, लेकिन गैर metabolizable ग्लूकोज अनुरूप 3 - हे मिथाइल-D-ग्लूकोज (3 OMG) या गैर भरमार परिवहनीय ग्लूकोज stereoisomer (ए) के रूप में DHA के साथ ऊष्मायन के दौरान एल ग्लूकोज. फिर परिणाम DHA तेज में भरमार भागीदारी का संकेत मिलता है. यह आंकड़ा लेन और Lawen 2008 42 से अनुमति के साथ reproduced किया गया है.

चित्रा 5
एस्कॉर्बेट लोड astrocytes से चित्रा 5. एस्कोर्बेट रिलीज उत्तेजक अमीनो एसिड एल एस्पार्टेट से प्रेरित नहीं, बल्कि गैर उत्तेजक अमीनो एसिड एल glutamine है. यह आंकड़ा एस्कॉर्बेट की उत्तेजना (एए) रिहाई के लिए खुराक प्रतिक्रिया घटता दिखाता है एस्पार्टेट एस्कॉर्बेट लोड माउस astrocytes के प्राथमिक संस्कृतियों से (बंद हलकों) और glutamine (खुला हलकों). दिखाया डेटा तीन प्रयोगों की (एसडी ±) साधन हैं. पी <0.001 बनाम'बेसल' शर्त. यह आंकड़ा लेन और Lawen 2012 में 32 से अनुमति के साथ reproduced किया गया है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस पत्र में हम सभ्य कोशिकाओं में अंतर और बाह्य डिब्बों से व्युत्पन्न एस्कॉर्बेट के निर्धारण के लिए दो, तेजी से विशिष्ट और अपेक्षाकृत संवेदनशील वर्णमिति microplate assays प्रस्तुत करते हैं. assays मानक प्रयोगशाला के उपकरण और अभिकर्मकों के उपयोग के साथ पूरा किया जा सकता है. परख के लिए आवश्यक केवल मामूली महंगा अभिकर्मक यह एल एस्कॉर्बेट की ओर analyte विशिष्टता के एक उच्च डिग्री प्रदान करता है के रूप में आवश्यक है जो ए ओ, है. assays या तो निलंबन कोशिकाओं (जैसे K562) या पक्षपाती कोशिकाओं (जैसे HepG2 या प्राथमिक कृंतक astrocytes) के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं, और सफलतापूर्वक ऐसी कोशिकाओं 19,20,32,37,38 का उपयोग पिछले प्रकाशनों में नियोजित किया गया है. वे एल एस्कॉर्बेट के लिए पर्याप्त विशिष्ट नहीं कर रहे हैं के रूप में ए ओ के स्थान पर अन्य एस्कॉर्बेट ऑक्सीकरण एजेंट (जैसे Tempol) का प्रयोग नहीं होना चाहिए. साथ ही, जैसे यौगिकों का उपयोगएस्कॉर्बेट रिलीज परख में Tempol सेलुलर झिल्ली को पार और intracellular एस्कॉर्बेट 44 oxidize करने Tempol की क्षमता से चकित हो जाएगा. ए ओ अनिवार्य रूप से झिल्ली impermeant इस्तेमाल किया समय के पाठ्यक्रम खत्म हो गया है.

