Sol ön inen arter ligasyonu ile Miyokard İskemi-reperfüzyon Hasarı bir fare modeli

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Biz tekrar elde edilebilirliğini arttırmak için, sol ön inen arter (LAD) üzerine ligasyon konumlandırma daha fazla netlik sağlar fare modellerinde miyokard infarktüsü (MI) simüle etmek için deneysel iskemi / reperfüzyon (I / R) hasarı ikna etmek için bir cerrahi yöntemi tanıtmak Farelerde MI deneyler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery. J. Vis. Exp. (86), e51329, doi:10.3791/51329 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Akut veya kronik miyokard infarktüsü (MI), yüksek morbidite ve mortalite nedeni kardiyovasküler olaylardır. MI sırasında iş yerinde patolojik mekanizmaların oluşturulması ve etkin tedavi yaklaşımların geliştirilmesinde tekrarlanabilir klinik insidansı taklit ve MI ile ilişkili patofizyolojik değişiklikleri yansıtmak için bir metodoloji gerektirir. Burada, kısa süreli iskemi-reperfüzyon (I / R) yaralanma hem de sürekli ligasyon için kullanılabileceğini fare modellerinde MI uyarılması için cerrahi bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemin en önemli avantajı, fare kalbin sol ventrikül iskeminin neden bu arter doğru ligasyonu izin vermek için, sol ön inen arter (LAD) konumunu kolaylaştırmaktır. LAD üzerinde, bağlantının doğru konumlandırma enfarktüs büyüklüğünün tekrar üretilebilirliğini artırır ve böylece daha güvenilir sonuçlar verir. Ligature yerleştirme daha fazla hassas t, farelerde MI simüle etmek için standart cerrahi yaklaşımlar artıracakhus istatistiksel olarak ilgili çalışmalar için gerekli deney hayvan sayısını azaltmak ve M aşağıdaki kardiyak fonksiyon bozukluğu üreten mekanizmaları anlamamıza artırır. MI Bu fare modeli, aynı zamanda, aşağıdaki MI miyokart hasarı hedefleyen tedaviler klinik öncesi test etmek için kullanışlıdır.

Introduction

, Miyokardiyal enfarktüs (MI) hayvan modelleri, iskemik kalp hastalığı 1 kompleks patofizyolojisinin araştırma önemlidir. İskemi-reperfüzyon (I / R) hasarı MI sırasında oluşan miyokard hasarı önemli bir katkıda bulunuyor. Koroner dolaşım oklüzyonu ile üretilen ilk iskemi hasarı zamanında perfüzyon geri anjiyoplasti kullanılmasıyla MI hastalarda en aza indirilebilir. Bu müdahale sayesinde büyük ölçüde akut MI kardiyomiyositlerinin ölüme götüren I / R hasarında iskemik alan sonuçlara içine kan akımının restorasyon ölümlerin sayısını azalttı ise. Miyokard kütle kaybı, kardiak çıktı ve kalp yetmezliği doğru ilerlemesini azalmasına katkıda bulunur. Böylece, I / R hasarı kardiyomyosit ölümle sonuçlanabilir mekanizmaların çalışması, kardiyovasküler araştırma soruşturma önemli bir hattır. Cerrahi koroner ligasyon çeşitli hayvan türlerinde MI modellerini ikna etmek için yararlı bir tekniktir, includi olduğunuSıçan, köpek ve domuz ng. Farklı laboratuvarlarda Yayınlar I / R hasarı 2,3 fareler kalp modelin kurulmasına ilişkin çeşitli yöntemler girmiştik. Bu mekanizmaları anlamak için biz MI patolojinin çeşitli yönleri üretebileceği güvenilir hayvan modelleri erişimi olmalıdır. Bu tür modellerin geliştirilmesi de MI tedavisi ve ilgili I / R hasarı için tedavi yaklaşımları test için gereklidir.

Deney hayvanlarında MI taklit etmek için mevcut cerrahi tekniklerin çoğu, daha sonra iskemi olayını üretmek üzere zaman içinde belirli bir süre için bir ligatür tarafından tıkanmaktadır arter (LAD) sol ön inen ortaya çıkarmak için göğüs boşluğuna cerrahi diseksiyon içerir. O zaman bu bağ I / R yaralanma, iskemik alan ve kuşak reperfüzyon izin vermek için çıkarılabilir. LAD üzerinde literatür konumu her zaman doğru yeniden olmadığını, bu yaklaşımların önemli bir sınırlamaBu yaklaşım ile indüklenen MI şiddetinde varyasyona neden olabilir. En uygun teknikler sadece genellikle kalbin ön duvarında LAD yaklaşık konumunu tarif. LAD dallanma ve yönü yeri her zaman sabit değildir ve ameliyat 6 sırasında olası komplikasyonlara yol, 4,5 kolayca karışabilir bireysel hayvanların değişebilir gibi. Bağı yanlış yerleşimin sonuçları tamamen modelinin özgüllüğünü ödün sol ventrikül indüklenen enfarktüs boyutu değişkenlik çalışabilir. Burada miyokard I / R ve LAD üzerine dikilen yerleştirilmesi geliştirilmiş doğruluğu sağlar: farelerde sürekli ligasyon için değiştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Başlangıç ​​kesi ve iç diseksiyon, hem de bu aort ortaya LAD ve site daha iyi takdir izin vermek için atrial kaldırmak için manipülasyon kullanımı için özel yaklaşımlar uygulayarak. KurulmasıLAD ve kökeni pozisyon tekrarlanabilir bir şekilde LAD bağlanması için fırsat sağlar. Miyokard I / R ve sürekli ligasyon Bu model, ameliyat sonrası enfarkt boyutunda varyasyonu azaltır değil, aynı zamanda, operasyon sırasında aşırı kanama insidansını azaltabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu hayvan protokol tarafından onaylanan ve Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun dir. Yerel IACUC tarafından geliştirilen tüm politikalar Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvarı Hayvan Refahı Ofisi tarafından geliştirilen Hayvan Deneyleri Kılavuzu ile uyumludur.

1.. Anestezi ve Endotrakeal Entübasyon

  1. Kullanmadan önce tüm enstrümanları ve cerrahi malzemeleri otoklavlayın. Prosedür boyunca steril, tek kullanımlık cerrahi eldiven giyin. Prosedür boyunca steril bir alan koruyun. Steril bir örtü kullanılması önerilmektedir ancak fare anatomik yerlerinden daha iyi görünüm için izin video gösterilir değildir.
  2. Bir indüksiyon odası içinde tek tek her bir fare yerleştirin ve doğrulma-refleksi kaybının kadar 0.4 L / dak 'lık bir akış oranı ile,% 5 izofluran ve oksijen kullanılarak anestezi sağlamak ve daha sonra inci korumaktrakeal tüp yerine dek anestezi cihazına bağlanmış bir roket ucu konisi tüp vasıtasıyla 0.4 L / dk 'lık bir akışı ile% 100 oksijen içinde% 2 izofluran ile e hayvan. Kullanılan izofluran anestezi makinesi uygun havalandırmalı ve işlem sırasında izofluran dumana cerrahın maruziyetini en aza indirmek için kömür filtreler ile donatılmış olmalıdır. Roket ucu konisi kaydetti ama fareyi entübe manipülasyonların görünüm için izin video gösterilir değildir.
  3. Cerrahi konumu kirlenmesini önlemek için ameliyat platformu farklı bir yerde bir hayvan saç kesme makinesi ile hayvanın göğüs tıraş.
  4. Sonraki entübasyon için cerrahi bir platform üzerinde yatar pozisyonda fare yerleştirin. Basit küçük polistiren köpük platformu bir işletim platformu olarak hizmet verebilir. Steril bir yüzey sağlamak için, önceden sterilize edilmiş örtü ile platformu örtün. Surgica farelerin vücut ısısını korumak için platform ve örtünün arasında bir ısıtma yastığı yerleştirinl işlemleri.
  5. Bant ile platforma en az 10 cm 2-0 ipek sütür uzunluğu takın ve ardından ön üst kesici dişlerin etrafında döngü dikiş. Fare burun üzerinde platformun kenarına yakın bir yerde (2-3 cm) 'de koni yerleştirin. Fare gergin durmasını çekin ve bir bant ile kuyruk tarafından platforma sabitleyin.
  6. Bant şeritler ile vücut yanlarına bacakları edin. Bu solunum tehlikeye gibi ön bacaklarda aşırı gerilmiş değildir önemlidir.
  7. Boyun, göğüs ve insizyon yapılır önce Betadine ve alkol ile traş cerrahi siteleri hazırlayın.
  8. Fare baş operatörü yönünde işaret ile platformu yerleştirin. 0.5 cm ortalama servikal cilt kesi kesmek. Trakea kas altında görülebilir sternohyoideus kas maruz onların kıstak tiroid bezinin lobları ayırın.
  9. Bir intub olarak kullanılabilir, böylece, bir 18 gauge trokar iç iğne kaldırmatirme tüpü. Iğne ucu bir tutucu olarak hizmet edebilir ve dış borunun 1 cm trakeal tüp olarak hizmet edebilir.
  10. Bir yandan kavisli bir forseps ile fare dilini tutun ve hafifçe yukarı doğru hareket ettirin. Servikal cilt kesi yoluyla trakea görüntüleyebilirsiniz. Tüp trakea içinde görülür kadar yavaşça entübasyon tüpü takmak için diğer elinizi kullanın.
  11. En kısa tüp, trakea olduğu gibi, borunun karşı diğer yandan da kavisli forseps hareket ve hızlı bir şekilde, iç iğne çıkarılır. Tüp, trakea takılı edilemezse, tüp solunum sorunları üreten önlemek için dışarı çekilmelidir. Bu, bunun yerine yemek borusu, trakea içine tüp ekleme önlemek için boğaz yakınken, boru yukarı ucu işaret etmek önemlidir.

2.. Havalandırma ve Fiksasyon

  1. Bir hayvan solunum 0,4 L / dakika 'lık bir akış oranı ile oksijen içinde% 2 izofluran ile havalandırma yapay havalandırma sağlar. Değiştirilmiş bir Y-sha kullanınventilatör ile entübasyon tüpü bağlamak için pe konnektörü. Entübasyon tüpünün doğru konumlandırma simetrik göğüs genişleme yargılamak tarafından teyit edilebilir.
  2. 260 ul / inme ve havalandırma oranında tidal hacim ayarlama, belirli bir fare gerekirse vücut ağırlığına göre ayarlanabilir dakikada 130 vuruş vardır.
  3. Kuyruk bandı çıkarın ve daha sonraki ameliyat için sağ lateral dekübit pozisyonda yerleştirmek için hafifçe fare açın. Tekrar platforma kuyruk ve bacaklarını sabitlemek için bant kullanın.
  4. Vücut ısısını izlemek için rektal prob takın ve 37 º C civarında sıcaklığı korumak için ısınma tabanını ayarlamak
  5. Bandı kullanarak platforma sonda elde edin. Kesi yapılmadan önce bölgeyi uyuşturmak için kesi yerinde bupivakain deri altına enjekte edilir.

3. Torakotomi

  1. Uzak soldan bir site 2 mm, yaklaşık 1 cm uzunluğunda bir kesi yapmak eğiksol ön bacak gövdesini (bacak ve vücut birleştiği yerde altında yaklaşık 1-2 mm) buluştuğu yönünde sternal sınır. Yüzeysel Torasik ven bu sitede yakın ve kesi yanal uç kadar gider böylece kesi yapılmalıdır, ancak ven içine kesmiyor.
  2. Toraks kas altına kaburga maruz olsa kesin. Bu adım sırasında kabın kaza yaralanmaları önlemek. Kanama meydana gelirse, bir sonraki adıma 7 geçmeden önce herhangi bir kanamayı durdurmak için pamuk aplikatör kullanın.
  3. Kaburga görselleştirmek ve ince ve yarı saydam göğüs duvarından akciğer şişirme. Üçüncü interkostal boşlukta bir 6-8 mm kesi yapmak için cerrahi makas kullanılarak göğüs boşluğu açın. Bu kesi internal torasik arter bulunan sternum sınırından 2 mm minimum olmalıdır. Arterin hasar kontrolü zordur ağır kanama üretecek.
  4. Önceden sterilize edilmiş ev yapımı göğüs Rekraktörleri int takınakciğeri önlemek için dikkatli olurken o geniş yaklaşık 8-10 mm, böylece o nazikçe kesi ve kesi açmak için geri çekin. Sarma tertibatında pim ile cerrahi platforma tespit edilmelidir.
  5. Bu noktada, kalp, ancak, yine de, akciğer kalp bir kısmını kapsayacak, görünür olmalıdır. Kavisli bir forseps ile yavaşça perikard Pick up, o ayrı çekin ve retraktörlerinize arkasında doku kaydırın. Bu manipülasyon sırasında akciğer yukarı ve kalp uzak kalkacaktır.

4. Konumlandırma LAD

  1. Bir diseksiyon mikroskobu ile kalp yüzeyinde LAD bulun. LAD sol ventrikül aşağı kalbin apeks yakınında gelen kalp duvarının orta çalışır. LAD parlak kırmızı görünür ve güçlü darbeli olacak. Burada damar ancak bazen doğru aydınlatma iki damarları ayırt yardımcı olabilir, LAD için yanlış. Aydınlatma çok parlak ise o renk takdir etmek zor olabilirdamarları arasındaki farklar.
  2. Bağlanması için LAD hazırlamak için yaklaşık 1-2 mm'lik bir çapa sahip steril bir pamuk parçası kullanarak. Sol atrium kaldırın ve LAD ortaya çıkarmak ve konumunu açıklığa kavuşturmak yardımcı olacak, sol atrium ve sol ventrikül arasındaki pamuk yerleştirin. LAD yer edilemezse, fragmanı yüzden sol atrium LAD kaynaklanan aortu ortaya çıkarmak için daha yüksek kaldırdı de kaydırılabilir.

5.. LAD ligasyonu

  1. Bağı için ideal konumlandırma sol kulak ucuna göre yaklaşık olarak 2 mm daha düşüktür. Pulmoner gövde sol kulak kepçesi belirlemenize yardımcı olması için bir belirteç olarak kullanılabilir. Seçenek olarak ise, bağlanma pozisyonu uzak sol sirkumfleks arasında bir dallanma noktası 1-2 mm olarak görselleştirilebilir. Nazikçe hemen amaçlanan ligasyon noktasının altında bir yerinde baskı uygulamak için kavisli bir forseps kullanın. Bu daha kolay arteri görmek için yapacak ve aynı zamanda yerinde kalp tutun yardımcı olacaktırve ligatürün bağlama basitleştirmek. Bir seferde en fazla 5 saniye forseps ile baskı uygulamak ve pompalama değiştirebilir kalp sıkıştırma kaçının.
  2. Bir mikroskop ile gözleyerek LAD altında 6-0 ipek sütür geçmek için bir konik iğne kullanın. İğne çok derine yerleştirilmiş ise sol ventrikül odasına girmek veya iğne çok sığ ise LAD zarar edecek gibi hassas arterin altında iğne takın. LAD yaralı ise kanama kontrol edilemez ise ancak hayvan euthanize tercih edilir, iğne kaldırmak ve kanamayı kontrol etmek LAD sütür.
  3. PE-10 bir boru, 2-3 mm uzunluğunda bir parça 8 yerleştirildiği ile 2-3 mm çapında bir döngü bırakarak dikiş ile gevşek bir çift düğüm olun.
  4. Sonra ventrikül duvarına zarar vermemeye özen, bir ek slipknot bağlayarak döngü güvenceye arter ve tüp etrafında döngü sıkın. Kalıcı ligasyonu için, doğrudan bir ile LAD kravat9 knot. Bağlanmasından sonra birkaç saniye içinde görünmelidir LV ön duvarında bir soluk renkli bir görünüm için kontrol ederek LAD oklüzyonu onaylayın.
  5. Retraktörü çıkarın ve bir bulldog kelepçe ile birlikte cildi sıkarak geçici yarayı kapatın. Iskemi muhafaza edilmesi zamanın uzunluğu deney tasarımına bağlıdır, ancak genellikle 20, 30, 45 veya 60 dk. Fare, LAD oklüzyonu süresince vantilatör üzerinde kalır.

6. Reperfüzyon

  1. Iskemi döneminden sonra bulldog klibini kaldırmak ve ligatürün maruz göğüs Ekartörleri yerleştirin. Çözemediniz ve PE-10 tüp çıkarın. 15-20 sn sonra LV ön duvarının pembe-kırmızı renkli bir dönüş gözlemleyerek reperfüzyon onaylayın.
  2. % 2 trifenil tetrazolyum klorid (TTC) ve mavi boyama reperfüzyon sonrası gerçekleştirilir olması durumunda dikiş yerinde bırakın. Boyama gerekli değilse, ameliyat dikiş ipliği be uzaklaştırıldı.
  3. Reperfüzyon süresi genellikle 24 saat için 1 saat kadar uzanan, deney tasarımı bağlıdır.

7. Göğüs kapatılması ve Ameliyat Sonrası Bakım

  1. Dikiş ile göğüs boşluğunu kapatmak 4-0 ipek sütür ile 3. interkostal insizyon kapattı. Bu akciğer sütürün açık ve 3 rd gibi tuzak ve 4. kaburgalar birbirine dikilir olmazlar önemlidir. Dikiş knot ipe iken göğüs boşluğunda kalmış olabilecek oda havasını en aza indirmek için iğne tutucu ile göğüs hafif baskı uygulamak için yararlı olduğunu.
  2. 4-0 ipek kullanılarak sürekli dikişlerle kas tüm katmanları kapatın. Sürekli bir dikiş ile cilt kapatmak için naylon sütürler kullanın. Seçenek olarak ise, deri kesintiye dikiş ile kapatılabilir.
  3. Oksijen akmaya devam ederken dikiş tam ateşkes izofluran akışı olduğunda. Fare, kedi taklidi veya kuyruk da, omuz hamle sonrasoluması girişimlerde başlamak istiyorum. Entübasyon tüpü ile ventilatörden fareyi çıkarın hala trakea tuttu.
  4. Fare normal solunum paterni devam eder ve ardından fareyi Ekstübe kadar dikkatlice hayvan gözlemlemek. Tüp ağız boşluğu salgıları aspirasyon önlemek için yavaş yavaş çıkarılmalıdır.
  5. Fare kafesine dönmeden önce başka bir 3-5 dakika için gözlemleyerek herhangi bir solunum sıkıntısı değil onaylayın. Dehidratasyon bulguları ameliyat sonrası gözetilirse, intraperitoneal enjeksiyon ile, steril tuzlu su, 0.5 ml kadar sağlar.
  6. Ameliyat sonrası analjezi için, hayvan ayaktan önce, bir opioid analjezik (buprenorfin, 0.1 mg / kg) deri altından (SC) uygulanması ve daha sonra ek bir dozu, bir sonraki 24 saat boyunca her 4-6 saat sağlar. Ameliyattan sonra 12 saatte sıkıntı hayvan işaretleri kontrol edin. Sağkalım cerrahi kullanarak enfarktüsteki Simülasyon SÜ toparlanmanın ardından ağrı ve sıkıntı değerlendirilmesini gerektirirrgery. Geçerli kabul edilen iyi uygulama nedeniyle kilo kaybı ya da ağrı belirtileri garanti olarak verilen ek doz ile invazif bir prosedür izlenerek ilk 24 saat boyunca analjezi sağlamaktır. Kalıcı ligasyonu için, vücut ağırlığı hayvanın kurtarma ölçmek için yardımcı günlük takip edilmelidir.
  7. Ibuprofen (Motrin), anti-enflamatuar, analjezik ve ateş düşürücü aktivitesi, ya da diğer NSAID'lerin bir steroid olmayan anti-enflamatuar ilaç (NSAID), ameliyattan önce iki gün boyunca 0.2 mg / ml solüsyon olarak hayvanın içme suyu olarak temin edilebilir ve herhangi bir ek ağrı / sıkıntı yönetmek için buprenorfin ile birlikte ameliyat sonrası 7 güne kadar.

Miyokard Enfarktüs Boyutu 8. Ölçümü

  1. Anestezi edilmiş ve istenen reperfüzyon süresi sonunda, fare entübe. Xiphoid için orta hatta göğüs keseceksiniz. Göğüs kafesinin altında ve midklavikuler hattının her iki tarafından karın ve diyaframı açın.
  2. <li> kalp Açığa ve daha sonra aynı yerde LAD yeniden lige. Bu yüzden,% 10 ptalo Blue yavaşça iskemik olmayan bölge 10 arasındaki iskemik bölgenin tarif için kalp leke aort içine direkt olarak enjekte edilebilir aort Cannulate.
  3. Hızla kalp tüketim ve kalp atışını durdurmak ve daha tutarlı bir kesit sağlamak için 30 mM KCI (potasyum klorid çözeltisi) yıkayın. -20 ° C'de en az 4 saat boyunca dondurmak ve kalp cihazı 11 kesit, bir kalp matris kullanılarak 1 mm'lik dilimler halinde kalp kesti.
  4. 40 dakika boyunca 37 ° C'de% 2 TTC kalp dilimleri inkübe edin. Canlı doku kırmızı lekeler ise enfarktüs alanları beyaz bir alan olarak sınırlanmıştır.
  5. Infarkt alanı ve normal doku arasındaki kontrastı artırmak için yardımcı olacak, gece boyunca% 10 formaldehit ile boyandı dilim düzeltmek. Dilimleri fotoğraf ve risk alan (AAR), iskemik olmayan bölge ve ImageJ yazılımı kullanarak enfarktüs alanı hesaplamak.
<p class = "jove_title"> 9. Kardiyak Enzim Düzeylerinin Ölçümü

Portal damanndan kan alınarak ve daha sonra santrifüj ile serum izole edilmesi farelerin serumunda I (cTnI) seviyeleri kalp troponin ölçün. Serum cTnI sonra bir nicel hızlı cTnl deneyi 12 ile belirlenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reperfüzyon, enfarkt boyutu ve alan riske (AAR), ptalo mavi boya ve trifenil tetrazolyum klorid (TTC) ile, LAD ligasyonu dikişine miyokardiyal doku distalinde haşlama gözlemleyerek teyit edilebilir analizi 24 saat sonra hem de ön duvar işlev bozukluğu. Reperfüzyon miyokard dokusu ve ön duvar hareket bazı kurtarma gösteri kırmızı renk dönüşü ile kontrol edilebilir.

Enfarktüs alanlar (beyaz) riski (kırmızı) bulunan alanlarda ayırt edilebilir ve alan değil riski (mavi) de olmalıdır. Ptalo Blue boya (Şekil 1A) uygulanması LAD oklüzyonu, mavi boya ile boyanmış değildir kalpler sadece infarkt alanı (Şekil 1 B) gösterebilir ise kalp alanının çözünürlüğü sağlar. Enfarktüs boyutları iskemi süresine bağlıdır. Önemlisi, kardiyak troponin I (cTnI) Tüm uygulandı Sham hayvanlarda düşük(Şekil 2), miyokardiyal enfarktüs uygulanan hayvanlara kıyasla, iskemi ve reperfüzyon dışında cerrahi işlemler. Bu, iskemi / reperfüzyon hasarı MI için yaygın olarak kullanılan bu biyobelirteç yükselmesine üretilmesi için yeterli iken, sham önemli kardiyak hastalığı üretmemiştir gösterir.

Şekil 1
Şekil 1:. LAD oklüzyonu ameliyat sonrası infarkt ölçüde miktarının (A) 45 dakika, 24 saat iskemi ve reperfüzyon tabi hayvanlardan Yaban tip fare kalp bölme Örnek görüntüsü. Mavi boya enjeksiyon bir enfarktüs riski olmayan kalbin iskemik olmayan bölge değerlendirilmesi için olanak sağlar. Mavi boya enjekte edilmez bir kalbin (B) A temsili resimbeyaz görünür kırmızı görünür alan riske (AAR), ve enfarktüs alanı vurgulamak için. Her bölgenin alanları toplam sol ventrikül bu dilimin toplam ağırlığı ile çarpılır (LV) alanı yüzdeleri olarak hesaplanmıştır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Şekil 2:. Kalp enfarktüsünün ölçüde bir ölçü olarak troponin seviyelerinin kullanılması kardiyak troponin bir çubuk grafik, 24 saat için (I / R) ya da sham ameliyat için 45 dakika iskemi ve reperfüzyona maruz farelerde I (CTnl) düzeyleri bir kontrol olarak. Kan, her grup için üç hayvanlardan ameliyattan 24 saat sonra portal ven toplanmıştır. CTnI düzeyleri belirgin olarak yükselmektedirSham kontrol hayvanlarına (1,195 ± 0,06651) göre I / R hasarı (9.195 ± 0,07146) aşağıdaki hayvanlar. Veri ± SEM olarak verildi ve *** P gösterir <0.0001 sahte kontrolünü karşılaştıran ve T-testi ile I / R grupları. Olduğunu büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fare miyokard iskemi-reperfüzyon modelleri klinik akut veya kronik kalp hastalığı 13,14 simüle etmek kardiyovasküler araştırma için etkili bir yöntemdir. Önemli bir çaba iskemik olayları ve birkaç farklı hayvan türlerinin kalplerinde reperfüzyon hasarı üretmek cerrahi yaklaşımlar geliştirmek ve rafine uygulanmıştır. Farklı hayvan sistemlerinin kullanımı için özel bir avantajı olmakla birlikte, fare, fare kalbinde miyokard I / R üretiminde geniş bir ilgiyi yöneltmiştir özelliklere sahiptir. Önemli nedenlerinden biri fare sisteminin genetik tractability olduğunu. Mevcut genetiği değiştirilmiş hayvanlar, ve yeni modeller belirli soruları için oluşturulabilir hangi göreli kolaylığı geniş seçimi, diğer hayvan modeli sistemlerinde hiçbir maç var. Kardiyovasküler çalışmalarda, farelerin artan kullanımı için bir başka neden cerrahi ekipman ve belirli diğer deney araçları artan mevcudiyetidirally farelerde kullanılmak için dizayn edilmiştir. Fare modelleri nispeten düşük maliyeti de çalışmalarda kullanımı için önemli bir katkıda bulunuyor. Ön-klinik çalışmalarda titizlik için artan ihtiyacı daha az kaynak hayvan uygun sayıda eklemek için gerekli olan zaman, daha gerçekçi olabilir, ek hayvanların kullanılması gerekmektedir. Fare modelinin kullanılması birçok avantaj olsa da, fare ve insan kardiyovasküler fizyoloji farklı yönleri göz önüne alındığında, özellikle dezavantajları da vardır. Örneğin köpek ve domuz gibi pek çok daha büyük bir hayvan modelleri, daha yakından fare dışında insan kardiyovasküler fizyoloji en yönlerini taklit eder. Bir diğer dezavantaj ise farede daha küçük kalbin fare, manipülasyon büyüklüğü özellikle LAD bulmak ve tekrarlanabilir bu sol ventrikül tutarlı bir infarkt alanı üretmek için bağlanması olarak, cerrahi uzman daha yüksek bir derece gerektirir. Burada sunulan yöntem kimlik a önemli bir gelişme sağlayabilirLAD nd ligasyonu. Kalp (Şekil 2) cTnl serbest miktarı Bizim tutarlı sonuçlar biz tekrarlanabilir bir benzer boyut ve kardiyomiyositler ölüm düzeyi enfaktı oluşturabilir öneririz.

Deneysel miyokard enfarktüs ikna etmek ameliyatları önemli bir yönü LAD açık kimlik ve ligasyonu. Burada ayrıntılı olarak verilen bir yaklaşımda biz kap üzerindeki ligasyon daha tutarlı konumlandırma sağlayan, LAD belirlemek ve erişmek için bir yöntem geliştirdik. Ameliyat sırasında, biz LAD konumunu netleştiriyor ve LAD ligasyonu kolaylaştırır LAD, açığa kadar ve tam sol atrium kaldırmak için steril pamuk küçük bir parça faydalanmak. Diğer yaklaşımlardan tekniği ve bir farklılaşma noktası için bu önemli bir adımdır. LAD ligasyon için, bu modifikasyonların yapılması fare modellerinde MI simülasyonu sırasında daha fazla yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için izin vermelidir. Sırasında yerinde geliştirilmiş hassasligature Ment infarkt boyutu tutarlılık ptalo Mavi boyanın perfüzyon kullanarak risk bölgesinde ölçmek için hala önemli oluşturulan geliştirmek gerekir. Bu, gen ekspresyonunun manipülasyon ligasyonu için kalbin kan damarlarının karşılık değişikliklere neden olabilir genetik modifikasyon fare hatları kullanımı sırasında geçerlidir.

Bu iskemi teyit ligasyon sırasında bir diğer kritik adım etkili LAD ligasyonu ile oluşturulan olmuştur. Risk alanında ayrı bir hızlı renk değişimi gözlenmesi iskemik durumlar miyokardın hedeflenen bölümünde üretilen emin olmak için gereklidir. LAD etkili tıkanır ise miyokardın Renkteki değişim bir kaç saniye içinde görülmelidir. Deney uç noktalar ölçülür önce prosedür diğer kritik adımlar iskemik dönemin süresini ve reperfüzyon için gereken süreyi içerir. Pr belirtildiği gibiotocol, iskemik sürenin uzunluğu kalp iskemik hasar farklı derecelerde üretilmesi için değiştirilebilir. Genel olarak iskemi daha uzun bir süre risk bölgesi boyunca daha geniş bir miyosit ölüme neden olur. Reperfüzyon süresi kalbinde fibrotik lezyonların görünümü hem de kalp debisi ve elektrofizyolojik değişikliklerin stabilizasyonu dahil olmak üzere kardiyak patolojilerin geliştirilmesi üzerinde etkileri olabilir. Bu nedenle, bu deneysel aşamaların spesifik uzunluğu çalışmada incelenen özel soruları için uygun olmalıdır. Deney uç noktaları da iskemi ve reperfüzyon el sürelerine ve deneyinde ele alınması için özel soruları uzunluğuna bağlı olarak seçilmelidir. Biz uç noktaları kardiyak hasarın boyutunu değerlendirmek üzere enfarktüs büyüklüğünü ve serum cTnI düzeyleri ELISA ölçümlerin TTC boyama kullanımını sunuyoruz. Bu son nokta, reperfüzyonun bir süre için de kullanılabilir, ancak bunlar, özellikle usef vardırul kısa reperfüzyon dönemleri (24 saat) için fonksiyonel kusurları henüz istikrar olmayabilir nerede. Biz böyle Doppler ekokardiyografi 15 ve koroner kan akımının 16 mikrosferdir ölçümleri gibi kardiyak debinin fonksiyonel ölçümleri, burada detaya gitmek yok da, bu yaklaşımlar, kronik tıkanması gibi uzun vadeli deneyler sırasında kardiyak fonksiyon değişiklikleri anlamak için yararlıdır LAD.

MI fare modellerinin kullanımı büyük avantajlara sahip olsa da kalbinde I / R hasarının çalışma için bu yaklaşımlara sınırlamalar hala vardır. Büyük cerrahi kesikler göğüs boşluğuna yapılmalıdır yana edilen doku kesintileri ve ortaya çıkan iltihaplanma MI etkilerine kalbin yanıtı etkileyebilir. Bu kaygılar kısmen tüm cerrahi adımları tüm çevresinde bağı sıkılaştırılması hariç yürütülmektedir sham ameliyat kontrol fareleri, kullanımı ile ele alınabilirLAD. Cerrahi invaziv doğa tarafından üretilen bir başka husus, işlem sırasında ve sonrasında meydana ağrı ve acı yönetmek için ihtiyaç vardır. Günümüzdeki en iyi uygulamalara uygun Ağrı yönetimi yaklaşımları bu prosedür ayrıntılı ve deney hayvanlarının acı çekmesini önlemek için gerekli vardır. Bu anestezik ve analjezik birçok farklı türde kullanımı bunların uygulama şu kardioprotektif etkileri olabilir farkında olmak önemlidir. Bu nedenle, bu deneysel sonuçların yorumlanması için bir komplikasyonları önlemek için, kontrol fareleri, sham ameliyat için kullanılmaz hatta herhangi bir kontrol farelerine, bu maddeleri uygulamak için uygun. Bu yaklaşımın bir başka sınırlama insan MI ile ilişkili patoloji mükemmel bir simülasyon sağlamaz olmasıdır. Sık sık bu gibi deneyleri için kullanılan fare modelleri, koroner vasküler hastalık, diyabet ve hipertansiyon gibi insanlarda MI altında yatan ko-morbiditeler, muzdarip değildir. Böylefare modelinde bulunmayan komplikasyonlar belirli bir deneyde çalışılan ve sonuçları yorumlarken bu nedenle kabul edilmelidir yolları üzerinde etkileri olabilir. Bu durumda, bu temel patolojilerin bazı ekran genetik olarak tadil edilmiş farelerin kullanımı daha etkili bir şekilde, insan hastalarda mevcut gibi hastalık modeli için uygun olabilir. Gelecekte, bu yaklaşımın diğer yönleri daha doğru bir insan MI patoloji ek yönlerini taklit etmek için modifiye edilebilir.

Bu kısıtlamalara rağmen, burada açıklanan yöntemler, insan hastalarda MI patolojik etkileri çok taklit fare lokalize I / R yaralanması meydana getirmek için etkili bir yaklaşımı temsil etmektedir. Bizim teknik daha tekrarlanabilir sonuçlara yol ve cerrahi kolaylaştırabilirsiniz LAD daha kolay manipülasyon için izin verir. Ancak, bu tekniği mastering hala sadece uygulama ile elde edilebilir önemli bir cerrahi beceri gerektirirProsedür. Ameliyatı yaparken, özellikle de bu protokolde not edilir yerlerde, yeterli bakımı hayvanların hayatta kalma oranı ve hem de deneysel sonuçların tekrarlanabilirliğini artıracaktır. Cerrahi yaklaşım hakim sonra, bu protokol hem de bir fare modeli üzerinde terapötik müdahalelerin etkinliğini test ilgilenenler gibi kardiyovasküler fizyoloji üzerindeki MI etkisini okuyan araştırmacılar oldukça yararlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr Nuh Weisleder TRIM-edicine, Inc bir Kurucusu ve Baş Bilimsel Görevlisi

Acknowledgments

Bu yayında bildirilen Araştırma Artrit ve Kas-iskelet Ulusal Enstitüsü ve Cilt Hastalıkları Ödülü Numarası R01-AR063084 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri bir parçası tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PhysioSuite with RightTemp Homeothermic Warming Kent Scientific Corp PS-RT
Light source Zeiss KL 1500 LCD
Mouse Heart Slicer Matrix Zivic Miller HSMS001-1
Micro Tray - Base, Lid, & Mat (6.0 x 10 x 0.75) Fine Science Tools 6100A
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma Aldrich T8877
Buprenorphine (Buprenex Injectable) Reckitt Benkiser Healthcare NDC 12496-0757-1
bupivacaine Hospira NDC 0409-1163-01
Isoflurane Abbott NDC 5260-04-05
Betadine Soultion  Purdue Pharma 25655-41-8
Mouse Cardiac Troponin T(cTnT) ELISA Kamiya Biomedical Company KT-58997
Fine Scissors Fine Science Tools 14040-10
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11231-30
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Slim Elongated Needle Holder Fine Science Tools 12005-15
Round Handled Needle Holders Fine Science Tools 12075-12
Omano Trinocular Stereoscope Microscope.com OM99-V6
SB2 Boom Stand with Universal Arm Microscope.com V6
Tracheal Tube, 0.5 mm, 1/16 in Y Kent Scientific Corp RSP05T16
Anesthesia Systems for Rodents and Small Animals VetEquip, Inc 901807
4-0 silk taper suture Sharpoint™ Products DC-2515N
6-0 silk taper suture Sharpoint™ Products DC-2150N

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. J Surg Res. 162, 239-249 (2010).
  2. Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107, 1445-1453 (2010).
  3. Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (2011).
  4. Salto-Tellez, M., et al. Myocardial infarction in the C57BL/6J mouse: a quantifiable and highly reproducible experimental model. Cardiovasc Pathol. 13, 91-97 (2004).
  5. Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16, 41-44 (2005).
  6. Degabriele, N. M., et al. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction. Exp Physiol. 89, 497-505 (2004).
  7. Shao, Y., Redfors, B., Omerovic, E. Modified technique for coronary artery ligation in mice. J Vis Exp. (2013).
  8. Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovasc Res. 74, 29-38 (2007).
  9. Nossuli, T. O., et al. A chronic mouse model of myocardial ischemia-reperfusion: essential in cytokine studies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, 1049-1055 (2000).
  10. Cozzi, E., et al. Ultrafine particulate matter exposure augments ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, 894-903 (2006).
  11. Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. J Vis Exp. 3896 (2012).
  12. Nagarajan, V., Hernandez, A. V., Tang, W. H. Prognostic value of cardiac troponin in chronic stable heart failure: a systematic review. Heart. 98, 1778-1786 (2012).
  13. Borst, O., et al. Methods employed for induction and analysis of experimental myocardial infarction in mice. Cell Physiol Biochem. 28, 1-12 (2011).
  14. Diepenhorst, G. M., van Gulik, T. M., Hack, C. E. Complement-mediated ischemia-reperfusion injury: lessons learned from animal and clinical studies. Ann Surg. 249, 889-899 (2009).
  15. Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7, 41691 (2012).
  16. Bamberg, F., et al. Accuracy of dynamic computed tomography adenosine stress myocardial perfusion imaging in estimating myocardial blood flow at various degrees of coronary artery stenosis using a porcine animal model. Invest Radiol. 47, 71-77 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics