Un modèle murin d'ischémie myocardique-reperfusion par ligature de l'artère interventriculaire antérieure

Medicine

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Summary

Nous introduisons une méthode chirurgicale pour induire expérimental d'ischémie / reperfusion (I / R) des blessures pour simuler un infarctus du myocarde (IM) dans les modèles de souris qui permet une plus grande clarté dans le positionnement de la ligature sur l'artère interventriculaire antérieure gauche (LAD) d'augmenter la reproductibilité d'expériences MI chez la souris.

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Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery. J. Vis. Exp. (86), e51329, doi:10.3791/51329 (2014).

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Abstract

Infarctus du myocarde aigu ou chronique (MI) sont des événements cardiovasculaires résultant de taux élevés de morbidité et de mortalité. Établir les mécanismes pathologiques à l'œuvre lors MI et le développement d'approches thérapeutiques efficaces exige une méthodologie reproductible pour simuler l'incidence clinique et refléter les modifications physiopathologiques associés à MI. Ici, nous décrivons un procédé chirurgical pour induire MI dans des modèles de souris qui peut être utilisée pour court terme d'ischémie-reperfusion (I / R) des blessures ainsi que la ligature permanente. L'avantage majeur de cette méthode est de faciliter la localisation de l'artère descendante antérieure gauche (LAD) pour permettre la ligation précise de cette artère pour induire une ischémie dans le ventricule gauche du cœur de souris. Le positionnement précis de la ligature sur la DAL augmente la reproductibilité de la taille de l'infarctus et produit des résultats plus fiables ainsi. Une plus grande précision dans le placement de la ligature d'améliorer les approches chirurgicales standard pour simuler MI chez la souris, tmari de réduire le nombre d'animaux de laboratoire nécessaires pour les études statistiquement pertinentes et d'améliorer notre compréhension des mécanismes produisant une dysfonction cardiaque après un infarctus. Ce modèle murin d'infarctus du myocarde est également utile pour le test préclinique de traitements ciblant la lésion myocardique après un IM.

Introduction

Des modèles animaux de l'infarctus du myocarde (MI) sont importants dans la recherche de la physiopathologie complexe de maladie cardiaque ischémique 1. Ischémie-reperfusion (I / R) des blessures est un contributeur majeur de la lésion myocardique généré pendant MI. La blessure de l'ischémie initiale produite par occlusion de la circulation coronaire peut être réduite chez les patients MI par l'utilisation de l'angioplastie pour restaurer la perfusion en temps opportun. Bien que cette intervention a considérablement réduit le nombre de décès dus aux infarctus aigu du myocarde, la restauration du flux sanguin dans les résultats de la zone ischémique dans I / R blessures qui conduit à la mort des cardiomyocytes. Cette perte de masse myocardique contribue à la diminution du débit cardiaque et de la progression vers l'insuffisance cardiaque. Ainsi, l'étude des mécanismes qui conduisent à la mort des cardiomyocytes de I / R blessures est une ligne importante de l'enquête dans la recherche cardiovasculaire. Ligature coronaire chirurgicale est une technique expérimentale utile pour induire des modèles de MI dans différents types d'animaux, y cong le rat, le chien et le cochon. Publications dans des laboratoires différents ont mis en place différentes méthodes sur la mise en place du modèle de coeur de souris de I / R blessures 2,3. Afin de mieux comprendre ces mécanismes, nous devons avoir accès à des modèles animaux fiables qui peuvent se reproduire plusieurs aspects de MI pathologie. Le développement de ces modèles est également essentielle pour tester des approches thérapeutiques pour le traitement de l'IM et de blessures I / R associé.

La plupart des techniques chirurgicales actuellement disponibles pour simuler MI chez des animaux expérimentaux impliquent dissection chirurgicale dans la cavité de la poitrine afin d'exposer la artère descendante antérieure gauche (LAD) qui est ensuite fermé par une ligature pour la période de temps définie afin de produire l'événement ischémique. Alors que la ligature peut être retiré pour permettre la reperfusion ischémique de la zone de génération et d'E / R de blessure. Une limitation majeure de ces approches en ce que la position de la littérature sur la LAD n'est pas toujours fidèlement reproduit, ce quipeut conduire à une variation de la sévérité de la MI induite par cette approche. La plupart des techniques disponibles décrites que de façon générale l'emplacement approximatif de la DAL dans la paroi antérieure du cœur. Comme la ramification et la direction de la LAD peuvent varier dans chaque animal l'emplacement n'est pas toujours fixe et peut être facilement confondue 4,5, conduisant à des complications potentielles pendant la chirurgie 6. Les conséquences de la mise en place incorrecte de la ligature peut courir à partir de la variabilité de la taille de l'infarctus induit dans le ventricule gauche à compromettre complètement la spécificité du modèle. Nous présentons ici une méthode modifiée pour I / R myocardique et la ligature permanente chez les souris qui permet d'améliorer la précision de placement de la ligature sur la DAL. En appliquant des approches spécifiques pour l'incision initiale et dissection interne, ainsi que l'utilisation des manipulations de lever les oreillettes pour permettre une meilleure appréciation de la DAL et le site où il se dégage de l'aorte. Instituant laposition sur la LAD et son origine est l'occasion pour ligaturer la DAL dans un mode reproductible. Ce modèle d'infarctus I / R et la ligature permanente non seulement diminue la variation de la taille de l'infarctus après une intervention chirurgicale, il peut également diminuer l'incidence des saignements excessifs pendant le fonctionnement.

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Protocol

Ce protocole a été approuvé par l'animal et est en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) à l'Ohio State University. Toutes les politiques élaborées par le IACUC locale sont en conformité avec le Guide de l'expérimentation animale développé par le Bureau de la protection des animaux de laboratoire à l'Institut National de la Santé.

1. Anesthésie et l'intubation endotrachéale

  1. Autoclave tous les instruments et les fournitures chirurgicales avant utilisation. Porter des gants chirurgicaux stériles, à usage unique tout au long de la procédure. Maintenir un champ stérile tout au long de la procédure. L'utilisation d'un champ stérile est suggéré mais non montré dans la vidéo pour permettre une meilleure visualisation des repères anatomiques sur la souris.
  2. Placer chaque souris individuellement dans une chambre d'induction et de fournir une anesthésie à l'aide de 5% d'isoflurane et d'oxygène avec un débit de 0,4 L / min jusqu'à ce que l'écoulement perte du réflexe de redressement, puis de maintenir èmee animal avec 2% d'isoflurane dans de l'oxygène à 100% avec un débit de 0,4 L / min à l'aide d'un tube de cône de pointe reliée à l'appareil d'anesthésie jusqu'à ce que le tube trachéal est en place. La machine d'anesthésie à l'isoflurane utilisé ne doit être évacué de manière appropriée et muni de filtres à charbon pour réduire au minimum l'exposition du chirurgien de fumées isoflurane pendant la procédure. La coiffe est noté, mais ne figure pas dans la vidéo pour permettre la visualisation des manipulations d'intuber la souris.
  3. Raser la poitrine de l'animal avec une tondeuse à cheveux de l'animal dans un emplacement différent de celui de la plate-forme d'intervention chirurgicale pour éviter la contamination de l'emplacement de chirurgie.
  4. Placez la souris dans une position couchée sur la plateforme de la chirurgie pour l'intubation ultérieur. Une simple petite plate-forme de la mousse de polystyrène peut servir de plate-forme d'exploitation. Couvrir la plate-forme avec un champ pré-stérilisé pour fournir une surface stérile. Placer un coussin chauffant entre la plate-forme et le drapé afin de maintenir la température du corps des souris en Surgical procédures.
  5. Fixez une longueur de 2-0 suture en soie d'au moins 10 cm de la plate-forme avec du ruban adhésif, puis boucle de la suture autour des incisives supérieures avant. Positionner le cône à proximité (3.2 cm) du bord de la plate-forme sur le nez de la souris. Tirez le tendu de la souris et le fixer à la plate-forme par la queue avec un morceau de ruban adhésif.
  6. Fixez les pieds sur les côtés du corps avec des brins de ruban. Il est important que les membres antérieurs sont pas trop tendus, car cela peut compromettre la respiration.
  7. Préparer les sites chirurgicaux rasé avec de la bétadine et alcool avant du cou et de la poitrine incisions sont faites.
  8. Placer la plate-forme avec la tête de la souris pointant dans la direction de l'opérateur. Couper une médiane incision de la peau du col 0,5 cm. Séparer les lobes de la glande thyroïde à leur isthme pour exposer le muscle sternohyoideus où la trachée peut être vu sous le muscle.
  9. Retirer l'aiguille intérieure d'un trocart de calibre 18 de sorte qu'il peut être utilisé comme un intubtube d'ation. La pointe de l'aiguille peut servir de support et à 1 cm du tube externe peut servir de tube trachéal.
  10. Maintenez la langue de la souris avec des pinces courbes dans une main et le déplacer légèrement vers le haut. Voir la trachée à travers l'incision cervicale de la peau. Utiliser l'autre main pour insérer doucement le tube d'intubation jusqu'à ce que le tube est vu à l'intérieur de la trachée.
  11. Dès que le tube est dans la trachée, déplacer les pinces courbes en revanche vers le tube et rapidement retirer l'aiguille intérieure. Si le tube ne peut pas être insérée dans la trachée, le tube doit être retiré pour éviter de produire des problèmes respiratoires. Il est important de pointer le bout du tube quand il est à proximité de la gorge afin d'éviter l'insertion du tube dans l'oesophage à la place de la trachée.

2. Ventilation et fixation

  1. Fournir une ventilation artificielle avec un appareil respiratoire des animaux de ventilation 2% d'isoflurane dans de l'oxygène avec un taux de 0,4 L / min. Utilisez un Y-sha modifiéconnecteur pe se connecter le tube d'intubation avec le ventilateur. Le positionnement correct de la sonde trachéale peut être confirmé en jugeant l'ampliation thoracique symétrique.
  2. Réglez le volume de marée à 260 pi / course et taux de ventilation est de 130 coups par minute, qui peuvent être ajustées au poids du corps d'une souris particulière si nécessaire.
  3. Retirez le ruban adhésif sur la queue et mettre la souris doucement pour le placer dans une position latérale droite de décubitus pour la chirurgie ultérieure. Utilisez du ruban adhésif pour fixer la queue et les pattes de la plate-forme à nouveau.
  4. Introduire la sonde rectale pour surveiller la température du corps et ajuster le coussin chauffant pour maintenir la température aux alentours de 37 ° C.
  5. Fixer la sonde à la plate-forme en utilisant du ruban. Injecter bupivacaïne voie sous-cutanée au site d'incision pour engourdir la région avant l'incision est faite.

3. Thoracotomie

  1. Faire une incision oblique qui est d'environ 1 cm de long à un site de 2 mm de la gauchefrontière sternale dans la direction de l'endroit où la patte avant gauche rencontre le corps (environ 1-2 mm au-dessous de laquelle la jambe et le corps se joignent). La veine thoracique superficielle est près de ce site et de l'incision doit être faite de telle sorte que l'extrémité latérale de l'incision va jusqu'à, mais ne coupe pas dans la veine.
  2. Couper si le muscle thoracique pour exposer les nervures en dessous. Au cours de cette étape d'éviter toute blessure accidentelle de la cuve. Si le saignement ne se produit, utiliser des applicateurs de coton pour arrêter le saignement avant de passer à l'étape suivante 7.
  3. Visualisez les nervures et gonfler les poumons à travers la paroi de la poitrine mince et semi-transparent. Ouvrez la cage thoracique à l'aide des ciseaux chirurgicaux à faire une incision de 6-8 mm dans le troisième espace intercostal. Cette incision doit être au minimum de 2 mm du bord sternal où l'artère thoracique interne est situé. Dommages à l'artère va produire des saignements abondants qui est difficile à contrôler.
  4. Insérez les rétracteurs de poitrine maison pré-stérilisés into l'incision et tirez doucement l'arrière pour ouvrir l'incision de sorte qu'il est d'environ 8-10 mm de large, en prenant soin d'éviter les poumons. Les écarteurs doivent être fixés à la plate-forme chirurgicale avec des épingles.
  5. A ce stade, le coeur doit être visible, cependant, le poumon sera toujours couvrir une partie du cœur. Décrochez le péricarde délicatement avec une pince courbes, le démonter, et faites glisser le tissu derrière les écarteurs. Au cours de cette manipulation du poumon se soulève et du coeur.

4. Positionnement CONT

  1. Localisez le DAL sur la surface du cœur à travers un microscope de dissection. Le DAL descend au milieu de la paroi cardiaque de près de la pointe du cœur à travers le ventricule gauche. Le DAL apparaît rouge vif et émet des impulsions fortement. La veine ici est parfois confondu avec le DAL, mais un bon éclairage peut aider à distinguer les deux navires. Si l'éclairage est trop lumineux, il peut être difficile d'apprécier la couleurles différences entre les navires.
  2. Utilisation d'un fragment de boule de coton stérile avec un diamètre d'environ 1-2 mm pour préparer la LAD pour la ligature. Placez le coton entre l'oreillette gauche et ventricule gauche, qui lèvera l'oreillette gauche et aider à exposer la LAD et de clarifier sa position. Si la DAL ne peut pas être localisé, le fragment peut être glissé plus loin dans l'oreillette gauche afin levée encore plus élevé pour révéler l'aorte où la DAL est originaire.

5. CONT ligature

  1. Le positionnement idéal pour la ligature est d'environ 2 mm inférieure à la pointe de l'oreillette gauche. Le tronc pulmonaire peut être utilisé comme marqueur pour identifier l'oreillette gauche. En variante, la position de la ligature peut être visualisée comme un point 1-2 mm de la ramification de la circonflexe gauche. Utilisez une pince courbes d'appliquer doucement la pression sur un site juste en dessous du point de ligature destinée. Ainsi, il sera plus facile de voir l'artère et aidera à maintenir le coeur en placeet de simplifier lier la ligature. Ne pas appliquer de pression avec la pince pour plus de 5 secondes à la fois et éviter la compression du cœur qui pourrait modifier pompage.
  2. Utiliser une aiguille effilée pour passer une suture de soie 6-0 sous la LAD tout en observant avec un microscope à dissection. Insérez l'aiguille dans l'artère avec une précision que l'aiguille pénétrer dans la chambre du ventricule gauche s'il est placé trop profondément ou endommager le DAL si l'aiguille est trop peu profonde. Si la banque DAL est blessé retirer l'aiguille et la suture de la DAL pour contrôler le saignement, mais si le saignement ne peut pas être contrôlée, il est préférable d'euthanasier l'animal.
  3. Faites un double noeud lâche avec la suture, laissant une boucle de 2-3 mm de diamètre par lequel un long morceau de tube PE-10 de 2-3 mm est placé 8.
  4. Serrer la boucle autour de l'artère et tubes puis fixez la boucle en liant un nœud coulant supplémentaires, en prenant soin de ne pas endommager la paroi du ventricule. Pour la ligature permanente, lier directement la LAD avec unnouer 9. Confirmer l'occlusion de LAD en vérifiant apparition d'une couleur plus pâle dans la paroi antérieure du LV qui doit apparaître en quelques secondes après la ligature.
  5. Retirez l'enrouleur et fermer la plaie temporairement en pinçant la peau avec une pince bulldog. La durée pendant laquelle est maintenue l'ischémie dépend de la conception de l'expérience, mais il est souvent 20, 30, 45 ou 60 min. La souris reste sur le ventilateur pendant la durée de l'occlusion de l'artère LAD.

6. Reperfusion

  1. Après la période d'ischémie retirer le clip de bouledogue et insérer les rétracteurs de la poitrine pour exposer la ligature. Dénouer le nœud et retirer le tube PE-10. Confirmez reperfusion en observant un retour de la couleur rose-rouge de la paroi antérieure de la LV après 15-20 sec.
  2. Laissez la suture en place si 2% de chlorure de triphényltétrazolium (TTC) et coloration au bleu seront effectuées après la reperfusion. Si la coloration n'est pas nécessaire, la suture peut be éliminée.
  3. Le temps de reperfusion dépend de la conception de l'expérience, qui s'étend généralement de 1 h à 24 h.

7. Poitrine fermeture et Soins postopératoires

  1. Fermez la cavité thoracique par couture fermé l'incision dans l'espace intercostal 3 ème 4-0 suture de soie. Il est important que les poumons sont clairs de la suture et ne deviennent pas piégés comme la 3 ème et 4 ème nervures sont suturées. Tout en liant les nœuds de suture, il est utile d'appliquer une légère pression sur la poitrine avec le porte-aiguille afin de minimiser tout l'air de la pièce qui pourrait être piégé dans la cavité thoracique.
  2. Fermez toutes les couches de muscles avec des sutures continues à l'aide de soie 4-0. Utilisez fils de nylon pour fermer la peau avec une suture continue. En variante, la peau peut être fermée avec une suture interrompue.
  3. Lorsque la suture est cessez complète le flux de l'isoflurane en oxygène continue à couler. Une fois que la souris se déplace ses moustaches ou la queue il, should commencer à faire des tentatives pour respirer spontanément. Retirez la souris du ventilateur avec le tube d'intubation toujours conservés dans la trachée.
  4. Observez attentivement l'animal jusqu'à ce que la souris reprend une respiration normale, puis extubation la souris. Le tube doit être retiré lentement pour éviter l'aspiration de sécrétions de la cavité orale.
  5. Confirmez la souris n'est pas du tout une détresse respiratoire en l'observant pour un autre 3-5 min avant de le retourner dans une cage. Si des signes de déshydratation sont observés après la chirurgie, de fournir jusqu'à 0,5 ml de solution saline stérile par injection intrapéritonéale.
  6. Pour l'analgésie post-opératoire, administrer un analgésique opioïde (buprénorphine, 0,1 mg / kg) sous-cutanée (SC) avant que l'animal est ambulatoire et ensuite fournir une dose supplémentaire chaque 4-6 h pour le 24 heures suivant. Vérifiez les signes de détresse des animaux à 12 h après la chirurgie. Simulation de l'infarctus du myocarde en utilisant la chirurgie de survie nécessite une évaluation de la douleur et de la détresse après la récupération de la surgery. La meilleure pratique acceptée actuelle est de fournir une analgésie pour les 24 premières heures suivant une procédure invasive avec des doses supplémentaires donnés comme justifié en raison de la perte de poids ou des signes de douleur. Pour la ligature permanente, le poids corporel doit être suivi chaque jour pour aider à évaluer le rétablissement de l'animal.
  7. L'ibuprofène (Motrin), un médicament anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) avec des anti-inflammatoires, analgésiques et antipyrétiques, ou d'autres AINS, peut être prévue dans l'eau potable de l'animal comme une solution à 0,2 mg / ml pour deux jours avant la chirurgie et jusqu'à un 7 jours après la chirurgie dans le long avec le buprénorphine pour gérer tout supplémentaire douleur / détresse.

8. Mesures de myocarde taille de l'infarctus

  1. Anesthésier et intuber la souris à la fin du temps de reperfusion souhaitée. Coupez la peau de la poitrine sur la ligne médiane de la xiphoïde. Ouvrir l'abdomen et le diaphragme au-dessous de la cage thoracique et des deux côtés de la ligne claviculaire.
  2. <li> Exposer le coeur et puis re-ligaturer la DAL au même endroit. Cathétériser l'aorte ainsi 10% bleu de phtalocyanine peut être lentement injecté directement dans l'aorte pour colorer le coeur pour la délimitation de la zone ischémique de la zone non ischémique 10.
  3. Rapidement exciser le coeur et le laver à 30 mM de KCl (solution de chlorure de potassium) de cesser les battements du cœur et permettre le sectionnement plus cohérente. Geler le cœur pendant au moins 4 heures à -20 ° C et couper le coeur en tranches de 1 mm en utilisant une matrice de coeur dispositif 11 de sectionnement.
  4. Incuber tranches de coeur avec 2% TTC à 37 ° C pendant 40 min. La zone de l'infarctus est délimité comme une zone blanche en tissu viable tache rouge.
  5. Fixer les coupes colorées à 10% de formaldéhyde durant la nuit, ce qui permettra d'augmenter le contraste entre la zone de l'infarctus et le tissu normal. Photographier les tranches et calculer la zone à risque (AAR), la zone non ischémique et la zone de l'infarctus en utilisant le logiciel ImageJ.
<p class = "jove_title"> 9. Mesure des niveaux d'enzymes cardiaques

Mesurer la troponine cardiaque I (cTnI) les niveaux dans le sérum des souris par l'obtention à partir de sang de la veine porte, puis en isolant le sérum par centrifugation. Les taux sériques de troponine Ic sont alors déterminées par un test rapide cTnI quantitative 12.

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Representative Results

Après 24 heures de reperfusion, l'analyse de la taille de l'infarctus et la zone à risque (AAR), par phthalo colorant bleu et chlorure de triphényl tétrazolium (TTC), la ligature de l'artère interventriculaire antérieure peut être confirmée par l'observation de blanchiment d'distale de tissu myocardique à la suture ainsi que le dysfonctionnement de la paroi antérieure. Reperfusion peut être vérifiée par le retour de la couleur rouge pour le tissu myocardique et la démonstration d'une certaine reprise de la paroi antérieure mouvement.

domaines de l'infarctus (blanc) devraient se distinguer des zones à risque (rouge) et la zone non à risque (bleu). Application de bleu de phtalocyanine colorant (figure 1A) permet pour la résolution de la zone du cœur où l'occlusion de l'artère interventriculaire antérieure, tandis que les cœurs qui ne sont pas colorées avec du colorant bleu ne peuvent afficher la zone de l'infarctus (figure 1B). Infarctus tailles dépendent de la durée de l'ischémie. Surtout, la troponine I (cTnI) les niveaux sont bas dans subi une opération fictive animaux qui ont subi tousles interventions chirurgicales, à l'exception d'ischémie et de la reperfusion, par rapport aux animaux ayant subi un infarctus du myocarde (figure 2). Cela indique la chirurgie factice n'a pas produit de pathologie cardiaque significative tandis que la lésion d'ischémie / reperfusion était suffisante pour produire l'élévation de ce biomarqueur largement utilisé pour MI.

Figure 1
Figure 1:. Quantification de l'étendue de l'infarctus après une opération d'occlusion LAD (A) représentant l'image de sections de coeur de type sauvage de souris provenant d'animaux soumis à 45 minutes d'ischémie et 24 heures de reperfusion. L'injection de colorant bleu permet une évaluation de la zone non-ischémique du cœur qui n'est pas à risque pour un infarctus. (B) Une image représentant d'un cœur où colorant bleu n'est pas injectémettre l'accent sur la zone à risque (AAR), qui apparaît en rouge, et la zone de l'infarctus, qui apparaît en blanc. Les zones de chaque région sont calculés en pourcentage du ventricule gauche de la surface totale (LV) multiplié par le poids total de cette tranche. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2:. Utilisation des niveaux de troponine cardiaque comme une mesure de l'ampleur de l'infarctus du myocarde Diagramme à barres de la troponine I cardiaque (cTnl) chez les souris soumises à 45 minutes d'ischémie et une reperfusion pendant 24 heures (I / R) ou une intervention chirurgicale fictive en tant que témoin. Le sang a été recueilli à partir de la veine porte, 24 heures après une intervention chirurgicale à partir de trois animaux pour chaque groupe. Les niveaux de troponine Ic sont significativement plus élevés dansanimaux suivants I / R blessures (9,195 ± 0,07146) par rapport aux animaux témoins fictive (1.195 ± 0,06651). Les données sont présentées comme moyenne ± SEM et *** indique P <0,0001 comparant témoin fictif et I groupes / R par T-essai. Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Discussion

Modèles d'ischémie-reperfusion du myocarde de souris sont une méthode efficace pour la recherche cardiovasculaire de simuler une maladie cardiaque aiguë ou chronique clinique 13,14. Des efforts importants ont été utilisée pour développer et affiner les approches chirurgicales qui produisent les événements ischémiques et des lésions de reperfusion dans les coeurs de plusieurs types d'animaux différents. Bien qu'il existe des avantages particuliers à l'utilisation de différents systèmes d'animaux, la souris possède des caractéristiques qui ont conduit à une vaste intérêt dans la production de I / R myocardique dans le cœur de souris. Une des raisons principales est la traçabilité génétique du système de la souris. La vaste sélection d'animaux génétiquement modifiés disponibles, et de la facilité relative avec laquelle les nouveaux modèles peuvent être générés pour répondre à des questions spécifiques, n'ont pas de correspondance dans d'autres systèmes de modèles animaux. Une autre raison de l'utilisation croissante des souris dans des études cardiovasculaires est la disponibilité croissante de matériel chirurgical et d'autres outils expérimentaux spécifiquesallié conçu pour une utilisation chez les souris. Le coût relativement faible de modèles de souris est également un facteur important de leur utilisation dans les études. Le besoin croissant de rigueur dans les études précliniques nécessite l'utilisation d'animaux supplémentaires, qui peuvent être plus réaliste lorsque moins de ressources sont nécessaires pour inclure le nombre approprié d'animaux. Bien que l'utilisation du modèle de la souris a plusieurs avantages il ya aussi des inconvénients, en particulier lorsque l'on considère les aspects divergents de la souris et de la physiologie cardiovasculaire humain. Beaucoup de modèles animaux plus gros, comme le chien et le cochon, imitent plus étroitement la plupart des aspects de la physiologie cardiovasculaire humain que la souris. Un autre inconvénient est la taille de la souris, la manipulation du plus petit coeur chez la souris nécessite un degré élevé de compétences chirurgicales, notamment dans la localisation de la LAD et de façon reproductible le ligaturant à produire une zone cohérente de l'infarctus dans le ventricule gauche. La méthode présentée ici peut fournir une amélioration significative de l'identification d'une ligature de l'artère interventriculaire antérieure. Nos résultats cohérents dans le montant de la cTnI libération du cœur (figure 2) montrent que nous pouvons générer de manière reproductible d'un infarctus taille et le niveau des cardiomyocytes mort similaire.

Un aspect clé de chirurgies pour induire un infarctus du myocarde expérimental est l'identification claire et la ligature de l'artère interventriculaire antérieure. Dans notre approche détaillée ici, nous avons amélioré la méthodologie pour identifier et accéder à la LAD, ce qui permet un positionnement plus cohérente de la ligature sur le navire. Pendant la chirurgie, nous faisons usage d'un petit morceau de coton stérile de lever l'oreillette gauche et totalement exposer le DAL, qui clarifie la position de LAD et facilite la ligature des LAD. Ceci une étape critique pour la technique et d'un point de différenciation à partir d'autres approches. L'introduction de ces modifications pour la ligature LAD devrait permettre des résultats plus reproductibles lors de la simulation de MI dans les modèles de souris. Si l'amélioration de la précision à l'endroitment de la ligature doit améliorer la cohérence de la taille de l'infarctus généré, il est toujours important de mesurer la zone à risque en utilisant une perfusion de bleu de phtalocyanine colorant. Ceci est particulièrement vrai lors de l'utilisation de lignées de souris de modification génétique, où la manipulation de l'expression génique peut se traduire par des changements dans la réponse des vaisseaux sanguins du cœur de la ligature.

Une autre étape cruciale pendant la ligature en confirmant que l'ischémie a été effectivement produite par la ligature de l'artère interventriculaire antérieure. Observation d'un changement rapide de couleur spécifique dans la zone de risque est essentiel d'être certain que les conditions ischémiques ont été produites dans la section ciblée du myocarde. Le changement de couleur du myocarde doit être considérée dans quelques secondes si la DAL est effectivement occlus. D'autres étapes importantes de la procédure concernent la durée de la période ischémique et le délai imparti pour la reperfusion avant paramètres expérimentaux sont mesurés. Comme mentionné dans le protocole, la durée de la période ischémique peut être modifiée pour produire différents degrés de lésions ischémiques au coeur. En général, une plus longue période d'ischémie entraîne plus étendu mort de myocytes dans toute la zone à risque. La durée de la reperfusion peut avoir des effets sur le développement de la pathologie cardiaque, y compris l'apparition de lésions fibrotiques dans le coeur ainsi que la stabilisation du débit cardiaque et des changements électrophysiologiques. Ainsi, la longueur spécifique de ces étapes expérimentales doit être adaptée pour répondre aux questions spécifiques examinées dans l'étude. Les paramètres expérimentaux devraient également être choisis en fonction de la durée des périodes d'ischémie et de reperfusion utilisés et les questions spécifiques devant être traités dans l'expérience. Nous présentons l'utilisation de TTC coloration pour mesurer la taille de l'infarctus et des mesures ELISA des niveaux sériques CTNi comme critères pour évaluer l'étendue des dommages cardiaques. Ces paramètres peuvent être utilisés pour toute la durée de la reperfusion, mais ils sont particulièrement useful pour des périodes plus courtes de reperfusion (24 heures) où les défauts de fonctionnement peut-être pas encore stabilisé. Alors que nous n'allons pas ici dans le détail sur les mesures fonctionnelles de débit cardiaque, comme l'échocardiographie Doppler 15 et les mesures de microsphères de débit coronarien 16, ces approches sont utiles pour comprendre les changements de la fonction cardiaque pendant plus d'expériences à long terme, tels que l'occlusion chronique de la DAL.

Bien que l'utilisation de modèles de souris de MI ont de grands avantages pour l'étude de l'I / R blessures dans le cœur il ya encore des limitations à ces approches. Depuis les grandes incisions chirurgicales doivent être faites dans la cavité de la poitrine les perturbations tissulaires résultant et l'inflammation associées peuvent influencer la réponse du coeur aux effets MI. Ces problèmes peuvent être partiellement résolues au moyen de l'utilisation de souris témoins sham chirurgicales, où toutes les étapes opératoires sont toutes réalisées à l'exception du serrage de la ligature autour de l'CONT. Un autre problème qui est produite par le caractère invasif de la chirurgie est la nécessité de gérer la douleur et la souffrance qui se produit pendant et après la procédure. approches de gestion de la douleur qui sont conformes aux meilleures pratiques actuelles sont détaillées dans cette procédure et sont nécessaires pour prévenir la souffrance des animaux de laboratoire. Il est important d'être conscient que l'utilisation de différents types d'anesthésiques et des analgésiques peut avoir des effets cardioprotecteurs après leur application. Ainsi, il convient d'appliquer ces agents pour les souris de contrôle, même pas de souris témoins qui ne sont pas utilisés pour les chirurgies fictives, afin d'éviter des complications à l'interprétation des résultats expérimentaux. Une autre limitation de cette approche est qu'elle ne fournit pas une simulation parfaite de pathologie associée à MI humaine. Foire modèles de souris utilisées pour ces expériences ne souffrent pas de co-morbidités qui sous-tendent la MI chez l'homme, comme la maladie vasculaire coronarienne, le diabète et l'hypertension. Telcomplications qui ne sont pas présents dans le modèle de souris pourraient avoir des effets sur les voies à l'étude dans une expérience particulière et doivent donc être considérés lors de l'interprétation des résultats. Dans ces cas, l'utilisation de souris transgéniques qui présentent certaines de ces pathologies sous-jacentes peut être approprié pour modéliser de façon plus efficace de la maladie car elle présenterait chez des patients humains. Dans l'avenir, d'autres aspects de cette approche pourraient être modifiés pour simuler plus précisément d'autres aspects de la pathologie humaine MI.

Malgré ces limites, les méthodes décrites ici représentent une approche efficace pour produire localisée blessures I / R chez la souris qui simule une grande partie des effets pathologiques de MI chez des patients humains. Notre technique permet une manipulation plus aisée de la LAD qui peut conduire à des résultats plus reproductibles et de simplifier l'opération. Toutefois, la maîtrise de cette technique nécessite encore habileté chirurgicale importante qui ne peut être acquise par la pratique dela procédure. Prendre soin suffisant lors de la conduite de la chirurgie, en particulier dans les endroits où cela est indiqué dans le protocole, permettra d'améliorer le taux de survie des animaux ainsi et la reproductibilité des résultats expérimentaux. Une fois l'approche chirurgicale est maîtrisée, ce protocole se révélera très utile aux enquêteurs étudient les effets des MI sur la physiologie cardiovasculaire, ainsi que ceux qui s'intéressent à tester l'efficacité des interventions thérapeutiques sur un modèle de souris.

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Disclosures

Dr Noah Weisleder est un fondateur et directeur scientifique de TRIM-édecine, Inc.

Acknowledgments

Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par l'Institut national de l'arthrite et de l'appareil locomoteur et de Skin Diseases, une partie des Instituts nationaux de la santé, en vertu Prix Nombre R01-AR063084. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PhysioSuite with RightTemp Homeothermic Warming Kent Scientific Corp PS-RT
Light source Zeiss KL 1500 LCD
Mouse Heart Slicer Matrix Zivic Miller HSMS001-1
Micro Tray - Base, Lid, & Mat (6.0 x 10 x 0.75) Fine Science Tools 6100A
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma Aldrich T8877
Buprenorphine (Buprenex Injectable) Reckitt Benkiser Healthcare NDC 12496-0757-1
bupivacaine Hospira NDC 0409-1163-01
Isoflurane Abbott NDC 5260-04-05
Betadine Soultion  Purdue Pharma 25655-41-8
Mouse Cardiac Troponin T(cTnT) ELISA Kamiya Biomedical Company KT-58997
Fine Scissors Fine Science Tools 14040-10
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11231-30
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Slim Elongated Needle Holder Fine Science Tools 12005-15
Round Handled Needle Holders Fine Science Tools 12075-12
Omano Trinocular Stereoscope Microscope.com OM99-V6
SB2 Boom Stand with Universal Arm Microscope.com V6
Tracheal Tube, 0.5 mm, 1/16 in Y Kent Scientific Corp RSP05T16
Anesthesia Systems for Rodents and Small Animals VetEquip, Inc 901807
4-0 silk taper suture Sharpoint™ Products DC-2515N
6-0 silk taper suture Sharpoint™ Products DC-2150N

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