Una rapida e specifica Microplate Assay per la determinazione di ascorbato intra-ed extracellulare in cellule in coltura

Biology

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Summary

L'ascorbato interpreta numerosi ruoli importanti nel metabolismo cellulare, molti dei quali sono venuti alla luce solo negli ultimi anni. Qui si descrive un medium-throughput specifico e poco costoso saggio micropiastra per la determinazione di entrambi ascorbato intra ed extracellulare in coltura cellulare.

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Lane, D. J., Lawen, A. A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (86), e51322, doi:10.3791/51322 (2014).

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Abstract

Vitamina C (acido ascorbico) svolge numerosi ruoli importanti nel metabolismo cellulare, molti dei quali sono venuti alla luce solo negli ultimi anni. Ad esempio, all'interno del cervello, ascorbato agisce in maniera neuroprotettivo e neuromodulatori che coinvolge l'ascorbato bicicletta tra i neuroni e astrociti vicinali - un rapporto che sembra essere cruciale per l'ascorbato cervello omeostasi. Inoltre, prove emergenti suggeriscono fortemente che l'ascorbato ha un ruolo notevolmente ampliato nella regolazione del metabolismo del ferro cellulare e sistemica di quanto è riconosciuto in stile classico. La crescente riconoscimento del ruolo fondamentale di ascorbato di fisiologia cellulare e organismal normale e deregolamentato richiede una serie di media-throughput e alta sensibilità tecniche analitiche che possono essere eseguiti senza la necessità di attrezzature specialistiche altamente costosi. Qui forniamo istruzioni esplicite per un mezzo di throughput, specifico e relativamente poco costoso test micropiastra per la determinazione dei both ascorbato intra ed extracellulare nelle cellule in coltura.

Introduction

La scoperta della natura chimica di acido ascorbico (vitamina C), e la sua identificazione come il tanto ricercato "fattore anti-scorbutico", di Albert Szent-Györgyi e altri in articoli pubblicati 1928-1934 1 sono stati eventi significativi nella storia di biochimica. Infatti, queste scoperte hanno contribuito a Szent-Györgyi stato assegnato il Premio Nobel per la Fisiologia e Medicina nel 1937. La suite in continua espansione dei ruoli per ascorbato di animali e fisiologia vegetale, così come la salute umana, continuano ad essere i soggetti di attivi scientifica indagini e polemiche.

L-ascorbato è un abbondante riducente fisiologico e enzima cofattore nei mammiferi, e contribuisce a numerose reazioni enzimatiche ben definiti che coinvolgono il collagene idrossilazione, carnitina e noradrenalina biosintesi, metabolismo della tirosina e ormone peptidico amidazione 2. Curiosamente, Evide di montaggioSNO suggerisce che ascorbato svolge un ruolo nello stimolare altri diossigenasi ferro-dipendenti, come prolina e asparaginyl idrossilasi coinvolti nella idrossilazione e mira dei fattori inducibili (HIF) 1α e 2α 3. Un recente rapporto suggerisce che l'ascorbato svolge un ruolo nella maturazione delle cellule T attraverso colpisce cromatina demetilazione attraverso la sua attività nello stimolare i idrossilasi nucleari, Jumonji C (JmjC) proteine ​​dominio; l'ultimo dei quali sembrano richiedere ascorbato di piena attività 4. Infatti, la stimolazione di tali enzimi da ascorbato sembra verificarsi con un meccanismo simile alla stimolazione da ascorbato delle HIF e collagene idrossilasi. Tra gli altri effetti classici, ascorbato contribuisce significativamente antiossidazione cellulare come una catena-rottura radical scavenger idrosolubile 5 e al riciclo di membrana plasmatica α-tocoferolo (vitamina E) attraverso la riduzione della α-tocopheroxyl radicale 6, which è importante nella protezione contro la perossidazione dei lipidi di membrana 7. È importante sottolineare che, sebbene la maggior parte dei mammiferi sono in grado di sintesi de novo epatica di ascorbato da D-glucosio, primati superiori, cavie e alcuni pipistrelli dipendono da fonti alimentari di vitamina 8. Ciò è dovuto alla inattivazione del gene Gulo, gli ortologhi di cui nei mammiferi affetti codificano l'enzima, γ-gulono-lattone ossidasi 9-13. Questo enzima è necessario per la reazione finale in ascorbato biosintesi di glucosio 13.

Dopo l'assorbimento trasportatore mediata dal lume intestinale nell'uomo, ascorbato è distribuito in tutto il corpo attraverso il sistema circolatorio. La vitamina si trova in genere nella sua forma ridotta a millimolari concentrazione intracellulare (con la notevole eccezione di eritrociti in cui le concentrazioni sono in genere simili a concentrazione plasmatica prevalente), e al conc micromolarentrations (ad esempio 50-200 micron) nella maggior parte dei fluidi extracellulari 14,15.

In condizioni fisiologiche, ascorbato subisce generalmente reversibile un elettrone ossidazione al ascorbil radicale libero (AFR, noto anche come monodehydroascorbate o semidehydroascorbate). Mentre l'AFR è relativamente stabile radicale 16, in assenza della sua rapida riduzione enzimatica di un elettrone ritorna ascorbato, due AFR può ulteriormente dismutate una ascorbato e una deidroascorbato (DHA) 9,13,17. Entro l'interno della cellula, l'ossidazione del prodotto a due elettroni di ascorbato, DHA, può essere rapidamente ridotta ritorna ascorbato da glutatione-e NAD (P) H enzimatico-dipendente e reazioni non enzimatiche 13.

Mentre è classicamente accettato che solo il ruolo significativo di ascorbato nel metabolismo del ferro è di stimolare l'assorbimento alimentare di ferro non-eme 18, noi ed altri abbiamo fornito prove strongly suggerendo che ascorbato gioca un ruolo notevolmente ampliato nel metabolismo di questo metallo. Primo, ascorbato che viene rilasciato da cellule ascorbato-piene sembra giocare un ruolo importante nel modulare l'assorbimento di ferro non legato alla transferrina dalle cellule 19,20, e molto recenti evidenze indicano che l'ascorbato modula anche l'assorbimento di ferro legato alla transferrina da celle 21, l'ultima delle quali corrisponde ad una maggiore fisiologica percorso ferro-uptake 22.

L'ascorbato è essenziale per la normale funzione del sistema nervoso centrale dei mammiferi 23,24. Insieme con la corteccia surrenale, ghiandola pituitaria, il timo, retina e corpo luteo, il cervello contiene alte concentrazioni di ascorbato rispetto ad altri tessuti del corpo 23,25-27. Inoltre, l'esposizione di entrambi 28,29 astrociti e cellule simili ai neuroni 30 al glutammato è noto per innescare il rilascio di ascorbato nello spazio extracellulare, dove il ascorbate è pensato per aiutare a proteggere i neuroni contro glutammato indotta da disfunzione neuronale 31. Sebbene l'esatto meccanismo di glutammato indotto ascorbato di liberazione dagli astrociti è sconosciuto, di recente abbiamo fornito prove che indicano il coinvolgimento di cellule gonfiore causato da glutammato assorbimento da parte del glutammato astrociti e aspartato trasportatore (GLAST, noto anche aminoacido eccitatorio trasportatore isoforma 1 [EAAT1 ] nell'uomo) e conseguente attivazione di osmolyte e anionici canali di volume sensibile (VSOACs) che sono permeabili alle piccole anioni organici come ascorbato 32. Le identità molecolari dei condotti membrana plasmatica coinvolti nella formazione VSOAC restano da identificare 33,34.

Sebbene molti saggi sono stati sviluppati per la determinazione di ascorbato in campioni biologici, che comprendono spettrofotometriche, cromatografiche fluorimetrica e saggi 35,36, c'è molto variabilità specificità, sensibilità, interference da contaminanti chimici, range lineare efficace e stabilità dell'analita endpoint. Inoltre, altri fattori importanti che influenzano la scelta del saggio sono rapidità, facilità d'uso e l'accesso alle apparecchiature relativamente specializzata come una cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) apparecchi.

Presentiamo qui un saggio colorimetrico per micropiastre semplice e altamente specifico per la determinazione di ascorbato intracellulare in cellule in coltura, così come un test separato per la determinazione di ascorbato-efflusso da cellule coltivate. Il secondo test ha lo scopo di aggirare il problema della sottovalutazione del rilascio ascorbato dalle cellule a causa del rapido re-uptake di ascorbato rilasciato da trasportatori ascorbato di sodio-dipendente (SVCTs). Sebbene entrambi questi metodi sono apparsi in alcune delle nostre precedenti pubblicazioni 19,20,32,37,38, questo manoscritto fornisce un insieme esplicito di istruzioni e linee guida per la loro esecuzione effettiva.

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Protocol

1. Determinare ascorbato intracellulare in cellule in coltura

  1. Coltura cellulare e la raccolta
    1. Grow sospensione (ad esempio eritroleucemia umana, K562) o cellule aderenti (ad esempio astrociti primari) utilizzando le procedure standard di coltura 19-21,32,38. Nota: per garantire le cellule contengono acido ascorbico, caricare cellule in coltura con l'ascorbato sia come ascorbato o DHA 33,39.
  2. Creare un estratto cellulare-ascorbato contenente
    1. Incubare un numero adeguato di PBS sospensione (PBS)-lavati o cellule aderenti con 450 ml di ghiacciata cellulare Permeabilization Buffer [CPB; 0,1% (w / v) in PBS saponina; 4 ° C]. Nota: determinare il numero di cellule necessario per ottenere un valore di assorbanza nell'intervallo lineare del test (vedi sotto) empiricamente l'utente finale. Nota: estratti di tessuto possono anche essere utilizzati (vedi la discussione per ulteriori dettagli).
    2. Agitazionecellule te in ghiaccio per 10 minuti al fine di garantire lisi cellulare approfondita.
    3. Creare un estratto intracellulare-ascorbato contenente chiarito rimuovendo detriti cellulari mediante centrifugazione del lisato grezzo a 16.000 xg per 5 minuti in una microcentrifuga refrigerata (4 ° C).
    4. Rimuovere accuratamente 4 x aliquote di 100 microlitri di ciascun campione e aggiungere a una sequenza orizzontale di pozzetti in una piastra a 96 pozzetti fondo piatto che contiene sia 25 pl / pozzetto di PBS ("-AO") solo o 25 ml / pozzetto di 45,5 U / ml soluzione stock di L-ascorbato ossidasi (AO) in PBS ("+ AO"). Nota: questo dovrebbe essere fatto in parallelo con la preparazione degli standard (vedi sotto).
  3. L'ascorbato costruzione standard-curva (deve essere costruito di nuovo per ogni test)
    1. Preparare una soluzione stock di 10 mM acido ascorbico in PBS freddo. Nota: Controllare la concentrazione di ascorbato spettrofotometricamente utilizzando una cuvetta di quarzo con un 1cm percorso di lunghezza a 265 nm (coefficiente di estinzione = 14.5 mM -1 cm -1) 40.
    2. Preparare con cura una serie di standard ascorbato tra 0 e 20 micron.
    3. In parallelo con il punto 1.2.4, rimuovere con cautela 4 × aliquote da 100 microlitri da ogni standard e aggiungere a una sequenza orizzontale di pozzetti in una piastra di fondo 96 pozzetti flat che contiene 25 ml / pozzetto di PBS ("-AO") o un soluzione madre 45,5 U / ml di AO in PBS ("+ AO"). Nota: 100 ml di norme di ascorbato di cui sopra conterrà 0-2 nmole di ascorbato. Si prega di notare, lo scopo della AO è quello di controllare il contributo di riducenti non ascorbato di ferricianuro di riduzione.
  4. Determinare ascorbato intracellulare - Fase 1: rimuovere selettivamente ascorbato e quantitativamente ossidare ascorbato con ferricianuro
    1. Orbitally mescolare la piastra a 96 pozzetti a 550 rpm a temperatura ambiente per 5 minuti al buio coprendo la piastra in alluminio. Nota: Til suo passo dovrebbe ossidare tutti ascorbato nei pozzi "+ AO" al DHA. I pozzi "-AO" dovrebbero essere influenzate.
    2. Aggiungere 50 ml di ferricianuro di potassio 3,5 mm (in appresso denominate "ferricianuro") in PBS a tutti i pozzetti. La finale [ferricianuro] = 1 mm. Nota: Utilizzare un multipipettor.
    3. Orbitally mescolare la piastra a 550 rpm a temperatura ambiente per altri 5 minuti al buio. Nota: Questo passo dovrebbe comportare la riduzione di ferricianuro di Ferrocianuro da ascorbato in un rapporto stechiometrico di 2 molecole di ferricianuro ridotti per 1 molecola di ascorbato ossidato.
    4. Immediatamente aggiungere 25 ml di una soluzione recente costruzione contenente 50% (v / v) di acido acetico e 30% (w / v) di acido tricloroacetico (TCA). Nota: Utilizzare un multipipettor.
  5. Determinare ascorbato intracellulare - Fase 2: quantificare la quantità di ferrocianuro formato 37
    1. Aggiungere 100 ml di soluzione di determinazione ferrocianuro di 37 each bene. Nota: Una soluzione di lavoro deve essere effettuata immediatamente prima dell'uso: 2 ml di 3 M Na-acetato (pH 6.0); 0,5 ml di acido acetico glaciale (~ 17.4 M di acido acetico); 2 ml di 0,2 M di acido citrico; 2 ml di 3,3 FeCl mm 3 a 0,1 M di acido acetico; 1 ml di 30 mM ferene-S. Il volume finale di questa soluzione di lavoro dovrebbe essere di 7,5 ml.
    2. Orbitally mescolare la piastra al buio a 550 rpm per 30 min a temperatura ambiente.
    3. Leggere i valori di assorbanza dei pozzetti a 593 nm (cioè il massimo assorbimento del Fe (II) (Ferene-S) 3 complesso).
    4. Calcolare la quantità di acido ascorbico intracellulare come nmoli di ascorbato per milione di cellule sottraendo inizialmente i valori A 593 nm per pozzi '+ AO' dai corrispondenti - pozzi 'AO' per ogni campione e poi interpolazione dalla curva standard ascorbato (vedi punto 1.3 ). Quando la costruzione della curva standard, tracciare questa "differenza di valore" per ogni standard contro l'importo di ascorbmangiato per pozzetto.

2. Determinazione della ascorbato-efflusso da cellule in coltura

  1. Coltura cellulare e la raccolta
    1. Crescere sospensione o cellule aderenti come sopra (vedi punto 1.1). Nota: effettuare il saggio di seguito in un formato piattaforma 24 pozzetti con sospensione e cellule aderenti per i migliori risultati.
    2. Risospendere le cellule in sospensione, o sovrapporre cellule aderenti, con 400 ml di pre-riscaldato soluzione salina tamponata con HEPES, con o senza calcio e magnesio, e contenente 5 mM D-glucosio (HBS / D; pH 7.3, 37 ° C) in pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere lo stesso volume di HBS / D per pozzetti esenti cella specificata di ciascun piastra da 24 pozzetti da esaminare. Nota: quest'ultimo servirà come controlli privi di cellule per la reazione di base (vedi sotto).

3. Determinano la quantità di ascorbato Rilasciato

  1. Le seguenti soluzioni madre devono essere preparate in anticipo: 120U / ml AO in HBS / D (preparare fresco); 2.4 mM Ferene-S in HBS / D; 120 micron FeCl 3 e 600 mM Na-citrato in HBS / D (preparare immediatamente da soluzioni stock più concentrate).
  2. Per avviare la reazione ferrireduction (volume finale per bene dovrebbe essere di 600 ml), aggiungere i seguenti volumi di reagenti ai singoli pozzetti già contenenti 400 ml di HBS / D:
    1. Aggiungere 50 ml di AO (120 U / ml) o HBS / D per accoppiato pozzetti in triplicato. La concentrazione finale AO dovrebbe essere di 10 U / ml. Nota: Label accoppiato pozzi come "- AO" e "+ AO".
    2. Mescolare le piastre con miscelazione delicata orbitale per 5 min a 37 ° C.
    3. Aggiungere 50 ml di 2,4 mm ferene-S in tutti i pozzetti. La concentrazione finale ferene-S dovrebbe essere di 200 micron. Mescolare le piastre come sopra per 5 min a 37 ° C.
    4. Aggiungere 50 ml di preparato fresco da 120 micron citrato ferrico. Il ferro finale e le concentrazioni di citrato dovrebbe essere di 10 micron di ferro e 50 micron citrato. Mescolare bene.
    5. In tre pozzetti di controllo triplicato, aspirare il terreno sovrastante e aggiungere 600 microlitri HBS / D contenente 0,1% di saponina. Nota: Questi risultati serviranno come "cell-lisi 100%" controlli di lattato deidrogenasi (LDH) rilascio da condurre in parallelo (vedi sotto).
    6. Incubare per 60 minuti al buio a 37 ° C.
    7. Al termine del dosaggio ascorbato-efflusso, rapidamente aspirare 500 microlitri da ogni pozzetto e aggiungere al opportunamente etichettati pozzetti in una piastra da 24 pozzetti. Nota: per cellule in sospensione, inizialmente rimuovere le cellule per centrifugazione a 4 ° C.
    8. Aggiungere 300 microlitri aliquote di surnatante in una piastra a 96 pozzetti e poi leggere a 593 nm.

    4. Determinazione di ascorbato extracellulare

    1. Leggere i valori di assorbanza dei pozzetti a 593 nm.
    2. Calcolare la quantità di ascorbato extracellulare come nmoli ascorbato per mg di proteina (o per milione di cellule) come descritto per la determinazione di ascorbato intracellularenel passaggio 1.5.4. Nota: l'utente finale deve ottimizzare le condizioni in modo che il rilascio ascorbato non è limitato dalla ascorbato intracellulare.

    5. Determinazione della LDH uscita

    1. Con i restanti 200 ml di soluzione extracellulare da ciascun campione condurre un saggio di rilascio di LDH 32,41 per determinare l'entità della lisi cellulare. Nota: il calcolo in% del totale LDH rilasciabile. Determinare LDH rilasciabile dai campioni che sono stati trattati con 0,1% di saponina.

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Representative Results

Determinazione del ascorbato intracellulare in cellule in sospensione coltivate

Nel primo test (Figura 1), ascorbato intracellulare viene determinata, seguendo ascorbato-specifica (cioè AO-sensitive) riduzione del ferricianuro di Ferrocianuro, utilizzando la determinazione altamente sensibile di ferrocianuro da una procedura pubblicata 37. Il rilevamento di ascorbato si basa sulla chelazione colorimetrica del ferro ferroso che viene generato dalla riduzione ascorbato-dipendente di ferricianuro di Ferrocianuro, seguita dalla riduzione di ferrico a ferro ferroso da ferrocianuro. Poiché le concentrazioni sovrafisiologici di alcuni ioni metallici bivalenti (es. Cu 2 +, Co 2 + e Zn 2 +) possono interferire, presumibilmente competendo con ferro ferroso per la chelazione da Ferene-S, le opportune precauzioni dovrebbero essere prese in tali condizioni 37.

Figura2 mostra una curva standard tipica per una serie di standard ascorbato di 0-20 micrometri (o 0-2 ascorbato nmole per pozzetto della piastra a 96 pozzetti; vedere il punto 6.5 del "Protocollo".). Sebbene non mostrato in questa figura, linearità si mantiene fino a 8 ascorbato nmole per pozzetto (per esempio, una A 593 nm di ~ 1,6), che corrisponde ad una concentrazione del campione ascorbato di ~ 80 mM. Il test può essere utilizzato per rilevare con successo livelli di ascorbato di sotto di 0,25 ascorbato nmole per bene (concentrazione di ascorbato campione 2,5 micron).

Cellule K562 rapidamente si accumulano ascorbato intracellulare da extracellulare DHA, ma non ascorbato (vedi Figura 3; riprodotta con il permesso di Lane e Lawen 2008 19). In questo esperimento rappresentativo, cellule K562 PBS-lavate (4 × 10 6 cellule / ml) sono stati incubati in PBS con 500 micron di entrambi ascorbato (Asc), DHA, DHA + 50 pm citocalasina B (DHA + CB), Asc + 5 ferricyanide mm (Asc / FIC) o Asc + 50 U / ml AO (Asc / AO) per 30 minuti a 37 ° C. Ascorbato intracellulare è stata determinata come descritto nel "protocollo".

DHA assorbimento da parte delle cellule K562 avviene trasportatore facilitante glucosio (GLUT)-mediata di trasporto (vedi figura 4; riprodotta con il permesso di Lane e Lawen 2009 42). Per valutare il coinvolgimento dei glutei in DHA assorbimento in questo esperimento rappresentativo, cellule K562 sono state incubate con concentrazioni crescenti di citocalasina B (CB) o dihydrocytochalasin B (H 2 CB) disciolto in MBS contenenti lo 0,5% di etanolo per 15 min a 37 ° C prima di incubazione con 400 pM DHA per 30 min a 37 ° C nello stesso mezzo (Fig. 4A). Le cellule sono state poi lavate tre volte in 100 volumi di MBS ghiacciate e loro ascorbato intracellulare determinate come descritto nel "protocollo". E 'importante notare mentre sia CB e H 2 CB inibiscono i processi motili a micromolarconcentrazioni (1-100 mM), solo CB, che differisce da H 2 CB dalla presenza del doppio legame singolo, inibisce il trasporto GLUT-dipendente a concentrazioni micromolari basse (1-10 mM) 43. Pertanto, come DHA captazione era inhibitable da CB, con un IC 50 <2,5 micron, ma non era inhibitable da H 2 CB, DHA assorbimento probabilmente avviene con i mezzi GLUT-mediata 38. In alternativa, nella figura 4B, le cellule lavate sono state esposte a concentrazioni crescenti del GLUT-trasportabile, ma analogico glucosio non metabolizzabile 3 - O-metil-D-glucosio (3-OMG) o il non-GLUT-trasportabili stereoisomero L glucosio - glucosio prima dell'incubazione con DHA come nel pannello A. Anche i risultati indicano coinvolgimento GLUT in DHA importazione inibizione dell'accumulo ascorbato intracellulare avviene solo in presenza del glucosio GLUT-analogico trasportabile.

Determinazione di ascorbato-Efflux da cellule aderenti

Nel secondo test, il tasso di ascorbato-efflusso da cellule in coltura può essere determinato. Questo test specifico è importante in quanto il rilascio di ascorbato dalle cellule sembra essere cruciale per l'assorbimento cellulare ascorbato regolamentati di ferro non legato alla transferrina dalle cellule 19,20. L'assorbimento del ferro non legato alla transferrina è considerata rilevante per la fisiopatologia dei disturbi ferro-sovraccarico quali i hemochromatoses 22, nonché di astrociti-neuroni scambio ferro e omeostasi nel cervello dei mammiferi 22. Infatti, abbiamo recentemente dimostrato che il principale neurotrasmettitore eccitatorio, L-glutammato, stimola il rilascio di ascorbato dagli astrociti in un modo dipendente dalla L-glutammato assorbimento da GLAST e successivo rigonfiamento cellulare che stimola il rilascio di ascorbato da VSOACs putativi 32. In analogia, ascorbato rElease dagli astrociti ascorbato-caricato può essere stimolata dall'acido eccitatoria ammino, L-aspartato, ma non il non-eccitatorio aminoacido L-glutammina. Questo effetto è illustrato nella figura 5 (riprodotto con il permesso Lane e Lawen 2012 32), che mostra le curve dose-risposta per la stimolazione di ascorbato (AA) uscita aspartato (cerchi chiusi) e glutammina (cerchi aperti) da colture primarie di ascorbato-caricato astrociti mouse.

È importante discutere come questo saggio ascorbato-efflusso differisce dal saggio fornito per la determinazione di ascorbato intracellulare. La differenza principale risiede nel fatto che il livello di ascorbato rimane in soluzione non è determinata da una reazione chimica condotta alla fine di un dato punto di tempo, come avviene per il metodo di determinazione ascorbato intracellulare. Invece, una "firma riduttiva" viene accumulatodurante il periodo in cui ascorbato viene rilasciato dalle cellule. Questa firma riduttiva viene catturato nella forma della riduzione ascorbato-dipendente extracellulare citrato ferrico seguita dalla rapida chelazione del ferro ferroso come un grande impermeant membrana extracellulare e [Fe (II) (Ferene-S) 3] 4 - chelato . Ferene-S può essere considerato simile a membrana e impermeant nel corso tempo breve del dosaggio. I livelli di questo complesso cromogenico possono essere determinate come una misurazione endpoint. Poiché solo i livelli AO-sensibili di questo chelato sono determinate, il saggio fornisce un alto grado di specificità per la determinazione dei extracellulare L-ascorbato.

Figura 1
Figura 1. Schema di flusso che mostra le fasi principali del protocollo perla determinazione di ascorbato intracellulare.

Figura 2
Figura 2 Una curva standard tipica per una serie di standard di ascorbato 0-20 micron.. (O 0-2 ascorbato nmole per pozzetto della piastra a 96 pozzetti,. Vedere il punto 6.5 del "protocollo") Le barre di errore non vengono visualizzate come sono all'interno della gamma occupata dai simboli.

Figura 3
Figura 3. K562 cellule in rapida accumulano ascorbato intracellulare da extracellulare DHA, ma le cellule K562 non ascorbato. PBS-lavate (4 × 10 6 cellule / ml) sono state incubate in PBS con 500 micron of sia ascorbato (Asc), DHA, DHA + 50 pm citocalasina B (DHA + CB), ferricianuro Asc + 5 mm (Asc / FIC) o Asc + 50 U / ml AO (Asc / AO) per 30 minuti a 37 ° C. Ascorbato intracellulare è stata determinata come descritto nel "protocollo". I risultati riportati sono mezzi di tre esperimenti individuali (+ SD). * La concentrazione di ascorbato intracellulare è stato stimato utilizzando uno spazio di acqua intracellulare pre-determinato per cellule K562 (cioè ~ 1,6 μl/106 celle) 19,20. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso di Lane e Lawen 2008 19.

Figura 4
Figura 4. DHA assorbimento da parte delle cellule K562 avviene trasportatore del glucosio facilitante (GLUT) trasporto-mediate. K562 cellule che erano state coltivate a 6-8 x 10 6 cellule / ml in RPMI + 10% (v / v) di siero fetale bovino a 37 ° C, 5% CO 2 e il 95% di aria inizialmente erano lavati tre volte con MBS. Cellule lavate sono stati poi esposti a concentrazioni crescenti di citocalasina B (CB; Sigma) o dihydrocytochalasin B (H 2 CB) disciolto in soluzione salina Mops-buffered (MBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na +, pH 7.3 ) contenente 0,5% di etanolo prima dell'incubazione con 400 pM DHA per 30 min a 37 ° C (A). Le cellule sono state poi lavate tre volte in 100 volumi di MBS freddo e la loro ascorbato intracellulare determinate come descritto nel "protocollo". Come DHA captazione era inhibitable da CB, ma non H 2 CB, DHA assorbimento avviene con i mezzi GLUT-mediata. In alternativa, in (B), le cellule lavate sono state esposte a concentrazioni crescenti del GLUT-trasportabile, ma analogico glucosio non metabolizzabile 3 - O-metil-D-glucosio (3-OMG) o lo stereoisomero glucosio non GLUT-trasportabili (A). Anche in questo caso i risultati indicano il coinvolgimento GLUT in DHA assorbimento. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso di Lane e Lawen 2008 42.

Figura 5
Figura 5. Rilascio ascorbato dagli astrociti ascorbato-caricato viene stimolata dal eccitatorio aminoacido L-aspartato, ma non il non-eccitatorio aminoacido L-glutammina. Questa figura mostra le curve dose-risposta per la stimolazione di ascorbato di rilascio (AA) da aspartato (cerchi chiusi) e glutammina (cerchi aperti) da colture primarie di astrociti topo di ascorbato-caricato. I dati riportati sono medie (± SD) di tre esperimenti. P <0,001 vsla condizione 'basale'. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso di Lane e Lawen 2012 32.

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Discussion

In questo articolo presentiamo due test colorimetrici micropiastre rapidi, specifici e relativamente sensibili per la determinazione di ascorbato derivato dai compartimenti intra ed extracellulari nelle cellule in coltura. Le analisi possono essere completate con accesso alla normale attrezzatura da laboratorio e reagenti. Il reagente solo moderatamente costosa necessaria per il dosaggio è AO, che è essenziale in quanto conferisce un elevato grado di specificità analita verso L-ascorbato. I saggi sono adatti per sia cellule in sospensione (ad esempio, K562) o cellule aderenti (ad esempio HepG2 o astrociti roditori primari), e sono stati impiegati con successo in precedenti pubblicazioni utilizzo di tali cellule 19,20,32,37,38. L'uso di altri agenti ossidanti ascorbato (ad es TEMPOL) al posto di AO dovrebbe essere evitato in quanto non sono sufficientemente specifici per L-ascorbato. Inoltre, l'uso di composti comeTEMPOL nel saggio ascorbato-release sarà confuso dalla capacità di TEMPOL di attraversare le membrane cellulari e ossidare ascorbato intracellulare 44. AO è essenzialmente membrana impermeant nei corsi a tempo utilizzate.

Abbiamo effettuato il confronto diretto dei risultati ottenuti con il test ascorbato colorimetrico descritto sopra e la determinazione fluorimetrica ascorbato di Vislisel e colleghi 36. Abbiamo trovato che entrambi i saggi hanno dato risultati identici per il saggio determinazione ascorbato intracellulare (dati non mostrati). È interessante notare che il saggio ascorbato di rilascio sopra descritta ha dato valori significativamente più elevati per il tasso apparente di ascorbato di efflusso che con il test endpoint fluorimetrico. Ciò suggerisce che il saggio ascorbato-efflusso qui descritto consente la determinazione di apparente "ascorbato-efflusso" che non è così facilmente confuso dal rischio di ascorbato ricaptazione da cellule; un processo che coinvolge probabilmente plASMA SVCTs membrana. Tale re-uptake tenderebbe a causare una sottostima dei livelli effettivi di ascorbato che sono stati rilasciati nel corso di un determinato periodo, se una misura endpoint ascorbato è stata presa. Va notato che se i campioni di tessuto (per esempio muscolo, polmone o cervello) devono essere utilizzati al posto delle cellule in coltura per il dosaggio intracellulare determinazione ascorbato, poi un omogenato di tessuto deve essere costruita utilizzando CPB ghiacciata e una qualche forma di distruzione meccanica ( ad esempio Dounce omogeneizzazione, la sonda a punta sonicazione, stampa francese, ecc.). Detriti cellulari deve essere rimosso per centrifugazione e l'utente dovrebbe considerare l'eventuale necessità di deproteinizzazione campione e / o aggiunta di inibitori della proteasi prima di procedere con la fase 1.2.4.

Abbiamo anche segnalato concentrazioni micromolari in precedenza che i bassi di citocalasina B (<10 micron) non ha inibito il tasso apparente di ascorbato-efflusso che sono stati determinati dai test 32 19, 20,38.

Ci sono diversi passaggi critici in questi protocolli. In primo luogo, i saggi qui descritti sono condizionate dalla capacità di AO per asportare selettivamente e rapidamente ascorbato in campioni accoppiati. Se l'attività specifica della preparazione di AO è nettamente inferiore rispetto all'attività nominale e assunta, è possibile che non tutto il ascorbato nella s AO contenentiamples saranno rimossi. Questo può portare a una sottostima della quantità di ascorbato nei campioni sconosciuti se si utilizza il "metodo diretto", per calcolare la quantità di ascorbato presente. Tuttavia, se si utilizza il "metodo standard curva", che è consigliato, preparazioni a bassa attività di AO porteranno solo ad una perdita di dosaggio sensibilità. Abbiamo trovato che buoni risultati congruenti ottenuti utilizzando preparazioni di AO costruiti sciogliendo 1,000 U di AO in 1 ml di PBS o MBS, che viene poi diviso in aliquote di 100 microlitri che vengono conservati a -80 ° C per non più di un mese. Inoltre, come AO è una proteina che può essere proteolytically degradato da lisati cellulari, inibitori della proteasi possono essere aggiunti lisati cellulari prima dell'aggiunta dei lisati nei rispettivi pozzetti AO-contenenti. Questo può essere una modifica utile considerare quando si utilizzano cellule o tessuti lisati che sono ricchi di attività della proteasi.

Inoltre, la sensibilità dei saggi descritti unBove dipende in gran parte l'uso del bidentato cromogenico Fe (II)-chelante, Ferene-S. Questo chelante può essere sostituito da chelanti chimicamente simili come ferrozina e bathophenanthroline disolfonato, ma con una diminuzione della sensibilità corrispondente al coefficiente di estinzione del loro Fe (II) chela 37. Inoltre, occorre prestare attenzione quando si usano bathophenanthroline disolfonato, come sembra condurre a tassi più elevati di apparente ferrireduction autocatalytic in presenza di complessi di ferro citrato di Ferene-S o Ferrozine 37,45. Questa è una preoccupazione pertinente nel caso del dosaggio ascorbato release come l'aspetto non-ascorbato-dipendente del Fe (II)-chelato diminuisce la sensibilità del saggio.

Mentre il dosaggio intracellulare ascorbato-determinazione è compatibile con le cellule aderenti, distacco di tali cellule prima lisi cellulare deve essere eseguita da raschiatura meccanica piuttosto che tripsina / EDTA. Come tripsina è una proteasisarà probabilmente interferire negativamente con il passo-ascorbato esaurimento con AO, l'ultima delle quali è una proteina. Inoltre, l'EDTA probabilmente interferire con la determinazione FOC passo da chelanti del ferro in concorrenza con ferene-S 37. Tali agenti devono essere evitati. Infine, il saggio di rilascio ascorbato potrebbe essere facilmente adattato per cellule in sospensione. Invece di aspirare largo della sovrastante Fe (II) (Ferene-S)-3 contenente chelato alla fine del test, le cellule devono essere rapidamente sedimentate mediante centrifugazione come per il dosaggio intracellulare ascorbato-determinazione. L'assorbanza a 593 nm del surnatante deve poi essere determinata.

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Disclosures

Gli autori hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Siamo grati al dottor Stephen Robinson e la Sig.ra Hania Czerwinska (Monash University) per la generosa offerta di culture astrociti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc 96-well flat-bottom plates Thermo 269620 Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge Eppendorf 5415D A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge Eppendorf 5810R Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer Bio-Rad Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) Eppendorf This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer Sigma-Aldrich 30790 Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762 Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO) Sigma-Aldrich A0157 Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC) Sigma-Aldrich 455989 Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) Sigma-Aldrich 92940
Sodium L-glutamate Sigma-Aldrich
L-glutamine Sigma-Aldrich
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate

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