हम ऊपर वर्णित वर्णमिति एस्कॉर्बेट परख और Vislisel और उनके सहयोगियों ने 36 की fluorometric एस्कॉर्बेट दृढ़ संकल्प के साथ प्राप्त परिणामों के प्रत्यक्ष तुलना प्रदर्शन किया है. हम दोनों assays intracellular एस्कॉर्बेट दृढ़ संकल्प परख (नहीं दिखाया डेटा) के लिए समान परिणाम दे दी है कि पाया. दिलचस्प है, ऊपर वर्णित एस्कॉर्बेट रिलीज परख fluorometric समापन बिंदु परख के साथ तुलना एस्कॉर्बेट तपका का स्पष्ट दर के लिए काफी उच्च मूल्यों दिया. इस के साथ साथ वर्णित एस्कॉर्बेट-तपका परख के रूप में आसानी एस्कॉर्बेट कोशिकाओं द्वारा फिर से तेज करने की संभावना से चकित नहीं है कि स्पष्ट "एस्कॉर्बेट-तपका" के निर्धारण के लिए अनुमति देता है कि पता चलता है; संभावना PL शामिल है कि एक प्रक्रियाअस्मा झिल्ली SVCTs. इस तरह फिर से तेज समापन बिंदु एस्कॉर्बेट माप लिया गया था कि अगर एक निश्चित अवधि के दौरान जारी किए गए थे कि एस्कॉर्बेट के वास्तविक स्तर के मूल्यवान समझना पैदा करने के लिए करते हैं जाएगा. यह ऊतकों के नमूनों (जैसे मांसपेशियों, फेफड़ों या मस्तिष्क) के बजाय intracellular एस्कॉर्बेट दृढ़ संकल्प परख के लिए संवर्धित कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जा रहे हैं, तो एक ऊतक homogenate (ठंडा CPB और यांत्रिक विघटन के कुछ फार्म का उपयोग करते हुए निर्माण किया जाना चाहिए कि ध्यान दिया जाना चाहिए जैसे Dounce homogenization, जांच की नोक sonication, आदि फ्रेंच प्रेस.). सेलुलर मलबे centrifugation द्वारा हटा दिया जाना चाहिए और उपयोगकर्ता चरण 1.2.4 के साथ आगे बढ़ने से पहले नमूना deproteinization और / या protease inhibitors के अलावा के लिए संभव की जरूरत पर विचार करना चाहिए.

हम भी cytochalasin बी (<10 माइक्रोन) के पहले से है कि कम micromolar सांद्रता सूचना दी परख 32 से निर्धारित किया गया है कि एस्कॉर्बेट-तपका का स्पष्ट दर को बाधित नहीं किया उपयोग, ferricyanide एस्कॉर्बेट की एक intracellular पूल द्वारा मुख्य रूप से कम हो जाता है के रूप में फेरिक साइट्रेट कोशिकी एस्कॉर्बेट 19 द्वारा मुख्य रूप से कम हो जाता है, जबकि (transplasma झिल्ली इलेक्ट्रॉन परिवहन की एक प्रक्रिया के माध्यम से), ferricyanide अधिक पसंद किया जा रहा है 20,38.

इन प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. सबसे पहले, यहाँ बताया assays के चुनिंदा और तेजी से बनती नमूनों में एस्कॉर्बेट दूर करने के लिए ए ओ की क्षमता पर गंभीर रूप से निर्भर हैं. ए ओ की तैयारी की विशिष्ट गतिविधि नाममात्र और ग्रहण गतिविधि से स्पष्ट रूप से कम है, तो यह संभव है कि ए ओ युक्त है में एस्कॉर्बेट के सभी नहींamples हटा दिया जाएगा. इस अज्ञात नमूनों में एस्कॉर्बेट की राशि का एक मूल्यवान समझना के लिए नेतृत्व कर सकते हैं एस्कॉर्बेट वर्तमान की राशि की गणना करने के लिए "प्रत्यक्ष विधि" का उपयोग करता हूं. एक सिफारिश की है जो "मानक वक्र विधि", का उपयोग करता है, तो हालांकि, एओ की कम गतिविधि की तैयारी ही परख संवेदनशीलता का एक नुकसान के लिए नेतृत्व करेंगे. हम अच्छे परिणाम लगातार फिर से अधिक नहीं के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है कि 100 μl aliquots में विभाजित है जो पीबीएस या एमबीएस, या तो के 1 मिलीलीटर में एओ के 1,000 यू भंग करके निर्माण एओ की तैयारी का उपयोग करके प्राप्त कर रहे हैं कि मिल गया है एक महीने. ए ओ proteolytically सेल lysates द्वारा अपमानित किया जा सकता है कि एक प्रोटीन होता है के रूप में आगे, protease inhibitors ए ओ युक्त वेल्स को lysates के अलावा पहले सेल lysates में जोड़ा जा सकता है. इस protease गतिविधि से समृद्ध होती हैं कि कोशिका या ऊतक lysates का उपयोग करते समय विचार करने के लिए एक उपयोगी संशोधन हो सकता है.

इसके अलावा, assays की संवेदनशीलता वर्णित एकBove काफी हद तक वर्णजनीय bidentate Fe (द्वितीय) chelator, Ferene एस के उपयोग पर निर्भर करता है. इस chelator ऐसे ferrozine और bathophenanthroline disulfonate के रूप में रासायनिक समान chelators द्वारा बदल दिया, लेकिन उनके Fe (द्वितीय) के विलुप्त होने के गुणांक के लिए इसी संवेदनशीलता में कमी के साथ 37 chelates किया जा सकता है. यह Ferene एस या Ferrozine 37,45 से लोहा साइट्रेट परिसरों की उपस्थिति में स्पष्ट autocatalytic ferrireduction की उच्च दर के लिए नेतृत्व करने के लिए प्रकट होता है, bathophenanthroline disulfonate का उपयोग करते समय इसके अलावा, ध्यान रखा जाना चाहिए. यह (द्वितीय) कीलेट परख की संवेदनशीलता कम हो जाएगा फे की गैर एस्कॉर्बेट पर निर्भर उपस्थिति के रूप में एस्कॉर्बेट रिलीज परख के मामले में एक उचित चिंता का विषय है.

Intracellular एस्कॉर्बेट निर्धारण परख पक्षपाती कोशिकाओं के साथ संगत है, सेलुलर सेल से पहले इस तरह की कोशिकाओं की टुकड़ी यांत्रिक scraping बजाय trypsin / EDTA द्वारा किया जाना चाहिए. Trypsin एक protease है के रूप मेंयह संभावना ए ओ, एक प्रोटीन है जो की बाद के साथ एस्कॉर्बेट कमी कदम के साथ नकारात्मक हस्तक्षेप करेगा. इसके अतिरिक्त, EDTA संभावना ferene-एस 37 के साथ प्रतियोगिता में लोहा chelating द्वारा एफ ओ सी दृढ़ संकल्प कदम के साथ हस्तक्षेप करेगा. इस तरह के एजेंटों से बचा जाना चाहिए. अंत में, एस्कॉर्बेट रिहाई परख आसानी से निलंबन कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसके बजाय overlying Fe (द्वितीय) (ferene-एस) बंद aspirating 3 युक्त परख के अंत में कुली, कोशिकाओं के तेजी से intracellular एस्कॉर्बेट निर्धारण परख के लिए के रूप में centrifugation द्वारा sedimented किया जाना चाहिए. सतह पर तैरनेवाला के 593 एनएम पर absorbance तो निर्धारित किया जाना चाहिए.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

हम astrocyte संस्कृतियों के उदार आपूर्ति के लिए डॉ. स्टीफन रॉबिन्सन और सुश्री Hania Czerwinska (मोनाश विश्वविद्यालय) के लिए आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc 96-well flat-bottom plates Thermo 269620 Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge Eppendorf 5415D A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge Eppendorf 5810R Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer Bio-Rad Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) Eppendorf This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer Sigma-Aldrich 30790 Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762 Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO) Sigma-Aldrich A0157 Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC) Sigma-Aldrich 455989 Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) Sigma-Aldrich 92940
Sodium L-glutamate Sigma-Aldrich
L-glutamine Sigma-Aldrich
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. (2006).
  2. Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
  3. Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
  4. Manning, J., et al. Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells. Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).
  5. Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
  6. Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
  7. May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
  8. Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
  9. Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
  10. Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
  11. Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
  12. Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
  13. Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. recycling and degradation in mammals. FEBS J. 274, 1-22 (2007).
  14. May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
  15. Wilson, J. X. Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).
  16. Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
  17. May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
  18. Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
  19. Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
  20. Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
  21. Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
  22. Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
  23. Grünewald, R. A. Ascorbic acid in the brain. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).
  24. Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
  25. Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
  26. Hediger, M. A. New view at C. Nat. Med. 8, 445-446 (2002).
  27. Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
  28. Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
  29. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  30. May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
  31. Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
  32. Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
  33. Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
  34. Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
  35. Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
  36. Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
  37. Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
  38. Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
  39. Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
  40. Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
  41. Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
  42. Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
  43. Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
  44. May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
  45. Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics