Een muizenmodel van myocard ischemie-reperfusie schade door de eileiders van de LAD

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

We introduceren een chirurgische methode experimentele ischemie / reperfusie (I / R) letsel veroorzaken simuleren myocardiaal infarct (MI) in muismodellen die zorgt voor meer duidelijkheid in positionering van de ligatie van de LAD (LAD) om de reproduceerbaarheid te verhogen MI van experimenten in muizen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery. J. Vis. Exp. (86), e51329, doi:10.3791/51329 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Acute of chronische myocardiaal infarct (MI) zijn cardiovasculaire gebeurtenissen leidt tot hoge morbiditeit en mortaliteit. Tot oprichting van de pathologische mechanismen aan het werk tijdens MI en het ontwikkelen van effectieve therapeutische benaderingen vereist methodologie om reproduceerbaar simuleren de klinische incidentie en weerspiegelen de pathofysiologische veranderingen die gepaard gaan met MI. Hier beschrijven we een chirurgische methode MI induceren in muismodellen die gebruikt kunnen worden voor korte ischemie-reperfusie (I / R) letsel en permanente ligatie. Het grote voordeel van deze methode is om locatie van de LAD (LAD) vergemakkelijken zodat nauwkeurige ligatie van deze slagader ischemie te induceren in de linker ventrikel van het hart muis. Nauwkeurige positionering van de ligatuur van de LAD verhoogt reproduceerbaarheid van infarctgrootte en dus betrouwbaardere resultaten. Grotere nauwkeurigheid in de plaatsing van de ligatuur zal verbeteren de standaard chirurgische benaderingen te simuleren MI in muizen, thus vermindering van het aantal proefdieren nodig zijn voor statistisch relevante studies en een beter inzicht in de mechanismen die de productie van cardiale dysfunctie na MI. Dit muismodel van MI is ook bruikbaar voor de preklinische testen van behandelingen voor myocardiale schade na MI.

Introduction

Diermodellen van myocardiaal infarct (MI) zijn belangrijk bij onderzoek van de complexe pathofysiologie van ischemische hartziekte 1. Ischemie-reperfusie (I / R) schade is een belangrijke bijdrage van de myocard schade die tijdens MI. De initiële schade door ischemie occlusie van de coronaire circulatie kan MI patiënten geminimaliseerd door het gebruik van angioplastie perfusie herstellen tijdig. Hoewel deze ingreep sterk heeft verminderd het aantal sterfgevallen als gevolg van acute MI, herstel van de bloedstroom in het ischemische gebied resulteert in I / R schade die leidt tot de dood van hartspiercellen. Dit verlies van myocardiale massa draagt ​​bij aan het hartminuutvolume en progressie naar hartfalen daalde. Aldus studie van de mechanismen die leiden tot cardiomyocyten dood van I / R schade is een belangrijke lijn van onderzoek in het cardiovasculair onderzoek. Chirurgische coronaire ligatie is een nuttige experimentele techniek om modellen van MI in diverse soorten dieren veroorzaken, including de rat, hond en varken. Publicaties in verschillende laboratoria verschillende methoden over de oprichting van de muizen hart model van I / R schade 2,3 geïntroduceerd. Om inzicht te krijgen in deze mechanismen moeten we kunnen beschikken over betrouwbare diermodellen dat verschillende aspecten van MI pathologie kan reproduceren. De ontwikkeling van dergelijke modellen is ook essentieel voor het testen van therapeutische benaderingen voor de behandeling van MI en bijbehorende I / R schade.

De meeste van de thans beschikbare chirurgische technieken te simuleren MI bij proefdieren betrekken chirurgische dissectie in de borstholte links LAD (LAD) die vervolgens wordt afgesloten door een ligatuur van bepaalde tijdsperiode de ischemische gebeurtenis produceren bloot. Dan dat ligatuur kan worden verwijderd om voor reperfusie van ischemische stippellijn genereren van I / R schade. Een belangrijke beperking van deze benaderingen in de stand van de literatuur over de LAD niet altijd nauwkeurig gereproduceerd, waarbijkan leiden tot variatie in de ernst van de MI geïnduceerd door deze benadering. De meeste beschikbare technieken alleen algemeen beschreven de geschatte locatie van de LAD in de voorste wand van het hart. Als de vertakking en de richting van de LAD kan variëren in individuele dieren de locatie is niet altijd vast en kan gemakkelijk verward 4,5, waardoor potentiële complicaties tijdens de operatie 6. De gevolgen van onjuiste plaatsing van de ligatuur kan lopen van variabiliteit in de grootte van het infarct geïnduceerd in de linker ventrikel volledig te doen aan de specificiteit van het model. Hier presenteren we een gemodificeerde werkwijze voor myocardiale I / R en permanente ligatie muizen die zorgt voor extra nauwkeurigheid van plaatsing van de ligatuur van de LAD. Door benaderingen voor de initiële incisie en interne dissectie, alsmede het gebruik van manipulaties aan de atria lift naar betere waardering van de LAD en de plaats waar dat uit de aorta mogelijk. Tot oprichting van depositie op de LAD en de oorsprong biedt de mogelijkheid om de LAD ligeren op reproduceerbare wijze. Dit model van myocardiale I / R en permanente ligatie vermindert niet alleen de variatie in infarctgrootte na chirurgie, kan ook de incidentie van overmatig bloeden te verminderen tijdens de operatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit dier protocol werd goedgekeurd door en is in overeenstemming met de uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Ohio State University richtlijnen en voorschriften. Alle beleid ontwikkeld door de lokale IACUC zijn in overeenstemming met de Dierproevenbesluit Guide ontwikkeld door Office of Laboratory Animal Welfare bij de National Institutes of Health.

1. Anesthesie en intubatie

  1. Autoclaveer alle instrumenten en chirurgische benodigdheden voor gebruik. Draag tijdens de gehele procedure steriele, voor eenmalig gebruik chirurgische handschoenen. Handhaven van een steriel veld tijdens de gehele procedure. Gebruik van een steriel laken wordt gesuggereerd maar niet getoond in de video om een ​​betere visualisatie van anatomische oriëntatiepunten op de muis.
  2. Plaats elke muis afzonderlijk in een inductie kamer en geven anesthesie met 5% isofluraan en zuurstof met een stroomsnelheid van 0,4 L / min tot verlies van oprichtreflex en e handhavene dier met 2% isofluraan in 100% zuurstof met een debiet van 0,4 l / min via een neuskegel buis verbonden met de anesthesietoestel totdat de tracheale buis plaats. De isofluraananesthesie machine gebruikt, moet naar behoren worden afgeblazen en uitgerust met koolstoffilters om de blootstelling van de chirurg om isofluraan dampen tijdens de procedure te minimaliseren. De neuskegel wordt opgemerkt, maar niet getoond in de video om voor visualisatie van de manipulaties om de muis intuberen.
  3. Scheer borst van het dier met een dier tondeuse op een andere locatie dan de operatie platform om verontreiniging van de operatie plaats voorkomen.
  4. Plaats de muis in liggende positie op een operatie platform voor volgende intubatie. Een eenvoudige kleine piepschuim platform kan dienen als een operationele platform. Bedek het platform met een vooraf gesteriliseerde laken een steriel oppervlak. Plaats een verwarmingselement tussen het platform en laken de lichaamstemperatuur van de muizen in surgica handhavenl procedures.
  5. Bevestig een lengte van 2-0 zijden hechtdraad ten minste 10 cm aan het platform met tape en vervolgens lus de hechtdraad rondom de voorste snijtanden. Plaats de conus in de nabijheid (2-3 cm) op de rand van het platform over de neus van de muis. Trek de muis strak en bevestig deze aan het platform door de staart met een stuk tape.
  6. Bevestig de poten aan de zijden van het lichaam met strengen tape. Het is belangrijk dat de voorste ledematen niet overbelast omdat dit ademhaling gevaar kunnen brengen.
  7. Bereid de geschoren chirurgische sites met Betadine en alcohol voor de nek en borst incisies worden gemaakt.
  8. Plaats het platform met de muis kop wijzen in de richting van de bediener. Snijd een 0,5 cm mediane cervicale incisie in de huid. Scheid de lobben van de schildklier hun isthmus de sternohyoideus spier waar de luchtpijp zichtbaar onder de spier bloot.
  9. Verwijder de binnenste naald van een 18 gauge trocar zodat het kan worden gebruikt als intubatie buis. De naaldpunt kan dienen als houder en 1 cm van de buitenste buis kan dienen als tracheale buis.
  10. Houd de tong van de muis met gebogen pincet in de ene hand en beweeg deze iets omhoog. Bekijk de luchtpijp via de cervicale incisie in de huid. Gebruik de andere hand voorzichtig steek de intubatie buis totdat de buis is te zien in de luchtpijp.
  11. Zodra de buis in de luchtpijp, beweeg de gebogen pincet in de andere hand naar de buis en snel te verwijderen van de binnenste naald. Indien de buis niet in de trachea kan worden geplaatst, neemt de buis uitgetrokken worden te voorkomen die ademhalingsproblemen. Het is belangrijk om het uiteinde van de buis wijzen als het dicht bij de keel om te voorkomen inbrengen van de buis in de slokdarm in plaats van de luchtpijp.

2. Ventilatie en Fixation

  1. Kunstmatige ventilatie met een dier respirator ontluchting 2% isofluraan in zuurstof met een stroomsnelheid van 0,4 L / min. Gebruik een aangepaste Y-shape connector om de intubatie buis verbinden met de ventilator. De juiste positionering van de tracheale buis kan worden bevestigd door beoordelen van de symmetrische borstkas.
  2. Stel het slagvolume van 260 ul / slag en ventilatiesnelheid 130 slagen per minuut, die kan worden aangepast aan het lichaamsgewicht van een bepaalde muis indien nodig.
  3. Verwijder de tape op de staart en draai zachtjes de muis om het te plaatsen in een juiste laterale decubitus positie voor de volgende operatie. Gebruik tape om de staart en benen om het platform weer vast te zetten.
  4. Plaats de rectale sonde naar lichaamstemperatuur monitoren en het verwarmingskussen om de temperatuur ongeveer 37 ° C te houden
  5. Maak de sonde naar het platform met behulp van tape. Injecteren bupivacaïne subcutaan op de incisie site om het te verdoven voordat de incisie wordt gemaakt.

3. Thoracotomie

  1. Een schuine incisie die ongeveer 1 cm lang op een plaats 2 mm van de linkersternum richting waar de linker voorpoot aan het lichaam (ongeveer 1-2 mm onder de plaats waar het been en het lichaam treden). De oppervlakkige thoracale ader nabij is deze site en de incisie moet worden gemaakt, zodat de laterale einde van de incisie gaat tot aan, maar niet gesneden in de ader.
  2. Knip hoewel de thoracale spieren aan de ribben eronder bloot. Tijdens deze stap te vermijden toevallige verwonding van het schip. Als bloeden optreedt, gebruik katoen applicators om het bloeden te stoppen voordat u verder gaat met de volgende stap 7.
  3. Visualiseer de ribben en het opblazen van de longen door de dunne en semi-transparante borstwand. Open de borstholte met behulp van chirurgische schaar om een ​​6-8 mm incisie in de derde intercostale ruimte te maken. Deze incisie moet minimaal 2 mm van de borstbeen grens waar de interne thoracale slagader zich bevindt. Schade aan de slagader zal zwaar bloeden, dat is moeilijk te reguleren.
  4. Steek de pre-gesteriliseerde zelfgemaakte kist retractors into de incisie en trek naar de incisie geopend zodat het ongeveer 8-10 mm breed terwijl ze voorzichtig aan de longen voorkomen. De oprolmechanismen moet de chirurgische platform kunnen worden bevestigd.
  5. Op dit punt het hart zichtbaar, maar de longen nog betrekking op een gedeelte van het hart. Pak de hartzakje zachtjes met gebogen pincet, uit elkaar te halen, en schuif het weefsel achter de retractors. Tijdens deze manipulatie de long zal omhoog en weg van het hart op te heffen.

4. Positionering LAD

  1. Zoek de LAD op het oppervlak van het hart door een dissectie microscoop. De LAD loopt in het midden van de hartwand uit de buurt van de top van het hart naar beneden door de linker hartkamer. De LAD lijkt helder rood en zullen sterk worden pulseren. De ader hier wordt soms verward met de LAD, maar de juiste verlichting kan helpen de twee schepen te onderscheiden. Als de verlichting is te fel kan het moeilijk zijn om de kleur te waarderenverschillen tussen de vaten.
  2. Gebruik een steriele watten fragment met een diameter van ongeveer 1-2 mm tot de LAD voor ligatie bereiden. Plaats de katoen tussen de linkerboezem en de linker hartkamer, waardoor het linker atrium zal opheffen en helpen de LAD bloot en haar standpunt te verduidelijken. Als de LAD niet kan worden gevonden, het fragment kan verder zodat het linker atrium wordt nog hoger opgetild naar de aorta waar de LAD afkomstig onthullen geschoven.

5. LAD ligatie

  1. De ideale positionering van de ligatuur ongeveer 2 mm hoger dan de punt van de linker oorschelp. De pulmonaire stam kan worden gebruikt als een marker om de Linker oorschelp. Alternatief kan de ligatie positie worden gevisualiseerd als een punt 1-2 mm van de vertakking van de linker circumflex. Gebruik gebogen pincet voorzichtig druk uit te oefenen op een plaats direct onder de beoogde ligatie punt. Dit zal het gemakkelijker maken om de slagader te zien en zal ook helpen houden het hart op zijn plaatsen vereenvoudiging van de binding van de ligatuur. Oefen geen druk met de tang voor meer dan 5 seconden per keer en compressie van het hart dat het pompen kunnen veranderen vermijden.
  2. Gebruik een taps toelopende naald naar een 6-0 zijden hechtdraad rijdt onder de LAD met inachtneming met een dissectie microscoop. Steek de naald onder de slagader met precisie zijn als de naald van de linker ventrikel kamer zal treden indien geplaatst te diep of beschadiging van de LAD als de naald is te ondiep. Als de LAD is gewond verwijder de naald en hechtdraad de LAD om het bloeden onder controle, maar als bloeden niet kan worden gecontroleerd is het beter om het dier te laten inslapen.
  3. Maak een losse dubbele knoop met de hechting, waardoor een 2-3 mm diameter lus, waardoor een 2-3 mm lang stuk van PE-10 buis wordt geplaatst 8.
  4. Draai de lus rond de slagader en slangen bevestig de lus door koppelverkoop een extra slipknot, het verzorgen van de ventrikel wand niet beschadigt. Voor permanente ligatie, direct bind de LAD met eenknoop 9. Controleer de occlusie van de LAD door te controleren voor het uiterlijk van een lichtere kleur in de voorste wand van de LV die binnen enkele seconden na ligatie verschijnt.
  5. Verwijder het oprolmechanisme en sluit de wond tijdelijk door knijpen van de huid samen met een bulldog klem. De tijdsduur dat ischemie wordt gehandhaafd afhankelijk van het experimentontwerp, maar vaak 20, 30, 45 of 60 minuten. De muis blijft de ventilator voor de duur van de LAD occlusie.

6. Reperfusie

  1. Na de periode van ischemie verwijder de bulldog clip en steek de borst retractoren om de ligatuur bloot. Ontkoppelen de knoop en verwijder de PE-10 buizen. Bevestig reperfusie door het observeren van een terugkeer van de roze-rode kleur van de voorste wand van de LV na 15-20 sec.
  2. Laat de hechtdraad in plaats als 2% trifenyltetrazoliumchloride (TTC) en de blauwe kleuring zal worden uitgevoerd na reperfusie. Indien kleuring is niet noodzakelijk, kan de hechting be verwijderd.
  3. De reperfusie zal afhangen van het experimentontwerp, gewoonlijk variërend van 1 uur tot 24 uur.

7. Borst Afsluiting en postoperatieve zorg

  1. Sluit de borstholte door naaien sloot de incisie in de 3e intercostale ruimte met 4-0 zijden hechtdraad. Het is belangrijk dat de longen duidelijk van de hechtdraad en niet worden gevangen als 3 en 4 de ribben elkaar gehecht. In het verlengde van de hechtdraad knopen is het nuttig om zachtjes op de borst met de naaldhouder aan elke kamer de lucht die kunnen worden gevangen in de borstholte te minimaliseren.
  2. Sluit alle lagen van de spier met doorlopende hechtingen behulp 4-0 zijde. Gebruik nylon hechtingen aan de huid met een doorlopende hechting sluiten. Als alternatief kan de huid worden gesloten met onderbroken hechtdraad.
  3. Wanneer hechten voltooid staakt de stroom van isofluraan terwijl zuurstof blijft stromen. Zodra de muis beweegt zijn snorharen of staart het, schouderd beginnen met het maken pogingen om spontaan te ademen. Verwijder de muis uit de ventilator met de intubatie buis nog steeds bewaard in de luchtpijp.
  4. Observeer het dier voorzichtig totdat de muis weer gewoon ademhaling en vervolgens extuberen de muis. De buis moet langzaam worden verwijderd om aspiratie van de mondholte afscheidingen te voorkomen.
  5. Bevestig de muis is in geen ademnood door het observeren van het voor een ander 3-5 minuten voordat u deze in een kooi. Wanneer tekenen van uitdroging waargenomen na chirurgie bieden tot 0,5 ml steriele zoutoplossing door intraperitoneale injectie.
  6. Voor post-operatieve analgesie, het beheer van een opioïde analgeticum (buprenorfine, 0,1 mg / kg) subcutaan (SC) voordat het dier is ambulant en vervolgens een extra dosis om de 4-6 uur voor de volgende 24 uur. Controleer de dieren tekenen van angst bij 12 uur na de operatie. Simulatie van myocard infarct met behulp van survival chirurgie vereist een beoordeling van pijn en verdriet na herstel van de surgery. De huidige geaccepteerde best practice is om analgesie voor de eerste 24 uur na een invasieve procedure met extra doses gegeven als gerechtvaardigd wegens gewichtsverlies of tekenen van pijn. Voor permanente ligatie moet lichaamsgewicht dagelijks gevolgd om het herstel van het dier te meten.
  7. Ibuprofen (Motrin), niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel (NSAID) met anti-inflammatoire, analgesie en antipyretische activiteit, of andere NSAID's, kunnen worden verschaft in drinkwater van het dier als een oplossing 0,2 mg / ml gedurende twee dagen voor de operatie en tot 7 dagen na operatie bij met de buprenorfine om extra pijn / ongemak beheren.

8. Meting van hartspierschade

  1. Verdoven en intuberen de muis aan het einde van de gewenste reperfusie tijd. Snijd de borst huid in de middellijn aan de xyphoid. Open de buik en het middenrif onder de ribbenkast en aan beide zijden van de midclaviculaire lijn.
  2. <li> Expose hart en vervolgens opnieuw ligeren de LAD op dezelfde locatie. Canule de aorta dus 10% Phthalo Blue langzaam kan rechtstreeks worden geïnjecteerd in de aorta naar het hart vlek voor de afbakening van de ischemische zone van de niet-ischemische zone 10.
  3. Snel accijnzen het hart en was het in 30 mM KCl (kaliumchloride) aan het kloppen van het hart te staken en een consequentere snijden. Bevries het hart voor ten minste 4 uur bij -20 ° C en snijd het hart in plakjes van 1 mm met een hart matrix snijden inrichting 11.
  4. Incubeer hart segmenten met 2% TTC bij 37 ° C gedurende 40 minuten. Het infarct gebied is afgebakend als een wit gebied, terwijl levensvatbaar weefsel kleurt rood.
  5. Bevestig de gekleurde schijfjes met 10% formaldehyde 's nachts, die zal helpen om het contrast tussen het infarct gebied en het normale weefsel te verhogen. Fotografeer de plakjes en bereken het risicogebied (AAR), de niet-ischemische zone en het infarct gebied met behulp van ImageJ software.
<p class = "jove_title"> 9. Meting van Cardiac enzymniveaus

Maatregel cardiaal troponine I (cTnI) niveaus in het serum van muizen door het verkrijgen van bloed uit de poortader en vervolgens isoleren serum door centrifugatie. Serum troponine niveaus worden dan bepaald met een kwantitatieve snelle cTnI assay 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Na 24 uur reperfusie, analyse van de grootte van het infarct en de regio-at-risk (AAR), door phthalo blauwe kleurstof en trifenyltetrazoliumchloride (TTC), ligatie van de LAD kan worden bevestigd door het observeren van blancheren van hartspierweefsel distaal van de hechtdraad en dysfunctie van de voorste wand. Reperfusie kan worden geverifieerd door de terugkeer van de rode kleur aan het hartspierweefsel en de demonstratie van enig herstel van de voorste wand beweging.

Infarct gebieden (wit) moet onderscheiden worden van risicogebieden (rood) en het gebied niet in gevaar (blauw). Toepassing van Phthalo Blue kleurstof (Figuur 1A) zorgt voor een oplossing van het gebied van het hart waar occlusie van de LAD, terwijl harten die niet gekleurd met blauwe kleurstof kan alleen het gebied van infarct (figuur 1B). Infarct maten zijn afhankelijk van de duur van de ischemie. Belangrijk, cardiale troponine I (cTnI) laag zijn in sham geopereerde dieren dat alle ondergingenchirurgische procedures behalve ischemie en reperfusie in vergelijking met dieren die myocardiaal infarct (figuur 2) ondergingen. Dit geeft de veinzerijchirurgie leverden geen significante cardiale pathologie, terwijl de ischemie / reperfusie schade was voldoende om verhoging van deze veel gebruikt biomarker voor MI produceren.

Figuur 1
Figuur 1:. Kwantificering van de omvang van het infarct volgende LAD occlusie chirurgie (A) representatief beeld van wild-type muizen hart delen van dieren die aan 45 minuten ischemie en 24 uur reperfusie. Injectie van blauwe kleurstof maakt beoordeling van de niet-ischemische zone van het hart dat niet risico op een infarct. (B) Een representatief beeld van een hart, waar blauwe kleurstof niet wordt geïnjecteerdbenadrukken het gebied-at-risk (AAR), die rood verschijnt, en het infarct gebied, dat wit verschijnt. De gebieden van elke regio worden berekend als percentage van de totale linker ventrikel (LV) oppervlakte vermenigvuldigd met het totale gewicht van het deel. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2
Figuur 2:. Gebruik van troponine niveau als een meting van de mate van hartinfarct een staafdiagram van het cardiale troponine I (CTnl) niveaus in muizen blootgesteld aan 45 minuten ischemie en reperfusie gedurende 24 uur (I / R) of veinzerijchirurgie als controle. Bloed werd verzameld uit de poortader op 24 uur na de operatie van drie dieren per groep. De niveaus van troponine aanzienlijk verhoogd indieren na I / R schade (9,195 ± 0,07146) in vergelijking met de sham controle dieren (1,195 ± 0,06651). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM en *** geeft P <0,0001 vergelijken sham-en I / R-groepen door T-test. Klik hier voor grotere afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mouse myocardiale ischemie-reperfusie modellen zijn een effectieve methode voor cardiovasculaire onderzoek te simuleren klinische acute of chronische hartziekte 13,14. Belangrijke inspanningen werden toegepast ontwikkelen en verfijnen chirurgische benaderingen die ischemische en reperfusie schade in de harten van verschillende diersoorten produceren. Hoewel er bepaalde voordelen aan het gebruik van verschillende dieren systemen, de muis heeft kenmerken die hebben geleid tot grote belangstelling voor het produceren van myocardiale I / R in de muizenhart. Een van de belangrijkste redenen is de genetische traceerbaarheid van het muizensysteem. De uitgebreide selectie van genetisch gemodificeerde dieren beschikbaar en het relatieve gemak waarmee nieuwe modellen kunnen worden gegenereerd op specifieke vragen te beantwoorden, geen gelijke in andere dierlijke modelsystemen. Een andere reden voor het toenemende gebruik van muizen in cardiovasculaire studies is de toenemende beschikbaarheid van chirurgische apparatuur en andere experimentele hulpmiddelen specifiekeally voor gebruik bij muizen. De relatief lage kosten van muismodellen is ook een belangrijke bijdrage aan het gebruik in studies. De toenemende behoefte aan nauwkeurigheid in preklinische studies is het gebruik van meer dieren, die realistischer zijn wanneer minder middelen nodig zijn om het juiste aantal dieren omvatten. Hoewel het gebruik van het muismodel heeft verschillende voordelen er nadelen, met name wanneer gezien de uiteenlopende aspecten van de muis en menselijke cardiovasculaire fysiologie. Veel grotere diermodellen zoals de hond en varken, beter nabootsen meeste aspecten van menselijke cardiovasculaire fysiologie van een muis. Een ander nadeel is de grootte van de muis, manipulatie van de kleinere hart in de muis is een hogere mate van chirurgische vaardigheden, vooral op het lokaliseren van de LAD en reproduceerbaar te ligeren om een ​​consistente infarct gebied in de linkerventrikel te produceren. De hier gepresenteerde methode kan een aanzienlijke verbetering van een identificatie verschaffennd ligatie van de LAD. Onze consistente resultaten in het bedrag van cTnI vrijlating uit het hart (figuur 2) suggereren dat we reproduceerbaar kunnen genereren infarct van een vergelijkbare omvang en niveau van hartspiercellen dood.

Een belangrijk aspect van de operaties om experimentele myocard infarct veroorzaken is de duidelijke identificatie en ligatie van de LAD. In onze aanpak hier beschreven hebben we de methodologie om te selecteren en de LAD verbeterd, waardoor meer consistente positionering van de ligatie op het schip. Tijdens de operatie, maken we gebruik van een klein stukje van steriele katoen aan het linker atrium en volledig til de LAD, die de positie van LAD verduidelijkt en vergemakkelijkt de ligatie van LAD bloot. Dit is een cruciale stap voor de techniek en een differentiatie punt van andere benaderingen. De invoering van deze wijzigingen voor de LAD ligatie moet het mogelijk maken voor meer reproduceerbare resultaten tijdens de simulatie van MI in muismodellen. Terwijl verbeterde precisie in de plaatsment van de ligatuur moet verbeteren consistentie in de grootte van het infarct gegenereerd is het nog steeds belangrijk om te meten het risico zone met behulp van perfusie van Phthalo Blauwe kleurstof. Dit geldt met name bij het gebruik van genetische modificatie muis lijnen waar de manipulatie van genexpressie kan leiden tot veranderingen in de reactie van de bloedvaten van het hart ligatie.

Een andere belangrijke stap in de eileiders bij de bevestiging dat ischemie daadwerkelijk is opgewekt door de ligatie van de LAD. Observatie van een afzonderlijke, snelle kleurverandering in het gebied van risico is essentieel om er zeker van dat ischemische voorwaarden in de beoogde gedeelte van het myocardium geproduceerd. De kleurverandering van het myocardium moet worden gezien binnen enkele seconden als de LAD effectief afgesloten. Andere kritische stappen in de procedure te betrekken de duur van de ischemische periode en de termijn voor reperfusie voor experimentele eindpunten worden gemeten. Zoals vermeld in de protocol, de duur van de ischemie kan worden gevarieerd om verschillende graden van ischemische schade aan het hart te produceren. Algemeen langere ischemie leidt tot uitgebreidere myocyten dood gehele gevarenzone. De lengte van reperfusie kan gevolgen voor de ontwikkeling van cardiale pathologie, zoals het verschijnen van fibrotische laesies in het hart en de stabilisatie van hartminuutvolume en elektrofysiologische veranderingen. Zo moet de specifieke lengte van deze experimentele stappen worden afgestemd op de in de studie onderzocht specifieke vragen te beantwoorden. De experimentele eindpunten wordt ook geselecteerd op basis van de lengte van ischemie en reperfusie periode gebruikt en de specifieke vragen in het experiment worden aangepakt. We presenteren het gebruik van TTC kleuring infarctgrootte en ELISA metingen van serum troponine te meten als eindpunten de mate van cardiale schade te beoordelen. Deze eindpunten kunnen worden gebruikt voor langere reperfusie, maar ze bijzonder USEFul voor kortere periodes reperfusie (24 uur) waarbij functionele gebreken mag nog niet gestabiliseerd. Hoewel we niet in detail hier functionele metingen van hartminuutvolume, zoals Doppler echocardiografie 15 en microbollen metingen van de coronaire bloedstroom 16, deze benaderingen nuttig om veranderingen in hartfunctie begrijpen gedurende langere termijn experimenten, zoals chronische occlusie van de LAD.

Hoewel het gebruik van muismodellen van MI grote voordelen voor de studie van I / R schade aan het hart zijn er nog beperkingen aan deze benaderingen. Aangezien grote chirurgische incisies worden gemaakt in de borstholte het resulterende weefsel storingen en geassocieerde ontsteking kan de reactie van het hart op de MI effecten beïnvloeden. Deze problemen kunnen deels worden aangepakt door het gebruik van sham chirurgische controlemuizen, waar alle chirurgische stappen allemaal uitgevoerd met uitzondering van de aanscherping van de ligatuur rond deLAD. Een ander probleem dat wordt geproduceerd door de invasieve aard van de operatie is de noodzaak om de pijn en het lijden die optreedt tijdens en na de procedure beheren. Pijnbestrijding benaderingen die voldoen aan de huidige beste praktijken worden beschreven in deze procedure en zijn noodzakelijk om het lijden van de proefdieren te voorkomen. Het is belangrijk te weten dat het gebruik van veel verschillende soorten anesthetica en analgetica cardioprotectieve effecten kan hebben na hun toepassing. Zo dienstig deze berekenen voor de controlemuizen, zelfs enkele controle muizen die niet worden gebruikt voor sham operaties, om eventuele complicaties interpretatie van de experimentele resultaten te vermijden. Een andere beperking van deze benadering is dat het geen perfecte simulatie van de pathologie geassocieerd met menselijke MI. Vaak wordt de muismodellen gebruikt voor dergelijke experimenten hebben geen last van co-morbiditeit die ten grondslag liggen aan de MI bij de mens, zoals coronaire vaatziekten, diabetes en hoge bloeddruk. Dergelijkcomplicaties die niet aanwezig is in het muismodel zijn kan effecten hebben op de wegen wordt bestudeerd in een bepaald experiment en moet daarom rekening worden gehouden bij het interpreteren van resultaten. In deze gevallen kan het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen die sommige onderliggende pathologieën tonen passend zijn beter te modelleren de ziekte in menselijke patiënten zouden presenteren. In de toekomst kunnen andere aspecten van deze aanpak worden gewijzigd om additionele aspecten van menselijke MI pathologie nauwkeuriger te simuleren.

Ondanks deze beperkingen, de hier beschreven werkwijzen vormen een effectieve aanpak gelokaliseerde I / R schade veroorzaken in de muis dat veel van de pathologische effecten van MI in menselijke patiënten simuleert. De techniek maakt snellere manipulatie van de LAD die kunnen leiden tot meer reproduceerbare resultaten en vereenvoudigen de operatie. Echter, het beheersen van deze techniek nog steeds vereist aanzienlijke chirurgische vaardigheid die alleen kan worden verkregen via de praktijk vande procedure. Het nemen van voldoende zorg bij het uitvoeren van de operatie, met name op plaatsen waar dit wordt vermeld in het protocol, zal de overlevingskans van dieren zo goed en de reproduceerbaarheid van de experimentele resultaten te verbeteren. Wanneer de chirurgische benadering beheerst, dit protocol zeer nuttig onderzoekers bestuderen van het effect van MI cardiovasculaire fysiologie evenals die geïnteresseerd zijn in het testen van de effectiviteit van therapeutische interventies op een muismodel bewijzen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr Noah Weisleder is een oprichter en Chief Scientific Officer bij TRIM-edicine, Inc

Acknowledgments

Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het Nationaal Instituut van artritis en spier-en huidziekten, onderdeel van de National Institutes of Health, onder Award nummer R01-AR063084. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PhysioSuite with RightTemp Homeothermic Warming Kent Scientific Corp PS-RT
Light source Zeiss KL 1500 LCD
Mouse Heart Slicer Matrix Zivic Miller HSMS001-1
Micro Tray - Base, Lid, & Mat (6.0 x 10 x 0.75) Fine Science Tools 6100A
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma Aldrich T8877
Buprenorphine (Buprenex Injectable) Reckitt Benkiser Healthcare NDC 12496-0757-1
bupivacaine Hospira NDC 0409-1163-01
Isoflurane Abbott NDC 5260-04-05
Betadine Soultion  Purdue Pharma 25655-41-8
Mouse Cardiac Troponin T(cTnT) ELISA Kamiya Biomedical Company KT-58997
Fine Scissors Fine Science Tools 14040-10
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11231-30
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Slim Elongated Needle Holder Fine Science Tools 12005-15
Round Handled Needle Holders Fine Science Tools 12075-12
Omano Trinocular Stereoscope Microscope.com OM99-V6
SB2 Boom Stand with Universal Arm Microscope.com V6
Tracheal Tube, 0.5 mm, 1/16 in Y Kent Scientific Corp RSP05T16
Anesthesia Systems for Rodents and Small Animals VetEquip, Inc 901807
4-0 silk taper suture Sharpoint™ Products DC-2515N
6-0 silk taper suture Sharpoint™ Products DC-2150N

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. J Surg Res. 162, 239-249 (2010).
  2. Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107, 1445-1453 (2010).
  3. Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (2011).
  4. Salto-Tellez, M., et al. Myocardial infarction in the C57BL/6J mouse: a quantifiable and highly reproducible experimental model. Cardiovasc Pathol. 13, 91-97 (2004).
  5. Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16, 41-44 (2005).
  6. Degabriele, N. M., et al. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction. Exp Physiol. 89, 497-505 (2004).
  7. Shao, Y., Redfors, B., Omerovic, E. Modified technique for coronary artery ligation in mice. J Vis Exp. (2013).
  8. Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovasc Res. 74, 29-38 (2007).
  9. Nossuli, T. O., et al. A chronic mouse model of myocardial ischemia-reperfusion: essential in cytokine studies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, 1049-1055 (2000).
  10. Cozzi, E., et al. Ultrafine particulate matter exposure augments ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, 894-903 (2006).
  11. Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. J Vis Exp. 3896 (2012).
  12. Nagarajan, V., Hernandez, A. V., Tang, W. H. Prognostic value of cardiac troponin in chronic stable heart failure: a systematic review. Heart. 98, 1778-1786 (2012).
  13. Borst, O., et al. Methods employed for induction and analysis of experimental myocardial infarction in mice. Cell Physiol Biochem. 28, 1-12 (2011).
  14. Diepenhorst, G. M., van Gulik, T. M., Hack, C. E. Complement-mediated ischemia-reperfusion injury: lessons learned from animal and clinical studies. Ann Surg. 249, 889-899 (2009).
  15. Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7, 41691 (2012).
  16. Bamberg, F., et al. Accuracy of dynamic computed tomography adenosine stress myocardial perfusion imaging in estimating myocardial blood flow at various degrees of coronary artery stenosis using a porcine animal model. Invest Radiol. 47, 71-77 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics