Eine schnelle und spezifische Mikroplatten-Assay zur Bestimmung der Intra-und extrazelluläre Ascorbat in kultivierten Zellen

Biology

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Summary

Ascorbat spielt eine wichtige Rolle in zahlreichen zellulären Stoffwechsels, von denen viele nur für Licht in den letzten Jahren. Hier beschreiben wir einen mittleren Durchsatz, spezifisch und kostengünstig Mikrotiterplatten-Assay zur Bestimmung von intra-und extrazellulären Ascorbat in Zellkultur.

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Lane, D. J., Lawen, A. A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (86), e51322, doi:10.3791/51322 (2014).

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Abstract

Vitamin C (Ascorbat) spielt eine wichtige Rolle bei zahlreichen zellulären Stoffwechsels, von denen viele nur für Licht in den letzten Jahren. Zum Beispiel im Gehirn wirkt Ascorbat in einer neuroprotektiven und neuromodulatorischen Weise, Ascorbat Zyklen zwischen Neuronen und Astrozyten vicinalen beinhaltet - eine Beziehung, die entscheidend für die Homöostase Gehirn Ascorbat zu sein scheint. Darüber hinaus Anzeichen dafür stark darauf hin, dass Ascorbat hat eine stark erweiterte Rolle bei der Regulierung zellulärer und systemischer Eisenstoffwechsel als klassisch anerkannt ist. Die zunehmende Anerkennung der integrale Rolle von Ascorbat in normalen und deregulierte zelluläre Physiologie der Organismen und erfordert eine Reihe von Mitteldurchsatz und hohe Empfindlichkeit analytischer Techniken, die ohne die Notwendigkeit für sehr teure Spezialausrüstung ausgeführt werden können. Hier stellen wir explizite Anweisungen für einen mittleren Durchsatz, spezifische und relativ kostengünstige Mikroassay zur Bestimmung von both intra-und extrazellulären Ascorbat in Zellkultur.

Introduction

Die Entdeckung der chemischen Natur von Ascorbinsäure (Vitamin C), und seiner Identifikation als der lange gesuchte "Anti-Skorbut-Faktor", von Albert Szent-Györgyi und andere in Papiere von 1928 bis 1934 veröffentlicht waren ein Wahrzeichen Ereignisse in der Geschichte der Biochemie. Tatsächlich trugen diese Entdeckungen Szent-Györgyi auf, die im Jahr 1937 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin. Die ständig wachsende Palette von Rollen für Ascorbat in Tier-und Pflanzenphysiologie, sowie die menschliche Gesundheit, weiterhin die Themen der aktiven wissenschaftlichen sein Untersuchung und Kontroversen.

L-Ascorbat ist eine reichlich vorhandene physiologische Reduktionsmittel und Enzym-Cofaktor in Säugersystemen, und trägt zu zahlreichen gut definierten enzymatischen Reaktionen, die die Hydroxylierung von Kollagen, Carnitin-Biosynthese und Norepinephrin, Tyrosin-Stoffwechsel und Peptidhormon Amidierung 2. Interessanterweise Montage evideNCE legt nahe, dass Ascorbat spielt eine Rolle bei der Stimulierung anderer Eisen-abhängige Dioxygenasen, wie die Prolyl-Hydroxylasen und Asparaginyl bei der Hydroxylierung beteiligt und Ausrichtung der Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIFs) und 1α 2α 3. Ein neuer Bericht legt nahe, dass Ascorbat spielt eine Rolle bei der T-Zellreifung durch Chromatin beeinflusst Demethylierung über seine Tätigkeit bei der Stimulierung der Kern Hydroxylasen, Jumonji C (JmjC) Domain-Proteine; von denen die letztere scheinen Ascorbat für volle Aktivität 4 erfordern. Tatsächlich ist die Stimulierung solcher Enzyme durch Ascorbat scheint durch einen ähnlichen Mechanismus auf die Stimulation auftreten durch Ascorbat der HIF-Hydroxylasen und Kollagen. Unter anderen klassischen Wirkungen beiträgt Ascorbat signifikant die zelluläre Antioxidation als wasserlösliches Kettenabbruch Radikalfänger 5 und dem Recycling von Plasmamembran-α-Tocopherol (Vitamin E) über die Reduktion der α-tocopheroxyl Rest 6, welche ist beim Schutz gegen Membranlipidperoxidation 7 wichtig. Wichtig ist, dass obwohl die meisten Säugetiere sind in der Lage, de novo hepatische Synthese von Ascorbat aus D-Glucose, höhere Primaten, Meerschweinchen und einige Fledermäuse hängen von Nahrungsquellen von Vitamin 8. Dies beruht auf der Inaktivierung des Gens GULO die Orthologe davon unberührt in Säugern codieren, das Enzym γ-Gulono-lacton-Oxidase 9-13. Dieses Enzym ist für die endgültige Reaktion in Ascorbat-Biosynthese aus Glucose 13 erforderlich.

Nach Transporter-vermittelte Resorption aus dem Darmlumen in den Menschen, Ascorbat während des Körpers durch das Kreislaufsystem verteilt. Das Vitamin wird in der Regel in seiner reduzierten Form in millimolaren Konzentrationen intrazellulär (mit der Ausnahme von Erythrozyten in dem die Konzentrationen sind in der Regel ähnlich wie der vorherrschende Plasmakonzentration) und in mikromolaren konz gefundenentrations (zB 50-200 uM) in den meisten extrazellulären Flüssigkeiten 14,15.

Unter physiologischen Bedingungen, Ascorbat in der Regel eine reversible Ein-Elektronen-Oxidation zum Radikal ascorbyl (AFR, auch als monodehydroascorbate oder semidehydroascorbate bekannt). Während der AFR ist ein relativ stabiles Radikal 16, in der Abwesenheit von seiner schnellen Ein-Elektronen-enzymatische Reduktion zurück zu Ascorbat können zwei AFRS disproportioniert einem Ascorbat und ein Dehydroascorbat (DHA) 9,13,17 fördern. Im Inneren der Zelle, die zwei-Elektronen-Oxidationsprodukt von Ascorbat, DHA, schnell wieder auf Ascorbat durch Glutathion und NAD (P) H-abhängige enzymatische und nicht-enzymatische Reaktionen, 13 reduziert werden.

Während es klassisch wird akzeptiert, dass Ascorbat einzige bedeutende Rolle im Eisenstoffwechsel ist die Nahrungsaufnahme von Nicht-Häm-Eisen-18 zu stimulieren, die wir und andere zur Verfügung gestellt haben Beweise strongly darauf hindeutet, dass Ascorbat spielt eine stark erweiterte Rolle im Stoffwechsel von diesem Metall. Zunächst erscheint Ascorbat, die durch Ascorbat-voll-Zellen freigesetzt wird, eine wichtige Rolle bei der Modulation der Aufnahme von Nicht-Transferrin-gebundenem Eisen von 19,20 Zellen zu spielen, und sehr neue Hinweise darauf, dass Ascorbat moduliert auch die Aufnahme von Transferrin-gebundenes Eisen von Zellen 21, von denen die letztere entspricht einer physiologischen Haupteisenaufnahmestrecke 22.

Ascorbat ist wichtig für die normale Funktion des zentralen Nervensystems bei Säugetieren 23,24. Zusammen mit der Nebennierenrinde, Hypophyse, Thymus, Retina und Gelbkörper enthält das Gehirn hohen Konzentrationen von Ascorbat im Vergleich zu anderen Körpergeweben 23,25-27. Zusätzlich wird die Belichtung beider 28,29 Astrozyten und Neuronen-ähnliche Zellen 30 zu Glutamat bekannt, die Freisetzung von Ascorbat in den extrazellulären Raum, in dem die Auslösung ascorbatE soll helfen Neuronen schützen vor Glutamat-induzierten neuronalen Dysfunktion 31. Während der genaue Mechanismus der Glutamat-induzierten Freisetzung aus Astrozyten Ascorbat unbekannt ist, haben wir vor kurzem legte Beweise, die die Beteiligung der Zelle Schwellungen, die durch Glutamataufnahme verursacht durch die Astrozyten Glutamat und Aspartat-Transporter (GLAST, auch bekannt exzitatorischen Aminosäuretransporter-Isoform 1 [EAAT1 ] beim Menschen) und damit die Aktivierung des Volumens empfindlichen Osmolyten und Anionen-Kanäle (VSOACs), die durchlässig für kleine organische Anionen wie Ascorbat 32. Die molekularen Identitäten der Kanäle in der Plasmamembran VSOAC Bildung beteiligt noch identifiziert werden 33,34.

Obwohl viele Assays zur Bestimmung von Ascorbat in biologischen Proben, die spektrophotometrische, fluorometrische und chromatographische Assays 35,36 umfassen entwickelt wurde, gibt es viel Variabilität in der Spezifität, Empfindlichkeit, interference von chemischen Verunreinigungen, effektive linearen Bereich und die Stabilität der Endpunkt Analyten. Zusätzlich können andere wichtige Faktoren, die die Wahl beeinflussen, sind Assay Schnelligkeit, einfache Handhabung und den Zugang zu relativ spezialisierte Ausrüstung wie einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)-Gerät.

Hier stellen wir eine einfache und sehr spezifische kolorimetrische Mikrotiterplatten-Assay zur Bestimmung der intrazellulären Ascorbat in kultivierten Zellen, sowie einen separaten Assay zur Bestimmung von Ascorbat-Efflux aus kultivierten Zellen. Letztere Assay zielt darauf ab, das Problem der Unterschätzung der Ascorbat Freisetzung aus den Zellen aufgrund der schnellen Wiederaufnahme des frei Ascorbat durch natriumabhängigen Transport Ascorbat (SVCTs) zu umgehen. Obwohl beide Methoden haben in einigen unserer bisherigen Veröffentlichungen 19,20,32,37,38 erschien, bietet diese Handschrift eine explizite Reihe von Anweisungen und Leitlinien für ihre effiziente Ausführung.

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Protocol

1. Bestimmen Intrazelluläre Ascorbat in kultivierten Zellen

  1. Zellkultur-und Ernte
    1. Wachsen Suspension (z. B. Mensch erythroleukemia, K562) oder adhärenten Zellen (zB primäre Astrozyten) mit Standard-Kulturverfahren 19-21,32,38. Hinweis: Um sicherzustellen, Zellen enthalten Ascorbat, laden kultivierten Zellen mit Ascorbat entweder als Ascorbat oder DHA 33,39.
  2. Neues Ascorbat haltigen Zellextrakt
    1. Inkubation eine entsprechende Anzahl von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gewaschen Aussetzung oder adhärenten Zellen mit 450 ul eiskaltem Zellpermeabilisierung Buffer [CPB; 0,1% (w / v) Saponin in PBS; 4 ° C]. Hinweis: Bestimmen der Anzahl von Zellen erforderlich ist, um einen Absorptionswert im linearen Bereich des Tests zu erhalten (siehe unten) empirisch durch den Endverbraucher. Hinweis: Gewebeextrakte können auch verwendet werden (siehe Diskussion für weitere Details).
    2. Agitate Zellen auf Eis für 10 Minuten, um eine gründliche zelluläre Lyse zu gewährleisten.
    3. Erstellen einer geklärten Ascorbat enthaltenden intrazellulären Extrakt durch Entfernen von Zelltrümmern durch Zentrifugieren des rohen Lysats bei 16.000 × g für 5 min in einer Mikrozentrifuge gekühlt (4 ° C).
    4. Entfernen Sie vorsichtig 4 x 100 ul Aliquots von jeder Probe, und fügen Sie eine horizontale Abfolge von Wells in einer 96-Well-Flachbodenplatte, die entweder 25 ul / Vertiefung PBS ("-AO") oder nur 25 ul / Vertiefung von 45,5 U enthält / ml Stammlösung von L-Ascorbat-Oxidase (AO) in PBS ("+ AO"). Hinweis: Diese sollten parallel mit der Vorbereitung der Standards durchgeführt werden (siehe unten).
  3. Ascorbat Standard-Kurve Bau (muss für jeden Test neu gebaut werden)
    1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM Ascorbinsäure in eiskaltem PBS. Hinweis: Überprüfen Sie, ob die Konzentration von Ascorbat spektrophotometrisch mit einer Quarz-Küvette mit einer 1cm Weglänge bei 265 nm (Extinktionskoeffizient = 14,5 mM -1 cm -1) 40.
    2. Sorgfältig bereiten eine Reihe von Ascorbat Standards zwischen 0 und 20 uM.
    3. Parallel zu Schritt 1.2.4, entfernen Sie vorsichtig 4 x 100 ul Aliquots von jedem Standard und fügen Sie zu einer horizontalen Folge von Vertiefungen in einer 96-Well-Flachbodenplatte, die 25 ul / Vertiefung enthält PBS ("AO-") oder eine 45,5 U / ml Stammlösung von AO in PBS ("+ AO"). Hinweis: 100 ul der oben Ascorbat Standards 0-2 nmol Ascorbat enthalten. Bitte beachten Sie, dass der Zweck der AO für den Beitrag der nicht-Ascorbat Reduktions Reduktion Ferricyanid steuern.
  4. Bestimmen intrazellulären Ascorbat - Schritt 1: selektiv zu entfernen, Ascorbat und quantitativ oxidieren Ascorbat mit Ferricyanid
    1. Orbital mischen die 96-Well-Platte bei 550 Upm bei Raumtemperatur für 5 min in der Dunkelheit durch Abdecken der Platte in Folien. Hinweis: Tseinen Schritt sollten alle Ascorbat in den "+ AO" Brunnen DHA zu oxidieren. Die "-AO" Brunnen sollte davon unberührt.
    2. Dann werden 50 ul 3,5 mM Kaliumferricyanid in PBS zu allen Vertiefungen (hierin als "Ferricyanid" bezeichnet). Die endgültige [Ferricyanid] = 1 mm. Hinweis: Verwenden Sie eine multipipettor.
    3. Die Platte Orbital mischen bei 550 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur für weitere 5 min im Dunkeln. Anmerkung: Dieser Schritt ist bei der Reduktion von Ferricyanid von Ascorbat in einem stöchiometrischen Verhältnis von 2 Molekülen Ferricyanid pro 1 Molekül Ascorbat oxidiert reduziert Cyanoferrat führen.
    4. Sofort werden 25 ul einer frisch aufgebaut Lösung mit 50% (v / v) Essigsäure und 30% (w / v) Trichloressigsäure (TCA). Hinweis: Verwenden Sie eine multipipettor.
  5. Bestimmen intrazellulären Ascorbat - Schritt 2: Quantifizierung der Menge des gebildeten Blutlaugen 37
    1. 100 l Ferrocyanidtest Bestimmung Lösung 37 bis Each gut. Hinweis: Eine funktionierende Lösung ist unmittelbar vor Gebrauch hergestellt werden: 2 ml 3 M Na-Acetat (pH 6,0); 0,5 ml Eisessig (~ 17,4 M Essigsäure); 2 ml 0,2 M Zitronensäure; 2 ml von 3,3 mM FeCl 3 in 0,1 M Essigsäure; 1 ml 30 mM Ferene-S. Das endgültige Volumen dieser Arbeitslösung sollte 7,5 ml betragen.
    2. Orbital mischen der Platte im Dunkeln bei 550 UpM für 30 min bei Raumtemperatur.
    3. Lesen der Absorptionswerte der Vertiefungen bei 593 nm (das heißt das Absorptionsmaximum des Fe (II) (Ferene-S) 3-Komplex).
    4. Berechnen Sie die Menge der intrazellulären Ascorbat als nmol Ascorbat pro Million Zellen zunächst Subtraktion der A 593 nm Werte für die '+ AO' Brunnen aus den entsprechenden '- AO "Brunnen für jede Probe und dann Interpolation von der Ascorbat Standardkurve (siehe Schritt 1.3 ). Bei der Konstruktion der Standardkurve zeichnen dieses "Differenzwert" für jeden Standard gegen die Höhe der ascorbaß pro Vertiefung.

2. Bestimmung von Ascorbat-Ausstrom aus kultivierten Zellen

  1. Zellkultur-und Ernte
    1. Wachsen Aussetzung oder adhärenten Zellen, wie oben (siehe Schritt 1.1). Hinweis: Durchführung der unter-Assay in einer 24-Well-Format plat mit Federung und adhärenten Zellen für beste Ergebnisse.
    2. Resuspendieren Suspensionszellen oder lagern adhärenten Zellen mit 400 &mgr; l vorgewärmtem HEPES-gepufferte Salzlösung, mit oder ohne Calcium und Magnesium, und enthaltend 5 mM D-Glucose (HBS / D, pH 7,3, 37 ° C) in Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Füge das gleiche Volumen an HBS / D angegeben zellfreien Vertiefungen auf jeder Platte mit 24 Vertiefungen untersucht werden. Hinweis: Letztere wird als zellfreie Kontrollen für die Baseline-Reaktion dienen (siehe unten).

3. Bestimmen Sie die Anzahl der Ascorbat freigegeben

  1. Sollten die folgenden Stammlösungen vorher vorbereitet werden: 120U / ml AO in HBS / D (frisch zubereiten); 2,4 mM Ferene-S in HBS / D; 120 uM FeCl 3 und 600 uM Na-Citrat in HBS / D (unmittelbar vorzubereiten aus mehr konzentrierte Stammlösungen).
  2. Um die Reaktions ferrireduction (Endvolumen pro Vertiefung sollte 600 ul sein) zu starten, fügen Sie die folgenden Mengen an Reagenzien an einzelnen Wells bereits 400 ul HBS / D enthält:
    1. Dann werden 50 &mgr; l AO (120 U / ml) oder HBS / D in Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung gepaart. Die endgültige Konzentration sollte AO 10 U / ml. Hinweis: Label gepaart Brunnen als "- AO" und "+ AO".
    2. Mische die Platten sanft orbitalen Mischen für 5 min bei 37 ° C.
    3. In 50 ul von 2,4 mM Ferene-S in alle Vertiefungen. Die endgültige Ferene-S-Konzentration sollte 200 &mgr; m sein. Mische die Platten wie oben für 5 min bei 37 ° C.
    4. In 50 ul frisch zubereitet 120 uM Eisen-III-Citrat. Die endgültige Eisen und Citrat-Konzentrationen sollten 10 uM Eisen und 50 uM Citrat sein. Gut mischen.
    5. In drei dreifach Steuer Brunnen, saugen Sie den darüberliegenden Medium, und fügen Sie 600 ul HBS / D mit 0,1% Saponin. Hinweis: Diese werden als "100% Zell-Lyse" Steuerelemente für ein Laktat-Dehydrogenase (LDH)-Freisetzungstest parallel durchgeführt werden (siehe unten) zu dienen.
    6. Inkubation für 60 min im Dunkeln bei 37 ° C.
    7. Am Ende des Ascorbat-Efflux-Assay, schnell absaugen 500 ul von jedem gut, und fügen Sie in einer 24-Well-Platte entsprechend gekennzeichnet Brunnen. Hinweis: für Suspensionszellen, zunächst zu entfernen, die Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C.
    8. Add 300 ul-Aliquots des Überstandes auf eine 96-Well-Platte und dann bei 593 nm abgelesen.

    4. Bestimmung der extrazellulären Ascorbat

    1. Lesen Sie die Absorptionswerte der Wells bei 593 nm auf.
    2. Berechnen der Menge des extrazellulären Ascorbat als Ascorbat nmol pro mg Protein (oder pro Million Zellen), die zur Bestimmung der intrazellulären Ascorbat beschriebenin Schritt 1.5.4. Hinweis: Der Anwender sollte Bedingungen zu optimieren, so dass Ascorbat Freigabe nicht durch intrazelluläre Ascorbat begrenzt.

    5. Bestimmung der LDH-Freisetzung

    1. Mit den restlichen 200 ul der extrazellulären Lösung von jeder Probe die Durchführung einer LDH-Freisetzungstest 32,41, um das Ausmaß der zellulären Lyse zu bestimmen. Hinweis: berechnet in% des Gesamt lösbare LDH. Bestimmen lösbare LDH aus den Proben, die mit 0,1% Saponin behandelt wurden.

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Representative Results

Bestimmung der intrazellulären Ascorbat in kultivierten Suspensionszellen

Im ersten Test (Abbildung 1), ist die intrazelluläre Ascorbat bestimmt, nach Ascorbat spezifische (dh, AO-und Kleinschreibung) Reduktion von Ferricyanid zu Ferrocyanid, mit Hilfe der hochempfindlichen Bestimmung von Blutlaugen durch eine zuvor veröffentlichten Verfahren 37. Der Nachweis von Ascorbat auf der kolorimetrischen Chelatisierung von Eisen, die von der Ascorbat-abhängige Reduktion von Ferricyanid zu Ferrocyanid, gefolgt von der Reduktion von Eisen-III zu Eisen von Ferrocyanid erzeugt basiert. Als supraphysiologischen Konzentrationen von einigen zweiwertigen Metallionen (zB Cu 2 +, Co 2 + und Zn 2 +) kann stören, vermutlich durch Konkurrenz mit Eisenchelation von Eisen für Ferene-S, sollten geeignete Vorsichtsmaßnahmen unter solchen Bedingungen 37 genommen werden.

Abbildung2 zeigt eine typische Standardkurve für eine Reihe von Normen Ascorbat 0-20 uM (oder 0-2 nmol Ascorbat pro Vertiefung der 96-Well-Platte, siehe Schritt 6.5 in der "Protokoll".). Obwohl in dieser Figur nicht gezeigt ist, ist die Linearität bis zu 8 nmol Ascorbat pro Vertiefung (dh ein Netz A 593 nm von ~ 1,6), was zu einer Probe Ascorbat-Konzentration von ~ 80 &mgr; m entspricht, gehalten. Der Test kann verwendet werden, um Ascorbat Ebenen erfolgreich erkennen unter 0,25 nmol Ascorbat pro Well (2,5 uM Probe Ascorbat-Konzentration) werden.

K562-Zellen schnell ansammeln intrazellulären Ascorbat von extrazellulären DHA, aber nicht Ascorbat (siehe Abbildung 3, mit Genehmigung von Lane und Lawen 2008 19 wiedergegeben). In dieser repräsentativen Experiment wurden PBS gewaschen K562-Zellen (4 x 10 6 Zellen / ml) in PBS mit 500 uM entweder Ascorbat (steigend) inkubiert, DHA, DHA + 50 uM Cytochalasin B (DHA + CB), ASC + 5 mM Ferricyanid (Asc / FIC) oder ASC + 50 U / ml AO (Asc / AO) für 30 min bei 37 ° C Intrazelluläre Ascorbat wurde wie im "Protokoll" beschrieben, bestimmt.

DHA-Aufnahme durch K562-Zellen erfolgt durch fördernde Glukosetransporter (GLUT)-vermittelten Transport (siehe Abbildung 4, mit Genehmigung von Lane und Lawen 2009 42 wiedergegeben). Um die Beteiligung von GLUTs in DHA-Aufnahme in diesem repräsentativen Versuch zu bewerten, wurden K562-Zellen mit steigenden Konzentrationen von Cytochalasin B (CB) oder Dihydrocytochalasin B (H 2 CB) in MBS, das 0,5% Ethanol für 15 min bei 37 ° C inkubiert, bevor gelöst Inkubation mit 400 &mgr; M DHA für 30 min bei 37 ° C in dem gleichen Medium (4A). Die Zellen wurden dann dreimal in 100 Volumina eiskaltem MBS und deren intrazelluläre Ascorbat bestimmt, wie in dem "Protokoll" beschrieben. Es ist wichtig zu beachten, während sowohl CB und CB H 2 hemmen bewegliche Prozesse in mikromolarenKonzentrationen (1-100 uM), nur CB, die von H 2 CB durch die Anwesenheit der einzige Doppelbindung unterscheidet, hemmt GLUT-abhängigen Transport bei niedrigen mikromolaren Konzentrationen (1-10 uM) 43. Daher wird, wie DHA-Aufnahme war hemmbar durch CB mit einem IC 50 <2,5 &mgr; M, aber nicht hemmbar durch H 2 CB, erfolgt DHA Aufnahme wahrscheinlich GLUT-vermittelten Transport 38. O-Methyl-D-glucose (3-OMG) oder die nicht-GLUT-transportierbaren Glucose Stereoisomer - L - alternativ in 4B, gewaschenen Zellen wurden zunehmenden Konzentrationen des GLUT-transportabel, aber nicht-metabolisierbaren Glucoseanalog 3 frei Glucose vor der Inkubation mit DHA in Panel A. Wiederum zeigen die Ergebnisse, GLUT Beteiligung an DHA Einfuhr die Hemmung der intrazellulären Akkumulation Ascorbat tritt nur in Gegenwart des GLUT-transportierbaren Glucoseanalog.

Determination von Ascorbat-Efflux von adhärenten Zellen

Im zweiten Assay, kann die Geschwindigkeit der Ascorbat-Efflux aus kultivierten Zellen bestimmt werden. Diese spezifischen Assay ist wichtig, da die Freisetzung von Zellen aus Ascorbat scheint für die Ascorbat-reguliert zelluläre Aufnahme von nicht-Transferrin-gebundene Eisen durch Zellen 19,20 sein. Die Aufnahme von Nicht-Transferrin-gebundene Eisen wird als die für die Pathophysiologie der Eisenüberladung Erkrankungen wie der hemochromatoses 22 sowie Astrozyten-Neuronen Eisenaustausch und Homöostase im Gehirn von Säugetieren 22 ist. In der Tat, wir haben kürzlich gezeigt, dass die Haupt erregende Neurotransmitter, L-Glutamat, löst die Freisetzung von Ascorbat aus Astrozyten in einer Weise, die auf L-Glutamat-Aufnahme durch GLAST und nachfolgende zelluläre Schwellung, die die Freisetzung von Ascorbat durch vermeintliche VSOACs 32 auslöst, hängt davon ab. In Analogie, Ascorbat release von Ascorbat belasteten Astrozyten durch die exzitatorischen Aminosäuren, L-Aspartat, aber nicht die nicht-anregenden Aminosäure L-Glutamin stimuliert werden. Dieser Effekt ist in Fig. 5 dargestellt, die Dosis-Antwort-Kurven für die Stimulation von Ascorbat (AA)-Freisetzung durch Aspartat (geschlossene Kreise) und Glutamin (offene Kreise) von Primärkulturen zeigt (mit freundlicher Genehmigung von Lane Lawen 2012 und 32 wiedergegeben) Ascorbat-Maus geladen Astrozyten.

Es ist wichtig, zu erläutern, wie dieses ascorbat-Efflux-Test unterscheidet sich von dem Test für die Bestimmung der intrazellulären Ascorbat ist. Der Hauptunterschied liegt in der Tatsache, dass das Niveau des in der Lösung verbleibenden Ascorbat nicht durch eine chemische Reaktion am Ende von einem gegebenen Zeitpunkt durchgeführt wird, wie es der Fall für die intrazelluläre Ascorbat Bestimmungsverfahren bestimmt. Stattdessen wird ein "reduktive Signatur" akkumuliertewährend der Periode, in der Ascorbat aus den Zellen freigesetzt. Diese reduktive Signatur in Form des Ascorbat-abhängige Reduktion von extrazellulärem Eisencitrat, gefolgt von der schnellen Chelatisierung des zweiwertigen Eisens als eine große extrazelluläre und membran impermeant erfasst [(II) (Ferene-S) Fe 3] 4 - Chelat . Ferene-S kann als ähnlich Membran-impermeante über die kurze Zeit Verlauf des Assays werden. Die Ebenen dieser chromogenen Komplex kann dann als Endpunkt Messung ermittelt werden. Da nur die AO-sensitive Ebenen dieser Chelat bestimmt sind, bietet der Test eine hohe Grad an Spezifität für die Bestimmung der extrazellulären L-Ascorbat.

Figur 1
1. Flussdiagramm, das wesentliche Schritte in dem Protokoll fürDie Bestimmung der intrazellulären Ascorbat.

Figur 2
Abbildung 2 Eine typische Standardkurve für eine Reihe von Normen Ascorbat 0-20 uM.. (Oder 0-2 nmol Ascorbat pro Vertiefung der 96-Well-Platte;. Siehe Schritt 6.5 in der "Protokoll") Fehlerbalken sind nicht wie dargestellt sie sind in dem Bereich mit den Symbolen besetzt.

Fig. 3
3. K562-Zellen rasch zu akkumulieren intrazellulär Ascorbat von extrazellulären DHA, aber nicht Ascorbat. PBS gewaschen K562-Zellen (4 × 10 6 Zellen / ml) in PBS mit 500 uM o inkubiertf entweder Ascorbat (steigend), DHA, DHA + 50 uM Cytochalasin B (DHA + CB), ASC + 5 mM Ferricyanid (steigend / FIC) oder ASC + 50 U / ml AO (Asc / AO) für 30 min bei 37 ° C. Intrazelluläre Ascorbat wurde wie im "Protokoll" beschrieben, bestimmt. Die gezeigten Ergebnisse sind Mittelwerte aus drei Einzelversuchen (+ SD). * Die intrazelluläre Ascorbat-Konzentration wurde mit einem vorher festgelegten intrazellulären Wasserraum für K562-Zellen (dh ~ 1,6 μl/106 Zellen) 19,20 geschätzt. Dieser Wert wurde mit Genehmigung von Lane und Lawen 2008 19 reproduziert worden.

Fig. 4
4. DHA-Aufnahme durch K562-Zellen fördernde Glucosetransporter (GLUT) auftritt vermittelten Transport. K562-Zellen, die 6-8 × 10 6 Zellen / ml in RPMI + 10% (aufgewachsenev / v) fötalem Rinderserum bei 37 ° C wurden 5% CO 2 und 95% Luft zunächst dreimal mit MBS gewaschen. Oder Dihydrocytochalasin B (H 2 CB) in Mops-gepufferte Kochsalzlösung gelöst (MBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na +, pH 7,3; Gewaschene Zellen wurden dann in steigenden Konzentrationen von Cytochalasin B (Sigma CB) ausgesetzt ), enthaltend 0,5% Ethanol vor der Inkubation mit 400 &mgr; M DHA für 30 min bei 37 ° C (A). Die Zellen wurden dann dreimal gewaschen, in 100 Volumina kaltem MBS und deren intrazelluläre Ascorbat bestimmt, wie in dem "Protokoll" beschrieben. Wie DHA-Aufnahme war inhibierbaren von CB, aber nicht H 2 CB, tritt DHA-Aufnahme durch GLUT-vermittelten Transport. Alternativ können in (B), gewaschenen Zellen wurden zunehmenden Konzentrationen ausgesetzt GLUT-transportabel, aber nicht-metabolisierbaren Glucoseanalog 3 - O-methyl-D-glucose (3-OMG) oder die nicht-GLUT-transportierbaren Glucose Stereoisomer (A). Auch hier zeigen die Ergebnisse, GLUT Beteiligung an DHA-Aufnahme. Dieser Wert wurde mit Genehmigung von Lane und Lawen 2008 42 reproduziert worden.

Figur 5
5. Ascorbate Mitteilung von Ascorbat belasteten Astrozyten durch die exzitatorischen Aminosäure L-Aspartat stimuliert, jedoch nicht die nicht-anregenden Aminosäure L-Glutamin. Diese Figur zeigt Dosis-Antwort-Kurven für die Stimulation von Ascorbat (AA)-Freisetzung durch Aspartat (geschlossene Kreise) und Glutamin (offene Kreise) von Primärkulturen von Ascorbat belasteten Maus Astrozyten. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte (± SD) von drei Experimenten. P <0,001 vsdie Bedingung "basalen". Dieser Wert wurde mit Genehmigung von Lane und Lawen 2012 32 reproduziert worden.

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Discussion

In der vorliegenden Arbeit werden zwei schnelle, spezifische und relativ empfindliche kolorimetrische Mikrotiterplatten-Assays zur Bestimmung von Ascorbat aus den intra-und extrazellulären Kompartimenten in kultivierten Zellen. Die Tests können mit Zugang zu Standard-Labor-Ausrüstung und Reagenzien durchgeführt werden. Die nur moderat kostspielig Reagens für den Assay erforderlich ist, AO, was wesentlich ist, da es einen hohen Grad an Spezifität gegenüber Analyt-L-ascorbat verleiht. Die Tests sind gut geeignet, um entweder Suspensionszellen (zB K562) oder adhärenten Zellen (zB HepG2-oder Primär Nagetier Astrozyten) und haben sich in früheren Publikationen mit solchen Zellen 19,20,32,37,38 beschäftigt. Die Verwendung von anderen Ascorbat Oxidationsmittel (z. B. Tempol) anstelle der AO sollte vermieden werden, da sie nicht ausreichend spezifisch für L-Ascorbat. Außerdem ist die Verwendung von Verbindungen wieTempol in der Ascorbat-Release-Assay wird durch die Fähigkeit der Tempol Zellmembranen zu überqueren und oxidieren intrazellulären Ascorbat 44 verwechselt werden. AO ist im Wesentlichen Membran-impermeante über die Zeitkurse verwendet.

Wir haben einen direkten Vergleich der mit dem oben beschriebenen kolorimetrischen Assay Ascorbat und fluorometrischen Bestimmung von Ascorbat Vislisel und Kollegen 36 erhaltenen Ergebnisse durchgeführt. Wir fanden, daß beide Assays ergaben identische Ergebnisse für die Bestimmung der intrazellulären Ascorbat-Assay (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise ist die oben beschriebene Ascorbat-Freisetzungsassay ergab wesentlich höhere Werte für die scheinbare Geschwindigkeit der Ascorbat-Efflux als bei der fluorometrischen Endpunktassay. Dies legt nahe, dass die hier beschriebene Ascorbat-Efflux-Assay erlaubt die Bestimmung der scheinbaren "Ascorbat-Efflux", die nicht so leicht durch die Wahrscheinlichkeit des Ascorbat-Wiederaufnahme durch Zellen verwechselt wird; ein Prozess, der wahrscheinlich mit plasma Membran SVCTs. Solche Wiederaufnahme würde dazu neigen, Unterschätzung der tatsächlichen Niveaus von Ascorbat, die in einem bestimmten Zeitraum veröffentlicht wurden, wenn ein Endpunkt Ascorbat Messung vorgenommen wurde verursachen. Es sei darauf hingewiesen, dass, wenn Gewebeproben (z. B. Muskel, Lunge oder Gehirn) anstelle von kultivierten Zellen für die Bestimmung der intrazellulären Ascorbat-Assay verwendet werden sollen, dann wird ein Gewebe-Homogenat ist mit eiskaltem CPB und eine Form der mechanischen Störung (aufgebaut sein kann zB Dounce Homogenisierung, Sondenspitzen-Beschallung, Französisch Presse etc.). Zelltrümmer sollten durch Zentrifugation entfernt werden und der Benutzer sollte die mögliche Notwendigkeit für die Proben Deproteinierung und / oder Zugabe von Protease-Inhibitoren, bevor Sie mit Schritt 1.2.4 fortfahren zu betrachten.

Wir berichteten auch, dass bisher niedrigen mikromolaren Konzentrationen von Cytochalasin B (<10 uM) nicht die scheinbare Geschwindigkeit von Ascorbat-Efflux, die durch den Test 32 ermittelt wurden, hemmen 19 reduziert, 20,38.

Es gibt mehrere wichtige Schritte in diese Protokolle. Zuerst werden die hierin beschriebenen Assays hängen entscheidend von der Fähigkeit, die Ascorbat-AO selektiv und schnell zu entfernen in gepaarte Stichproben. Wenn die spezifische Aktivität des Präparats von AO ist deutlich geringer als die Soll-und angenommener Aktivität ist es möglich, dass nicht alle von Ascorbat in der AO-haltigen sBeispiele wird entfernt. Dies kann zu einer Unterschätzung der Höhe von Ascorbat in den unbekannten Proben führen, wenn mit dem "direkten Methode", um die Menge von Ascorbat zu berechnen. Allerdings, wenn man die "Standard-Kurvenverfahren", die empfohlen wird, verwendet, geringer Aktivität Zubereitungen der AO nur zu einem Verlust der Assay-Sensitivität führen. Wir haben gefunden, daß gute Ergebnisse konsistent mit Hilfe Zubereitungen AO konstruiert erhalten durch Auflösen von 1.000 U AO in 1 ml von entweder PBS oder MBS, die dann in 100 ul-Aliquots, die bei -80 ° C für nicht mehr als gespeicherte geteilt einem Monat. Ferner ist, wie AO ist ein Protein, das proteolytisch durch Zelllysate abgebaut werden können, Protease-Inhibitoren können Zelllysaten vor Zugabe der Lysate auf die AO-enthaltenden Vertiefungen zugegeben werden. Dies kann eine nützliche Modifikation, die bei der Verwendung von Zell-oder Gewebe Lysaten, die reich an Protease-Aktivität sind sein.

Außerdem beschrieb die Empfindlichkeit der Assays einBove hängt weitgehend von der Verwendung des chromogenen zweizähnigen Fe (II)-Chelatbildner, Ferene-S. Diese Chelatbildner können durch chemisch ähnliche Chelatoren wie Ferrozin und Bathophenanthrolin disulfonat ersetzt werden, aber mit einer Abnahme der Empfindlichkeit entsprechend der Extinktionskoeffizient der Fe (II)-Chelate 37. Darüber hinaus sollte Vorsicht bei der Verwendung Bathophenanthrolin Disulfonat, wie es scheint, um zu höheren Raten von offensichtlich autokatalytische ferrireduction in Gegenwart von Eisen-Citrat-Komplexe als Ferene-S oder Ferrozine 37,45 führen genommen werden. Dies ist eine einschlägige Sorge bei der Ascorbat-Freisetzungstest als nicht-Ascorbat-abhängigen Erscheinung der Fe (II)-Chelat wird die Empfindlichkeit des Assays zu verringern.

Während die intrazelluläre Ascorbat Bestimmung Assay mit adhärenten Zellen kompatibel sind, sollte Ablösung solcher Zellen vor zelluläre Lyse durch mechanisches Abkratzen statt Trypsin / EDTA durchgeführt werden. Trypsin ist eine Protease,es wahrscheinlich negativ beeinträchtigen die Ascorbat-Abreicherungsschritt mit AO, von denen die letztere ein Protein ist. Darüber hinaus wird die EDTA wahrscheinlich mit dem FOC Bestimmungsschritt durch Chelat-Eisen im Wettbewerb mit Ferene-S 37 stören. Solche Mittel sollten vermieden werden. Schließlich könnte die Ascorbat-Freisetzungstest für Suspensionszellen leicht angepasst werden kann. Statt Absaugen der darüberliegenden Fe (II) (Ferene-S) 3-haltigen Chelat am Ende des Assays werden die Zellen durch Zentrifugation sollte schnell wie für die intrazelluläre Ascorbat-Bestimmungsassay sedimentiert werden. Die Absorption bei 593 nm des Überstands sollte dann bestimmt werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Wir sind dankbar, dass Dr. Stephen Robinson und Frau Hania Czerwinska (Monash University) für die großzügige Versorgung der Astrozyten-Kulturen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc 96-well flat-bottom plates Thermo 269620 Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge Eppendorf 5415D A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge Eppendorf 5810R Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer Bio-Rad Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) Eppendorf This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer Sigma-Aldrich 30790 Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762 Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO) Sigma-Aldrich A0157 Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC) Sigma-Aldrich 455989 Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) Sigma-Aldrich 92940
Sodium L-glutamate Sigma-Aldrich
L-glutamine Sigma-Aldrich
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate

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